Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Evolution und Expression von Kandidatengenen anhand von RNA-Sequenzierungsdaten zu untersuchen.
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Methodenartikel
Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Destillieren und Melden großer Datensätze, wie z. B. das gesamte Genom oder Transkriptomdaten, ist oft eine entmutigende Aufgabe. Eine Möglichkeit, die Ergebnisse aufzuschlüsseln, besteht darin, sich auf eine oder mehrere Genfamilien zu konzentrieren, die für den Organismus und die Studie von Bedeutung sind. In diesem Protokoll skizzieren wir bioinformatische Schritte, um eine Phylogenie zu erzeugen und die Expression von Genen von Interesse zu quantifizieren. Phylogenetische Bäume können Aufschluss darüber geben, wie sich Gene innerhalb und zwischen Arten entwickeln, und die Orthologie offenbaren. Diese Ergebnisse können mit RNA-seq-Daten verbessert werden, um die Expression dieser Gene in verschiedenen Individuen oder Geweben zu vergleichen. Studien der molekularen Evolution und Expression können Modi der Evolution und Erhaltung der Genfunktion zwischen Arten aufdecken. Die Charakterisierung einer Genfamilie kann als Sprungbrett für zukünftige Studien dienen und eine wichtige Genfamilie in einem neuen Genom oder Transkriptom hervorheben.
Einleitung
Fortschritte in sequenzierenden Technologien haben die Sequenzierung von Genomen und Transkriptomen von Nicht-Modellorganismen erleichtert. Neben der erhöhten Machbarkeit der Sequenzierung von DNA und RNA aus vielen Organismen ist eine Fülle von Daten öffentlich verfügbar, um Gene von Interesse zu untersuchen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, bioinformatische Schritte zur Untersuchung der molekularen Evolution und Expression von Genen bereitzustellen, die eine wichtige Rolle im interessierender Organismus spielen können.
Die Untersuchung der Evolution eines Gens oder einer Genfamilie kann Einblicke in die Evolution biologischer Systeme g....
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Protokoll
Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien von UC Irvine.
1. RNA-seq-Bibliotheksvorbereitung
- Isolieren Sie RNA mit den folgenden Methoden.
- Sammeln Sie Proben. Soll RNA zu einem späteren Zeitpunkt extrahiert werden, die Probe flash einfrieren oder in RNA-Speicherlösung15 ( Materialtabelle )legen.
- Euthanisieren und sezieren Sie den Organismus, um Gewebe von Interesse zu trennen.
- Extrahieren Sie die Gesamt-RNA mit einem Extraktionskit und reinigen Sie die RNA mit einem RNA-Reinigungskit (Materialtabelle)
HINWEIS: Es gibt Protokolle und Ki....
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Ergebnisse
Die oben genannten Methoden sind in Abbildung 1 zusammengefasst und wurden auf einen Datensatz von Hydra vulgaris Geweben angewendet. H. vulgaris ist ein wirbelloses Süßwasser, das zum Stamm Cnidaria gehört, zu dem auch Korallen, Quallen und Seeanämonen gehören. H. vulgaris kann sich asexuell vermehren, indem sie knospen und sie können ihren Kopf und Fuß regenerieren, wenn sie halbiert werden. In dieser Studie wollten wir die Evolution und Expression von O.......
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Diskussion
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, einen Überblick über die Schritte zur Charakterisierung einer Genfamilie unter Verwendung von RNA-seq-Daten zu geben. Diese Methoden haben sich für eine Vielzahl von Arten und Datensätzen4,34,35bewährt. Die hier etablierte Pipeline wurde vereinfacht und sollte einfach genug sein, um von einem Anfänger in der Bioinformatik verfolgt zu werden. Die Bedeutung des Protokolls besteht darin, d.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Danksagungen
Wir danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad und Aline G. Rangel für Rat und Anleitung bei der Integration einiger dieser Schritte in unseren Workflow. Wir danken auch Katherine Williams, Elisabeth Rebboah und Natasha Picciani für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsstipendium der George E. Hewitt Foundation for Medical an A.M.M unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bioanalyzer-DNA-Kit | Agilent | 5067-4626 | Nasslabormaterialien |
| Bioanalyzer-RNA Kit | Agilent | 5067-1513 | Nasslabormaterialien |
| BLAST+ v. 2.8.1 | Auf dem Computercluster* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ | ||
| Blast2GO (auf Ihrem PC) | Auf dem lokalen Computer https://www.blast2go.com/b2g-register-basic | ||
| boost v. 1.57.0 | Auf Computer-Cluster | ||
| Bowtie v. 1.0.0 | Auf Computer-Cluster https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/ Computing-Cluster | ||
| (dringend empfohlen) | HINWEIS: Analysen von Genomdaten werden am besten auf einem High-Performance-Computing-Cluster durchgeführt, da die Dateien sehr groß sind. | ||
| Manschettenknöpfe v. 2.2.1 | Auf dem Computercluster | ||
| edgeR v. 3.26.8 (in R) | In Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | ||
| gcc v. 6.4.0 | Auf dem Computercluster | ||
| Java v. 11.0.2 | Auf dem Computercluster | ||
| MEGA7 (auf Ihrem PC) | Auf dem lokalen Computer https://www.megasoftware.net | ||
| MEGAX v. 0.1 | Auf dem lokalen Computer https://www.megasoftware.net | ||
| NucleoSpin RNA II Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | Nasslabormaterialien |
| perl 5.30.3 | Auf dem Computercluster | ||
| python | Auf dem Computercluster | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q32866 | Nasslabormaterialien |
| R v.4.0.0 | Auf dem Computer cluster https://cran.r-project.org/src/base/R-4/ | ||
| RNAlater | ThermoFisher | AM7021 | Nasslabormaterialien |
| RNeasy-Kit | Qiagen | 74104 | Nasslabormaterialien |
| RSEM v. 1.3.0 | Computersoftware https://deweylab.github.io/RSEM/ | ||
| RStudio v. 1.2.1335 | Auf dem lokalen Computer https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download | ||
| Samtools v. 1.3 | Computersoftware | ||
| SRA Toolkit v. 2.8.1 | Auf dem Computer cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit | ||
| STAR v. 2.6.0c | Auf dem Computer cluster https://github.com/alexdobin/STAR | ||
| StringTie v. 1.3.4d | Auf dem Computer cluster https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ | ||
| Transdecoder v. 5.5.0 | Auf dem Computer cluster https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases | ||
| Trimmomatic v. 0.35 | Auf dem Computer cluster http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Trinity v.2.8.5 | Auf dem Computer cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases | ||
| TRIzol | ThermoFisher | 15596018 | Nasslabormaterialien |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | Nasslabormaterialien |
| TURBO DNA-freies Kit | ThermoFisher | AM1907 | Nasslabormaterialien |
| *Für Downloads und Installationen auf dem Computer-Cluster ist möglicherweise Root-Zugriff erforderlich. Wenden Sie sich an Ihren Netzwerkadministrator. |
Referenzen
- Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V., Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes. Genome Research. 12 (7), 1048-1059 (2002).
- Gabaldón, T., Koonin, E. V. Functional and evolutionary implications of gene ortholo....
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Nachdrucke und Genehmigungen
