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Genetics

Détection de variantes génétiques dans le gène CALR à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution

Published: August 26, 2020 doi: 10.3791/61642
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Hematology, University Medical Centre Ljubljana, 2Clinical Institute for Genomic Medicine, University Medical Centre Ljubljana, 3Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

Summary

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une solution sensible et rapide pour la détection de variantes génétiques. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes modifiant la forme de la courbe de fusion. En peignant la GRH et l’électrophorèse sur gel d’agarose, différents types de variantes génétiques telles que les indels peuvent être identifiés.

Abstract

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une méthode puissante pour le génotypage et le balayage de variation génétique. La plupart des applications hrm dépendent de colorants ADN saturés qui détectent les différences de séquence et d’hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Une excellente résolution d’instrument et un logiciel spécial d’analyse des données sont nécessaires pour identifier les petites différences de courbe de fusion qui identifient une variante ou un génotype. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour les patients atteints d’une maladie spécifique, en particulier le cancer et dans le gène CALR chez les patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs négatifs du chromosome Philadelphie. Des changements, des insertions et/ou des délétions (indels) d’un seul nucléotide dans le gène d’intérêt peuvent être détectés par l’analyse HRM. L’identification des différents types de variantes génétiques est principalement basée sur les contrôles utilisés dans le test qPCR HRM. Cependant, à mesure que la longueur du produit augmente, la différence entre les courbes de type sauvage et les courbes hétérozygotes devient plus petite et le type de variante génétique est plus difficile à déterminer. Par conséquent, lorsque les indels sont la variante génétique prévalente attendue dans le gène d’intérêt, une méthode supplémentaire telle que l’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée pour clarifier le résultat de la GRH. Dans certains cas, un résultat non concluant doit être revérifié/rediagnostiqué par séquençage de Sanger standard. Dans cette étude rétrospective, nous avons appliqué la méthode à des patients JAK2 V617F négatifs atteints de NPP.

Introduction

Des variantes génétiques somatiques du gène de la calréticuline(CALR)ont été reconnues en 2013 chez des patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs (NPP) tels que la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primaire1,2. Depuis lors, plus de 50 variantes génétiques du gène CALR ont été découvertes, induisant un décalage de trame +1 (−1+2)3. Les deux variantes génétiques CALR les plus fréquentes sont une délétion de 52 pb (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52,p. (Leu367Thrfs*46)), également appelée mutation de type 1, et une insertion de 5 pb (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs*47)), également appelée mutation de type 2. Ces deux variantes génétiques représentent 80 % de toutes les variantes génétiques du CALR. Les autres ont été classés comme de type 1 ou de type 2 en utilisant des algorithmes basés sur la préservation d’une hélice α proche du type sauvage CALR4. Nous présentons ici l’une des méthodes très sensibles et rapides pour la détection des variantes génétiques CALR, la méthode d’analyse de fusion à haute résolution (HRM). Cette méthode permet la détection rapide des variantes génétiques de type 1 et de type 2, qui représentent la majorité des mutations CALR 5. La GRH a été introduite en combinaison avec la « réaction en chaîne par polymérase » (qPCR) en temps réel en 1997 en tant qu’outil de détection de la mutation dans le facteur V de Leiden6. Par rapport au séquençage de Sanger qui représente la technique de référence, la GRH est une méthode plus sensible et moins spécifique5. La méthode HRM est une bonne méthode de criblage qui permet une analyse rapide d’un grand nombre d’échantillons avec un grand rapport coût-bénéfice5. Il s’agit d’une méthode pcr simple réalisée en présence d’un colorant fluorescent et ne nécessitant pas de compétences spécifiques. Un autre avantage est que la procédure elle-même n’endommage ni ne détruit l’échantillon analysé, ce qui nous permet de réutiliser l’échantillon pour l’électrophorèse ou le séquençage de Sanger après la procédure HRM7. Le seul inconvénient est qu’il est parfois difficile d’interpréter les résultats. De plus, HRM ne détecte pas la mutation exacte chez les patients présentant des mutations non de type 1 ou de type 28. Chez ces patients, un séquençage de Sanger doit être effectué (Figure 1).

La GRH est basée sur l’amplification de la région spécifique de l’ADN en présence d’un colorant fluorescent saturé d’ADN, qui est incorporé dans l’ADN double brin (dsDNA). Le colorant fluorescent émet de la lumière lorsqu’il est incorporé dans l’ADNds. Après une augmentation progressive de la température, l’ADNds se décompose en ADN simple brin, qui peut être détecté sur la courbe de fusion comme une diminution soudaine de l’intensité de fluorescence. La forme de la courbe de fusion dépend de la séquence d’ADN utilisée pour détecter la mutation. Les courbes de fusion des échantillons sont comparées aux courbes de fusion de mutations connues ou de type sauvage CALR. Les courbes de fusion distinctes représentent une mutation différente qui n’est pas de type 1 ou de type 29.

L’algorithme de détection de la variante génétique somatique dans le gène CALR par GRH, électrophorèse sur gel d’agarose et méthode de séquençage (Figure 1) a été utilisé et validé dans l’étude rétrospective publiée avantle 10.

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Protocol

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de la République de Slovénie. Toutes les procédures étaient conformes à la déclaration d’Helsinki.

1. PCR quantitative en temps réel (qPCR) basée sur la fluorescence et analyse post-qPCR par HRM

  1. Remettre en suspension les apprêts énumérés dans le tableau des matériaux à 100 μM avec H2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir tableau des matériaux). Préparez un apprêt de concentration de travail de 10 μM. Les amorces utilisées dans le protocole ont été publiées avantle 2.
  2. Quantifier l’ADN des granulocytes par la méthode de coloration par fluorescence en suivant les instructions11 du fabricant (voir tableau des matériaux). Préparer une solution d’ADN de 20 ng/μL en utilisant 10 mM de Tris-Cl, 0,5 mM d’EDTA, pH 9,0 (voir tableau des matériaux).
    1. En plus des échantillons d’ADN, préparez au moins trois témoins d’ADN : deux témoins positifs avec la NM_004343.3 (CALR) : c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs*46) (délétion de 52 pb ou mutation de type 1), et NM_004343.3(CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs*47) (insertion de 5 pb ou mutation de type 2), ainsi que l’ADN de type sauvage et le contrôle négatif en tant que contrôle non-gabarit (NTC).
      REMARQUE: Avant d’effectuer la configuration HRM, vérifiez que l’instrument qPCR est étalonné pour les expériences HRM.
  3. Préparez qPCR HRM Master Mix selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux)comme suit : 10 μL de 2x qPCR Master Mix with Dye, 0,2 μL de 10 μM Forward Primer, 0,2 μL de 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL de H 2 O stérile, sans RNase et sans DNase. Utilisez les amorces de la Table des matériaux. Exécutez trois répliques pour chaque échantillon d’ADN et contrôle.
    1. Préparez le qPCR HRM Master Mix en fonction du nombre d’échantillons traités. Inclure un volume excédentaire d’au moins 10 % dans les calculs afin de fournir un volume excédentaire pour la perte qui se produit lors des transferts de réactifs.
  4. Mélanger le contenu de la réaction en tapotant doucement et en inversant le tube et en vortexant pendant 2-3 s. Collectez toutes les gouttelettes dispersées de la paroi du tube vers le bas par un bref tour.
  5. Préparer une plaque de réaction appropriée pour l’instrument et l’expérience hrm (voir Tableau des matériaux). Transférer 19 μL du mélange maître qPCR HRM vers les puits appropriés de la plaque de réaction optique de 96 puits.
  6. Pipeter 1 μL des témoins négatifs, des témoins positifs et des échantillons dans les puits appropriés de la plaque de réaction optique. Pour le CNT, transférer 1 μL de H2O stérile, sansRNase et sans DNase utilisé pour préparer le mélange maître HRM qPCR au lieu de l’ADN.
  7. Scellez la plaque de réaction avec le film adhésif optique. Faites-le fermement pour éviter l’évaporation pendant la course. Vérifiez que le film adhésif optique est plan sur tous les puits de la plaque de réaction pour assurer une détection correcte de la fluorescence.
  8. Faire tourner la plaque de réaction à 780 x g à température ambiante (RT) pendant 1 minute. Vérifiez que le liquide se trouve au fond des puits dans la plaque de réaction. Procédez à l’exécution du test.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver la plaque à 4 °C pendant 24 h au maximum. Laissez la plaque stockée à 4 °C chauffer à RT, puis faites tourner brièvement la plaque avant de la faire fonctionner.
  9. Selon les instructions du fabricant, préparez et commencez la course pour amplifier et faire fondre l’ADN et générer des données de fluorescence HRM dans l’instrument qPCR. Dans le logiciel du système d’instruments, affectez les commandes et les échantillons aux puits appropriés.
  10. Pour la détection de variantes génétiques CALR, modifiez le protocole d’amplification de l’instrument par défaut et amplifiez l’ADN en utilisant le protocole de cycle thermique suivant : 95 °C pendant 10 minutes, suivi de 50 cycles de 95 °C pendant 10 s et 62,5 °C pendant 60 s.
  11. Effectuer l’étape de courbe de fusion/dissociation (HRM) immédiatement après la qPCR selon les instructions du fabricant12 comme suit : 95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 1 min, puis une vitesse de rampe de 0,025 °C/s jusqu’à 95 °C. Maintenir la température à 95 °C pendant 15 s et à 60 °C pendant 15 s.
  12. L’exécution se termine automatiquement. Tout d’abord, examinez et vérifiez le diagramme d’amplification (Figure 2).
  13. Dans le menu d’expérience du logiciel du système d’instruments, sélectionnez l’option de tracé d’amplification. Si aucune donnée n’est affichée, cliquez sur le bouton vert Analyser.
    1. Dans l’onglet Diagramme d’amplification, dans le menu déroulant Type de diagramme, sélectionnez le tracé qui affiche les données d’amplification sous forme de lectures de fluorescence brute normalisées à la fluorescence de la référence passive (ΔRn) en fonction du nombre de cycles (ΔRn vs Cycle). Dans le menu déroulant Couleur du tracé, sélectionnez Exemple.
  14. Dans le menu déroulant Type de graphique, sélectionnez le type de graphique d’amplification linéaire. Affichez le cycle de début et de fin de la ligne de base sur le graphique d’amplification linéaire en sélectionnant l’option de début de la ligne de base. Vérifiez que la configuration de référence est correctement définie. Le cycle de fin doit être réglé quelques cycles avant le numéro de cycle où un signal fluorescent important est détecté. La ligne de base est généralement définie de 3 à 15 cycles(Figure 2).
  15. Dans le menu déroulant Type de graphique, sélectionnez le type de graphique d’amplification log10. Affichez la ligne de seuil sur le graphique en sélectionnant l’option de seuil. Ajustez le seuil en conséquence s’il n’est pas défini correctement. Le seuil correctement défini signifie que la ligne de seuil traverse la phase exponentielle des courbes qPCR (Figure 2).
  16. Vérifier que les courbes d’amplification normales se trouvent dans tous les puits d’échantillonnage et de contrôle positif. Vérifiez qu’il n’y a pas d’amplification dans les puits NTC avant le cycle 40. Un diagramme d’amplification normale montre une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35(Figure 2). Exclure les puits d’échantillonnage de l’analyse s’il n’y a pas d’amplification dans la position du puits.
    REMARQUE: Si le diagramme d’amplification semble anormal ou si le puits NTC indique l’amplification, identifiez et résolvez le problème conformément au guide de dépannage du fabricant.
  17. Exclure la valeur aberrante avec la valeur du cycle de quantification (Cq) qui diffère des réplications de plus de 2 dans le logiciel du systèmed’instruments 12. Les valeurs aberrantes peuvent produire des résultats erronés en matière de GRH.
  18. Dans les courbes de fusion dérivées, passez en revue les régions/lignes de température avant et après fusion. Les régions pré- et post-fusion doivent se trouver dans une zone plate où il n’y a pas de grands pics ou de pentes dans les niveaux fluorescents (Figure 3). Si nécessaire, ajustez-le en conséquence. Configurer le démarrage et l’arrêt des lignes de température pré- et post-fusion à environ 0,5 °C l’une de l’autre (Figure 3). Redémarrez l’analyse si les paramètres sont ajustés en cliquant sur le bouton Analyser.
  19. Dans l’onglet du graphique de différence, dans l’onglet Paramètres du tracé, choisissez l’un des contrôles de type sauvage (homozygote) qui se réplique comme ADN de référence et redémarrez l’analyse en cliquant sur le bouton Analyser.
  20. Dans l’onglet Courbes de fusion alignées, vérifiez que tous les témoins positifs ont le génotype correct et que le NTC n’a pas réussi à amplifier (Figure 4). Dans le tableau des puits, sélectionnez les puits contenant un contrôle positif pour mettre en évidence la courbe de fusion correspondante dans les diagrammes d’analyse. Vérifiez que la couleur de la ligne correspond au génotype correct. Répétez les étapes pour les puits contenant les autres témoins positifs et le CNT.
  21. Dans l’onglet Courbes de fusion alignées, examinez attentivement les affichages de tracé pour les échantillons inconnus et comparez-les aux affichages de tracé pour les contrôles (Figure 4). Dans le tableau des puits, sélectionnez les puits contenant les répliques d’échantillons inconnues, vérifiez la couleur de la courbe de fusion et alignez-les sur les commandes dans une séquence ordonnée en sélectionnant les puits contenant des contrôles positifs un par un. Répétez le processus pour tous les échantillons inconnus.
    REMARQUE : L’échantillon inconnu contient la variante de l’une des commandes si sa courbe de fusion est étroitement alignée sur celle-ci. Différents groupes de variantes (couleurs différentes) peuvent être affichés indiquant que l’échantillon inconnu est constitué d’une variante inconnue, ne correspondant pas aux contrôles (Figure 8). Un faible niveau de la variante génétique somatique peut être présent dans l’échantillon du patient. Cela pourrait influencer l’interprétation du résultat de la GRH, en particulier à la limite de détection du test(figure 9). Dans ces cas, la couleur ou même la forme de la ligne pourrait ressembler beaucoup à celle du génotype de type sauvage.
    1. Lorsque le résultat n’est pas concluant, combinez les résultats de la GRH avec les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose et des méthodes de séquençage. Retestez l’échantillon ou la demande et retestez un nouvel échantillon si nécessaire.
    2. Examinez attentivement l’ensemble de données pour les courbes de réplication et vérifiez que l’alignement de chaque réplication au sein du groupe est serré. Exclure la réplique si elle ne s’aligne pas étroitement avec les autres échantillons du groupe (valeur aberrante). Retestez l’échantillon si d’autres valeurs aberrantes sont présentes et que les résultats ne sont pas concluants. Sachez que la quantité et la qualité de l’échantillon d’ADN influencent les résultats de la GRH.
  22. Analysez le résultat de l’échantillon inconnu dans l’onglet Graphique de différence. Répétez la procédure décrite à l’étape 1.21 et vérifiez que les résultats obtenus pour l’échantillon inconnu sont les mêmes.
  23. Ensuite, exécutez les produits qPCR HRM sur le gel d’agarose.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conservez la plaque à 4 °C pendant 24 heures au maximum ou à -20 °C pendant une période plus longue mais pas plus de 7 jours. Laissez la plaque stockée à 4 °C chauffer à RT, puis faites tourner brièvement la plaque avant de la faire fonctionner. Laissez la plaque stockée à - 20 °C décongeler et réchauffer à RT, puis faites tourner brièvement la plaque avant de l’exécuter.

2. Électrophorèse sur gel d’agarose

  1. Exécuter les produits qPCR HRM sur un gel préfabriqué d’agarose à 4 % contenant une coloration fluorescente d’acide nucléique à l’aide du système d’électrophorèse sur gel approprié (voir tableau des matériaux, figure 5). Exécutez une seule réplication HRM positive, négative, NTC et échantillon qPCR.
    REMARQUE: Les gants doivent toujours être portés lors de la manipulation de gels. Tout autre système d’électrophorèse sur gel peut remplir cet objectif si le pourcentage équivalent d’agarose, la coloration d’acide nucléique fluorescent et le format de puits sont choisis.
  2. Exécutez le système d’électrophorèse sur gel selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux). Retirez le gel préfabriqué dans la cassette de l’emballage, retirez le peigne et insérez-le dans l’appareil conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
    REMARQUE: Chargez le gel dans les 15 minutes suivant l’ouverture de l’emballage.
  3. Diluer un échantillon de 10 μL à 20 μL avecduH2O stérile, sans RNase et sans DNase. Chargez chaque puits avec 20 μL d’échantillon dilué.
  4. Diluer 3 μL de solution étalon de taille d’ADN à 20 μL avecH2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir Tableau des matériaux). Charger le puits M avec 20 μL de solution étalon diluée de taille d’ADN (Figure 6).
  5. Remplissez tous les puits vides avec 20 μL de H2Ostérile, sans RNase et sans DNase.
  6. Sélectionnez immédiatement le programme en fonction du pourcentage du gel en cours d’exécution et réglez la durée d’exécution de l’appareil à 10 minutes.
  7. Démarrez l’électrophorèse dans les 1 min suivant le chargement de l’échantillon en appuyant sur le bouton GO. Le temps d’électrophorèse peut être prolongé si une résolution insuffisante est obtenue.
    REMARQUE: Ne pas dépasser la durée maximale recommandée de l’électrophorèse de l’agarose conformément aux instructions du fabricant.
  8. Lorsque l’électrophorèse est terminée, visualisez l’ADN dans le gel à l’aide d’une lumière bleue ou d’une transillumination UV. La visualisation, l’analyse et le stockage des images d’électrophorèse sont principalement effectués par un imageur de gel avec système de documentation photographique (Figure 5).
  9. Analyser et interpréter le modèle de gel visualisé des produits qPCR HRM en comparant les résultats de l’échantillon inconnu à des témoins positifs(Figure 7 et Figure 8).
  10. Si l’échantillon inconnu de résultats de GRH et d’électrophorèse sur gel indique qu’une variante génétique inconnue est présente, séquencer le produit de GRH qPCR à l’aide d’amorces décrites dans le tableau des matériaux selon le protocole décrit13.
    ATTENTION : Les gels d’agarose contenant une coloration d’acide nucléique fluorescent doivent être éliminés correctement conformément aux règlements de l’établissement.

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Representative Results

La région d’intérêt de l’ADN amplifié avec une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 et des valeurs très étroites du cycle de quantification (Cq) dans tous les échantillons et témoins répliqués(Figure 2)est une condition préalable à l’identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM. Ceci est réalisé en utilisant une détermination précise de l’ADN avec coloration par fluorescence et une quantité égale d’ADN dans l’expérience qPCR HRM (voir étape 1.2). La figure 2 montre l’amplification réussie de la région d’intérêt de l’ADN où les valeurs Cq de tous les échantillons et témoins sont dans un intervalle très étroit. Il n’y a pas d’amplification dans les puits du CNT.

L’étape HRM est effectuée immédiatement après qPCR à l’aide du protocole décrit à l’étape 1.11. Les régions de fusion actives (Figure 3, étiquette (c)) des échantillons, les contrôles et le NTC sont utilisés pour créer leurs tracés de courbe de fusion alignés (Figure 4). Par conséquent, les régions/lignes de température pré- et post-fusion correctement réglées(Figure 3A)sont importantes pour visualiser et identifier correctement les variantes génétiques dans les échantillons. La figure 4A et la figure 4B montrent les courbes de fusion alignées et les diagrammes de différence, respectivement, où l’identification de variantes génétiques est possible. Les échantillons inconnus sont étroitement alignés avec l’un des témoins positifs. La figure 3B montre des régions/lignes de température de pré- et post-fusion mal définies. Il en résulte une courbe de fusion alignée et des diagrammes de différence où l’identification correcte des variantes génétiques est plus difficile(Figure 4C et Figure 4D).

Pour confirmer les résultats de la GRH et pour détecter si une méthode de séquençage standard ou de prochaine génération est nécessaire pour identifier la variante génétique présente dans l’échantillon, l’électrophorèse sur gel d’agarose est utilisée. La figure 7 montre l’électrophorèse sur gel d’agarose des mêmes échantillons et témoins que ceux présentés à la figure 4. La variante génétique de l’échantillon peut être identifiée en comparant le motif de bande de l’échantillon aux témoins et en combinant l’électrophorèse hrM et l’électrophorèse sur gel d’agarose. Cependant, l’identification correcte de la variante génétique ne peut être effectuée que pour les échantillons qui contiennent la même variante génétique que l’un des témoins utilisés dans le test HRM (Figure 7). Les échantillons contenant des variantes génétiques CALR rares diffèrent par le résultat de la GRH et le schéma de bande d’électrophorèse (Figure 8). Dans ce cas, le séquençage de Sanger ou même la méthode de séquençage de nouvelle génération sont utilisés pour identifier la variante génétique exacte.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de l’algorithme de détection des variantes génétiques somatiques dans le gène CALR par GRH, électrophorèse sur gel d’agarose et méthodes de séquençage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme d’amplification du test qPCR HRM pour la détection des variantes génétiques du gène CALR. Le diagramme d’amplification est affiché sous forme de fluorescence brute normalisée à la fluorescence à partir de la référence passive (ΔRn) et en fonction d’un nombre de cycle. La ligne de base est définie de 3 à 15 cycles lorsque la région d’intérêt de l’ADN a été amplifiée efficacement en utilisant 20 ng d’ADN de haute qualité dans la réaction qPCR. Les diagrammes d’amplification normaux de la région d’intérêt de l’ADN de tous les échantillons sont représentés par des lignes vertes. Les graphiques montrent une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 dans l’expérience en utilisant 20 ng d’ADN de haute qualité dans la réaction qPCR. Le graphique ne montre aucune amplification dans les puits d’échantillonnage non gabarits (CNT). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Courbes de fusion dérivées dans le test HRM qPCR pour la détection des variantes génétiques du gène CALR.  A) Exemple de régions/lignes de température correctement définies avant et après fusion. La ligne de température d’arrêt préfusion doit être adjacente au début de la région de transition de fusion. La ligne de température de début post-fusion doit être adjacente à l’extrémité de la région de transition de fusion. L’étiquette a) indique la paire de lignes à gauche des pics où les températures de début et d’arrêt de la préfusion sont définies. Chaque amplicon est double brin. L’étiquette (b) indique les pics de données de la région de fusion active utilisée pour créer le tracé des courbes de fusion alignées. L’étiquette (c) indique la paire de lignes à droite des pics où les températures de départ et d’arrêt post-fusion sont définies. Chaque amplicon est simple brin. B) Exemple de régions/lignes de température de pré- et post-fusion mal définies. Le début et l’arrêt des conduites de température avant et après fusion ne sont pas adjacents aux régions de transition de fusion et sont séparés de plus de 0,5 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Courbes de fusion alignées et diagrammes de différence dans le test qPCR HRM pour la détection des variantes génétiques du gène CALR.  A) et B) montrent les courbes de fusion alignées et les diagrammes de différence après que les régions/lignes de température avant et après fusion ont été correctement définies. A)Les courbes de fusion alignées des témoins positifs avec une délétion de 52 pb (mutation de type 1), une insertion de 5 pb (mutation de type 2) et un type sauvage sont de couleur orange, violette et rouge, respectivement. B) Le diagramme de différence des mêmes échantillons que celui décrit dans le panneau A. C) et D) montrent les courbes de fusion alignées et les diagrammes de différence après les régions/lignes de température de pré- et post-fusion incorrectement définies pour le même ensemble d’échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Le système d’électrophorèse sur gel. A) Les unités de base du système d’électrophorèse sur gel (voir Tableau des matériaux). B)Imageur de gel avec système de photo-documentation composé d’une caméra CCD, d’une chambre avec des lumières trans/éclairantes appropriées et d’un filtre photographique (voir Tableau des matériaux). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Chargement du gel avec des échantillons dilués et une solution étalon de taille d’ADN ouH2Osans RNase et DNase pour les puits vides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Analyses des produits de GRH qPCR sur électrophorèse sur gel. Le gel a été exposé à un transilluminateur UV. L’image a été prise par le système de documentation photographique (Figure 5B). Les puits de 1 à 3 montrent des témoins: délétion de 52 pb (mutation de type 1), insertion de 5 pb (mutation de type 2) et variante de type sauvage, respectivement. Le motif de bande des échantillons inconnus dans les puits 4-10 les indique comme la variante génétique de type sauvage. Le puits M représente une solution étalon de taille d’ADN dilué (100 à 2 000 pb). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Analyses hrM et électrophorèse sur gel des variantes génétiques du gène CALR.  A) Analyses de GRH. Les courbes de fusion alignées des témoins positifs avec une délétion de 52 pb (mutation de type 1), une insertion de 5 pb (mutation de type 2) et un type sauvage sont de couleur orange, violet et rouge, respectivement. L’échantillon inconnu avec les différentes variantes génétiques est indiqué comme couleur bleu foncé. B) Analyses d’électrophorèse sur gel. Les puits de 1 à 3 montrent des témoins: délétion de 52 pb (mutation de type 1), insertion de 5 pb (mutation de type 2) et variante de type sauvage, respectivement. Le motif de bande de l’échantillon inconnu dans la voie 9 indique les différentes variantes génétiques comme témoins. D’autres échantillons inconnus sont la variante de type sauvage. Le puits M représente la solution étalon de taille d’ADN dilué (100 à 2 000 pb). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Limite de détection du test de GRH. Une dilution en série d’un échantillon d’une délétion de 52 pb (mutation de type 1) et d’une insertion de 5 pb (mutation de type 2) est présentée présentant une charge d’allèles variants génétiques d’environ 50% selon l’analyse de séquençage de Sanger et le test qPCR HRM selon le protocole décrit dans cet article. A) et B) montrent les courbes de fusion alignées et les diagrammes de différence pour les dilutions de type sauvage et en série d’une délétion de 52 pb (mutation de type 1). C) et D) montrent les courbes de fusion alignées et les diagrammes de différence pour les dilutions de type sauvage et en série d’une insertion de 5 pb (mutation de type 2). Dans les deux cas, la variante génétique CALR a pu être détectée avec une dilution allant jusqu’à 1,56%. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La fusion à haute résolution de l’ADN est une solution simple pour le génotypage et le balayage des variantesgénétiques 14. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour un certain groupe de patients atteints de cancer1,2,15,16,10. Les délétions ou insertions dans le gène d’intérêt peuvent être détectées par l’analyse HRM comme nous l’avons montré à la figure 4A. Lors de la mise en œuvre du test qPCR HRM dans les tests de routine, nous avons effectué une étude d’évaluation initiale incluant 21 patients ET JAK2 V617F négatifs avec un âge médian de 63 ans (allant de 24 à 90 ans). Une variante génétique du gène CALR a été détectée chez 12 des 21 patients etét négatifs JAK2 V617F (proportion 0,57). Une délétion de 52 pb (mutation de type 1) a été détectée chez 9 patients sur 21 (proportion 0,43), une insertion de 5 pb (mutation de type 2) a été détectée chez 3 patients JAK2 V617F négatifs sur 21 (proportion 0,143). Les résultats sont cohérents avec les données de la littérature1,2,17.

L’identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM peut être réalisée grâce au développement approprié du test qui garantit que l’expérience est optimisée pour hrM. Des facteurs autres que la séquence peuvent être une source de petites différences dans les courbes HRM telles que la conception de l’apprêt, la longueur de l’amplicon, la sélection du colorant, le choix du réactif qPCR HRM et les profils de température et de temps des étapes qPCR HRM. C’est la partie du tout début du développement et de l’optimisation du test qPCR HRM et a déjà été discutéailleurs 12,14,18. Cependant, une identification fiable des variantes génétiques dans le gène CALR avec une sensibilité comparable des tests pourrait être réalisée sur différentes plates-formes hrM en utilisant les mêmes séquences d’amorce19. Le point le plus critique dans le processus d’optimisation du test qPCR HRM était l’optimisation de la température de fusion et d’allongement dans l’étape qPCR du test qPCR HRM. Aucune modification n’a été nécessaire pour l’étape 12 de laGRH. Dans les tests de routine, d’autres facteurs influençant les résultats de la GRH deviennent plus importants à suivre.

L’ADN de haute qualité remis en suspension dans un tampon à faible teneur en sel tel que TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA ou concentration inférieure) et la même quantité d’ADN dans le test qPCR HRM sont des facteurs importants pour une région d’intérêt de l’ADN amplifiée avec succès avec un plateau de signal élevé dans la phase d’amplification qPCR (Figure 2). Cela conduit à une identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM (Figure 4A,4B)12,14. Un tampon à haute teneur en sel utilisé pour l’élution de l’ADN dans le protocole d’extraction peut modifier subtilement la thermodynamique de la transition de fusion de l’ADN. La précipitation et la remise en suspension dans un tampon à faible teneur en sel TE ou la dilution de l’échantillon peuvent résoudre le problème des impuretés dans l’échantillon d’ADN. L’ADN de mauvaise qualité peut produire des produits pcR non spécifiques ou une amplification ratée. Tout cela peut entraîner une reproductibilité plus faible et un taux d’erreur plus élevé dans la détection des variantes HRM. Une optimisation supplémentaire pour les échantillons difficiles tels que l’ADN extrait d’échantillons incorporés dans la paraffine pourrait être nécessaire pour obtenir un résultat hrM optimal15.

De grandes différences dans la quantité d’ADN utilisée dans le test qPCR HRM peuvent avoir un impact sur la température de fusion (Tm) résultante et, par conséquent, conduire à des résultats non concluants. Par conséquent, la détermination précise de la concentration d’ADN et la dilution de tous les échantillons d’ADN sont obligatoires20. Les méthodes d’absorption ultraviolette (UV) et de coloration par fluorescence déterminent avec précision les concentrations de solutions d’ADN de haute pureté21. La méthode d’absorbance UV pourrait être utilisée pour évaluer la pureté des solutions d’ADN en effectuant des mesures d’absorbance de rapport à A260/A280 et A260/230. Cependant, la méthode de coloration fluorescente est plus sensible à la dégradation de l’ADN que la méthode d’absorption UV et permet de déterminer plus précisément la concentration d’ADN21. Par conséquent, il est plus approprié pour la normalisation de la quantification et de la dilution de tous les échantillons d’ADN dans l’analyse HRM20,21.

Les indels sont les principales variantes génétiques du gène CALR observées chez les patients atteints deNPP 1. Au fur et à mesure que la longueur du produit change et augmente, la différence entre les courbes de type sauvage et les courbes hétérozygotes devient plus petite et la détection de variante devient plus difficile7. Par conséquent, une méthode supplémentaire pour la clarification de cette variante génétique devrait être utilisée.

Un bon exemple est l’électrophorèse sur gel d’agarose. Il s’agit d’une méthode simple et efficace pour séparer des fragments d’ADN de différentes tailles22,23. Les molécules d’ADN sont séparées par taille dans le gel d’agarose de sorte que la distance parcourue est inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire24. La figure 4A, la figure 4B et la figure 7 montrent des exemples où les deux types les plus courants de variante génétique CALR, la délétion 52 pb et l’insertion 5 pb, sont identifiés en combinant les résultats de l’électrophorèse sur gel qPCR et de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Cependant, lorsque le résultat de la GRH et le motif de bande d’électrophorèse sur gel d’agarose indiquent une variante génétique différente (y compris un changement de nucléotide unique) comme chez les témoins(Figure 8),le séquençage de Sanger est toujours nécessaire pour identifier la variante génétique exacte10.

Un faible niveau de variante génétique somatique dans le gène CALR peut être présent dans l’échantillon du patient, ce qui rend une interprétation de la GRH qPCR, de l’électrophorèse sur gel d’agarose et des résultats du séquençage de Sanger plus exigeante, en particulier à la limite de détection du test(Figure 9). Toute ligne de forme de courbe de fusion différente du type sauvage indique la variante génétique présente dans l’échantillon. La sensibilité du test qPCR HRM est inférieure à 5 %(figure 9 et référence19)et est plus sensible que la méthode de séquençage de Sanger, dont la sensibilité a été rapportée à 15-20 %19. Dans ces cas, la méthode de séquençage profond de nouvelle génération qui détecte les indels plus importants pourrait être appliquée et confirmer le résultat de la GRH. En conclusion, l’analyse HRM est une méthode puissante pour le génotypage et le balayage de la variation génétique des variantes génétiques somatiques dans le gène CALR. L’identification des différents types de variantes génétiques est principalement basée sur les témoins utilisés dans le test qPCR HRM. Des résultats plus fiables sont obtenus en combinant les résultats de la GRH avec les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose. En cas de résultats non concluants, le séquençage standard de Sanger ou une méthode de séquençage de nouvelle génération encore plus sensible peut être utilisé pour identifier correctement la variante génétique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier tous les experts universitaires et les employés du Laboratoire d’hématologie spécialisée, Département d’hématologie, Division de médecine interne, Centre médical universitaire de Ljubljana.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E-Gel EX 4% Agarose Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit Invitrogen, Thermo Fischer Scientific G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific 4415440 Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4346907
MicroAmp Optical adhesive film Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4311971
NuGenius Syngene NG-1045 Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse Eurofins Genomics Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51306 DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32856
QUBIT dsDNA HS assay Invitrogen, Thermo Fischer Scientific Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder Invitrogen, Thermo Fischer Scientific 10488058 Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific 4453534
Water nuclease free VWR, Life Science 436912C RNase, DNase and Protease free water

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Génétique numéro 162 Analyse de fusion à haute résolution réaction en chaîne quantitative en temps réel de polymérase basée sur la fluorescence variante génétique électrophorèse sur gel d’agarose préfabriquée mutation somatique indel balayage hétéroduplex CALR
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