Summary
यहां, हम फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा वैकुलेचर, नाभिक, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और लिपिड-ड्रॉपलेट कोट प्रोटीन की कल्पना करने के लिए मार्कर के संयोजन का उपयोग करके माउस और मानव सफेद आदिपोज ऊतक दोनों की 3डी संरचना को हल करने के लिए एक सरल, सस्ती और तेजी से समाशोधन विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
मोटापा दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा है जो हृदय रोगों, टाइप-2 मधुमेह और यकृत रोगों को विकसित करने के लिए जोखिम को बढ़ाता है। मोटापा एडीपोसाइट हाइपरप्लासिया और/या हाइपरट्रोफिया के कारण एडीपोज ऊतक (एटी) द्रव्यमान में वृद्धि की विशेषता है, जिससे इसकी त्रि-आयामी संरचना का गहरा पुन: तैयार किया जाता है । दरअसल, मोटापे के दौरान विस्तार करने के लिए एटी की अधिकतम क्षमता मोटापे से जुड़ी विकृतियों के विकास के लिए निर्णायक है। यह एटी विस्तार ऊर्जा के सेवन की अधिकता के अनुकूलन को सक्षम करने और मांसपेशियों और जिगर जैसे अन्य मेटाबोलिक अंगों के लिए हानिकारक लिपिड स्पिलओवर से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण होमोस्टिटिक तंत्र है। इसलिए, एटी विस्तार की विफलता की ओर ले जाने वाले संरचनात्मक रीमॉडलिंग को समझना उच्च नैदानिक प्रयोज्यता के साथ एक बुनियादी सवाल है। इस लेख में, हम एक सरल और तेजी से समाशोधन विधि का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक की आकृति विज्ञान का पता लगाने के लिए किया जाता है। यह अनुकूलित एटी क्लियरिंग विधि आसानी से रासायनिक हुड, तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से लैस किसी भी मानक प्रयोगशाला में आसानी से किया जाता है। इसके अलावा, इस्तेमाल किए गए रासायनिक यौगिक आसानी से उपलब्ध हैं। महत्वपूर्ण बात, यह विधि विशेष रूप से एडिपोसाइट्स, न्यूरोनल और संवहनी नेटवर्क, और जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं के वितरण की कल्पना करने के लिए विभिन्न मार्कर को धुंधला करके 3 डी एट संरचना को हल करने की अनुमति देती है।
Introduction
मोटापा आदिपोस ऊतक द्रव्यमान में वृद्धि की विशेषता है और दुनिया भर में एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य मुद्दा बन गया है, यह देखते हुए कि मोटापे के साथ लोगों को हृदय रोग, टाइप-2 मधुमेह, जिगर की बीमारियों और कुछ कैंसर के विकास का खतरा बढ़ गया है ।
एडीपोज ऊतक का एक मौलिक शारीरिक कार्य पूरे शरीर के ग्लूकोज और लिपिड होयोस्टेसिस1,2को मिलाना है। भोजन अवधि के दौरान, एडिपोसाइट्स (यानी, एडीपोज ऊतक की मुख्य कोशिकाएं) भोजन द्वारा प्रदान किए गए ग्लूकोज और लिपिड की अधिकता को ट्राइग्लिसराइड्स में स्टोर करते हैं। उपवास के दौरान, एडिपोसाइट्स शरीर की ऊर्जा मांग को बनाए रखने के लिए ट्राइग्लिसराइड्स को गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड और ग्लाइसरोल में तोड़ देते हैं। मोटापे के विकास के दौरान, एडीपोज ऊतक अपनी भंडारण क्षमता को बढ़ाने के लिए, एडीपोसाइट्स1के आकार (हाइपरट्रोफिया) और/या संख्या (हाइपरप्लासिया) को बढ़ाकर विस्तार करते हैं । जब आदिपोस ऊतक का विस्तार अपनी सीमा तक पहुंच जाता है, तो रोगियों के बीच एक निरंतर अत्यधिक चर, शेष लिपिड मांसपेशियों और यकृत3,,4सहित अन्य मेटाबोलिक अंगों में जमा हो जाते हैं, जिससे उनकी कार्यात्मक विफलता होती है और मोटापे से संबंधित कार्डियो-मेटाबोलिक जटिलताओं की शुरुआत होती है1,,5। इसलिए, तंत्र है कि वसा ऊतक विस्तार को नियंत्रित की पहचान एक प्रमुख नैदानिक चुनौती है ।
मोटापे के दौरान आदिपोस ऊतकों के भीतर प्रलेखित रूपात्मक संशोधन इसके रोग रोग से जुड़े होते हैं। एडिपोज टिश्यू के टिश्यू ऑर्गेनाइजेशन का वर्णन करने के लिए कई धुंधला प्रक्रियाओं का उपयोग किया गया है, जिनमें ऐक्टिन6,वैस्कुलर मार्कर7,लिपिड-ड्रॉपलेट मार्कर8और विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका मार्कर9,,10शामिल हैं। हालांकि, एडीपोसाइट्स (50 से 200 माइक्रोन)11के विशाल व्यास के कारण, मोटापे के दौरान देखे गए नाटकीय संरचनात्मक एटी परिवर्तनों का सही विश्लेषण करने के लिए पूरे ऊतक के एक बड़े हिस्से को तीन आयामों में विश्लेषण करना आवश्यक है। हालांकि, क्योंकि प्रकाश एक अपारदर्शी ऊतक में प्रवेश नहीं करता है, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक बड़े ऊतक नमूनों के भीतर 3 डी में इमेजिंग संभव नहीं है। उन्हें पारदर्शी बनाने के लिए ऊतक समाशोधन के तरीकों को साहित्य में सूचित किया गया है (एक समीक्षा के लिए,12देखें) एक ऊतकों को साफ करने और गहराई से प्रदर्शन करने की अनुमति देता है, पूरे ऊतक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी। ये विधियां स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों में 3 डी सेलुलर संगठन का आकलन करने के लिए अभूतपूर्व अवसर प्रदान करते हैं। वर्णित विधियों में से प्रत्येक के फायदे और कमियां हैं, और इसलिए अध्ययन किए गए ऊतकों के आधार पर सावधानीपूर्वक चयनित होने की आवश्यकता है (समीक्षा के लिए,13देखें)। वास्तव में, कुछ दृष्टिकोणों के लिए लंबी इनक्यूबेशन अवधि और / या उन सामग्रियों या यौगिकों के उपयोग की आवश्यकता होती है जो या तो महंगी, विषाक्त या14,15 , 16,17,,,18,,,19प्राप्त करने में कठिन होती हैं ।18 20 ऊतकों को साफ करने के लिए वर्नर स्पलटेहोल्ज़ द्वारा एक शताब्दी पहले उपयोग किए गए पहले यौगिकों में से एक का लाभ उठाते हुए, हमने एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और सस्ती प्रोटोकॉल स्थापित किया है जो रासायनिक हुड, तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर और एक कॉन्डोकल माइक्रोस्कोप सहित विशिष्ट उपकरणों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में सभी माउस और मानव एडिपोस ऊतक डिपो के समाशोधन के लिए बहुत अच्छीतरहसे अनुकूलित है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इस प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था और सभी माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक डिपो के लिए मान्य है। मानव और माउस आदिपोस ऊतकों को यूरोपीय कानूनों के अनुसार एकत्र किया गया था और फ्रांसीसी और स्वीडिश नैतिक समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. माउस और मानव सफेद आदिपोस ऊतक का निर्धारण
- 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) वाले पीबीएस के कम से कम 10 मिलीएल में काटे गए माउस या मानव सफेद एडीपोज ऊतकों को विसर्जित करें।
- 1 घंटे के लिए एक रोलिंग प्लेट पर कमरे के तापमान पर प्लास्टिक ट्यूब हिलाओ ।
- फिक्सेशन को पूरा करने के लिए, रात भर एक रोलिंग प्लेट पर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक ट्यूब छोड़ दें।
नोट: यह प्रोटोकॉल बड़े एडीपोज ऊतक नमूनों के लिए अनुकूलित किया गया है, जैसे चूहों से प्राप्त पूरे एपीडिडिमल फैट पैड्स ने एक सामान्य आहार (≈250 मिलीग्राम - ≈0.6 सेमी3)खिलाया। चूहों से प्राप्त एपिडिडिमल फैट पैड जैसे बड़े नमूनों के लिए एक उच्च वसा आहार (≈1.5 ग्राम - ≈4 सेमी3)या मानव एडीपोज ऊतक नमूने खिलाया गया, हालांकि समाशोधन प्रोटोकॉल पूरी तरह से पूरे नमूने के लिए काम करना चाहिए (पीएफए और एंटीबॉडी मिश्रण स्केलिंग द्वारा), सामान्य तौर पर, हम अतिरिक्त धुंधला या अनुप्रयोगों के लिए शेष नमूनों को आरक्षित करने के लिए 1 ग्राम (≈2.5 सेमी3)के आसपास ऊतक टुकड़ों में कटौती करते हैं। पीएफए (चरण 1.1.) के लिए हम ऊतक की मात्रा का लगभग 10 गुना उपयोग करने की सलाह देते हैं। एंटीबॉडी मिश्रण (चरण 3.1. और 3.4.) के लिए, ऊतक को पूरी तरह से विसर्जित करने के लिए मात्रा बढ़ाएं, और 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें यदि ऊतक 1.5 एमएल प्लास्टिक माइक्रोट्यूब (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए बहुत बड़ा है।
2. माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक का पारमेबिलाइजेशन और संतृप्ति
- पीएफए के सभी निशान को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस के 10 एमएल में फिक्स्ड व्हाइट एडीपोज ऊतक कुल्ला।
- 0.3% ग्लाइसिन (सामग्रीकी तालिका देखें) के साथ पूरक पीबीएस के 10 एमएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक विसर्जित करें और शेष मुक्त एल्डिहाइड समूहों को बुझाने के लिए 100 क्रांतियों प्रति मिनट (आरपीएम) पर 1 घंटे के लिए कक्षीय शेखर में कमरे के तापमान पर ट्यूब को हिलाएं।
- 0.2% ट्राइटन एक्स-100 (सामग्रीकी तालिका देखें) के साथ पूरक पीबीएस के 10 मिलीएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक विसर्जित करें और 100 आरपीएम पर 2 घंटे के लिए तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को हिलाएं।
- 0.2% ट्राइटन एक्स-100 और 20% डीएमएसओ (सामग्रीकी तालिका देखें) के साथ पूरक पीबीएस के 10 एमएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक विसर्जित करें और रात 100 आरपीएम पर तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को हिलाएं।
- 0.1% ट्वीन-20 (सामग्रीकी तालिका देखें), 0.1% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पूरक पीबीएस के 10 मिलीएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक विसर्जित करें, 0.1% deoxycholate (सामग्री की तालिकादेखें) और 20% DMSO और कम से कम 24 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर एक तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हिला।
- पीबीएस के 10 एमएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक को कुल्ला 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पूरक किया जाता है और 1 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर कक्षीय शेखर में कमरे के तापमान पर ट्यूब को हिलाएं।
- 0.2% ट्राइटन एक्स-100 के साथ पूरक पीबीएस के 10 एमएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक विसर्जित करें, 10% DMSO और 3% बीएसए (सामग्री की मेजदेखें) और 12 घंटे के लिए १०० आरपीएम पर एक तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हिला, किसी भी साइट है कि गैर विशेष रूप से एंटीबॉडी बांध सकता है तर ।
नोट: चरण 2.7 में, बीएसए को उपयोग की जाने वाली माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों के रक्त सीरम द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
3. माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक के लिए धुंधला प्रक्रिया
- 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ, 3% बीएसए और प्राथमिक एंटीबॉडी (क्रायोसेक्शन धुंधला करने की तुलना में 10x अधिक केंद्रित लेकिन प्रत्येक एंटीबॉडी एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए) के साथ पूरक पीबीएस के 300 माइक्रोल युक्त 1.5 एमएल प्लास्टिक माइक्रोट्यूब में ऊतक को स्थानांतरित करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करके प्रकाश से ट्यूब की रक्षा और कम से कम दो दिनों के लिए 100 आरपीएम पर एक तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हिला (चरण 1.1 और चरण 3.7.1 में नोट देखें) ।
- पीबीएस के 10 मिलीएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक को कुल्ला करें, जिसमें 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए के साथ पूरक किया गया है और 5 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित ट्यूब को हिलाएं। इस कदम को दो बार अंजाम।
- पीबीएस के 10 मिलीएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक को कुल्ला 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए के साथ मिलाएं और ट्यूब को हिलाएं, प्रकाश से संरक्षित, एक रात से दो दिनों के लिए 100 आरपीएम पर तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
- ऊतक को 1.5 एमएल प्लास्टिक माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पीबीएस के 300 माइक्रोल 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ, 3% बीएसए और माध्यमिक एंटीबॉडी (क्रायोसेक्शन स्टेनिंग की तुलना में 10x अधिक केंद्रित) के साथ पूरक हैं। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करके प्रकाश से ट्यूब की रक्षा और कम से कम दो दिनों के लिए 100 आरपीएम पर एक तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब हिला (चरण 1.1 और चरण 3.7.1 में नोट देखें) ।
- पीबीएस के 10 मिलीएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक को कुल्ला करें, जिसमें 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए और ट्यूब को हिलाया गया है, जो प्रकाश से संरक्षित है, 37 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 5 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर। इस कदम को दो बार अंजाम।
- पीबीएस के 10 मिलीएल युक्त 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में ऊतक को कुल्ला करना 0.2% ट्राइटन एक्स-100, 10% डीएमएसओ और 3% बीएसए और ट्यूब को हिलाता है, जो प्रकाश से संरक्षित होता है, 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 100 आरपीएम पर एक रात से दो दिनों के लिए।
- पीबीएस के 10 एमएल वाले 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में टिश्यू को कुल्ला करें और प्रकाश से सुरक्षित ट्यूब को 2 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर तापमान नियंत्रित कक्षीय शेखर में 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं।
नोट: नाभिक या ऐक्टिन जैसी विशिष्ट संरचनाओं की लेबलिंग के लिए, 4′, 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (डीएपीआई या समकक्ष) और/या फ्लोरोसेंटली लेबल-फ्लोइडिन को चरण ३.१ पर जोड़ना होगा । जब केवल फ्लोरोसेंटी लेबल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, या चरण 3.4 पर। जब माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।
नोट: धुंधला प्रक्रिया के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी पहले से ही फ्लोरोक्रोम (जैसे प्रवाह साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाते हैं) के साथ संयुग्मित किया जा सकता है और हम इसे समय और विशिष्टता के लाभ के लिए सलाह देते हैं। दरअसल, भले ही माउस प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग माध्यमिक एंटी-माउस एंटीबॉडी द्वारा किया जा सकता है, जैसा कि हमने यहां प्रदर्शित किया, हमने अक्सर इम्यूनोग्लोबुलिन परिसंचारी के कारण रक्त वाहिकाओं के गैर-विशिष्ट धुंधला देखा है। इसलिए, इस मुद्दे से बचने के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी जो पहले से ही लेबल किए गए हैं, अत्यधिक अनुशंसित हैं और यहां हम सबूत प्रदान करते हैं कि प्रवाह साइटोमेट्री में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी हमारी प्रक्रिया के अनुकूल हैं। हालांकि, एक एंटीजन के विशिष्ट मामले में जो निम्न स्तर पर व्यक्त किया जाता है, माध्यमिक एंटीबॉडी के माध्यम से एक संकेत प्रवर्धन कदम अनिवार्य है; जब केवल उपलब्ध प्राथमिक एंटीबॉडी माउस में किया जाता है, तो बलिदान पर कम से कम 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ चूहों का हृदय-पर्फ्यूजन इम्यूनोग्लोबुलिन परिसंचारी और इस प्रकार गैर-विशिष्ट धुंधला का एक बड़ा हिस्सा हटा सकता है।
4. माउस और मानव सफेद एडीपोज ऊतक के लिए समाशोधन प्रक्रिया
- ऊतक को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में विसर्जित करें जिसमें 10 मिलीएल 50% इथेनॉल होता है और ट्यूब को हिलाएं, प्रकाश से संरक्षित, कक्षीय शेखर में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर।
- ऊतक को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में विसर्जित करें जिसमें 10 एमएल 70% इथेनॉल होता है और ट्यूब को हिलाता है, जो प्रकाश से सुरक्षित होता है, कमरे के तापमान पर कक्षीय शेखर में 2 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर।
- ऊतक को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में विसर्जित करें जिसमें 95% इथेनॉल का 10 एमएल होता है और ट्यूब को हिलाता है, जो प्रकाश से संरक्षित होता है, कमरे के तापमान पर कक्षीय शेखर में 2 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर।
- ऊतक को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में विसर्जित करें जिसमें 100% इथेनॉल का 10 एमएल होता है और ट्यूब को हिलादेना, प्रकाश से संरक्षित, कक्षीय शेखर में कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 100 आरपीएम पर।
- ऊतक को 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में विसर्जित करें जिसमें 100% इथेनॉल का 10 एमएल होता है और ट्यूब को हिलाता है, जो प्रकाश से संरक्षित होता है, रात 100 आरपीएम पर कक्षीय शेखर में कमरे के तापमान पर।
- एक प्लास्टिक टोपी के साथ एक 20 मिलीएल कांच की बोतल में ऊतक विसर्जित (सामग्री की मेज देखें) मिथाइल सालिसिलेट के 5 एमएल युक्त (सामग्री की मेजदेखें) एक रासायनिक हुड के नीचे और कांच के कंटेनर को हिला, प्रकाश से संरक्षित, कमरे के तापमान पर १०० आरपीएम में एक कक्षीय शेखर में कम से 2 घंटे के लिए ।
नोट: चरण 4.3 से बचकर समाशोधन प्रक्रिया को काफी त्वरित (यदि आवश्यक हो) किया जा सकता है। और 4.5., हालांकि अंतिम समाशोधन गुणवत्ता थोड़ी कम हो जाएगी।
5.3D-मंजूरी दे दी सफेद आदिपोस ऊतक के confocal इमेजिंग
- ऊतक को एक रासायनिक हुड के नीचे ग्लास बॉटम (सामग्री की टेबलदेखें) से लैस धातु इमेजिंग कक्ष में स्थानांतरित करें और कक्ष को ताजा मिथाइल सैलिसिलेट से भरें।
नोट: ऊतक को जगह में सुरक्षित करने के लिए, और इस प्रकार इसे कक्ष में बग़ल में तैरने या बग़ल में जाने से रोकने के लिए, कक्ष में बढ़ते समय ऊतक के शीर्ष पर कई 18 मिमी गोल ग्लास कवरस्लिप (सामग्रीकी तालिका देखें) लागू करें। - इमेजिंग चैंबर को उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर रखें।
- पूरे एडीपोज ऊतक या मानव ऊतक नमूने के कुछ सेमी3 3 डी नक्शे उत्पन्न करने के लिए कम आवर्धन उद्देश्य (उदाहरण के लिए, 4x उद्देश्य) का उपयोग करके ऊतक की छवि।
- उच्च आवर्धन पर ऊतक नमूने के लिए कई क्षेत्रों का चयन करें। आमतौर पर, 20x लंबी दूरी के वायु उद्देश्य का उपयोग करें जो संकल्प और गहराई के बीच एक अच्छा अनुपात प्रदान करता है। हम 600 और 2000 माइक्रोन गहराई के बीच जेड-स्टैक के साथ बड़ी मोज़ेक छवियां प्राप्त करते हैं।
नोट: ऊतक में गहरी छवि के लिए एक लंबी दूरी के उद्देश्य का उपयोग करें ।
6. 3 डी एडीपोज ऊतक छवियों से मात्रात्मक परिणामों का निष्कर्षण
नोट: विभिन्न संरचनाओं का विभाजन और बिंदु 5 में उत्पन्न 3डी-इमेज स्टैक से मात्रात्मक जानकारी के बाद की निकासी कई मौजूदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर विकल्पों में से किसी का उपयोग करके किया जा सकता है, या तो वाणिज्यिक या फ्रीवेयर। निम्नलिखित बिंदुओं में, हम एक रणनीति का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 3डी एडिपोस ऊतक छवियों से मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए किया जाता है।
- 3डी स्टैक को सॉफ्टवेयर फॉर्मेट पर फ्री-अप मेमोरी स्पेस में कन्वर्ट करें ।
- कोशिकाओं को खंडित करें।
- सॉफ्टवेयर के सेल मॉड्यूल खोलें।
- सेल डिटेक्शन सेटिंग को प्लाज्मा झिल्ली धुंधला करने के लिए बदलें।
- सेल परिधि को चित्रित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर के फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें (प्लालोइडिन जो कॉर्टिकल ऐक्टिन या प्लाज्मा झिल्ली मार्कर जैसे मैक्रोफेज के लिए एफ 4/80, टी कोशिकाओं के लिए टीसीआर-β, या प्रतिरक्षा कोशिका उपप्रकारों के लिए विशिष्ट भेदभाव सीडी प्रोटीन का क्लस्टर लेबल करता है)।
- थ्रेसहोल्ड सेट करें और अपेक्षित सेल आकार (यानी, सेल डिटेक्शन के लिए 1 से 200 माइक्रोन) की एक श्रृंखला प्रदान करें।
- विभाजन चलाएं। जेड-स्टैक के अनुरूप एक मात्रा खंडित कोशिकाओं के साथ उत्पन्न होगी जो प्रत्येक पड़ोसी कोशिकाओं के लिए एक अलग रंग के साथ रंग-कोडित होगी।
- खंडित कलाकृतियों को बाहर करने के लिए सांख्यिकीय फिल्टर (आकार, गोलाई, परिपत्रता, आदि) को सांख्यिकीय टैब में लागू करें और/या खंडित कोशिकाओं को उनके आकार के आधार पर ब्याज की कोशिका में परिष्कृत करने के लिए (यानी, आदिपोसाइट्स के लिए 20-200 माइक्रोन; मैक्रोफेज के लिए 5-25 माइक्रोन; लिम्फोसाइट्स के लिए 1-3 माइक्रोनम) ।
- सांख्यिकी टैब से माप और मात्रात्मक डेटा (मात्रा, संख्या, आकार, व्यास, आदि) निकालें।
- एक संरचना के रूप में सेलुलर घटकों (नाभिक, वेसिकल्स, आदि) या जहाजों को खंडित करें।
नोट: हालांकि फिलामेंट सेगमेंटेशन जहाजों की कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है, लेकिन हम जहाजों के आकार, मात्रा और व्यास पर डेटा निकालने के लिए सतह मॉड्यूल विभाजन का उपयोग करते हैं। दरअसल, फिलामेंट्स मॉड्यूल का उपयोग करते समय जहाजों के आकारों का मात्राकरण खो जाता है।- सॉफ्टवेयर के भूतल मॉड्यूल खोलें।
- 3 डी में पुनर्निर्माण के लिए विशेष रूप से उपकोशिकीय घटक लेबल करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर के फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें।
- थ्रेसहोल्ड सेट करें और संरचना के अपेक्षित व्यास आकार की एक श्रृंखला प्रदान करें (यानी, नाभिक के लिए 0.5-5 माइक्रोन; जहाजों के लिए 0-100 माइक्रोन; आदि)।
- विभाजन चलाएं। खंडित सेलुलर संरचना के साथ एक मात्रा उत्पन्न की जाएगी। माप और मात्रात्मक डेटा (मात्रा, संख्या, आकार, व्यास, आदि) सांख्यिकी टैब से निकाले जा सकते हैं।
- जहाजों को एक ट्यूबलर सातत्य के रूप में खंडित करें।
नोट: हालांकि फिलामेंट सेगमेंटेशन जहाजों की कनेक्टिविटी का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है, लेकिन हम जहाजों के आकार, मात्रा और व्यास पर डेटा निकालने के लिए सतह मॉड्यूल विभाजन का उपयोग करते हैं। दरअसल, फिलामेंट्स मॉड्यूल का उपयोग करते समय जहाजों के आकारों का मात्राकरण खो जाता है।- सॉफ्टवेयर के फिलामेंट्स मॉड्यूल को खोलें।
- पोत धुंधला करने के लिए इसी फ्लोरोसेंट चैनल का चयन करें।
- फ्लोरेसेंस तीव्रता के लिए थ्रेसहोल्ड सेट करें और अपेक्षित कनेक्टिंग नोड्स की उचित संख्या का चयन करें।
- विभाजन चलाएं। पोत नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करने वाले फिलामेंट्स 3डी में जेनरेट किए जाएंगे । माप सांख्यिकी टैब से निकाला जा सकता है, जिससे पोत की लंबाई, पोत शाखाओं में बंटी की संख्या आदि सहित मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने की अनुमति दी जा सकती है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके और चित्र 1 में संक्षेप में, हम क्रमशः चित्र 2ए और चित्रा 2B में प्रस्तुत मानव और माउस सफेद एडीपोज ऊतक को दाग और ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट करने में सक्षम थे। Figure 2B मंजूरी दे दी ऊतक को कॉन्फोकल इमेजिंग(चित्रा 3 ए)करने के लिए धातु इमेजिंग कक्ष में स्थानांतरित कर दिया गया था। समाशोधन ने ऊतक छवियों की गहराई में काफी सुधार किया जिसे हम प्राप्त करने में सक्षम थे(चित्रा 3B और चित्रा 3 सी)। पूरे एडीपोज ऊतक को 4x उद्देश्य (अनुपूरक फिल्म 1 देखें)का उपयोग करके कम आवर्धन पर 3 डी में अधिग्रहीत किया जा सकता है, ताकि 3D मानचित्र उत्पन्न किया जा सके, जिससे 20x उद्देश्य(चित्रा 3 डी)का उपयोग करके उच्च आवर्धन पर अधिग्रहीत किए जाने वाले विभिन्न क्षेत्रों का चयन किया जा सके। उच्च आवर्धन छवियों को 2 मिमी(चित्रा 3E)की गहराई के साथ 3 डी में प्राप्त किया जाता है।
यह प्रक्रिया फ्लोरोसेंटली-लेबल वाले फालोइडिन का उपयोग करके डीएपीआई और ऐक्टिन का उपयोग करके नाभिक सहित कई सामान्य सेल मार्कर की लेबलिंग को सक्षम बनाती है। पेरिलिपिन एंटीबॉडी (सामग्रियों की तालिका देखें) का उपयोग करके लिपिड बूंदों और एडिपोसाइट्स के विशिष्ट धुंधला को प्राप्त किया जा सकता है; चित्रा 4A) और एंटी-ग्लूट4 एंटीबॉडी (सामग्रियों की तालिका देखें; चित्रा 4B) क्रमानुसार। सीडी 31 एंटीबॉडी का उपयोग करके रक्त वाहिकाओं का पता लगाया जा सकता है (सामग्रियों की तालिका देखें; चित्रा 4C) या माउस बलिदान से कुछ ही समय पहले लेक्टिन-DyLight649 के नसों में इंजेक्शन द्वारा (सामग्रियों की मेज देखें; चित्रा 4D)। एंटी-सीडी 301-फिकोरीथ्रिन एंटीबॉडी (सामग्रियों की तालिका देखें) का उपयोग करके मैक्रोफेज और टी-कोशिकाओं की कल्पना की जा सकती है; चित्रा 4D) और एंटी-टीसीआर-β-पैसिफिक ब्लेउ एंटीबॉडी (सामग्रियों की तालिका देखें; चित्रा 4E)। एंटी-टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) एंटीबॉडी (सामग्रियों की तालिका देखें) का उपयोग करके परिधीय तंत्रिका नेटवर्क का पता लगाया जा सकता है; चित्रा 4एफ-जी)। इसके अतिरिक्त, यह प्रोटोकॉल माउस एपिडिडिमल एडीपोज ऊतक(चित्र 4ए-बी, ई),माउस चमड़े के नीचे एडिपोस ऊतक(चित्र 4डी, जी),माउस ब्राउन एडीपोज ऊतक(चित्रा 4F)और मानव आदिपोस ऊतक(चित्रा 4C)के समाशोधन की अनुमति देता है। इन मार्कर को सेगमेंट करने के लिए इन लेबलिंग और एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (सामग्रियों की तालिका देखें) के संयोजन का उपयोग करके, हम आदिपोज ऊतक i) के भीतर निर्धारित कर सकते हैं, एडिपोसाइट्स का मतलब आकार और आकार वितरण(चित्रा 5ए-बी)और ii) रक्त वाहिका नेटवर्क घनत्व(चित्रा 5C)।
चित्रा 1: सफेद एडीपोज ऊतक के लिए समाशोधन प्रक्रिया का सारांश। माउस या मानव सफेद आदिपोस ऊतकों को ठीक किया जाता है, परमीलित, संतृप्त, दाग और साफ किया जाता है। छवियों को तब 3D में अधिग्रहीत किया जाता है और एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: सफेद आदिपोज ऊतक की तस्वीरें। (A)समाशोधन प्रक्रिया से पहले और बाद में मानव सफेद एब्डोमिनोपेल्विक की तस्वीर। (ख)समाशोधन प्रक्रिया से पहले और बाद में माउस एपीडिडिमल सफेद एडीपोज ऊतक की तस्वीर । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3: एडीपोज ऊतक समाशोधन के साथ बेहतर इमेजिंग गहराई। (A)ग्लास बॉटम से लैस मेटैलिक इमेजिंग चैंबर का बढ़ना। (ख)माउस एपिडिडिमल सफेद एडीपोज ऊतक की जेड-सीरीज छवियां समाशोधन से पहले और बाद में फल्लोइडिन-एलेक्सा488 (हरे रंग) से सना हुआ है । (ग)XZ पैनल बी जेड-स्टैक के पार सफेद बिंदीदार लाइनों के अनुरूप अनुमान । (घ)0.4 सेमी जेड-स्टैक का माउस चमड़े के नीचे सफेद एडीपोज ऊतक का ढेर, जो फलॉइडिन-एलेक्सा488 का उपयोग करके ऐक्टिन के लिए दाग था और 4x उद्देश्य के साथ कम आवर्धन पर अधिग्रहीत किया गया था। दाईं ओर छोटी छवियों को 20x उद्देश्य का उपयोग करके चयनित ऊतक स्थिति में प्राप्त किया गया था। (ई)इमेज जेड-स्टैक के 3डी वॉल्यूम रेंडरिंग का साइड व्यू क्लीयर माउस वाइट एडिपोस टिश्यू से दागदार फालोइडिन-एलेक्सा488 से 20x इमेजेज के समान हासिल किया गया।)। हमारी उच्च आवर्धन प्रक्रिया द्वारा प्राप्त 3 डी इमेजिंग गहराई यहां प्रदर्शित की जाती है और जेड-डेप्थ कलर कोडिंग (जेड = 0 मिमी के लिए गहरे नीले रंग से जेड = 2 मिमी के लिए गहरे लाल) द्वारा रेखांकित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: माउस और मानव सफेद आदिपोज ऊतकों कई मार्कर के लिए दाग । (A)एंटी-पेरिलिपिन1 एंटीबॉडी और एंटी-माउस-एलेक्सा647-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके लिपिड बूंदों के लिए दाग वाले माउस एपिडिडिमल सफेद एडीपोस ऊतक की एकल विमान छवि। (ख)माउस एपिडिडिमल सफेद एडिपोस ऊतक की मोज़ेक एकल विमान छवि DAPI, एंटी-ग्लूट4 एंटीबॉडी और एंटी-माउस-एलेक्सा647-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके नाभिक और एडिपोसाइट्स के लिए दागदार ऊतक। (C)Z-प्रक्षेपण 600 माइक्रोन जेड-स्टैक ऑफ ह्यूमन व्हाइट एब्डोमिनोपेल्विक एडिपोज ऊतक सीडी 31-एलेक्सा647-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करने वाले जहाजों के लिए दागदार। (घ)600 माइक्रोन िएम जेड-स्टैक का जेड-प्रोजेक्शन 600 माइक्रोन्यूटेनियस वाइट एडिपोज टिश्यू के ढेर में लेक्टिन-डाइलाइट649 नसों में इंजेक्शन और एंटी-सीडी 301-एलेक्सा5555 एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए जहाजों और मैक्रोफेज के लिए दागदार । लोअर राइट इनसेट सफेद बिंदीदार बॉक्स की एक ज़ूम इमेज है। (ई)एक्यूआईपी की सिंगल प्लेन इमेज एपिडिडिमल वाइट एडिपोज टिश्यू को एक्फिन और टी-सेल्स के लिए दागदार किया गया जिसमें फालोइडिन-एलेक्सा488 और एंटी-टीसीआर-पैसिफिक ब्लू-कंजूस का इस्तेमाल किया गया । लोअर राइट इनसेट सफेद बिंदीदार बॉक्स की एक ज़ूम इमेज है। (F)50 माइक्रोन जेड-स्टैक ऑफ माउस ब्राउन एडिपोस ऊतक का स्टैक, डीएपीआई, एंटी-टीएच एंटीबॉडी और एंटी-रैबिट-एलेक्सा647-संयुग्म एंटीबॉडी का उपयोग करके नाभिक और न्यूरोनल नेटवर्क के लिए दागदार। (जी)600 माइक्रोन िएम जेड-स्टैक का 600 माइक्रोन िएश सफेद एडीपोज ऊतक का ढेर डीएपीआई, एंटी-टीएच एंटीबॉडी और एंटी-रैबिट-एलेक्सा 647-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करके नाभिक और न्यूरोनल नेटवर्क के लिए दागदार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके 3D छवियों का विश्लेषण (सामग्रियों की तालिका देखें)। (A)व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर द्वारा 3 डी में खंडित मानव आदिपोसाइट्स की 3डी वॉल्यूम प्रतिपादन। हर एडिपोसिट के संपर्क में आने वाले आदिपोसाइट्स का एक अलग रंग होता है। जहाजों को लाल रंग में दर्शाया जाता है। (ख)पैनल ए के 3डी वॉल्यूम रेंडरिंग से एडिपोसाइट्स का आकार मात्रा और वितरण, जिसमें लगभग 20,000 एडिपोसाइट्स होते हैं। (ग)वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3 डी में खंडित रक्त वाहिकाओं की 3डी मात्रा प्रतिपादन और बड़े और छोटे जहाजों के लिए लाल या पीले रंग में क्रमशः प्रतिनिधित्व किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक मूवी 1: चित्रा 3 डी में दिखाए गए पूरे चमड़े के नीचे सफेद एडीपोज ऊतक की 3डीमात्रा प्रतिपादन। सफेद बॉक्स 2 सेमी3 क्यूब का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
रोग प्रगति के दौरान आदिपोज ऊतक के भीतर होने वाले संशोधन, जैसे मोटापे की, विकृति के पीछे तंत्र की समझ के लिए मौलिक है। एडिपोस टिश्यू में इस तरह के तंत्र को उजागर करने वाले अग्रणी अध्ययन वैश्विक दृष्टिकोणों जैसे संपूर्ण एडीपोज टिश्यू प्रोटेओमिक्स21, प्रवाह साइटोमेट्री22,23और ट्रांसक्रिप्टोमिक्स24,25पर आधारित हैं । इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल,विश्लेषण26, 27, 28,,29का उपयोग करके आदिपोज ऊतकों में होने वाले संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने28के29प्रयास किए गए हैं । हालांकि, अनुभाग के सीमित आकार के कारण, 5-10 माइक्रोन एडीपोज ऊतक वर्गों का विश्लेषण, महत्वपूर्ण संरचनात्मक विशेषताओं की सराहना करने की क्षमता को प्रतिबंधित करता है। सबसे पहले, केवल कुछ एडिपोसाइट नाभिक प्रति अनुभाग पता लगाने योग्य हैं क्योंकि प्रत्येक खंड एडिपोसाइट्स (1/10 वें) के केवल एक छोटे हिस्से का प्रतिनिधित्व करताहै। दूसरा, एडिपोसाइट्स ऊतक वर्गों से अनुमानित एडिपोसाइट्स का आकार गलत है क्योंकि अधिकांश एडिपोसाइट्स उनके भूमध्य रेखा के नीचे या पीछे काटे जाते हैं, जिससे उनके मतलब के आकार का पक्षपातपूर्ण (कम) माप होता है। तीसरा, रक्त वाहिका और तंत्रिका फाइबर सातत्य भौतिक खंड के दौरान खो रहे हैं । चौथा, ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रत्येक उपप्रकारों का वितरण स्थापित करना मुश्किल है क्योंकि त्रि-आयामी निर्देशांक खो जाते हैं। इस संदर्भ में, हम यहां जिस कार्यप्रणाली का प्रस्ताव करते हैं, वह किसी भी मानक प्रयोगशाला को सरल और सस्ती तरीके से तीन आयामों में मानव और माउस सफेद एडीपोज ऊतक की छवि बनाने की अनुमति देता है।
इस विधि की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, ऊतक (निर्धारण, पारमेबिलाइजेशन, धुंधला, समाशोधन) तैयार करने के लिए आवश्यक समय लंबा है (एक सप्ताह से अधिक)। इसे कम करना मुश्किल होगा क्योंकि इस समय के बहुमत के लिए ऊतक दाग की आवश्यकता है। इतने बड़े ऊतक नमूनों के भीतर एंटीबॉडी के प्रवेश के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। इनक्यूबेशन समय कम होने से गैर-समरूप एंटीबॉडी प्रवेश होने का खतरा बढ़ जाएगा, जिससे कलाकृतियों को धुंधला कर दिया जाएगा । इसलिए, समय हासिल करने और प्रक्रिया को छोटा करने के लिए एकमात्र संभव खिड़की ऊतक को साफ करने के लिए समर्पित समय है, जो इष्टतम परिणामों की आवश्यकता होने पर लगभग एक दिन लेता है, लेकिन गुणवत्ता में नाटकीय गिरावट के बिना इसे आधे दिन तक कम किया जा सकता है। दूसरी सीमा ऊतक की संभावित सिकुड़न है। दरअसल, किसी भी प्रोटोकॉल में जो सॉल्वैंट्स का उपयोग करके ऊतक को निर्जलित करता है, यह संभावना है कि पानी हटाने के कारण ऊतक सिकुड़ जाते हैं। इस सिकुड़न का आकलन हमेशा चुनौतीपूर्ण होता है, और यहां लगभग असंभव है क्योंकि ऊतक का किनारा पारदर्शी हो जाता है जब निर्जलीकरण प्रक्रिया के दौरान लिपिड निकाले जाने लगते हैं। इसलिए, साफ किए गए ऊतकों के आकार के अनुमानों को सावधानी के साथ व्याख्या करने की आवश्यकता है। तथापि, माउस से प्राप्त ऊतकों के बीच एडिपोसाइट आकार या पोत की लंबाई में परिवर्तनों की तुलना विभिन्न जीनोटाइप के साथ की जाती है और / या विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों में प्रस्तुत की गई जानकारीपूर्ण11बनी हुई है । अंतिम सीमा पूरे माउस की बड़ी मात्रा से जुड़ी हुई है ऊतक या एक बड़े मानव आदिपोस ऊतक सर्जिकल नमूने से जुड़ा हुआ है। दरअसल, हालांकि प्रोटोकॉल पूरी तरह से इन बड़े नमूनों को साफ करने के लिए अनुकूलित है, इमेजिंग एक पूरे अंग एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ चुनौतीपूर्ण है । इस मुद्दे को दूर करने और पूरे अंग समाशोधन प्रक्रिया की पूरी क्षमता का फायदा उठाने की रणनीति, 4x उद्देश्य का उपयोग करके पूरे अंग का 3डी कम आवर्धन मानचित्र प्राप्त करना है, और ऊतक के भीतर बेतरतीब ढंग से फैले विशिष्ट क्षेत्रों का चयन करना है जहां 20x लंबी दूरी के उद्देश्य का उपयोग करके उच्च आवर्धन 3 डी छवियों का अधिग्रहण किया जा सकता है। "उच्च आवर्धन" सेटअप लगभग 45 मिमी3 (4.7 x 4.7 x 2 मिमी) के ऊतकों की मात्रा इमेजिंग की अनुमति देता है। यद्यपि यह मात्रा पूरे अंग (0.5 से 4 सेमी3से अधिक) की मात्रा की तुलना में सीमित है, ऊतक के भीतर कई पदों पर अधिग्रहण दोहराने से हमें सेलुलर पर ऊतक का एक अच्छा नमूना प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। ध्यान दें कि इमेजिंग बड़े ऊतकों इमेजिंग डेटा की एक महत्वपूर्ण राशि है कि संग्रहीत करने की आवश्यकता होगी उत्पन्न करेगा।
14,30के ऊतकों को साफ करने के लिए पहले वर्णित तरीकों की तुलना में प्रक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर होता है । सबसे पहले, AdipoClear के विपरीत, जो मेथनॉल, डाइक्लोरोमेथेन और डिबेंजाइलेथर14का उपयोग करता है, यहां प्रस्तुत विधि समाशोधन के लिए निर्जलीकरण और मिथाइल सैलिसिलेट के लिए इथेनॉल का उपयोग करती है। इसलिए, प्रक्रिया सुरक्षित है क्योंकि यह कम विषाक्त समाशोधन सॉल्वैंट्स का लाभ उठाती है जो अक्सर डाइक्लोरोमेथेन, मेथनॉल और डाइबेन्जाइलेथर की उच्च विषाक्तता की तुलना में खाद्य/पेय-प्रसंस्करण उद्योगों (इथेनॉल और मिथाइलसाइलिसाइलेट) द्वारा उपयोग की जाती हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के अनुसार ऊतक की तैयारी आदिपोक्लियर प्रोटोकॉल14की तुलना में दो दिन तेज है। हाल ही में, ली और उनके सहयोगियों द्वारा एक और विधि का प्रस्ताव किया गया था ताकि उन्हेंग्लिसरोल 30में डुबोकर ऊतक के टुकड़ों को साफ किया जा सके। इस प्रक्रिया की तुलना में यह प्रोटोकॉल बहुत सरल है, और छवियों की गुणवत्ता उच्च आवर्धन पर भी अच्छी है। हालांकि, यह समाशोधन प्रोटोकॉल केवल 2 मिमी3 एडीपोज ऊतक टुकड़ों का उपयोग करते समय कुशलता से काम करता है। समाशोधन प्रक्रिया से पहले इन छोटे नमूनों में ऊतक की खंडिताई कम आवर्धन पर भी 2 मिमी3 से बड़े ऊतक की मात्रा इमेजिंग से एक को रोकता है । यहां प्रस्तुत प्रक्रिया कम आवर्धन पर 3 डी में पूरे ऊतक के मानचित्रण और उच्च आवर्धन पर पूरे मंजूरी दे दी आदिपोस ऊतक के भीतर कई ज्ञात पदों पर४५ मिमी 3 के आसपास छवियों के 3 डी ढेर के अधिग्रहण की अनुमति देता है ।
इस प्रक्रिया में भविष्य के कई अनुप्रयोग हो सकते हैं। किसी भी विधि के साथ के रूप में, यहां वर्णित प्रक्रिया को सरल और/या आगे अनुकूलित किया जा सकता है । प्रक्रिया के लिए एक दिलचस्प अग्रिम समाशोधन प्रक्रिया के संयोजन से आ सकता है, हमने अतिरिक्त इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ वर्णित किया है। उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल प्रोजेक्शन टोमोग्राफी (ऑप्ट), टोटल इंटरनल रिफ्लेक्शन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफ), चुनिंदा प्लान रोशनी माइक्रोस्कोपी (एसपीआईएम) या उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (एसटीईटी) जैसे विशिष्ट इमेजिंग सेटअप प्रक्रिया के साथ सैद्धांतिक रूप से संगत हैं, हालांकि यह उन प्रयोगशालाओं के लिए अपनी लागू क्षमता को सीमित करेगा जो इन प्रणालियों से सुसज्जित हैं। वैकल्पिक रूप से, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर इंडेक्स और एक अधिग्रहण प्रणाली के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करके जो प्रति सेकंड सैकड़ों छवियों को प्राप्त करने में सक्षम है, जो कई प्रयोगशालाओं में पाया जाता है, कोई भी सुपर रिज़ॉल्यूशन रेडियल इंटरप्रसिएशन (एसआरआरएफ) पोस्ट-प्रोसेसिंग इमेज एनालिसिस फ्रीवेयर31का उपयोग करके सुपर-रेजोल्यूशन विश्लेषण कर सकता है। दिलचस्प बात यह है कि शास्त्रीय फ्लोरोक्रोम को एसआरआरएफ विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जाता है, जो पूरे मानव और माउस सफेद एडीपोज ऊतकों के 3 डी सुपर-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण को सक्षम करेगा।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम समाशोधन से पहले ऊतक प्रसंस्करण से संबंधित हैं। सबसे पहले, और शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल विश्लेषणों के लिए, निर्धारण कदम मौलिक है। कमजोर निर्धारण के मामले में, संरचनात्मक विशेषताओं को संरक्षित नहीं किया जाता है, जबकि विस्तारित निर्धारण से विशिष्ट एंटीजन साइटों को क्रॉसलिंकिंग और अवरुद्ध किया जाता है और परिणामस्वरूप गैर-सजातीय इम्यूनो-धुंधला हो जाता है। एक और संवेदनशील कदम ऊतक का धुंधला है, जो कई महत्वपूर्ण बिंदुओं को प्रस्तुत करता है जो हम नीचे वर्णन करेंगे। सबसे पहले, एंटीबॉडी को क्रायोस्टेट वर्गों पर परीक्षण करके मान्य करने की आवश्यकता होती है ताकि यह पुष्टि की जा सके कि वे कार्यात्मक हैं और उनकी इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए। अंतिम एकाग्रता है कि समाशोधन प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है दस बार क्रायोस्टेट वर्गों के लिए इष्टतम एकाग्रता है । दूसरा, ऊतक के आकार के कारण इनक्यूबेशन का समय भी महत्वपूर्ण है। एक इनक्यूबेशन समय जो बहुत कम है, कमजोर या गैर-सजातीय इम्यूनोदाता (उदाहरण के लिए, ऊतक की परिधि पर सही धुंधला लेकिन कोई आंतरिक धुंधला नहीं होगा)। इसी तरह, धोने के कदम जो बहुत कम हैं, गैर-विशेष रूप से बाध्य एंटीबॉडी को ऊतक से हटाने से रोकेंगे जिससे गैर-विशिष्ट धुंधला हो जाएगा। हमारे ज्ञान के लिए, एंटीबॉडी के साथ ऊतक के विस्तारित इनक्यूबेशन धुंधला ख़राब नहीं करता है । इसलिए, हम दृढ़ता से लंबी इनक्यूबेशन और धोने की अवधि की सलाह देते हैं। तीसरा, फ्लोरोक्रोम का चुनाव ब्याज के संकेत के अनुकूल होना चाहिए। सामान्य रूप से ऊतक नमूनों में, और विशेष रूप से सफेद एडीपोज ऊतक, गैर-नगण्य ऑटो-फ्लोरेसेंस 488 एनएम और 555 एनएम पर पता लगाने योग्य है। अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन के लिए यह एक मुद्दा नहीं है और धुंधला इन चैनलों में अच्छी तरह से काम करेंगे । हालांकि, कम अभिव्यक्ति वाले प्रोटीन के लिए हम दृढ़ता से दूर-लाल फ्लोरोक्रोम के उपयोग की सलाह देते हैं। समाशोधन के लिए, कोई महत्वपूर्ण कदम नहीं हैं क्योंकि कार्यप्रणाली बहुत सरल है। ध्यान रखें कि मिथाइल सैलिसिलेट प्लास्टिक सामग्री के साथ संगत नहीं है, इसलिए हम इमेजिंग करने के लिए समाशोधन चरणों और एक धातु कक्ष के लिए कांच की बोतलों और ग्लास बॉटम से लैस एक धातु कक्ष की सलाह देते हैं। इस बढ़ते प्रक्रिया के लिए विकल्प i का उपयोग करके मौजूद हैं) एक सामान्य ग्लास स्लाइड, दंत राल और ग्लास कवरलिप (एक छोटे ग्लास चैंबर उत्पन्न करने के लिए), या ii) एक ग्लास पेट्री-डिश (ईमानदार माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए)।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को INSERM, Université कोटे डी अज़ूर द्वारा समर्थित किया गया था, और भविष्य Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01) के लिए निवेश के माध्यम से फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR) से अनुदान द्वारा, कार्यक्रम UCA जेडी (ANR-15-IDEX-01) अकादमी के माध्यम से 2 "सिस्टेम्स कॉम्प्लेक्स" और अकादमी 4 "कॉम्प्लेक्स एट विविधता du vivant", Fondation डालना ला Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), और युवा अन्वेषक कार्यक्रम जेजी (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) । हम Conseil Départemental des Alpes-Maritimes और Région PACA द्वारा वित्त पोषित C3M की इमेजिंग कोर सुविधा का भी शुक्रिया अदा करते हैं, और जो आईबीएसए माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग प्लेटफॉर्म कोटे डी अज़ूर (MICA) द्वारा भी समर्थित है। हम ऊतक तैयार करने में तकनीकी मदद के लिए मैरियन डसॉट का शुक्रिया अदा करते हैं। हम पांडुलिपि के सबूत पढ़ने के लिए एबी Cuttriss, UCA अंतरराष्ट्रीय वैज्ञानिक दृश्यता, धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
