Summary
تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو حل حساس وسريع للكشف عن المتغير الجيني. ذلك يعتمد على الاختلافات التسلسل التي تؤدي إلى تغيير شكل heteroduplexes منحنى ذوبان. من خلال تمشيط HRM و agarose هلام الكهربائي، يمكن تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية مثل indels.
Abstract
تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو وسيلة قوية لل genotyping والمسح الجيني الاختلاف. تعتمد معظم تطبيقات إدارة الموارد البشرية على تشبع أصباغ الحمض النووي التي تكشف عن اختلافات التسلسل ، واللاتيرودوبلس التي تغير شكل منحنى الذوبان. وهناك حاجة إلى دقة ممتازة للصك وبرامج خاصة لتحليل البيانات لتحديد الاختلافات الصغيرة في منحنى الذوبان التي تحدد متغيرا أو نمطا جينيا. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد للمرضى الذين يعانون من مرض معين ، وخاصة السرطان وفي جين CALR في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية النقوية السالبة للكروموسوم في فيلادلفيا. يمكن الكشف عن التغيرات النيوكليوتيدات واحد، الإدراج و / أو الحذف (indels) في الجين من الفائدة من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويستند تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية في الغالب على الضوابط المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية QPCR. ومع ذلك ، مع زيادة طول المنتج ، يصبح الفرق بين منحنيات البرية والهتيروزيجوتي أصغر ، ونوع المتغير الجيني أكثر صعوبة في تحديده. لذلك ، حيث indels هي البديل الجيني السائد المتوقع في جين الاهتمام ، يمكن استخدام طريقة إضافية مثل إلكتروفورسيس هلام الآغاروز لتوضيح نتيجة إدارة الموارد البشرية. في بعض الحالات، يجب إعادة فحص/إعادة تشخيص نتيجة غير حاسمة من خلال تسلسل سانجر القياسي. في هذه الدراسة بأثر رجعي، طبقنا هذه الطريقة على JAK2 V617F-المرضى الذين يعانون من MPN.
Introduction
تم التعرف على المتغيرات الوراثية الجسدية في جين السعرات الحرارية(CALR)في عام 2013 في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية (MPN) مثل تجلط الدم الأساسي والتليف النقوي الأولي1،2. ومنذ ذلك الحين، تم اكتشاف أكثر من 50 متغيرا جينيا في جين CALR، مما أدى إلى تحول إطاري +1 (−1+2)3. المتغيران الجينيان الأكثر شيوعا في CALR هما حذف 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46))، وتسمى أيضا طفرة من النوع 1، وإدخال 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47))، وتسمى أيضا طفرة النوع 2. يمثل هذان المتغيران الجينيان 80٪ من جميع المتغيرات الجينية CALR. وقد صنفت الأخرى على أنها نوع 1-مثل أو نوع 2-مثل استخدام خوارزميات على أساس الحفاظ على الحلزون α قريبة من نوع البرية CALR4. هنا، نقدم واحدة من الطرق الحساسة للغاية والسريعة للكشف عن المتغير الجيني CALR، وطريقة تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM). تمكن هذه الطريقة من الكشف السريع عن المتغيرات الجينية من النوع 1 والنوع 2 ، والتي تمثل غالبية طفرات CALR 5. وقدم إدارة الموارد البشرية في تركيبة مع الوقت الحقيقي »تفاعل البوليميراز المتسلسل« (qPCR) في عام 1997 كأداة للكشف عن طفرة في عامل V لايدن6. بالمقارنة مع تسلسل سانجر الذي يمثل تقنية المعيار الذهبي ، فإن إدارة الموارد البشرية هي طريقة أكثر حساسية وأقل تحديدا5. طريقة إدارة الموارد البشرية هي طريقة فحص جيدة تمكن من التحليل السريع لعدد كبير من العينات مع فائدة كبيرة من حيث التكلفة5. وهو أسلوب PCR بسيطة يؤديها في وجود صبغة الفلورسنت ولا تتطلب مهارات محددة. فائدة أخرى هي أن الإجراء نفسه لا يضر أو يدمر العينة التي تم تحليلها التي تسمح لنا بإعادة استخدام العينة لتسلسل الكهربائي أو سانجر بعد إجراء إدارة الموارد البشرية7. العيب الوحيد هو أنه من الصعب في بعض الأحيان تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك، لا تكتشف إدارة الموارد البشرية الطفرة الدقيقة في المرضى الذين يعانون من طفرات غير من النوع 1 أو النوع2 8. في هؤلاء المرضى، ينبغي تنفيذ تسلسل سانجر(الشكل 1).
وتستند إدارة الموارد البشرية على تضخيم منطقة الحمض النووي المحددة في وجود صبغة فلورية الحمض النووي المشبعة ، والتي يتم دمجها في الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA). تنبعث من الصبغة الفلورية ضوء عند دمجها في dsDNA. بعد زيادة تدريجية في درجة الحرارة، dsDNA ينهار إلى الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل، والتي يمكن الكشف عنها على منحنى ذوبان كانخفاض مفاجئ في كثافة الفلورية. يعتمد شكل منحنى الذوبان على تسلسل الحمض النووي الذي يستخدم للكشف عن الطفرة. تتم مقارنة منحنيات ذوبان العينات بمنحنيات ذوبان الطفرات المعروفة أو CALR البرية. تمثل منحنيات الذوبان المتميزة طفرة مختلفة غير من النوع 1 أو النوع 29.
خوارزمية الكشف عن المتغير الجيني الجسدي في الجين CALR بواسطة إدارة الموارد البشرية، أجاروز هلام electrophoresis وطريقة التسلسل(الشكل 1)تم استخدامها والتحقق من صحتها في الدراسة بأثر رجعي نشرت قبل10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة الأخلاقيات الطبية في جمهورية سلوفينيا على الدراسة. وكانت جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي.
1. الفلورسينس القائم على الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) وتحليل ما بعد qPCR من قبل إدارة الموارد البشرية
- Resuspend التمهيديات المدرجة في جدول المواد إلى 100 ميكرومتر مع عقيمة، RNase و DNase الحرة H2O (انظر جدول المواد). جعل 10 ميكرومتر عمل تركيز التمهيدي. تم نشر المبرمجين المستخدمة في البروتوكول قبل2.
- الكمية المحببة الحمض النووي من قبل طريقة تلطيخ مضان بعد تعليمات الشركة المصنعة11 (انظر جدول المواد). إعداد محلول الحمض النووي 20 نانوغرام / μL باستخدام 10 mM تريس-Cl، 0.5 mM EDTA، درجة الحموضة 9.0 (انظر جدول المواد).
- بالإضافة إلى عينات الحمض النووي، وإعداد ما لا يقل عن ثلاثة ضوابط الحمض النووي: اثنين من الضوابط الإيجابية مع NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46) (حذف 52 bp أو طفرة من النوع 1)، و NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47) (إدخال 5 bp أو نوع 2 طفرة) متغير جيني، بالإضافة إلى الحمض النووي البري والتحكم السلبي كتحكم غير قالب (NTC).
ملاحظة: قبل تنفيذ إعداد إدارة الموارد البشرية، تأكد من معايرة أداة qPCR لتجارب إدارة الموارد البشرية.
- بالإضافة إلى عينات الحمض النووي، وإعداد ما لا يقل عن ثلاثة ضوابط الحمض النووي: اثنين من الضوابط الإيجابية مع NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46) (حذف 52 bp أو طفرة من النوع 1)، و NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47) (إدخال 5 bp أو نوع 2 طفرة) متغير جيني، بالإضافة إلى الحمض النووي البري والتحكم السلبي كتحكم غير قالب (NTC).
- إعداد qPCR HRM ماجستير ميكس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد)على النحو التالي: 10 ميكرولتر من 2x qPCR ماجستير ميكس مع صبغ، 0.2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي، 0.2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر عكس التمهيدي، 8.6 ميكرولتر من العقيمة، RNase و DNase الحرة H2O. استخدام التمهيديات من جدول المواد. تشغيل ثلاث نسخ متماثلة لكل عينة الحمض النووي والتحكم.
- إعداد qPCR HRM ماجستير ميكس وفقا لعدد من العينات التي يجري تجهيزها. قم بتضمين حجم زائد لا يقل عن 10٪ في الحسابات لتوفير حجم زائد للخسارة التي تحدث أثناء عمليات نقل الكاشف.
- مزيج محتويات رد الفعل عن طريق التنصت بلطف وعكس الأنبوب والدوامات لمدة 2-3 ق. جمع جميع قطرات متناثرة من جدار الأنبوب إلى أسفل من قبل تدور وجيزة.
- إعداد لوحة رد فعل مناسبة للآلة وتجربة إدارة الموارد البشرية (انظر جدول المواد). نقل 19 ميكرولتر من qPCR HRM ماجستير ميكس إلى الآبار المناسبة من لوحة رد الفعل البصري 96 جيدا.
- Pipet 1 ميكرولتر من الضوابط السلبية، والضوابط الإيجابية، وعينات في الآبار المناسبة من لوحة رد الفعل البصري. بالنسبة للمجلس الوطني الانتقالي، نقل 1 ميكرولتر من المعقمة، RNase و DNase الحرة H2O المستخدمة لإعداد qPCR HRM ماجستير ميكس بدلا من الحمض النووي.
- ختم لوحة رد الفعل مع فيلم لاصق البصرية. القيام بذلك بحزم لمنع التبخر أثناء التشغيل. تأكد من أن الفيلم اللاصق البصري هو الطائرة عبر جميع الآبار في لوحة رد الفعل لضمان الكشف عن مضان الصحيح.
- تدور لوحة رد الفعل في 780 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 دقيقة. تأكد من أن السائل في الجزء السفلي من الآبار في لوحة رد الفعل. تابع تشغيل المقايسة.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين لوحة في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة. السماح للوح المخزنة في 4 درجة مئوية لتدفئة لRT، ومن ثم تدور لوحة لفترة وجيزة قبل تشغيله. - وفقا لتعليمات الشركة المصنعة إعداد وبدء تشغيل لتضخيم وذوبان الحمض النووي وتوليد بيانات مضان إدارة الموارد البشرية في صك qPCR. في برنامج نظام الأجهزة، قم بتعيين عناصر التحكم والعينات إلى الآبار المناسبة.
- للكشف عن المتغير الجيني CALR، قم بتغيير بروتوكول تضخيم الأداة الافتراضية وتضخيم الحمض النووي باستخدام بروتوكول الدراجات الحرارية التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 50 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ق و 62.5 درجة مئوية لمدة 60 s.
- قم بتنفيذ مرحلة المنحنى/التفكك الذائب (HRM) مباشرة بعد qPCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة12 على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، و60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم معدل منحدر قدره 0.025 درجة مئوية / ثانية حتى 95 درجة مئوية. عقد درجة الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و 60 درجة مئوية لمدة 15 s.
- ينتهي التشغيل تلقائيا. أولا، مراجعة و التحقق من مؤامرة التضخيم (الشكل 2).
- في قائمة التجارب لبرنامج نظام الأجهزة، حدد خيار مخطط التضخيم. إذا لم يتم عرض أية بيانات، فانقر فوق الزر الأخضر تحليل.
- في علامة التبويب مخطط التضخيم، من القائمة المنسدلة لنوع الرسم، حدد الرسم الذي يعرض بيانات التضخيم كقراءات الفلورية الخام التي تم تطبيعها إلى الفلورسينس من المرجع السلبي (ΔRn) كدالة لرقم الدورة (ΔRn vs Cycle). في القائمة المنسدلة لون الرسم، حدد نموذج.
- من القائمة المنسدلة لنوع الرسم البياني، حدد نوع الرسم البياني التضخيم الخطي. إظهار دورة بداية ونهاية الأساس على الرسم البياني التضخيم الخطي عن طريق تحديد خيار بدء الأساس. تحقق من تعيين الأساس بشكل صحيح. يجب تعيين دورة النهاية قبل بضع دورات من رقم الدورة حيث يتم الكشف عن إشارة فلورية كبيرة. وعادة ما يتم تعيين خط الأساس من 3 إلى 15 دورة(الشكل 2).
- من القائمة المنسدلة لنوع الرسم البياني، حدد نوع الرسم البياني لتضخيم اللوغاريتم10. إظهار خط العتبة على الرسم البياني عن طريق تحديد خيار العتبة. ضبط العتبة وفقا لذلك إذا لم يتم تعيين بشكل صحيح. وتعني عتبة المجموعة بشكل صحيح أن خط العتبة يعبر المرحلة الأسية لمنحنيات qPCR(الشكل 2).
- تحقق من أن منحنيات التضخيم العادية موجودة في جميع آبار التحكم العينة والإيجابية. تحقق من عدم وجود تضخيم في آبار المجلس الانتقالي قبل الدورة 40. تظهر مؤامرة التضخيم الطبيعية زيادة أسية في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35(الشكل 2). استبعاد عينات الآبار من التحليل إذا لم يكن هناك تضخيم في وضع البئر.
ملاحظة: إذا كانت مؤامرة تضخيم تبدو غير طبيعية أو يشير جيدا NTC التضخيم، تحديد وحل المشكلة وفقا لدليل الشركة المصنعة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. - استبعاد القيمة المتطرفة مع دورة القياس الكمي (Cq) التي تختلف عن التكرارات بأكثر من 2 في برنامج نظام الأجهزة12. قد تنتج القيم المتطرفة نتائج خاطئة MM.
- في منحنيات ذوبان المشتقة، راجع مناطق ما قبل وما بعد الذوبان/ خطوط درجة الحرارة. وينبغي أن تكون المناطق ما قبل وما بعد ذوبان داخل منطقة مسطحة حيث لا توجد قمم كبيرة أو المنحدرات في مستويات الفلورسنت(الشكل 3). إذا لزم الأمر ضبطه وفقا لذلك. إعداد بداية وتوقف خطوط درجة الحرارة قبل وبعد ذوبان ما يقرب من 0.5 درجة مئوية وبصرف النظر عن بعضها البعض(الشكل 3). أعد تشغيل التحليل إذا تم ضبط المعلمات بالنقر فوق الزر تحليل.
- في علامة التبويب رسم الفرق، في علامة التبويب إعدادات الرسم، اختر أحد أنواع التحكم البرية (homozygote) التي يتم نسخها نسخا متماثلا كالحمض النووي المرجعي وإعادة تشغيل التحليل بالنقر على زر التحليل.
- في علامة التبويب المنحنيات ذوبان محاذاة، تأكد من أن جميع الضوابط الإيجابية لديها النمط الجيني الصحيح وفشل المجلس الانتقالي لتضخيم(الشكل 4). من جدول البئر، حدد الآبار التي تحتوي على عنصر تحكم إيجابي لتسليط الضوء على منحنى الذوبان المقابل في مؤامرات التحليل. تأكد من أن لون الخط يتوافق مع النمط الجيني الصحيح. كرر الخطوات للالآبار التي تحتوي على عناصر التحكم الإيجابية الأخرى و NTC.
- في علامة التبويب منحنيات الذوبان المنحازة، راجع بعناية يعرض مؤامرة لعينات غير معروف ومقارنتها يعرض مؤامرة لضوابط (الشكل 4). من الجدول البئر، حدد الآبار التي تحتوي على نماذج نسخ متماثلة غير معروفة، والتحقق من لون منحنى ذوبان ومحاذاتها مع عناصر التحكم في تسلسل أمر عن طريق تحديد الآبار التي تحتوي على ضوابط إيجابية واحدا تلو الآخر. كرر العملية لكافة العينات غير معروف.
ملاحظة: يحتوي النموذج غير معروف متغير أحد عناصر التحكم إذا منحنى انصهار به هو محاذاة بإحكام إلى ذلك. يمكن عرض مجموعات متغير مختلفة (ألوان مختلفة) مما يشير إلى أن العينة غير معروف يتكون من متغير غير معروف، لا تتوافق مع عناصر التحكم(الشكل 8). يمكن أن يكون هناك مستوى منخفض من المتغير الوراثي الجسدي في عينة المريض. وهذا يمكن أن يؤثر على تفسير نتيجة إدارة الموارد البشرية، لا سيما عند حد الكشف عن المقايسة(الشكل 9). في هذه الحالات، يمكن أن يشبه لون الخط أو حتى شكله بشكل كبير لون النمط الجيني البري.- عندما تكون النتيجة غير حاسمة، والجمع بين نتائج إدارة الموارد البشرية مع نتائج الكهروفورسيس هلام agarose وطرق التسلسل. إعادة اختبار العينة أو طلب وإعادة اختبار عينة جديدة إذا لزم الأمر.
- راجع بعناية مجموعة البيانات الخاصة بالمنحنيات المتماثلة وتحقق من أن محاذاة كل نسخة متماثلة داخل المجموعة ضيقة. استبعاد النسخ المتماثل إذا لم محاذاة بإحكام مع العينات الأخرى في المجموعة (شاذ). إعادة اختبار العينة إذا كان هناك المزيد من القيم المتطرفة والنتائج غير حاسمة. كن على علم بأن كمية ونوعية عينة الحمض النووي تؤثر على نتائج إدارة الموارد البشرية.
- تحليل النتيجة لعينة غير معروف في علامة التبويب رسم الفرق. كرر الإجراء الموضح في الخطوة 1.21 وتحقق من أن النتائج التي تم الحصول عليها للعينة غير معروف هي نفسها.
- ثم قم بتشغيل منتجات إدارة الموارد البشرية qPCR على هلام الآغاروز.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين لوحة في 4 °C لمدة لا تزيد عن 24 ساعة أو في -20 درجة مئوية لفترة أطول ولكن لا يزيد عن 7 أيام. السماح للوح المخزنة في 4 درجة مئوية لتدفئة لRT، ومن ثم تدور لوحة لفترة وجيزة قبل تشغيله. السماح للوح المخزنة في - 20 درجة مئوية لذوبان ودافئة لRT، ومن ثم تدور لوحة لفترة وجيزة قبل تشغيله.
2. أجاروز هلام الكهربائي
- تشغيل منتجات QPCR HRM على هلام agarose قبل المدلى بها 4٪ تحتوي على وصمة عار حمض النووي الفلورية باستخدام نظام الكهربائي هلام المناسبة (انظر جدول المواد، الشكل 5). تشغيل واحد فقط موجبة سالبة NTC و نموذج qPCR HRM النسخ المتماثل.
ملاحظة: يجب دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع المواد الهلامية. أي نظام آخر هلام electrophoresis يمكن تحقيق هذا الغرض إذا تم اختيار ما يعادل نسبة agarose، وصمة عار الحمض النووي الفلورية وشكل جيدا. - تشغيل نظام الجل الكهربائي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). إزالة هلام ما قبل المدلى بها في كاسيت من الحزمة، وإزالة المشط وإدراجه في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
ملاحظة: قم بتحميل الجل خلال 15 دقيقة من فتح الحزمة. - تمييع عينة 10 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر مع العقيمة، RNase و DNase الحرة H2O. تحميل كل بئر مع 20 ميكرولتر من عينة مخففة.
- تمييع 3 ميكرولتر من محلول قياس حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر مع العقيمة، RNase و DNase الحرة H2O (انظر جدول المواد). تحميل M جيدا مع 20 ميكرولتر من محلول معيار حجم الحمض النووي المخفف (الشكل 6).
- ملء أي آبار فارغة مع 20 ميكرولتر من العقيمة، RNase و DNase مجانا H2O.
- حدد البرنامج فورا وفقا للنسبة المئوية من الجل الذي يتم تشغيله وتعيين وقت التشغيل على الجهاز إلى 10 دقائق.
- بدء الكهربية في غضون 1 دقيقة من عينة التحميل عن طريق الضغط على زر GO. يمكن تمديد وقت التحليل الكهربائي إذا تم الحصول على دقة غير كافية.
ملاحظة: لا تتجاوز الحد الأقصى الموصى به من وقت تشغيل الكهروضوئية Agarose وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. - عند اكتمال الكهربائي، تصور الحمض النووي في هلام باستخدام الضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية transillumination. تصور وتحليل وتخزين الصور الكهربائي ويتم معظمها بواسطة صور هلام مع نظام توثيق الصور(الشكل 5).
- تحليل وتفسير تصور qPCR نمط هلام منتجات إدارة الموارد البشرية من خلال مقارنة نتائج العينة غير معروف لضوابط إيجابية (الشكل 7 والشكل 8).
- إذا كانت العينة غير معروفة HRM وهلام electrophoresis النتائج تشير إلى أن البديل الجيني غير معروف موجود، تسلسل المنتج QPCR إدارة الموارد البشرية باستخدام التمهيديات الموصوفة في جدول المواد وفقا للبروتوكول وصف13.
تنبيه: يجب التخلص بشكل صحيح من المواد الهلامية الآغاروز التي تحتوي على وصمة حمض النيوكليك الفلورية لكل لوائح المؤسسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إن منطقة الحمض النووي التي تم تضخيمها بنجاح مع زيادة هائلة في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35 والقيم الضيقة للغاية لدورة القياس الكمي (Cq) في جميع العينات والضوابط المكررة(الشكل 2)هي شرط أساسي لتحديد المتغيرات الجينية الموثوق بها من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويتحقق ذلك باستخدام تحديد دقيق للحمض النووي مع تلطيخ الفلورسينس وكمية متساوية من الحمض النووي في تجربة إدارة الموارد البشرية QPCR (انظر الخطوة 1.2). ويبين الشكل 2 التضخيم الناجح لمنطقة الحمض النووي ذات الأهمية حيث تكون قيم Cq لجميع العينات والضوابط في فاصل زمني ضيق جدا. ولا يوجد تضخيم في آبار المجلس الوطني الانتقالي.
يتم تنفيذ مرحلة إدارة الموارد البشرية مباشرة بعد qPCR باستخدام البروتوكول الموضح في الخطوة 1.11. وتستخدم المناطق ذوبان نشطة (الشكل 3، التسمية (ج)) من العينات ، والضوابط وNTC لإنشاء المؤامرات منحنى ذوبان محاذاة(الشكل 4). لذلك، فإن المناطق قبل وبعد ذوبان بشكل صحيح / خطوط درجة الحرارة (الشكل 3A) مهمة لتصور وتحديد المتغيرات الجينية بشكل صحيح في العينات. ويبين الشكل 4 ألف والشكل 4ب منحنيات الذوبان المنحازة ومؤامرات الفرق، على التوالي، حيث يمكن تحديد المتغيرات الجينية. يتم محاذاة العينات غير معروف بإحكام مع واحدة من عناصر التحكم الإيجابية. يظهر الشكل 3B بشكل غير صحيح تعيين المناطق قبل وبعد ذوبان / خطوط درجة الحرارة. وهذا يؤدي إلى منحنى ذوبان الانحياز والمؤامرات الفرق حيث تحديد الصحيح للمتغيرات الجينية هو أكثر صعوبة(الشكل 4C والشكل 4D).
لتأكيد نتائج إدارة الموارد البشرية والكشف عما إذا كان هناك حاجة إلى طريقة تسلسل قياسية أو الجيل التالي لتحديد المتغير الجيني الموجود في العينة ، يتم استخدام التلفات الكهربائية هلام الآجاروز. الشكل 7 يظهر إلكتروفورسيس هلام agarose من نفس العينات والضوابط التي يتم عرضها في الشكل 4. ويمكن تحديد المتغير الجيني في العينة من خلال مقارنة نمط النطاق للعينة بالضوابط وبالجمع بين HRM و agarose gel electrophoresis. ومع ذلك، لا يمكن إجراء تحديد المتغير الجيني الصحيح إلا للعينات التي تحتوي على نفس المتغير الجيني كأحد عناصر التحكم المستخدمة في المقايسة HRM(الشكل 7). تختلف العينات التي تحتوي على متغيرات CALR الجينية النادرة في نتيجة إدارة الموارد البشرية ونمط النطاق الكهربائي(الشكل 8). في هذه الحالة، يتم استخدام تسلسل سانجر أو حتى طريقة تسلسل الجيل القادم لتحديد المتغير الجيني الدقيق.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للخوارزمية للكشف عن المتغير الجيني الجسدي في جين CALR بواسطة إدارة الموارد البشرية، وكهرومورفوريس هلام الآغاروز وطرق التسلسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مؤامرة تضخيم من qPCR HRM المقايسة للكشف عن المتغيرات الجينية في الجين CALR. يتم عرض مؤامرة التضخيم كما مضان الخام تطبيع إلى مضان من المرجع السلبي (ΔRn) وكدالة لعدد دورة. يتم تعيين خط الأساس من 3 إلى 15 دورة عندما تم تضخيم منطقة الحمض النووي ذات الاهتمام بكفاءة باستخدام 20 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة في رد فعل qPCR. وتظهر قطع التضخيم الطبيعية لمنطقة الحمض النووي التي تهم جميع العينات كخطوط خضراء. تظهر المؤامرات زيادة هائلة في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35 في التجربة باستخدام 20 نانوغرام من الحمض النووي عالي الجودة في تفاعل qPCR. الرسم البياني يظهر أي تضخيم في الآبار عينة غير قالب (NTC). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: منحنيات تذوب المشتقة في المقايسة QPCR HRM للكشف عن المتغيرات الجينية في الجين CALR. أ)مثال على تعيين بشكل صحيح قبل وبعد ذوبان المناطق / خطوط درجة الحرارة. يجب أن يكون خط درجة حرارة التوقف قبل الذوبان مجاورا لبداية منطقة الانتقال الذائبة. يجب أن يكون خط درجة حرارة البدء بعد الذوبان مجاورا لنهاية منطقة الانتقال الذائبة. تشير التسمية (أ) إلى زوج الخطوط إلى يسار القمم حيث يبدأ ما قبل الذوبان ويتم تعيين درجات الحرارة. كل أمبيريكون تقطعت به السبل مرتين. تشير التسمية (ب) إلى قمم البيانات في منطقة الذوبان النشطة المستخدمة لإنشاء مؤامرة منحنيات الذوبان المنحازة. تشير التسمية (ج) إلى زوج الخطوط إلى يمين القمم حيث يتم تعيين درجات الحرارة بعد الذوبان و درجات الحرارة. كل أمبيريكون تقطعت به السبل. ب)مثال على تعيين بشكل غير صحيح قبل وبعد ذوبان المناطق / خطوط درجة الحرارة. بداية وتوقف خطوط درجة الحرارة قبل وبعد ذوبان ليست مجاورة للمناطق الانتقالية تذوب وأكثر من 0.5 درجة مئوية وبصرف النظر عن بعضها البعض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: منحنيات الذوبان المنحازة ومؤامرات الفرق في المقايسة QPCR HRM للكشف عن المتغيرات الجينية في جين CALR. أ) و B) إظهار منحنيات تذوب الانحياز والمؤامرات الفرق بعد ما قبل وبعد ذوبان المناطق / يتم تعيين خطوط درجة الحرارة بشكل صحيح. أ)تظهر منحنيات الذوبان المنحازة للتحكمات الإيجابية مع حذف 52 bp (طفرة من النوع 1) ، وإدخال 5 bp (طفرة من النوع 2) ونوع البرية كلون برتقالي وأرجواني وأحمر ، على التوالي. ب)مؤامرة الفرق من نفس العينات كما هو موضح في لوحة A. ج)و D) إظهار منحنيات تذوب الانحياز والمؤامرات الفرق بعد تعيين بشكل غير صحيح قبل وبعد ذوبان المناطق / خطوط درجة الحرارة لنفس المجموعة من العينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: نظام الجل الكهربائي. أ) الوحدات الأساسية لنظام الجل الكهربائي (انظر جدول المواد). ب) صور جل مع نظام توثيق الصور التي تتكون من كاميرا CCD، وغرفة مع أضواء عبر / مضيئة مناسبة، ويظهر مرشح التصوير الفوتوغرافي (انظر جدول المواد). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحميل الجل مع عينات مخففة وحجم الحمض النووي الحل القياسي أو RNase و DNase مجانا H2O لل آبار فارغة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليلات لمنتجات إدارة الموارد البشرية QPCR على الكهروفوريسيس الهلامي. تعرض الجل للأشعة فوق البنفسجية transilluminator. تم التقاط الصورة من قبل نظام توثيق الصور(الشكل 5B). تظهر الآبار من 1 إلى 3 عناصر تحكم: حذف 52 نقطة أساس (طفرة من النوع 1) ، وإدخال 5 bp (طفرة من النوع 2) ومتغير من النوع البري ، على التوالي. يشير نمط النطاق للعينات غير المعروفة في الآبار 4-10 إلى أنها البديل الجيني البري. يمثل بئر M محلول معيار حجم الحمض النووي المخفف (100 إلى 2000 نقطة أساس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تحليل HRM وجل الكهربائي للمتغيرات الجينية في الجين CALR. أ) تحليلات إدارة الموارد البشرية. تظهر منحنيات الذوبان المنحازة للضوابط الإيجابية مع حذف 52 bp (طفرة من النوع 1) ، وإدخال 5 bp (طفرة من النوع 2) ونوع البرية كلون برتقالي وأرجواني وأحمر ، على التوالي. يشار إلى العينة غير المعروفة ذات المتغير الجيني المختلف على أنها لون أزرق داكن. ب)تحليلات جل الكهربائي. تظهر الآبار من 1 إلى 3 عناصر تحكم: حذف 52 نقطة أساس (طفرة من النوع 1) ، وإدخال 5 bp (طفرة من النوع 2) ومتغير من النوع البري ، على التوالي. يشير نمط النطاق للعينة غير المعروفة في الممر 9 إلى المتغير الجيني المختلف كعناصر تحكم. عينات أخرى غير معروفة هي البديل البرية من نوع. يمثل بئر M الحل القياسي لحجم الحمض النووي المخفف (100 إلى 2000 نقطة أساس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: الحد الأقصى للكشف عن المقايسة HRM. يتم تقديم تخفيف تسلسلي لعينة من حذف 52 bp (طفرة من النوع 1) وإدراج 5 bp (طفرة من النوع 2) يعرض عبء أليل متغير وراثي بنسبة 50٪ تقريبا وفقا لتحليل تسلسل سانجر وفحص QPCR HRM وفقا للبروتوكول الموصوف في هذه المقالة. أ)و B) إظهار منحنيات ذوبان محاذاة واختلافات المؤامرات للتخفيفات البرية من نوع والمسلسل من حذف 52 نقطة أساس (نوع 1 طفرة). ج)و D) إظهار منحنيات ذوبان محاذاة واختلافات المؤامرات للتخفيف البرية من نوع والمسلسل من الإدراج 5 نقطة أساس (نوع 2 طفرة). في كلتا الحالتين، يمكن الكشف عن البديل الجيني CALR في تخفيف يصل إلى 1.56٪. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ذوبان عالية الدقة من الحمض النووي هو حل بسيط ل genotyping والمسح الجيني المتغير14. يعتمد ذلك على اختلافات التسلسل التي تؤدي إلى الترودوبليكس التي تغير شكل منحنى الذوبان. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد لمجموعة معينة من المرضى المصابين بالسرطان1و2و15و16و10. يمكن الكشف عن عمليات الحذف أو الإدراج في جين الاهتمام من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية كما أظهرنا في الشكل 4A. عند تنفيذ تقييم إدارة الموارد البشرية qPCR في الاختبار الروتيني ، قمنا بإجراء دراسة تقييم أولية بما في ذلك 21 مريضا من JAK2 V617F-NEGATIVE ET الذين يبلغ متوسط أعمارهم 63 عاما (تتراوح أعمارهم بين 24 و90 عاما). تم الكشف عن متغير وراثي في جين CALR في 12 من أصل 21 JAK2 V617F-سلبي ET المرضى (نسبة 0.57). تم الكشف عن حذف 52 bp (نوع 1 طفرة) في 9 من أصل 21 (نسبة 0.43)، تم الكشف عن إدراج 5 bp (نوع 2 طفرة) في 3 من أصل 21 (نسبة 0.143) JAK2 V617F-سلبية ET المرضى. النتائج تتفق مع البيانات الواردة من الأدب1،2،17.
يمكن تحقيق تحديد موثوق للمتغيرات الجينية من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية من خلال تطوير الفحص السليم الذي يضمن تحسين التجربة لهذه الإدارة. يمكن أن تكون عوامل أخرى غير التسلسل مصدرا للاختلافات الصغيرة في منحنيات إدارة الموارد البشرية مثل تصميم التمهيدي وطول التضخيم واختيار الصبغة واختيار كاشف إدارة الموارد البشرية qPCR وملامح درجة الحرارة والوقت لخطوات QPCR HRM. هذا هو جزء من التنمية في وقت مبكر جدا والتحسين من qPCR HRM المقايسة وقد نوقشت بالفعل في مكان آخر12،14،18. ومع ذلك ، يمكن تحقيق تحديد موثوق للمتغيرات الجينية في جين CALR مع حساسية مماثلة للمقاولات على منصات إدارة الموارد البشرية المختلفة باستخدام نفس التسلسلات التمهيدية19. وكانت النقطة الأكثر أهمية في عملية التحسين من qPCR HRM المقايسة الأمثل لدرجة حرارة ذوبان وإطالة في خطوة qPCR من qPCR HRM المقايسة. لم تكن هناك حاجة إلى تعديل لخطوة إدارة الموارد البشرية12. في الاختبار الروتيني، تصبح العوامل الأخرى التي تؤثر على نتائج إدارة الموارد البشرية أكثر أهمية لمتابعة.
الحمض النووي عالي الجودة الذي أعيد إنفاقه في حاجز منخفض الملح مثل TE (10 mM Tris أو 1 mM EDTA أو تركيز أقل) ونفس الكمية من الحمض النووي في مقايسة QPCR HRM هي عوامل مهمة لمنطقة مصالح الحمض النووي التي تم تضخيمها بنجاح مع هضبة إشارة عالية في مرحلة تضخيم qPCR (الشكل 2). وهذا يؤدي إلى تحديد موثوق للمتغيرات الجينية من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية (الشكل 4A,4B)12,14. قد يؤدي عازل عالي الملح يستخدم ل elution من الحمض النووي في بروتوكول الاستخراج إلى تغيير الديناميكا الحرارية لانتقال ذوبان الحمض النووي بمهارة. هطول الأمطار وإعادة الإنفاق في TE العازلة منخفضة الملح أو تخفيف العينة يمكن أن تحل مشكلة الشوائب في عينة الحمض النووي. يمكن أن ينتج الحمض النووي منخفض الجودة منتجات PCR غير محددة أو تضخيم فاشل. كل هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض معدل الإعادة إنتاج وخطأ أعلى في الكشف عن متغير إدارة الموارد البشرية. ويمكن أن تكون هناك حاجة إلى تحسين إضافي للعينات الصعبة مثل الحمض النووي المستخرج من عينات البارافين المضمنة للحصول على نتيجة إدارة الموارد البشرية الأمثل15.
يمكن أن تؤثر الاختلافات الكبيرة في كمية الحمض النووي المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية QPCR على درجة حرارة الذوبان الناتجة وبالتالي تؤدي إلى نتائج غير حاسمة. لذلك ، فإن التحديد الدقيق لتركيز الحمض النووي وتخفيف جميع عينات الحمض النووي إلزامي20. الأشعة فوق البنفسجية (UV) امتصاص وطرق تلطيخ مضان بدقة تحديد تركيزات عالية النقاء حلول الحمض النووي21. ويمكن استخدام طريقة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية لتقييم نقاء حلول الحمض النووي من خلال إجراء قياسات امتصاص النسبة في A260/A280 و A260/230. ومع ذلك ، فإن طريقة تلطيخ الفلورسنت أكثر حساسية لتدهور الحمض النووي من طريقة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ويمكن أن تحدد بدقة أكبر تركيز الحمض النووي21. لذلك ، فمن الأنسب لتوحيد القياس الكمي وتخفيف جميع عينات الحمض النووي في تحليل إدارة الموارد البشرية20،21.
و indels هي المتغيرات الجينية الرئيسية في الجين CALR لوحظ في المرضى MPN1. كما يتغير طول المنتج ويزيد، والفرق بين البرية من نوع ومنحنيات heterozygote يصبح أصغر، والكشف البديل يصبح أصعب7. ولذلك، ينبغي استخدام طريقة إضافية لتوضيح هذا المتغير الجيني.
ومن الأمثلة الجيدة على ذلك هو إلكتروفورسيس هلام الآغاروز. هذه طريقة بسيطة وفعالة لفصل شظايا الحمض النووي من أحجام مختلفة22،23. يتم فصل جزيئات الحمض النووي حسب الحجم داخل هلام الآجاروز بحيث تكون المسافة المقطوعة متناسبة عكسيا مع لوغاريتم وزنها الجزيئي24. الشكل 4A، الشكل 4B والشكل 7 تظهر الأمثلة حيث يتم تحديد النوعين الأكثر شيوعا من البديل الجيني CALR ، حذف 52 bp وإدراج 5 bp ، من خلال الجمع بين نتائج QPCR HRM وagarose gel electrophoresis. ومع ذلك ، عندما تشير نتيجة إدارة الموارد البشرية ونمط نطاق الجل agarose electrophoresis إلى متغير وراثي مختلف (بما في ذلك تغيير النيوكليوتيدات الواحد) كما هو الحال في الضوابط(الشكل 8)، لا تزال هناك حاجة إلى تسلسل سانجر لتحديد المتغير الجيني الدقيق10.
يمكن أن يكون هناك مستوى منخفض من المتغير الجيني الجسدي في جين CALR في عينة المريض مما يجعل تفسير إدارة الموارد البشرية qPCR ، وكهروفلوريس هلام agarose ونتائج تسلسل سانجر أكثر تطلبا ، خاصة عند حد الكشف عن المقايسة(الشكل 9). يشير أي خط شكل منحنى انصهار يختلف عن النوع البري الأول إلى البديل الوراثي الموجود في العينة. حساسية qPCR HRM المقايسة أقل من 5٪ (الشكل 9 والمرجع19) وأكثر حساسية من طريقة تسلسل سانجر، الذي تم الإبلاغ عن حساسيته لتكون 15-20٪19. في هذه الحالات، يمكن تطبيق الجيل التالي من أسلوب التسلسل العميق الذي يكشف عن indels أكبر وتأكيد نتيجة إدارة الموارد البشرية. في الختام، تحليل إدارة الموارد البشرية هو وسيلة قوية لل genotyping والتباين الجيني المسح الضوئي للمتغيرات الوراثية الجسدية في الجين CALR. ويستند تحديد أنواع مختلفة من المتغير الجيني في الغالب على الضوابط المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية qPCR. يتم الحصول على نتائج أكثر موثوقية من خلال الجمع بين نتائج إدارة الموارد البشرية مع نتائج من إلكتروفورسيس هلام agarose. في حالة النتائج غير الحاسمة، يمكن استخدام تسلسل سانجر القياسي أو حتى طريقة تسلسل الجيل التالي الأكثر حساسية لتحديد المتغير الجيني بشكل صحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا جميع الخبراء الأكاديميين والموظفين في مختبر أمراض الدم المتخصص، قسم أمراض الدم، شعبة الطب الباطني، المركز الطبي الجامعي ليوبليانا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al.
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D.
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
