Summary
Her beskriver vi en enkel, billig og hurtig clearing metode til at løse 3D-strukturen af både mus og humanhvidt fedtvæv ved hjælp af en kombination af markører til at visualisere vaskulatur, kerner, immunceller, neuroner, og lipid-dråbe pels proteiner ved fluorescerende billeddannelse.
Abstract
Fedme er et stort verdensomspændende folkesundhedsproblem, der øger risikoen for at udvikle hjerte-kar-sygdomme, type-2 diabetes, og leversygdomme. Fedme er karakteriseret ved en stigning i fedtvæv (AT) masse på grund af adipocyt hyperplasi og / eller hypertrophia, fører til dybtgående remodeling af sin tre-dimensionelle struktur. Faktisk er AT's maksimale evne til at ekspandere under fedme afgørende for udviklingen af fedme-associerede patologier. Denne AT ekspansion er en vigtig homeostatisk mekanisme til at muliggøre tilpasning til et overskud af energiindtag og for at undgå skadelige lipid spillover til andre metaboliske organer, såsom muskler og lever. Derfor er forståelse af den strukturelle remodeling, der fører til svigt af AT ekspansion et grundlæggende spørgsmål med høj klinisk anvendelighed. I denne artikel beskriver vi en enkel og hurtig clearing metode, der rutinemæssigt anvendes i vores laboratorium til at udforske morfologi af mus og humant hvidt fedtvæv ved fluorescerende billeddannelse. Denne optimerede AT-clearingmetode udføres nemt i ethvert standardlaboratorium, der er udstyret med en kemisk hætte, en temperaturstyret orbitalshaker og et fluorescerende mikroskop. Desuden er de anvendte kemiske forbindelser let tilgængelige. Vigtigere er det, denne metode gør det muligt at løse 3D AT struktur ved farvning forskellige markører til specifikt visualisere adipocytter, neuronal og vaskulære netværk, og den medfødte og adaptive immunceller fordeling.
Introduction
Fedme er karakteriseret ved en stigning i fedtvæv masse og er blevet et stort verdensomspændende folkesundhedsproblem, da mennesker med fedme har øget risiko for at udvikle hjerte-kar-sygdom, type-2 diabetes, leversygdomme og nogle kræftformer.
En grundlæggende fysiologisk funktion af fedtvæv er at modulere helkropsglukose og lipidhomøostase1,2. I fodringsperioden opbevarer adipocytterne (dvs. de vigtigste celler i fedtvævet) det overskydende glukose og lipider, som et måltid leverer, til triglycerider. Under fastende, adipocytter nedbryde triglycerider i ikke-esterificerede fedtsyrer og glycerol at opretholde energibehovet i kroppen. Under udviklingen af fedme, fedtvæv udvide ved at øge størrelsen (hypertrophia) og / eller antallet (hyperplasi) af adipocytes1, at øge deres lagerkapacitet. Når udvidelsen af fedtvæv når sin grænse, en konstant meget varierende blandt patienter, de resterende lipider ophobes i andre metaboliskeorganer,herunder muskler oglever 3,4, fører til deres funktionelle svigt og indlede fedme-relaterede cardio-metaboliskekomplikationer 1,5. Derfor, identificere de mekanismer, der styrer fedtvæv ekspansion er en vigtig klinisk udfordring.
De morfologiske ændringer dokumenteret i fedtvæv under fedme er knyttet til dens patologiske dysfunktion. Flere farvning procedurer er blevet brugt til at beskrive væv organisation af fedtvæv, herunder actin6, vaskulæremarkører 7, lipid-dråbemarkører 8, og specifikke immuncelle markører9,10. Men på grund af den enorme diameter af adipocytter (50 til 200 μm)11, er det vigtigt at analysere en stor del af hele vævet i tre dimensioner for præcist at analysere de dramatiske strukturelle AT ændringer observeret under fedme. Men da lyset ikke trænger ind i et uigennemsigtigt væv, er billeddannelse i 3D i en stor vævsprøver ved hjælp af fluorescensmikroskopi ikke mulig. Metoder til vævsclearing for at gøre dem gennemsigtige er blevet rapporteret i litteraturen (til gennemgang, se12), så man kan rydde væv og udføre dybdegående, hele vævfluorescensmikroskopi. Disse metoder giver hidtil usete muligheder for at vurdere 3D cellulære organisation i sundt og syge væv. Hver af de beskrevne metoder har fordele og ulemper, og derfor skal nøje vælges afhængigt af det undersøgte væv (for en gennemgang, se13). Nogle metoder kræver faktisk en lang inkubationstid og/eller anvendelse af materialer eller forbindelser , der enten er dyre , giftige eller vanskelige atopnå 14,15,16,17,18,19. Drage fordel af en af de første forbindelser, der anvendes et århundrede siden af Werner Spalteholz at rydde væv20, vi oprettet en brugervenlig og billig protokol, der er meget velegnet til clearing af alle mus og menneskelige fedtvæv depoter i ethvert laboratorium med typisk udstyr, herunder en kemisk hætte, en temperatur-kontrolleret orbital shaker og en konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol blev testet og er valideret for alle mus og humane hvide fedtvæv depoter. Humane og mus fedtvæv blev indsamlet i overensstemmelse hermed til europæisk lovgivning og godkendt af franske og svenske etiske udvalg.
1. Fiksering af mus og humant hvidt fedtvæv
- Det høstede mus eller det hvide fedtvæv hos mennesker nedsænkes i mindst 10 ml PBS, der indeholder 4 % paraformaldehyd (PFA), nedsænkes i et 15 ml plastrør.
- Plastrøret rystes ved stuetemperatur på en rulleplade i 1 time.
- Lad plastrøret ved 4 °C være på en rulleplade natten over for at fuldføre fikseringen.
BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset til store fedtvævsprøver, såsom hele epididymale fedtpuder fra mus, der får en normal kost (≈250 mg - ≈0,6 cm3). For større prøver som epididymalfedtpuder fra mus, der har fået en diæt med højt fedtindhold (≈1,5 g - ≈4 cm3)eller vævsprøver hos mennesker selv om clearingprotokollen bør fungere perfekt for hele prøven (ved at opskalere PFA og antistofblandingerne), skærer vi generelt vævsstykker ca. 1 g (≈ 2,5 cm3)for at reservere de resterende prøver enten til yderligere farvning eller anvendelser. Til PFA (trin 1.1.) anbefaler vi at bruge ca. 10 gange vævets volumen. For antistofblandingerne (trin 3.1. og 3.4) skal du øge volumen for helt at nedsænke vævet og bruge et 15 ml plastrør (se materialetabel),hvis vævet er for stort til en 1,5 ml plastmikrorør (se materialetabel).
2. Permeabilization og mætning af mus og humant hvidt fedtvæv
- Skyl det faste hvide fedtvæv i 10 ml PBS i 5 min ved stuetemperatur for at fjerne alle spor af PFA.
- Væv i en 15 ml plastrør indeholdende 10 ml PBS suppleret med 0,3% glycin (se Tabel af materialer)og ryst røret ved stuetemperatur i en orbital shaker i 1 time ved 100 omdrejninger i minuttet (rpm) for at slukke de resterende frie aldehydgrupper.
- Vævet nedsænkes i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS suppleret med 0,2 % Triton X-100 (se materialetabel),og røret rystes ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalrysker i 2 timer ved 100 omdrejninger i minuttet.
- Vævet nedsænkes i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS suppleret med 0,2 % Triton X-100 og 20% DMSO (se materialetabel),og røret rystes ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalryker ved 100 omdr./min. natten over.
- Væv i en 15 ml plastrør indeholdende 10 ml PBS suppleret med 0,1% Tween-20 (se Tabel over materialer),0,1% Triton X-100, 0,1 % deoxycholat (se materialetabel)og 20 % DMSO, og røret rystes ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalshaser ved 100 omdrejninger i mindst 24 timer.
- Skyl vævet i et 15 ml plastrør indeholdende 10 ml PBS suppleret med 0,2% Triton X-100 og ryst røret ved stuetemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 1 time.
- Vævet nedsænkes i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS suppleret med 0,2 % Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA (se Materialetabel),og rørret ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalshaker ved 100 omdr./min. i 12 timer for at mætte alle steder, der ikke specifikt kan binde antistoffer.
BEMÆRK: I trin 2.7 kan BSA erstattes af blodserum af arten af det sekundære antistof, der anvendes.
3. Farvning procedure for mus og humane hvide fedtvæv
- Vævet overføres i en 1,5 ml mikrotube af plast, der indeholder 300 μL PBS suppleret med 0,2 % Triton X-100, 10 % DMSO, 3 % BSA og de primære antistoffer (10x mere koncentreret end til kryosektionsplejning, men optimal antistofkoncentration bør evalueres for hvert antistof). Røret beskyttes mod lys ved at dække med aluminiumsfolie og ryste røret ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalshaker ved 100 omdrejninger i mindst to dage (se bemærkningen i trin 1.1 og trin 3.7.1).
- Skyl vævet i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS suppleret med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA og ryst røret beskyttet mod lys ved 37 °C i en temperaturkontrolleret orbital shaker ved 100 rpm i 5 timer. Udfør dette trin to gange.
- Skyl vævet i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS suppleret med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA og ryst røret, beskyttet mod lys, ved 37 °C i en temperaturstyret orbital shaker ved 100 rpm i en nat til to dage.
- Vævet overføres til en 1,5 ml mikrotube af plast, der indeholder 300 μL PBS suppleret med 0,2 % Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA og de sekundære antistoffer (10x mere koncentreret end til krysinfektion). Røret beskyttes mod lys ved at dække med aluminiumsfolie og ryste røret ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalshaker ved 100 omdrejninger i mindst to dage (se bemærkningen i trin 1.1 og trin 3.7.1).
- Skyl vævet i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS suppleret med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, og 3% BSA og ryst røret, beskyttet mod lys, ved 37 °C i en temperaturstyret orbital shaker ved 100 rpm i 5 timer. Udfør dette trin to gange.
- Skyl vævet i et 15 ml plastrør indeholdende 10 ml PBS suppleret med 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA og ryst røret, beskyttet mod lys, ved 37 °C i en temperaturstyret orbital shaker ved 100 omdr./min. i en nat til to dage.
- Vævet skylles i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml PBS, og røret, der er beskyttet mod lys, rystes ved 37 °C i en temperaturstyret orbitalshaker ved 100 omdrejninger i 2 timer.
BEMÆRK: Til mærkning af specifikke strukturer såsom kerner eller actin tilsættes 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI eller tilsvarende), og/eller fluorescerende mærket-phalloidin skal tilføjes på trin 3.1. når der kun anvendes fluorescerende mærkede primære antistoffer, eller i trin 3.4. når der anvendes sekundære antistoffer.
BEMÆRK: Til farvningsproceduren kan primære antistoffer, der allerede er konjugeret med fluorokrom (som dem, der anvendes til flowcytometri), anvendes, og vi anbefaler det for at opnå tid og specificitet. Selv om primære museantistoffer kan anvendes efterfulgt af sekundære antimuseantistoffer, som vi viste det her, har vi ofte observeret ikke-specifik farvning af blodkar på grund af cirkulerende immunglobulin. For at undgå dette problem anbefales primære antistoffer, der allerede er mærket, derfor stærkt, og her fremlægger vi dokumentation for, at de antistoffer, der anvendes i flowcytometri, er forenelige med vores procedure. I det specifikke tilfælde med et antigen, der udtrykkes ved lave niveauer, er et signalforstærkningstrin via sekundære antistoffer imidlertid obligatorisk. når det eneste tilgængelige primære antistof er fremstillet i mus, kan en hjerteperfusion af musene med PBS i mindst 5 minutter ved ofringen fjerne en stor del af cirkulerende immunglobulin og dermed den ikke-specifikke farvning.
4. Clearing procedure for mus og humane hvide fedtvæv
- Væv i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml ethanol, nedsænkes i et 15 ml plastrør, der indeholder 10 ml ethanol, og røret rystes, beskyttet mod lys ved stuetemperatur i en orbitalrysker ved 100 omdrejninger i 2 timer.
- Væv i en 15 ml plastrør indeholdende 10 ml 70% ethanol og ryst røret, beskyttet mod lys, ved stuetemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Væv i en 15 ml plastrør indeholdende 10 ml 95% ethanol og ryst røret, beskyttet mod lys, ved stuetemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Væv i en 15 ml plastrør indeholdende 10 ml 100% ethanol og ryst røret, beskyttet mod lys, ved stuetemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm i 2 timer.
- Væv i en 15 ml plastrør indeholdende 10 ml 100% ethanol og ryst røret, beskyttet mod lys, ved stuetemperatur i en orbital shaker ved 100 rpm natten over.
- Væv i en 20 ml glasflaske nedsænkes med en plasthætte (se materialetabel), der indeholder 5 ml methylsalicylat (se materialetabel)under en kemisk hætte, og glasbeholderen rystes, beskyttet mod lys, ved stuetemperatur i en orbitalshaker ved 100 omdrejninger i mindst 2 timer.
BEMÆRK: Clearingproceduren kan fremskyndes betydeligt (om nødvendigt) ved at undgå trin 4.3. og 4.5., selv om den endelige clearingkvalitet ville blive reduceret en smule.
5.3D-confokal billeddannelse af renset hvidt fedtvæv
- Overfør vævet til et metallisk billedstofkammer, der er udstyret med en glasbund (se materialetabel)under en kemisk hætte, og fyld kammeret med frisk methylsalicylat.
BEMÆRK: For at fastgøre vævet og dermed forhindre det i at flyde eller bevæge sig sidelæns i kammeret skal der påføres flere 18 mm runde glasdæksler (se materialetabel)oven på vævet, når det monteres i kammeret. - Anvend billedkammeret på et omvendt konfokal mikroskop.
- Image vævet ved hjælp af en lav forstørrelse mål (f.eks 4x mål) til at generere et par cm3D kort over hele fedtvæv eller af det menneskelige væv prøve.
- Vælg flere områder til vævsprøvetagning ved højere forstørrelse. Brug typisk et 20x langdistanceluftmål, der giver et godt forhold mellem opløsning og dybde. Vi erhverver store mosaik billeder med z-stakke mellem 600 og 2000 μm dybde.
BEMÆRK: Brug en langdistance mål til at billedet dybere ind i vævet.
6. Udvinding af kvantitative resultater fra 3D fedtvævsbilleder
BEMÆRK: Segmenteringen af de forskellige strukturer og den efterfølgende udtrækning af de kvantitative oplysninger fra 3D-billedstakken, der genereres i punkt 5, kan udføres ved hjælp af en af de mange eksisterende billedanalysesoftwaremuligheder, enten kommercielle eller freeware. I de følgende punkter beskriver vi en strategi, der rutinemæssigt bruges i vores laboratorium til at udtrække kvantitative oplysninger fra 3D-fedtvævsbilleder ved hjælp af kommerciel software (se Tabel over materialer).
- Konverter 3D-stakkene til softwareformatet for at frigøre hukommelse.
- Segmenter cellerne.
- Åbn modulet Cell i softwaren.
- Skift indstillingen til celledetektering til plasmamembranfarvning.
- Vælg fluorescerende kanal for den markør, der anvendes til at afgrænse celleperiferi (falloidin, som etiketter kortikale actin eller plasma membran markører såsom F4/80 for makrofag, TCR-β for T-celler, eller klynge af differentiering CD proteiner specifikke for immuncelle undertyper).
- Konfigurer tærsklerne, og angiv en række forventede cellestørrelser (dvs. 1 til 200 μm til celledetektering).
- Kør segmenteringen. Der genereres en diskenhed, der svarer til z-stakken, med de segmenterede celler, der farvekodes med en anden farve for hver af de tilstødende celler.
- Anvende statistiske filtre (størrelse, rundhed, cirkularitet osv.) under fanen statistik for at udelukke segmenteringsartefakter og/eller for at forfine de segmenterede celler til den celle, der er af interesse, baseret på deres størrelse (dvs. 20-200 μm for adipocytter; 5-25 μm for makrofager; 1-3 μm for lymfocytter).
- Uddrage målinger og kvantitative data (volumen, antal, størrelse, diameter osv.) fra fanen Statistik.
- Segment cellulære komponenter (kerner, vesikler, osv.) eller fartøjer som en struktur.
BEMÆRK: Selvom filamentsegmenteringen er meget nyttig til at undersøge beholdernes konnektivitet, bruger vi segmenteringen af overflademodulet til at udtrække data om beholdernes størrelse, volumen og diametre. Kvantificeringen af fartøjernes størrelse går tabt ved brug af filamentmodulet.- Åbn Surface-modulet i softwaren.
- Vælg fluorescerende kanal for den markør, der bruges til specifikt at mærke den undercellekomponent, der skal rekonstruere den i 3D.
- Der opstilles tærskler, og der skal være en rækkevidde af konstruktionens forventede diameterstørrelse (dvs. 0,5-5 μm for kerner; 0-100 μm for beholdere osv.).
- Kør segmenteringen. Der genereres en diskenhed med den segmenterede mobilstruktur. Målinger og kvantitative data (volumen, antal, størrelse, diameter osv.) kan udtrækkes fra fanen Statistik.
- Beholderne segmenteres som et rørformet kontinuum.
BEMÆRK: Selvom filamentsegmenteringen er meget nyttig til at undersøge beholdernes konnektivitet, bruger vi segmenteringen af overflademodulet til at udtrække data om beholdernes størrelse, volumen og diametre. Kvantificeringen af fartøjernes størrelse går tabt ved brug af filamentmodulet.- Åbn softwarens filamentermodul.
- Vælg den fluorescerende kanal, der svarer til fartøjets farvning.
- Konfigurer tærsklerne for fluorescensintensiteten, og vælg det relevante antal forventede forbindelsesnoder.
- Kør segmenteringen. Filamenter, der repræsenterer fartøjsnettet, vil blive genereret i 3D. Målingerne kan udtrækkes fra statistikfanen, så der kan opnås kvantitative data, herunder fartøjets længde, antallet af fartøjsgrening osv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der er beskrevet her og opsummeret i figur 1, var vi i stand til at plette og optisk klart humant og mushvidt fedtvæv som beskrevet i henholdsvis figur 2A og figur 2B. Det clearede væv blev overført til det metalliske billeddannelseskammer for at udføre konfokal billeddannelse (figur 3A). Clearingen drastisk forbedret dybden af vævsbilleder, som vi var i stand til at erhverve(Figur 3B og Figur 3C). Hele fedtvæv kan erhverves i 3D ved lav forstørrelse ved hjælp af en 4x mål (se Supplerende Movie 1), at generere en 3D-kort, gør det muligt at vælge de forskellige områder, der skal erhverves ved høj forstørrelse ved hjælp af en 20x mål (Figur 3D). De høje forstørrelsesbilleder anskaffes i 3D med en dybde på 2 mm (Figur 3E).
Denne procedure gør det muligt at mærke en lang række generelle cellemarkører, herunder kerner, ved hjælp af DAPI og actin ved hjælp af fluorescerende mærket Phalloidin. Specifik farvning af lipiddråber og adipocytter kan opnås ved hjælp af perilipin antistof (se tabel over materialer; Figur 4A) og anti-glut4 antistof (se tabel over materialer; Figur 4B) Henholdsvis. Blodkar kan detekteres ved hjælp af enten CD31 antistof (se tabel over materialer; Figur 4C) eller ved intravenøs injektion af lectin-DyLight649 kort før museoffer (se materialetabel; Figur 4D). Makrofager og T-celler kan visualiseres ved hjælp af anti-CD301-PhycoErythrin antistof (se tabel over materialer; Figur 4D) og anti-TCR-β-Pacific Bleu-antistoffet (se materialetabel; Figur 4E). Det perifere nervenetværk kan detekteres ved hjælp af anti-tyrosin hydroxylase (TH) antistof (se tabel over materialer; Figur 4F-G). Desuden giver denne protokol mulighed for rydning af museepididymalt fedtvæv (Figur 4A-B,E), subskutant fedtvæv(figur 4D,G),musebrunt fedtvæv ( figur4F) og humant fedtvæv ( Figur4C). Ved hjælp af en kombination af disse mærkning og en kommerciel software (se tabel over materialer) til segment af disse markører, kan vi bestemme inden for fedtvæv i) adipocytter gennemsnitlige størrelse og størrelse distribution(Figur 5A-B)og ii) blodkar netværk tæthed (Figur 5C).
Figur 1: Resumé af clearingproceduren for hvidt fedtvæv. Mus eller menneskelige hvide fedtvæv er faste, permeabilized, mættet, farves og ryddet. Billeder er derefter erhvervet i 3D og analyseres ved hjælp af en kommerciel software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fotografier af hvidt fedtvæv. aA) Fotografi af humant hvidt abdominopelvic fedtvæv før og efter clearingproceduren. (B) Fotografi af museepididymalt hvidt fedtvæv før og efter lysningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forbedret billeddybde med fedtvævsclearing. AA) Montering af det metalliske billeddannende kammer udstyret med glasbund. (B) Z-serie billeder af mus epididymal hvid fedtvæv plettet med falloidin-Alexa488 (grøn) før og efter clearing. (C) XZ projektioner svarende til de hvide stiplede linjer på tværs af panelet B z-stack. D) Z-projektion på 0,4 cm z-stak af mus subkutan hvid fedtvæv plettet for actin ved hjælp af Phalloidin-Alexa488 og erhvervet ved lav forstørrelse med en 4x mål. De små billeder til højre blev erhvervet på den valgte vævsposition ved hjælp af et 20x mål. (E) Side visning af 3D volumen gengivelse af billedet z-stack fra ryddet mus hvid fedtvæv plettet med Phalloidin-Alexa488 erhvervet på samme måde som de 20x billeder fra (D). 3D-billeddiaddybden, der opnås ved vores højforstørrelsesprocedure, demonstreres her og understreges af en z-dybdefarvekodning (mørkeblå for z=0 mm til mørkerød for z=2 mm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mus og humant hvidt fedtvæv plettet for flere markører. (A) Enkelt plan billede af mus epididymal hvid fedtvæv farves for lipid dråber ved hjælp af anti-perilipin1 antistof og anti-mus-alexa647-konjugerede antistof. (B) Mosaik enkelt plan billede af musen epididymal hvid fedtvæv farves for kerner og adipocytter ved hjælp af DAPI, anti-Glut4 antistof og anti-mus-alexa647-konjugeret antistof. c) Z-fremskrivning på 600 μm z-stak af humant hvidt abdominopelvic fedtvæv, der farves for beholdere, der anvender CD31-alexa647-konjugeret antistof. D) Z-fremskrivning på 600 μm z-stak af museubkutant hvidt fedtvæv, der farves til beholdere og makrofager ved hjælp af lectin-DyLight649 intravenøse injektioner og anti-CD301-alexa555-antistof. Nederst til højre er et zoomet billede af den hvide prikkede boks. (E) Enkelt plan billede af mus epididymal hvid fedtvæv plettet for actin og T-celler ved hjælp af falloidin-Alexa488 og anti-TCRβ-Pacific blå-konjugerede. Nederst til højre er et zoomet billede af den hvide prikkede boks. (F)Z-projektion på 50 μm z-stack af musebrunt fedtvæv, der farves til kerner og neuronalt netværk ved hjælp af DAPI, anti-TH antistof og anti-kanin-alexa647-konjugeret antistof. g) Z-projektion på 600 μm z-stak af museubkutant hvidt fedtvæv, der farves til kerner og neuronalt netværk ved hjælp af DAPI, anti-TH antistof og anti-kanin-alexa647-konjugeret antistof. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Analyse af 3D-billeder ved hjælp af kommercielt tilgængelig software (se materialetabel). (A) 3D-volumengengivelse af humane adipocytter segmenteret i 3D ved hjælp af kommercielt tilgængelig software. Hver adipocyt har en anden farve til sin kontakte tilstødende adipocytter. Fartøjerne er repræsenteret med rødt. (B) Størrelse kvantificering og fordeling af adipocytter fra 3D volumen gengivelse af panel A, som indeholder omkring 20.000 adipocytter. cC) 3D-volumengengivelse af blodkar, der er segmenteret i 3D ved hjælp af kommercielt tilgængelig software og repræsenteret med rødt eller gult for henholdsvis store og små kar. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Movie 1: 3D volumen gengivelse af hele subkutan hvid fedtvæv vist i figur 3D. Den hvide boks repræsenterer en 2 cm3 terning. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ændringer, der opstår inden for fedtvævet i løbet af patologisk progression, såsom fedme, er afgørende for forståelsen af mekanismerne bag patologien. Banebrydende undersøgelser, der afslørede sådanne mekanismer i fedtvæv har været baseret på globale tilgange såsom hele fedtvæv proteomics21, flow cytometri22,23, og transskriptomics24,25. Desuden er der gjort en indsats for at undersøge de strukturelle ændringer , der sker i fedtvæv ved hjælp af histologiskeanalyser 26,27,28,29. Men analysen af 5-10 μm fedtvæv sektioner, på grund af den begrænsede størrelse af afsnittet, begrænser evnen til at værdsætte vigtige strukturelle træk. For det første er kun nogle få adipocyt kerner påviselige pr. sektion, da hver sektion kun repræsenterer en lille del af adipocytterne (1/10th). For det andet er størrelsen af de adipocytter, der er anslået fra fedtvævssektioner, unøjagtig, fordi de fleste adipocytter skæres under eller bag deres ækvator, hvilket fører til en forudindtaget (under)måling af deres gennemsnitsstørrelse. For det tredje, blodkar og nerve fiber kontinuum er tabt under fysisk sektion. For det fjerde er fordelingen af hver undertyper af immunceller i vævet vanskelig at fastslå, fordi de tredimensionale koordinater går tabt. I denne sammenhæng giver den metode, vi foreslår her, ethvert standardlaboratorium mulighed for at afbilde menneske- og musehvidt fedtvæv i tre dimensioner på en enkel og billig måde.
Denne metode har nogle begrænsninger. For det første er den tid, der kræves for at forberede vævet (fiksering, permeabilisering, farvning, clearing) lang (mere end en uge). Dette ville være vanskeligt at reducere, fordi størstedelen af denne tid er nødvendig for at plette vævet. Udbredelsen af antistoffer i så store vævsprøver kræver lange inkubationstider. En reduktion af inkubationstiden ville øge risikoen for ikke-homogen antistofindtrængning, hvilket ville føre til farvningsartefakter. Derfor er det eneste mulige vindue til at få tid og forkorte proceduren er den tid dedikeret til at rydde vævet, som tager omkring en dag, hvor optimale resultater er påkrævet, men dette kan reduceres til en halv dag uden et dramatisk fald i kvaliteten. Den anden begrænsning er den sandsynlige svind af vævet. Faktisk, i enhver protokol, der dehydrerer væv ved hjælp af opløsningsmidler, er det sandsynligt, at vævene skrumpe på grund af fjernelse af vand. Estimering af denne svind er altid udfordrende, og det er næsten umuligt her, fordi kanten af vævet bliver gennemsigtig, når lipider begynder at blive udvundet under dehydreringsprocessen. Derfor, størrelsen skøn af de clearede væv skal fortolkes med forsigtighed. Sammenligning af ændringer i adipocytstørrelser eller karlængde mellem væv afledt af mus med forskellige genotyper og/eller underkastet forskellige miljøforhold er dog fortsat informative11. Den sidste begrænsning er knyttet til den store mængde af hele musen fedtvæv eller af en stor human fedtvæv kirurgisk prøve. Selv om protokollen er perfekt tilpasset til at rydde disse store prøver, er billeddannelse et helt organ udfordrende med et konfokal mikroskop. Strategien for at løse dette problem og udnytte det fulde potentiale af hele organclearingproceduren er at erhverve et 3D-kort med lav forstørrelse over hele organet ved hjælp af et 4x-mål og at udvælge specifikke områder, der er tilfældigt spredt i vævet, hvor der kan erhverves højere forstørrelse 3D-billeder ved hjælp af et 20x langdistancemål. Opsætningen med "høj forstørrelse" gør det muligt at billedre vævsvolumen på ca. 45 mm3 (4,7 x 4,7 x 2 mm). Selv om dette volumen er begrænset i forhold til mængden af hele organet (0,5 til mere end 4 cm3),gentage erhvervelser på flere positioner i vævet giver os mulighed for at opnå en god prøveudtagning af vævet på cellulære til sub-cellulære opløsning. Bemærk, at billeddannelse store væv vil generere en betydelig mængde af billeddannelse data, der skal lagres.
Proceduren har betydelige forskelle i forhold til metoder , der tidligere er blevet beskrevet for at rense fedtvæv14,30. Først og fremmest, i modsætning til AdipoClear, der bruger methanol, dichlormethan, og dibenzylether14, den metode, der præsenteres her bruger ethanol til dehydrering og methylsalicylat til clearing. Derfor er proceduren sikrere, fordi den udnytter mindre giftige clearingopløsningsmidler, der ofte anvendes af fødevare-/drikkevareforarbejdningsindustrien (ethanol og methylsalicylat), sammenlignet med den høje toksicitet af dichlormethan, methanol og dibenzylether. Desuden er fremstillingen af vævet i henhold til protokollen er to dage hurtigere end AdipoClear protokol14. For nylig, en anden metode blev foreslået af Li og kolleger til at rydde fedtvæv stykker ved at nedsænke dem i glycerol30. Denne protokol er meget enkel selv i forhold til denne procedure, og kvaliteten af billederne er god selv ved høj forstørrelse. Men denne clearing protokol virker kun effektivt, når du bruger 2 mm3 fedtvæv stykker. Trækning af vævet i disse små prøver før clearingproceduren forhindrer en fra billeddannelse væv mængder større end 2 mm3 selv ved lav forstørrelse. Proceduren præsenteres her tillader kortlægning af hele vævet i 3D ved lav forstørrelse og erhvervelse af 3D stakke af billeder omkring 45 mm3 på flere kendte positioner i hele ryddet fedtvæv ved høj forstørrelse.
Denne procedure kan have flere fremtidige programmer. Som med enhver anden metode kan den procedure, der er beskrevet her, forenkles og/eller optimeres yderligere. Et interessant fremskridt for proceduren kunne komme fra kombinationen af clearingprocessen, beskrev vi, med yderligere billeddannelsesmetoder. F.eks. er specifikke billeddannelsesopsætninger, såsom optisk projektionstomografi (OPT), total intern refleksionsfluorescensmikroskopi (TIRF), spim-mikroskopi (Selective Plan Illumination Microscopy) eller mikroskopi med stimuleret emissionsudtømning (STED), i princippet forenelige med proceduren, selv om dette vil begrænse dens anvendelighed på de laboratorier, der er udstyret med disse systemer. Alternativt, ved hjælp af et mål med en høj numerisk blænde indeks og en erhvervelse system, der er i stand til at erhverve hundredvis af billeder per sekund, som findes i mange laboratorier, kunne man udføre super-opløsning analyser ved hjælp af Super Resolution Radial Udsving (SRRF) efterbehandling billedanalyse freeware31. Interessant, klassisk fluorochromes er tilpasset til SRRF analyse, som ville gøre det muligt 3D super-opløsning analyser af hele menneskelige og mus hvide fedtvæv.
Mange kritiske trin i protokollen er relateret til vævsbehandling før selve clearingen. Først og fremmest, og som for klassiske histologiske analyser, fiksering skridt er grundlæggende. I tilfælde af svag fiksering bevares strukturelle egenskaber ikke, mens udvidet fiksering fører til krydslinking og blokering af specifikke antigenområder og deraf følgende ikke-homogen immunfarvning. Et andet følsomt skridt er farvning af vævet, som præsenterer flere kritiske punkter, som vi vil beskrive nedenfor. For det første skal antistofferne valideres ved at teste dem på kryostatsektioner for at bekræfte, at de er funktionelle, og for at bestemme deres optimale koncentration. Den endelige koncentration, der anvendes til clearingproceduren, er ti gange den optimale koncentration for kryostatsektionerne. For det andet er tidspunktet for inkubation også kritisk på grund af vævets størrelse. En inkubationstid, der er for kort, vil give svag eller ikke-homogen immunstaining (f.eks. korrekt farvning i vævs periferi, men ingen indre farvning). På samme måde vil vasketrin, der er for korte, forhindre, at ikke-specifikt bundne antistoffer fjernes fra vævet, hvilket fører til ikke-specifik farvning. Så langt du ved, forringer udvidet inkubation af vævet med antistoffer ikke farvningen. Derfor anbefaler vi på det kraftigste lange inkubations- og vaskeperioder. For det tredje skal valget af fluorromet tilpasses det interessesignal, der er tale om. I vævsprøver i almindelighed, og især hvidt fedtvæv, kan ikke ubetydelig autofluorescens påvises ved 488 nm og 555 nm. For højt udtrykte proteiner er dette ikke et problem, og farvning vil fungere godt i disse kanaler. Men for proteiner med lavt udtryk anbefaler vi på det kraftigste brugen af vidtrøde fluorokrom. For clearing, er der ingen kritiske skridt, da metoden er meget enkel. Husk, at methylsalicylat ikke er kompatibelt med plastmaterialer, derfor anbefaler vi glasflasker til lysningstrinnene og et metallisk kammer udstyret med en glasbund til at udføre billeddannelsen. Alternativer til denne montering procedure findes ved hjælp af i) en normal glas dias, dental harpiks og glas coverslip (til at generere et lille glas kammer), eller ii) et glas petriskål (for opretstående mikroskop opsætninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af INSERM, Université Côte d'Azur, og ved tilskud fra det franske nationale forskningsagentur (ANR) gennem investeringer for fremtiden Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes" og Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) og Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi takker også Imaging Core Facility i C3M, der finansieres af Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, og som også støttes af IBISA-mikrokopi- og billedplatformen Côte d'Azur (MICA). Vi takker Marion Dussot for teknisk hjælp i vævspræparat. Vi takker Abby Cuttriss, UCA International Videnskabelig synlighed, for korrekturlæsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microtubes | Eppendorff tubes - Dutscher | 33528 | |
| 15 mL plastic tubes | Falcon tubes - Dutscher | 352096 | |
| 18 mm round glass coverslip | Mariendfeld | 0117580 | |
| 20 mL glass bottle | Wheaton | 986546 | |
| anti-mouse-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-605-150 | Dilution: 1/100 |
| anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Dilution: 1/100 |
| BSA | Sigma-aldrich | A6003 | |
| CD301-PE antibody | Biolegend | BLE145703 | Dilution: 1/100 |
| CD31 antibody | AbCam | ab215912 | Dilution: 1/50 |
| Commercial 3D analysis software - IMARIS | Oxford instrument | with Cell module | |
| Confocal microscope - Nikon A1R | Nikon | ||
| Dapi | ThermoFisher | D1306 | Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000 |
| Deoxycholate | Sigma-aldrich | D6750 | |
| DMSO | Sigma-aldrich | D8418 | |
| Glut4 antibody | Santa Cruz | sc-53566 | Dilution: 1/50 |
| Glycine | Sigma-aldrich | G7126 | |
| Lectin-DyLight649 | Vector Lab | DL-1178-1 | Stock Concentration : 2 µg/µL; IV Injection: 50 µL/mice |
| Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber | Thermofisher | A7816 | |
| Methyl salicylate | Sigma-aldrich | M6752 | |
| Perilipin antibody | Progen | 651156 | Dilution: 1/50 |
| Phalloidin-alexa488 | ThermoFisher | A12379 | Dilution: 1/100 |
| TCR-β-PB antibody | Biolegend | BLE109225 | Dilution: 1/100 |
| TH antibody | AbCam | ab112 | Dilution: 1/50 |
| Triton X100 | Sigma-aldrich | X100 | |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | P416 |
References
- Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues. Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).
- Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk. Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).
- Mittendorfer, B. Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).
- Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity. Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).
- Vergoni, B., et al. DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Zwick, R. K., et al. Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation. Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).
- Zhang, L., et al. The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice. Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).
- Yang, H., et al. Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance. Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).
- Laforest, S., et al. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity. 25 (1), Silver Spring. 122-131 (2017).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY. Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Experimental & Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).
- Zhang, Y., et al. 3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy. Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).
- Ke, M. T., Imai, T. Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB. Current Protocols in Neuroscience. 66, Unit 2 22 (2014).
- Hahn, C., et al. High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO). Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Präparaten und Seine Theoretischen. Hierzel, S. , Leipzig. (1911).
- Shields, K. J., Wu, C.
- Bourlier, V., et al. Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages. Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).
- Hill, D. A., et al. Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).
- Acosta, J. R., et al. Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 250 (2017).
- Coppack, S. W.
- Cancello, R., et al. Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss. Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).
- Cinti, S. Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ. Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue. Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).
- Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).
- Gustafsson, N., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nature Communication. 7, 12471 (2016).
