Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Detectie van genetische varianten in het CALR-gen met behulp van smeltanalyse met hoge resolutie

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

Hoge resolutie smeltanalyse (HRM) is een gevoelige en snelle oplossing voor detectie van genetische varianten. Het hangt af van sequentieverschillen die ertoe leiden dat heteroduplexen de vorm van de smeltcurve veranderen. Door hrm en agarose gel elektroforese te kammen, kunnen verschillende soorten genetische varianten zoals indels worden geïdentificeerd.

Abstract

Hoge resolutie smeltanalyse (HRM) is een krachtige methode voor genotypering en genetische variatiescanning. De meeste HRM-toepassingen zijn afhankelijk van verzadigde DNA-kleurstoffen die sequentieverschillen detecteren en heteroduplexen die de vorm van de smeltcurve veranderen. Uitstekende instrumentresolutie en speciale data-analysesoftware zijn nodig om de kleine smeltcurveverschillen te identificeren die een variant of genotype identificeren. Verschillende soorten genetische varianten met verschillende frequenties kunnen worden waargenomen in het gen dat specifiek is voor patiënten met een specifieke ziekte, met name kanker en in het CALR-gen bij patiënten met Philadelphia-chromosoomnegatieve myeloproliferatieve neoplasmata. Enkelvoudige nucleotideveranderingen, inserties en/of deleties (indels) in het betreffende gen kunnen worden gedetecteerd door de HRM-analyse. De identificatie van verschillende soorten genetische varianten is meestal gebaseerd op de controles die worden gebruikt in de qPCR HRM-test. Naarmate de productlengte toeneemt, wordt het verschil tussen wildtype- en heterozygote curven echter kleiner en is het type genetische variant moeilijker te bepalen. Daarom, waar indels de heersende genetische variant zijn die wordt verwacht in het gen van belang, kan een aanvullende methode zoals agarose gel elektroforese worden gebruikt voor de verduidelijking van het HRM-resultaat. In sommige gevallen moet een niet-overtuigend resultaat opnieuw worden gecontroleerd / opnieuw worden gediagnosticeerd door standaard Sanger-sequencing. In deze retrospectieve studie pasten we de methode toe op JAK2 V617F-negatieve patiënten met MPN.

Introduction

Somatische genetische varianten in het calreticuline-gen(CALR)werden in 2013 herkend bij patiënten met myeloproliferatieve neoplasmata (MPN) zoals essentiële trombocytemie en primaire myelofibrose1,2. Sindsdien zijn meer dan 50 genetische varianten in het CALR-gen ontdekt, die een +1 (−1+2) frameshift3induceren. De twee meest voorkomende CALR genetische varianten zijn een 52 bp deletie (NM_004343,3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), ook wel type 1 mutatie genoemd, en een 5 bp insertie (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), ook wel type 2 mutatie genoemd. Deze twee genetische varianten vertegenwoordigen 80% van alle CALR genetische varianten. De andere zijn geclassificeerd als type 1-achtig of type 2-achtig met behulp van algoritmen op basis van het behoud van een α helix dicht bij wild type CALR4. Hier presenteren we een van de zeer gevoelige en snelle methoden voor CALR genetische variantdetectie, de hoge resolutie smeltanalysemethode (HRM). Deze methode maakt de snelle detectie van type 1 en type 2 genetische varianten mogelijk, die de meerderheid van de CALR-mutaties vertegenwoordigen5. HRM werd in 1997 geïntroduceerd in combinatie met real time »polymerasekettingreactie« (qPCR) als hulpmiddel om de mutatie in factor V Leiden6te detecteren. In vergelijking met Sanger sequencing die de gouden standaard techniek vertegenwoordigt, is HRM een meer gevoelige en minder specifieke methode5. De HRM-methode is een goede screeningsmethode die een snelle analyse van een groot aantal monsters mogelijk maakt met een grote kosten-batenverhouding5. Het is een eenvoudige PCR-methode die wordt uitgevoerd in de aanwezigheid van een fluorescerende kleurstof en vereist geen specifieke vaardigheden. Een ander voordeel is dat de procedure zelf het geanalyseerde monster niet beschadigt of vernietigt, waardoor we het monster opnieuw kunnen gebruiken voor elektroforese of Sanger-sequencing na de HRM-procedure7. Het enige nadeel is dat het soms moeilijk is om de resultaten te interpreteren. Bovendien detecteert HRM de exacte mutatie niet bij patiënten met niet-type 1- of type 2-mutaties8. Bij deze patiënten moet Sanger-sequencing worden uitgevoerd(figuur 1).

HRM is gebaseerd op de amplificatie van het specifieke DNA-gebied in aanwezigheid van verzadigende DNA-fluorescerende kleurstof, die is opgenomen in dubbelstrengs DNA (dsDNA). De fluorescerende kleurstof straalt licht uit wanneer deze in het dsDNA wordt opgenomen. Na een progressieve temperatuurstijging breekt dsDNA af in enkelstrengs DNA, dat op de smeltcurve kan worden gedetecteerd als een plotselinge afname van de fluorescentie-intensiteit. De vorm van de smeltcurve is afhankelijk van de DNA-sequentie die wordt gebruikt om de mutatie te detecteren. Smeltcurven van monsters worden vergeleken met smeltcurven van bekende mutaties of wildtype CALR. Verschillende smeltcurven vertegenwoordigen een andere mutatie die niet type 1 of type 29is.

Het algoritme voor de detectie van somatische genetische varianten in het CALR-gen door HRM, agarosegel-elektroforese en sequencingmethode (figuur 1) werd gebruikt en gevalideerd in de retrospectieve studie gepubliceerd vóór10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Commissie medische ethiek van de Republiek Slovenië. Alle procedures waren in overeenstemming met de verklaring van Helsinki.

1. Fluorescentie-gebaseerde kwantitatieve real-time PCR (qPCR) en post-qPCR analyse door HRM

  1. Resuspend primers vermeld in de tabel van materialen tot 100 μM met steriele, RNase en DNase vrije H2O (zie tabel van materialen). Maak een 10 μM werkconcentratie primer. Primers die in het protocol worden gebruikt, zijn gepubliceerd vóór2.
  2. Kwantificeer granulocyten DNA door de fluorescentiekleuringsmethode volgens de instructies van de fabrikant11 (zie Tabel met materialen). Bereid een DNA-oplossing van 20 ng/μL met behulp van 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (zie Materialentabel).
    1. Bereid naast DNA-monsters ten minste drie DNA-controles voor: twee positieve controles met de NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp deletie of type 1 mutatie), en NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp insertie of type 2 mutatie) genetische variant, evenals wild-type DNA en negatieve controle als een niet-template (NTC) controle.
      OPMERKING: Controleer voordat u de HRM-installatie uitvoert of het qPCR-instrument is gekalibreerd voor HRM-experimenten.
  3. Bereid qPCR HRM Master Mix volgens het protocol van de fabrikant (zie Tabel met materialen)als volgt: 10 μL van 2x qPCR Master Mix met Kleurstof, 0,2 μL van 10 μM Forward Primer, 0,2 μL van 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL steriel, RNase en DNase vrij H2O. Gebruik de primers uit de Tabel van Materialen. Voer drie replicaties uit voor elk DNA-monster en elke controle.
    1. Bereid de qPCR HRM Master Mix voor op basis van het aantal monsters dat wordt verwerkt. Neem overtollig volume van ten minste 10% op in de berekeningen om overtollig volume te bieden voor het verlies dat optreedt tijdens reagensoverdrachten.
  4. Meng de reactie-inhoud door zachtjes op de buis te tikken en om te keren en vortexing gedurende 2-3 s. Verzamel alle verspreide druppels van de wand van de buis naar de bodem door een korte draai.
  5. Bereid een reactieplaat voor die geschikt is voor het instrument en het HRM-experiment (zie Tabel met materialen). Breng 19 μL van de qPCR HRM Master Mix over naar de juiste putten van de optische reactieplaat met 96 putten.
  6. Pipetteer 1 μL van de negatieve controles, positieve controles en monsters in de juiste putten van de optische reactieplaat. Breng voor de NTC 1 μL steriele, RNase- en DNase-vrije H2O over die wordt gebruikt voor het bereiden van de qPCR HRM Master Mix in plaats van DNA.
  7. Sluit de reactieplaat af met de optische zelfklevende film. Doe het stevig om verdamping tijdens het hardlopen te voorkomen. Controleer of de optische zelfklevende film vlak is over alle putten in de reactieplaat om een correcte fluorescentiedetectie te garanderen.
  8. Draai de reactieplaat gedurende 1 minuut op 780 x g bij kamertemperatuur (RT). Controleer of de vloeistof zich op de bodem van de putjes in de reactieplaat bevindt. Ga verder met het uitvoeren van de test.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de plaat niet langer dan 24 uur bij 4 °C. Laat de plaat die bij 4 °C is bewaard opwarmen tot RT en draai de plaat kort voordat u hem laat draaien.
  9. Volgens de instructies van de fabrikant bereidt u de run voor en start u de run om het DNA te versterken en te smelten en om HRM-fluorescentiegegevens in het qPCR-instrument te genereren. Wijs in de software van het instrumentsysteem de bedieningselementen en monsters toe aan de juiste putten.
  10. Wijzig voor de detectie van genetische varianten van CALR het standaard systeemversterkingsprotocol en versterk het DNA met behulp van het volgende thermische cyclusprotocol: 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 50 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 62,5 °C gedurende 60 s.
  11. Voer de smeltcurve/dissociatiefase (HRM) onmiddellijk na qPCR uit volgens de instructies van de fabrikant12 als volgt: 95 °C gedurende 10 s, 60 °C gedurende 1 minuut en vervolgens een hellingsnelheid van 0,025 °C/s tot 95 °C. Houd de temperatuur gedurende 15 s op 95 °C en gedurende 15 s op 60 °C.
  12. De run eindigt automatisch. Bekijk en verifieer eerst de versterkingsplot(figuur 2).
  13. Selecteer in het experimentmenu van de instrumentsysteemsoftware de optie versterkingsplot. Als er geen gegevens worden weergegeven, klikt u op de groene knop Analyseren.
    1. Selecteer op het tabblad versterkingsplot in het vervolgkeuzemenu plottype de plot die de versterkingsgegevens weergeeft terwijl de ruwe fluorescentiewaarden zijn genormaliseerd naar de fluorescentie van de passieve referentie (ΔRn) als functie van het cyclusgetal (ΔRn versus cyclus). Selecteer in het vervolgkeuzemenu Plotkleur de optie Voorbeeld.
  14. Selecteer in het vervolgkeuzemenu grafiektype het type lineaire versterkingsgrafiek. Toon de begin- en eindcyclus van de basislijn in de lineaire versterkingsgrafiek door de startoptie basislijn te selecteren. Controleer of de basislijn correct is ingesteld. De eindcyclus moet een paar cycli vóór het cyclusnummer worden ingesteld waar een significant fluorescerend signaal wordt gedetecteerd. De uitgangswaarde wordt meestal ingesteld van 3 tot 15 cycli(figuur 2).
  15. Selecteer in het vervolgkeuzemenu grafiektype het type log10-versterkingsgrafiek. Toon de drempellijn in de grafiek door de drempeloptie te selecteren. Pas de drempel dienovereenkomstig aan als deze niet correct is ingesteld. De correct ingestelde drempel betekent dat de drempellijn de exponentiële fase van de qPCR-curven kruist(figuur 2).
  16. Controleer of normale versterkingscurven zich in alle monster- en positieve controleputten bevinden. Controleer of er geen versterking in de NTC-putten is vóór cyclus 40. Een normale versterkingsplot toont een exponentiële toename van fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 overschrijdt (figuur 2). Sluit de monsterputten uit van de analyse als er geen versterking in de putpositie is.
    OPMERKING: Als de versterkingsplot er abnormaal uitziet of als de NTC de versterking goed aangeeft, identificeert en lost u het probleem op volgens de handleiding voor probleemoplossing van de fabrikant.
  17. Sluit de uitschieter uit met de kwantificeringscyclus (Cq) waarde die verschilt van replicaties met meer dan 2 in de instrumentsysteemsoftware12. De uitschieters kunnen foutieve HRM-resultaten opleveren.
  18. Bekijk in de afgeleide smeltcurven de voor- en nasmeltgebieden / temperatuurlijnen. De pre- en post-smeltgebieden moeten zich binnen een vlak gebied bevinden waar zich geen grote pieken of hellingen in de fluorescerende niveaus bevinden(figuur 3). Pas het indien nodig dienovereenkomstig aan. Stel de start en stop in van de temperatuurlijnen voor en na het smelten op ongeveer 0,5 °C van elkaar(figuur 3). Start de analyse opnieuw als de parameters zijn aangepast door op de knop Analyseren te klikken.
  19. Kies op het tabblad verschilplot op het tabblad plotinstellingen een van de wild-type controle (homozygoot) repliceert als het referentie-DNA en start de analyse opnieuw door op de knop Analyseren te klikken.
  20. Controleer in het tabblad uitgelijnde smeltcurven of alle positieve controles het juiste genotype hebben en dat NTC niet kan worden versterkt(figuur 4). Selecteer in de puttabel de putten met een positieve controle om de overeenkomstige smeltcurve in de analyseplots te markeren. Controleer of de kleur van de lijn overeenkomt met het juiste genotype. Herhaal de stappen voor de putten met de andere positieve controles en NTC.
  21. Bekijk op het tabblad uitgelijnde smeltcurven zorgvuldig de plotweergaven voor de onbekende monsters en vergelijk ze met de plotweergaven voor besturingselementen(figuur 4). Selecteer in de puttabel de putten met de onbekende monsterreplicaties, controleer de kleur van de smeltcurve en lijn ze uit met de besturingselementen in een geordende volgorde door de putten met positieve controles één voor één te selecteren. Herhaal het proces voor alle onbekende monsters.
    OPMERKING: Het onbekende monster bevat de variant van een van de besturingselementen als de smeltkromme er strak op is uitgelijnd. Er kunnen verschillende variantgroepen (verschillende kleuren) worden weergegeven, wat aangeeft dat het onbekende monster uit een onbekende variant bestaat, die niet overeenkomt met de besturingselementen(figuur 8). Een laag niveau van de somatische genetische variant kan aanwezig zijn in het monster van de patiënt. Dit kan van invloed zijn op de interpretatie van het HRM-resultaat, met name bij de detectiegrens van de test(figuur 9). In deze gevallen kan de kleur of zelfs de vorm van de lijn sterk lijken op die van het wildtype genotype.
    1. Wanneer het resultaat niet overtuigend is, combineert u de HRM-resultaten met de resultaten van de agarosegel-elektroforese en sequencingmethoden. Test het monster opnieuw of vraag het aan en test indien nodig een nieuw monster opnieuw.
    2. Controleer de gegevensset zorgvuldig op replicatiecurven en controleer of de uitlijning van elke replicatie binnen de groep strak is. Sluit de replicatie uit als deze niet goed is uitgelijnd met de andere steekproeven in de groep (uitschieter). Test de steekproef opnieuw als er meer uitschieters aanwezig zijn en de resultaten niet overtuigend zijn. Houd er rekening mee dat de kwantiteit en kwaliteit van het DNA-monster van invloed zijn op de HRM-resultaten.
  22. Analyseer het resultaat voor het onbekende voorbeeld op het tabblad Verschilplot. Herhaal de procedure beschreven in stap 1.21 en controleer of de resultaten voor het onbekende monster dezelfde zijn.
  23. Voer vervolgens de qPCR HRM-producten uit op de agarose-gel.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Bewaar de plaat niet langer dan 24 uur bij 4 °C of gedurende langere tijd, maar niet langer dan 7 dagen bij -20 °C. Laat de plaat die bij 4 °C is bewaard opwarmen tot RT en draai de plaat kort voordat u hem laat draaien. Laat de plaat die is bewaard bij - 20 °C ontdooien en opwarmen tot RT en draai de plaat vervolgens kort voordat u deze laat draaien.

2. Agarose gel elektroforese

  1. Voer qPCR HRM-producten uit op een 4% agarose pre-cast gel met een fluorescerende nucleïnezuurvlek met behulp van het juiste gel-elektroforesesysteem (zie Tabel met materialen, figuur 5). Voer slechts één positieve, negatieve, NTC- en voorbeeld qPCR HRM-replicatie uit.
    OPMERKING: Handschoenen moeten altijd worden gedragen bij het hanteren van gels. Elk ander gel-elektroforesesysteem kan dit doel vervullen als het equivalente agarosepercentage, fluorescerende nucleïnezuurkleuring en putformaat worden gekozen.
  2. Voer het gel-elektroforesesysteem uit volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Verwijder de voorgegoten gel in de cassette uit de verpakking, verwijder de kam en plaats deze in het apparaat volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Laad de gel binnen 15 minuten na het openen van de verpakking.
  3. Verdun een monster van 10 μL tot 20 μL met steriel, RNase- en DNase-vrij H2O. Laad elke put met 20 μL verdund monster.
  4. Verdun 3 μL DNA-grootte standaardoplossing tot 20 μL met steriel, RNase en DNase vrij H2O (zie Tabel met materialen). Laad de M-put met 20 μL verdunde DNA-grootte standaardoplossing(figuur 6).
  5. Vul lege putten met 20 μL steriel, RNase- en DNase-vrij H2O.
  6. Selecteer onmiddellijk het programma op basis van het percentage van de gel dat wordt uitgevoerd en stel de looptijd op het apparaat in op 10 minuten.
  7. Start de elektroforese binnen 1 minuut na het laden van het monster door op de GO-knop te drukken. De elektroforesetijd kan worden verlengd als er onvoldoende resolutie wordt verkregen.
    OPMERKING: Overschrijd de maximale aanbevolen agarose-elektroforese-looptijd volgens de instructies van de fabrikant niet.
  8. Wanneer de elektroforese is voltooid, visualiseer dan DNA in de gel met behulp van een blauw licht of UV-transilluminatie. Het visualiseren, analyseren en opslaan van de elektroforesebeelden gebeurt meestal door een gel imager met fotodocumentatiesysteem(figuur 5).
  9. Analyseer en interpreteer het gevisualiseerde qPCR HRM-productgelpatroon door de resultaten van het onbekende monster te vergelijken met positieve controles(figuur 7 en figuur 8).
  10. Als de resultaten van de hrm- en gelelektroforese van het onbekende monster aangeven dat er een onbekende genetische variant aanwezig is, sequentieer dan het qPCR HRM-product met behulp van primers beschreven in de tabel met materialen volgens het beschreven protocol13.
    LET OP: De agarosegels met een fluorescerende nucleïnezuurvlek moeten volgens de instellingsvoorschriften op de juiste manier worden weggegooid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het met succes versterkte DNA-gebied van belang met een exponentiële toename van fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 overschrijdt en zeer smalle waarden van de cyclus van kwantificering (Cq) in alle gerepliceerde monsters en controles (figuur 2) is een voorwaarde voor de betrouwbare identificatie van genetische varianten door HRM-analyse. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een nauwkeurige bepaling van DNA met fluorescentiekleuring en een gelijke hoeveelheid DNA in het qPCR HRM-experiment (zie stap 1.2). Figuur 2 toont de succesvolle amplificatie van het DNA-gebied van belang waar de Cq-waarden van alle monsters en controles zich in een zeer smal interval bevinden. Er is geen versterking in de NTC-putten.

De HRM-fase wordt onmiddellijk na qPCR uitgevoerd met behulp van het protocol beschreven in stap 1.11. De actieve smeltgebieden(figuur 3,label (c)) van de monsters, de controles en de NTC worden gebruikt om hun uitgelijnde smeltcurveplots te creëren(figuur 4). Daarom zijn de correct ingestelde pre- en post-smeltgebieden / temperatuurlijnen (figuur 3A) belangrijk voor het goed visualiseren en identificeren van genetische varianten in de monsters. Figuur 4A en figuur 4B tonen respectievelijk de uitgelijnde smeltcurven en verschilplots, waar de identificatie van genetische varianten mogelijk is. De onbekende monsters zijn strak uitgelijnd met een van de positieve controles. Figuur 3B toont verkeerd ingestelde pre- en post-smeltgebieden/temperatuurlijnen. Dit resulteert in een uitgelijnde smeltcurve en verschilplots waarbij correcte identificatie van de genetische varianten moeilijker is(figuur 4C en figuur 4D).

Om de HRM-resultaten te bevestigen en om te detecteren of een standaard- of next generation sequencing-methode nodig is om de genetische variant in het monster te identificeren, wordt agarosegel-elektroforese gebruikt. Figuur 7 toont de agarosegel-elektroforese van dezelfde monsters en controles die in figuur 4worden weergegeven. De genetische variant in het monster kan worden geïdentificeerd door het bandpatroon van het monster te vergelijken met de controles en door de HRM- en agarosegel-elektroforese te combineren. De juiste genetische variantidentificatie kan echter alleen worden uitgevoerd voor de monsters die dezelfde genetische variant bevatten als een van de controles die in de HRM-test worden gebruikt(figuur 7). Monsters die zeldzame CALR genetische varianten bevatten, verschillen in het HRM-resultaat en het elektroforesebandpatroon(figuur 8). In dit geval wordt de Sanger-sequencing- of zelfs next generation sequencing-methode gebruikt om de exacte genetische variant te identificeren.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van het algoritme voor de detectie van somatische genetische varianten in het CALR-gen door HRM, agarosegel-elektroforese en sequencingmethoden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Amplificatieplot van de qPCR HRM-test voor de detectie van de genetische varianten in het CALR-gen. De versterkingsplot wordt weergegeven als de ruwe fluorescentie genormaliseerd tot de fluorescentie van de passieve referentie (ΔRn) en als een functie van een cyclusgetal. De basislijn wordt ingesteld van 3 tot 15 cycli wanneer het DNA-gebied van belang efficiënt werd versterkt met behulp van 20 ng hoogwaardig DNA in de qPCR-reactie. De normale amplificatieplots van het DNA-gebied van belang van alle monsters worden weergegeven als groene lijnen. Plots tonen een exponentiële toename van fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 in het experiment overschrijdt met behulp van 20 ng hoogwaardig DNA in qPCR-reactie. De grafiek toont geen versterking in de niet-sjabloon monsterputten (NTC). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Afgeleide smeltcurven in de qPCR HRM-test voor de detectie van de genetische varianten in het CALR-gen.  A) Een voorbeeld van correct ingestelde voor- en nasmeltgebieden/temperatuurlijnen. De temperatuurlijn voor de smeltstop moet zich grenzen aan het begin van het smeltovergangsgebied. De temperatuurlijn na het smelten moet grenzen aan het einde van het smeltovergangsgebied. Het (a)-label geeft het paar lijnen links van de pieken aan waar de voorsmelt- en stoptemperaturen worden ingesteld. Elke amplicon is dubbelstrengs. Het (b)-label geeft de gegevenspieken aan van het actieve smeltgebied dat is gebruikt om de uitgelijnde smeltcurven te maken. Het (c)-label geeft het paar lijnen rechts van de pieken aan waar de start- en stoptemperaturen na het smelten zijn ingesteld. Elke amplicon is enkelstrengs. B) Een voorbeeld van verkeerd ingestelde pre- en post-smeltgebieden/temperatuurlijnen. De start en stop van de pre- en post-melt temperatuurlijnen grenzen niet aan de smeltovergangsgebieden en liggen meer dan 0,5 °C van elkaar verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: De uitgelijnde smeltcurves en verschilplots in de qPCR HRM-assay voor de detectie van de genetische varianten in het CALR-gen.  A) en B) tonen de uitgelijnde smeltcurven en verschildiagrammen nadat de voor- en na-smeltgebieden/temperatuurlijnen correct zijn ingesteld. A) De uitgelijnde smeltcurven van de positieve controles met 52 bp deletie (type 1 mutatie), 5 bp insertie (type 2 mutatie) en een wild-type worden weergegeven als respectievelijk oranje, paarse en rode kleur. B) De verschilplot van dezelfde monsters als beschreven in paneel A. C) en D) tonen de uitgelijnde smeltcurven en verschildiagrammen na de onjuist ingestelde voor- en na-smeltgebieden/temperatuurlijnen voor dezelfde reeks monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Het gel-elektroforesesysteem. A) De basiseenheden van het gel-elektroforesesysteem (zie Tabel met materialen). B) Gel imager met fotodocumentatiesysteem bestaande uit een CCD-camera, een kamer met geschikte trans/ verlichtingslichten en een fotografisch filter wordt getoond (zie Materiaaltabel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Het laden van de gel met verdunde monsters en DNA-grootte standaardoplossing of RNase en DNase vrije H2O voor lege putten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Analyses van de qPCR HRM producten op gel elektroforese. De gel werd blootgesteld aan UV-transilluminator. De foto is gemaakt met het fotodocumentatiesysteem(figuur 5B). Putten van 1 tot 3 tonen controles: respectievelijk 52 bp-deletie (type 1-mutatie), 5 bp-insertie (type 2-mutatie) en wild-type variant. Het bandpatroon van de onbekende monsters in de putten 4-10 geeft ze aan als de wild-type genetische variant. De M-put vertegenwoordigt verdunde DNA-grootte standaardoplossing (100 tot 2.000 bp). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: HRM- en gel-elektroforeseanalyses van de genetische varianten in het CALR-gen.  A) HRM-analyses. De uitgelijnde smeltcurven van de positieve controles met 52 bp deletie (type 1 mutatie), 5 bp insertie (type 2 mutatie) en een wild-type worden weergegeven als respectievelijk oranje, paarse en rode kleur. Het onbekende monster met de verschillende genetische variant wordt aangeduid als donkerblauwe kleur. B)Gel-elektroforeseanalyses. Putten van 1 tot 3 tonen controles: respectievelijk 52 bp-deletie (type 1-mutatie), 5 bp-insertie (type 2-mutatie) en wild-type variant. Het bandpatroon van het onbekende monster in de baan 9 geeft de verschillende genetische variant aan als controles. Andere onbekende monsters zijn de wild-type variant. De M-put vertegenwoordigt de verdunde DNA-grootte standaardoplossing (100 tot 2.000 bp). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: De detectiegrens van de HRM-test. Een seriële verdunning van een monster van een 52 bp-deletie (type 1-mutatie) en 5 bp-insertie (type 2-mutatie) wordt gepresenteerd met een genetische variantallelbelasting van ongeveer 50% volgens Sanger-sequencinganalyse en de qPCR HRM-assay volgens het protocol dat in dit artikel wordt beschreven. A) en B) tonen de uitgelijnde smeltcurven en verschilplots voor wildtype en seriële verdunningen van een 52 bp-deletie (type 1-mutatie). C) en D) tonen de uitgelijnde smeltcurven en verschilplots voor wildtype en seriële verdunningen van een 5 bp insertie (type 2 mutatie). In beide gevallen kon de CALR genetische variant worden gedetecteerd in verdunning tot 1,56%. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoge resolutie smelten van DNA is een eenvoudige oplossing voor genotypering en genetische variant scanning14. Het hangt af van sequentieverschillen die resulteren in heteroduplexen die de vorm van de smeltcurve veranderen. Verschillende soorten genetische varianten met verschillende frequenties kunnen worden waargenomen in het gen dat specifiek is voor een bepaalde groep patiënten met kanker1,2,15,16,10. Deleties of inserties in het gen van belang kunnen worden gedetecteerd door de HRM-analyse zoals we hebben laten zien in figuur 4A. Bij de implementatie van de qPCR HRM-test in de routinetests hebben we een eerste evaluatiestudie uitgevoerd met 21 JAK2 V617F-negatieve ET-patiënten met een mediane leeftijd van 63 jaar (bereik van 24 tot 90 jaar). Een genetische variant in het CALR-gen werd gedetecteerd bij 12 van de 21 JAK2 V617F-negatieve ET-patiënten (verhouding 0,57). Een 52 bp deletie (type 1 mutatie) werd gedetecteerd bij 9 van de 21 (verhouding 0,43), een 5 bp insertie (type 2 mutatie) werd gedetecteerd bij 3 van de 21 (verhouding 0,143) JAK2 V617F-negatieve ET patiënten. De resultaten komen overeen met de gegevens uit de literatuur1,2,17.

Betrouwbare identificatie van genetische varianten door HRM-analyse kan worden bereikt door de juiste testontwikkeling die ervoor zorgt dat het experiment wordt geoptimaliseerd voor HRM. Andere factoren dan sequentie kunnen een bron zijn van kleine verschillen in de HRM-curven, zoals primerontwerp, ampliconlengte, kleurstofselectie, keuze van qPCR HRM-reagens en temperatuur- en tijdprofielen van de qPCR HRM-stappen. Dit is het deel van de zeer vroege ontwikkeling en optimalisatie van de qPCR HRM-assay en is elders al besproken12,14,18. Betrouwbare identificatie van genetische varianten in het CALR-gen met vergelijkbare gevoeligheid van de assays kan echter worden bereikt op verschillende HRM-platforms met behulp van dezelfde primersequenties19. Het meest kritieke punt in het optimalisatieproces van de qPCR HRM-test was optimalisatie van de smelt- en rektemperatuur in de qPCR-stap van de qPCR HRM-test. Er was geen wijziging nodig voor de HRM stap12. In de routinetests worden andere factoren die van invloed zijn op de HRM-resultaten belangrijker om te volgen.

Hoogwaardig DNA geresuspendeerd in een zoutarme buffer zoals TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA of lagere concentratie) en dezelfde hoeveelheid DNA in de qPCR HRM-test zijn belangrijke factoren voor het succesvol versterken van DNA-interessegebied met een hoog signaalplateau in de qPCR-amplificatiefase(figuur 2). Dit leidt tot betrouwbare identificatie van genetische varianten door HRM-analyse (Figuur 4A,4B)12,14. Een zoutrijke buffer die wordt gebruikt voor de elutie van DNA in het extractieprotocol kan de thermodynamica van de DNA-smeltovergang subtiel veranderen. Precipitatie en resuspensie in te lage zoutbuffer of verdunning van het monster kan het probleem van de onzuiverheden in het DNA-monster oplossen. Dna van lage kwaliteit kan niet-specifieke PCR-producten of mislukte amplificatie produceren. Dit alles kan resulteren in een lagere reproduceerbaarheid en een hoger foutenpercentage bij HRM-variantdetectie. Extra optimalisatie voor de uitdagende monsters zoals DNA geëxtraheerd uit paraffine-ingebedde monsters kan nodig zijn om een optimaal HRM-resultaat te verkrijgen15.

Grote verschillen in de DNA-hoeveelheid die wordt gebruikt in de qPCR HRM-test kunnen de resulterende smelttemperatuur (Tm) beïnvloeden en bijgevolg leiden tot onduidelijke resultaten. Daarom is de precieze bepaling van de DNA-concentratie en verdunning van alle DNA-monsters verplicht20. Ultraviolette (UV) absorptie- en fluorescentiekleuringsmethoden bepalen nauwkeurig de concentraties van zeer zuivere DNA-oplossingen21. De UV-absorptiemethode kan worden gebruikt voor het evalueren van de zuiverheid van de DNA-oplossingen door verhoudingsabsorptiemetingen uit te voeren bij A260/A280 en A260/230. De fluorescerende kleuringsmethode is echter gevoeliger voor de afbraak van DNA dan de UV-absorptiemethode en kan de DNA-concentratie nauwkeuriger bepalen21. Daarom is het meer geschikt voor de standaardisatie van kwantificering en verdunning van alle DNA-monsters in de HRM-analyse20,21.

De indels zijn de belangrijkste genetische varianten in het CALR-gen waargenomen bij MPN-patiënten1. Naarmate de productlengte verandert en toeneemt, wordt het verschil tussen wild-type en heterozygote curven kleiner en wordt de variantdetectie moeilijker7. Daarom moet een aanvullende methode voor de verduidelijking van een dergelijke genetische variant worden gebruikt.

Een goed voorbeeld is agarose gel elektroforese. Dit is een eenvoudige en effectieve methode om DNA-fragmenten van verschillende groottes te scheiden22,23. DNA-moleculen worden gescheiden door grootte in de agarose-gel, zodat de afgelegde afstand omgekeerd evenredig is met de logaritme van zijn molecuulgewicht24. Figuur 4A, Figuur 4B en Figuur 7 tonen voorbeelden waarbij de twee meest voorkomende soorten CALR genetische variant, 52 bp deletie en 5 bp insertie, worden geïdentificeerd door qPCR HRM en agarose gel elektroforese resultaten te combineren. Wanneer het HRM-resultaat en het agarosegel-elektroforesebandpatroon echter wijzen op een andere genetische variant (inclusief enkele nucleotideverandering) zoals in de controles(figuur 8),is Sanger-sequencing nog steeds nodig om de exacte genetische variant te identificeren10.

Een laag niveau van somatische genetische variant in het CALR-gen kan aanwezig zijn in het monster van de patiënt, waardoor een interpretatie van de qPCR HRM, agarose gel elektroforese en Sanger sequencing resultaten veeleisender is, met name bij de detectiegrens van de test (Figuur 9). Elke smeltcurvevormlijn die afwijkt van het wilde type één geeft aan welke genetische variant in het monster aanwezig is. De gevoeligheid van de qPCR HRM-assay is lager dan 5%(figuur 9 en referentie19)en is gevoeliger dan de Sanger-sequencingmethode, waarvan de gevoeligheid werd gerapporteerd als 15-20%19. In deze gevallen kan de volgende generatie diepe sequencingmethode worden toegepast die grotere indels detecteert en het HRM-resultaat bevestigt. Kortom, de HRM-analyse is een krachtige methode voor genotypering en genetische variatiescanning van somatische genetische varianten in het CALR-gen. De identificatie van verschillende soorten genetische varianten is meestal gebaseerd op de controles die worden gebruikt in de qPCR HRM-test. Meer betrouwbare resultaten worden verkregen door de HRM-resultaten te combineren met resultaten van agarose gel elektroforese. In geval van niet-overtuigende resultaten kan standaard Sanger-sequencing of nog gevoeligere next generation sequencing-methode worden gebruikt om de genetische variant goed te identificeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag alle academische experts en medewerkers van het gespecialiseerde hematologielaboratorium, afdeling hematologie, afdeling interne geneeskunde, universitair medisch centrum Ljubljana bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
  2. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
  3. Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
  4. Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
  5. Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
  6. Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
  7. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
  8. Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
  9. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
  10. Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
  11. Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
  12. Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
  13. Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
  14. Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
  15. Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
  16. Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
  17. Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
  18. Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
  19. Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
  20. Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
  21. Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
  22. Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
  23. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
  24. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).

Tags

Genetica Hoge resolutie smeltanalyse fluorescentie-gebaseerde kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie genetische variant pre-gegoten agarose gel elektroforese indel somatische mutatie heteroduplex scanning CALR
Detectie van genetische varianten in het <em>CALR-gen</em> met behulp van smeltanalyse met hoge resolutie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pajič, T., Belčič… More

Pajič, T., Belčič Mikič, T., Podgornik, H., Klun, J., Šućurović, S., Zver, S., Sever, M. Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis. J. Vis. Exp. (162), e61642, doi:10.3791/61642 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter