Summary
Høyoppløselig smelteanalyse (HRM) er en sensitiv og rask løsning for genetisk variantdeteksjon. Det avhenger av sekvensforskjeller som resulterer i at heteroduplexer endrer formen på smeltekurven. Ved å kombinere HRM og agarose gelelektroforese, kan forskjellige typer genetiske varianter som indels identifiseres.
Abstract
Høyoppløselig smelteanalyse (HRM) er en kraftig metode for genotyping og genetisk variasjonsskanning. De fleste HRM-applikasjoner er avhengige av mettende DNA-fargestoffer som oppdager sekvensforskjeller, og heteroduplekser som endrer formen på smeltekurven. Utmerket instrumentoppløsning og spesiell dataanalyseprogramvare er nødvendig for å identifisere de små smeltekurveforskjellene som identifiserer en variant eller genotype. Ulike typer genetiske varianter med forskjellige frekvenser kan observeres i genet som er spesifikt for pasienter med en bestemt sykdom, spesielt kreft og i CALR-genet hos pasienter med Philadelphia-kromosom-negative myeloproliferative neoplasmer. Enkelt nukleotidendringer, innsettinger og/eller slettinger (indels) i genet av interesse kan oppdages av HRM-analysen. Identifiseringen av ulike typer genetiske varianter er for det meste basert på kontrollene som brukes i qPCR HRM-analysen. Men etter hvert som produktlengden øker, blir forskjellen mellom wild-type og heterozygote kurver mindre, og typen genetisk variant er vanskeligere å bestemme. Derfor, hvor indels er den utbredte genetiske varianten som forventes i genet av interesse, kan en ekstra metode som agarose gel elektroforese brukes til avklaring av HRM-resultatet. I noen tilfeller må et inkonklusivt resultat kontrolleres/diagnostiseres på nytt ved standard Sanger-sekvensering. I denne retrospektive studien brukte vi metoden på JAK2 V617F-negative pasienter med MPN.
Introduction
Somatiske genetiske varianter i calreticulin-genet (CALR) ble anerkjent i 2013 hos pasienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN) som essensiell trombocytemi og primær myelofibrose1,2. Siden da har mer enn 50 genetiske varianter i CALR-genet blitt oppdaget, og induserer en +1 (−1 +2) frameshift3. De to hyppigste CALR genetiske varianter er en 52 bp sletting (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs *46)), også kalt type 1 mutasjon, og en 5 bp innsetting (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs*47)), også kalt type 2 mutasjon. Disse to genetiske variantene representerer 80% av alle CALR genetiske varianter. De andre har blitt klassifisert som type 1-lignende eller type 2-lignende ved hjelp av algoritmer basert på bevaring av en α helix nær wild type CALR4. Her presenterer vi en av de svært følsomme og raske metodene for CALR genetisk variantdeteksjon, den høyoppløselige smelteanalysemetoden (HRM). Denne metoden muliggjør rask deteksjon av type 1 og type 2 genetiske varianter, som representerer de fleste CALR-mutasjoner 5. HRM ble introdusert i kombinasjon med sanntid »polymerasekjedereaksjon« (qPCR) i 1997 som et verktøy for å oppdage mutasjonen i faktor V Leiden6. Sammenlignet med Sanger-sekvensering som representerer den gylne standardteknikken, er HRM en mer følsom og mindre spesifikk metode5. HRM-metoden er en god screeningmetode som muliggjør en rask analyse av et stort antall prøver med stor nytte-kostnadsgevinst5. Det er en enkel PCR-metode utført i nærvær av fluorescerende fargestoff og krever ikke spesifikke ferdigheter. En annen fordel er at selve prosedyren ikke skader eller ødelegger den analyserte prøven som gjør at vi kan gjenbruke prøven for elektroforese eller Sanger-sekvensering etter HRM-prosedyren7. Den eneste ulempen er at det noen ganger er vanskelig å tolke resultatene. I tillegg oppdager HRM ikke den nøyaktige mutasjonen hos pasienter med mutasjoner av ikke-type 1 eller type 28. Hos disse pasientene skal Sanger-sekvensering utføres (figur 1).
HRM er basert på forsterkning av den spesifikke DNA-regionen i nærvær av mettende DNA fluorescerende fargestoff, som er innlemmet i dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Det fluorescerende fargestoffet avgir lys når det er innlemmet i dsDNA. Etter en progressiv temperaturøkning bryter dsDNA ned i enkeltstrenget DNA, som kan oppdages på smeltekurven som en plutselig reduksjon i fluorescensintensiteten. Formen på smeltekurven avhenger av DNA-sekvensen som brukes til å oppdage mutasjonen. Smeltekurver av prøver sammenlignes med smeltekurver av kjente mutasjoner eller villtype CALR. Distinkte smeltekurver representerer en annen mutasjon som ikke er type 1 eller type 29.
Algoritmen for den somatiske genetiske variantdeteksjonen i CALR-genet av HRM, agarose gelelektroforese og sekvenseringsmetode (figur 1) ble brukt og validert i den retrospektive studien publisert før10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av Komiteen for medisinsk etikk i Republikken Slovenia. Alle prosedyrer var i samsvar med Helsinki-erklæringen.
1. Fluorescensbasert kvantitativ sanntids PCR (qPCR) og post-qPCR analyse av HRM
- Spenningsprimere oppført i materialtabellen til 100 μM med sterile, RNase og DNase fri H2O (se Materialfortegnelse). Lag en 10 μM arbeidskonsentrasjonsprimer. Primere som brukes i protokollen, ble publisert før2.
- Kvantumsgranulocytter DNA ved fluorescensfargingsmetoden etter produsentens instruksjon11 (se Materialfortegnelse). Forbered en 20 ng/μL DNA-løsning ved hjelp av 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9.0 (se Materialfortegnelse).
- I tillegg til DNA-prøver, lag minst tre DNA-kontroller: to positive kontroller med NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp sletting eller type 1 mutasjon), og NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs*47) (5 bp innsetting eller type 2) genetisk variant, samt wild-type DNA og negativ kontroll som en ikke-mal (NTC) kontroll.
MERK: Før du utfører HRM-oppsettet, må du bekrefte at qPCR-instrumentet er kalibrert for HRM-eksperimenter.
- I tillegg til DNA-prøver, lag minst tre DNA-kontroller: to positive kontroller med NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp sletting eller type 1 mutasjon), og NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs*47) (5 bp innsetting eller type 2) genetisk variant, samt wild-type DNA og negativ kontroll som en ikke-mal (NTC) kontroll.
- Forbered qPCR HRM Master Mix i henhold til produsentens protokoll (se Materialtabell) som følger: 10 μL 2x qPCR Master Mix med Fargestoff, 0,2 μL μL 10 μM foroverprimer, 0,2 μL 10 μM reversprimer, 8,6 μL steril, RNase og DNase fri H2O. Bruk primerne fra materialtabellen. Kjør tre repliker for hver DNA-prøve og kontroll.
- Klargjør qPCR HRM Master Mix i henhold til antall prøver som behandles. Inkluder overflødig volum på minst 10% i beregningene for å gi overflødig volum for tapet som oppstår under reagensoverføringer.
- Bland reaksjonsinnholdet ved å tappe forsiktig og invertere røret og virvelen i 2-3 s. Samle alle de spredte dråpene fra veggen av røret til bunnen med et kort spinn.
- Klargjør en reaksjonsplate som passer for instrumentet og HRM-eksperimentet (se Materialtabell). Overfør 19 μL av qPCR HRM Master Mix til de aktuelle brønnene på den 96-brønns optiske reaksjonsplaten.
- Pipet 1 μL av de negative kontrollene, positive kontroller og prøver i de aktuelle brønnene til den optiske reaksjonsplaten. For NTC, overfør 1 μL steril, RNase og DNase gratis H2O som brukes til å forberede qPCR HRM Master Mix i stedet for DNA.
- Forsegle reaksjonsplaten med den optiske klebefilmen. Gjør det godt for å forhindre fordampning under løpeturen. Kontroller at den optiske klebefilmen er plan over alle brønnene i reaksjonsplaten for å sikre korrekt fluorescensdeteksjon.
- Snurr reaksjonsplaten ved 780 x g ved romtemperatur (RT) i 1 minutt. Kontroller at væsken er på bunnen av brønnene i reaksjonsplaten. Fortsett med å kjøre analysen.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar platen ved 4 °C i ikke mer enn 24 timer. La platen som er lagret ved 4 °C varmes opp til RT, og snurr deretter platen kort før du kjører den. - I henhold til produsentens instruksjon forberede og starte løpet for å forsterke og smelte DNA og å generere HRM fluorescensdata i qPCR instrumentet. I instrumentsystemprogramvaren tilordner du kontrollene og prøvene til de aktuelle brønnene.
- For calr genetisk variant deteksjon, endre standard instrument forsterkning protokollen og forsterke DNA ved hjelp av følgende termisk sykling protokoll: 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av 50 sykluser av 95 °C i 10 s og 62,5 °C i 60 s.
- Utfør smeltekurven/dissosiasjonstrinnet (HRM) umiddelbart etter qPCR i henhold til produsentensanvisninger 12 som følger: 95 °C i 10 s, 60 °C i 1 min, og deretter en rampehastighet på 0,025 °C/s til 95 °C. Hold temperaturen ved 95 °C i 15 s og ved 60 °C i 15 s.
- Kjøringen avsluttes automatisk. Først må du gå gjennom og bekrefte forsterkningsplottet (figur 2).
- Velg alternativet for forsterkningsplott i eksperimentmenyen til instrumentsystemprogramvaren. Hvis ingen data vises, klikker du den grønne knappen Analyser.
- I kategorien Forsterkningsplott velger du plottet som viser forsterkningsdataene som rå fluorescensavlesninger normalisert til fluorescensen fra den passive referansen (ΔRn) som en funksjon av syklusnummer (ΔRn vs Cycle). Velg Eksempelpå rullegardinmenyen tegnefarge .
- Velg den lineære forsterkningsgraftypen på rullegardinmenyen diagramtype. Vis start- og sluttsyklusen for grunnlinje i det lineære forsterkningsdiagrammet ved å velge alternativet for planlagt start. Kontroller at grunnlinjen er riktig angitt. Endesyklusen bør stilles inn noen sykluser før syklusnummeret der betydelig fluorescerende signal oppdages. Grunnlinjen angis vanligvis fra 3 til 15 sykluser (figur 2).
- Velg graftypen log10-forsterkning på rullegardinmenyen graftype for graftype. Vis terskellinjen i diagrammet ved å velge terskelalternativet. Juster terskelen tilsvarende hvis den ikke er riktig innstilt. Den riktig angitte terskelverdien betyr at terskellinjen krysser den eksponentielle fasen av qPCR-kurvene (figur 2).
- Kontroller at normale forsterkningskurver er i alle prøve- og positive kontrollbrønner. Kontroller at det ikke er forsterkning i NTC-brønnene før syklus 40. Et normalt forsterkningsplott viser en eksponentiell økning i fluorescens som overskrider terskelen mellom syklusene 15 og 35 (figur 2). Utelukke prøvebrønnene fra analysen dersom det ikke er forsterkning i brønnposisjonen.
MERK: Hvis forsterkningsplottet ser unormalt ut eller NTC-brønnen indikerer forsterkningen, må du identifisere og løse problemet i henhold til produsentens feilsøkingsveiledning. - Utelat det ytterste med kvantifiseringssyklusverdien (Cq) som er forskjellig fra replikeringer med mer enn 2 i instrumentsystemprogramvaren12. Ytterkantene kan gi feilaktige HRM-resultater.
- I de avledede smeltekurvene bør du gå gjennom for- og ettersmeltingsområdene/temperaturlinjene. Pre- og postsmeltingsregionene bør være innenfor et flatt område der det ikke er store topper eller bakker i fluorescerende nivåer (figur 3). Juster det om nødvendig deretter. Sett opp start- og stopp på temperaturlinjene for for- og ettersmelting ca. 0,5 °C bortsett fra hverandre (figur 3). Start analysen på nytt hvis parametrene justeres ved å klikke på Analyser-knappen.
- I kategorien differensplott velger du en av de ville kontrollene (homozygote) som referanse-DNA og starter analysen på nytt ved å klikke på Analyser-knappen.
- I kategorien justerte smeltekurver kontrollerer du at alle positive kontroller har riktig genotype, og at NTC ikke kan forsterkes (figur 4). Fra brønntabellen velger du brønnene som inneholder en positiv kontroll for å markere den tilsvarende smeltekurven i analyseplottene. Kontroller at fargen på linjen tilsvarer riktig genotype. Gjenta trinn for brønnene som inneholder de andre positive kontrollene og NTC.
- I kategorien Justerte smeltekurver ser du nøye gjennom tegnevisningene for de ukjente prøvene og sammenligner dem med tegnevisningene for kontroller (Figur 4). Fra brønntabellen velger du brønnene som inneholder den ukjente prøven replikerer, kontrollerer fargen på smeltekurven og justerer dem etter kontrollene i en ordnet rekkefølge ved å velge brønnene som inneholder positive kontroller en etter en. Gjenta prosessen for alle ukjente prøver.
MERK: Den ukjente prøven inneholder varianten av en av kontrollene hvis smeltekurven er tett justert etter den. Ulike variantgrupper (forskjellige farger) kan vises, noe som indikerer at den ukjente prøven består av en ukjent variant, som ikke tilsvarer kontrollene (figur 8). Et lavt nivå av den somatiske genetiske varianten kan være til stede i pasientens prøve. Dette kan påvirke tolkningen av HRM-resultatet, spesielt ved deteksjonsgrensen for analysen (figur 9). I disse tilfellene kan fargen eller til og med formen på linjen ligne på den wild-type genotypen.- Når resultatet er inkonklusivt, kombiner HRM-resultatene med resultatene av agarose gelelektroforese og sekvenseringsmetoder. Test eksemplet eller forespørselen på nytt, og test et nytt eksempel på nytt om nødvendig.
- Se nøye gjennom datasettet for replikeringskurver, og kontroller at justeringen av hver replikering i gruppen er stram. Utelat replikeringen hvis den ikke er tett justert i forhold til de andre prøvene i gruppen (ytterste). Test eksemplet på nytt hvis det finnes flere ytterpunkter og resultatene ikke er entydige. Vær oppmerksom på at mengden og kvaliteten på DNA-prøven påvirker HRM-resultatene.
- Analyser resultatet for det ukjente eksemplet i kategorien Differenstegning . Gjenta prosedyren som er beskrevet i trinn 1.21, og kontroller at resultatene som er oppnådd for det ukjente eksemplet, er de samme.
- Kjør deretter qPCR HRM-produktene på agarose gel.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Oppbevar platen ved 4 °C i ikke mer enn 24 timer eller ved -20 °C i lengre tid, men ikke mer enn 7 dager. La platen som er lagret ved 4 °C varmes opp til RT, og snurr deretter platen kort før du kjører den. La platen som er lagret ved - 20 °C tine og varme til RT, og snurr deretter platen kort før du kjører den.
2. Agarose gel elektroforese
- Kjør qPCR HRM-produkter på en 4 % agarose pre-støpt gel som inneholder en fluorescerende nukleinsyreflekk ved hjelp av riktig gelelektroforesesystem (se Materialtabell, figur 5). Kjør bare én positiv, negativ, NTC og sample qPCR HRM-replikering.
MERK: Hansker skal alltid brukes ved håndtering av geler. Ethvert annet gelelektroforesesystem kan oppfylle dette formålet hvis tilsvarende agaroseprosent, fluorescerende nukleinsyreflekk og brønnformat velges. - Kjør gelelektroforesesystemet i henhold til produsentens protokoll (se Materialfortegnelse). Fjern den forhåndsstøpte gelen i kassetten fra pakken, fjern kammen og sett den inn i apparatet i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialbord).
MERK: Legg gelen innen 15 minutter etter at du har åpnet pakken. - Fortynn en 10 μL prøve til 20 μL med steril, RNase og DNase fri H2O. Last hver brønn med 20 μL fortynnet prøve.
- Fortynn 3 μL av DNA-størrelse standardløsning til 20 μL med steril, RNase og DNase fri H2O (se Materialfortegnelse). Last inn M-brønnen med 20 μL fortynnet standardløsning for DNA-størrelse (figur 6).
- Fyll eventuelle tomme brønner med 20 μL steril, RNase og DNase fri H2O.
- Velg umiddelbart programmet i henhold til prosentandelen av gelen som kjøres og sett operasjonstiden på apparatet til 10 minutter.
- Start elektroforesen innen 1 min etter innlastingsprøven ved å trykke på GO-knappen. Elektroforesetiden kan forlenges hvis det ikke oppnås tilstrekkelig oppløsning.
MERK: Ikke overskrid maksimal anbefalt agarose elektroforese kjøretid i henhold til produsentens anvisninger. - Når elektroforesen er fullført, visualiser DNA i gelen ved hjelp av et blått lys eller UV-transilluminasjon. Visualisering, analyse og lagring av elektroforesebildene gjøres for det meste av en gelbilde med fotodokumentasjonssystem (figur 5).
- Analyser og tolk det visualiserte gelmønsteret for qPCR HRM-produkter ved å sammenligne resultatene av den ukjente prøven med positive kontroller (figur 7 og figur 8).
- Hvis resultatene av den ukjente prøven HRM og gelelektroforese indikerer at en ukjent genetisk variant finnes, sekvenser qPCR HRM-produktet ved hjelp av primere beskrevet i Materialfortegnelse i henhold til protokollen beskrevet13.
FORSIKTIG: Agarosegelene som inneholder en fluorescerende nukleinsyreflekk må kastes på riktig måte i henhold til institusjonens forskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede forsterkede DNA-regionen av interesse med en eksponentiell økning i fluorescens som overskrider terskelen mellom syklus 15 og 35 og svært smale verdier av kvantifiseringssyklusen (Cq) i alle replikerte prøver og kontroller (figur 2) er en forutsetning for pålitelig identifisering av genetiske varianter ved HRM-analyse. Dette oppnås ved å bruke en presis bestemmelse av DNA med fluorescensfarging og like mye DNA i qPCR HRM-eksperimentet (se trinn 1.2). Figur 2 viser vellykket forsterkning av DNA-regionen av interesse der Cq-verdiene til alle prøvene og kontrollene er i et svært smalt intervall. Det er ingen forsterkning i NTC-brønnene.
HRM-fasen utføres umiddelbart etter qPCR ved hjelp av protokollen som er beskrevet i trinn 1.11. De aktive smelteområdene (Figur 3, etikett (c)) for prøvene, kontrollene og NTC brukes til å opprette sine justerte smeltekurveplott (figur 4). Derfor er de riktig innstilte forhåndsinnstilte forhåndsinnstilte og ettersmeltede områdene/temperaturlinjene (figur 3A) viktige for å visualisere og identifisere genetiske varianter i prøvene på riktig måte. Figur 4A og figur 4B viser henholdsvis justerte smeltekurver og differensplott, der identifisering av genetiske varianter er mulig. De ukjente prøvene er tett på linje med en av de positive kontrollene. Figur 3B viser feil innstilte forhåndsinnstilte og ettersmeltede områder/temperaturlinjer. Dette resulterer i en justert smeltekurve og forskjellsplott der riktig identifisering av de genetiske variantene er vanskeligere (Figur 4C og Figur 4D).
For å bekrefte HRM-resultatene og for å oppdage om standard eller neste generasjons sekvenseringsmetode er nødvendig for å identifisere den genetiske varianten som finnes i prøven, brukes agarose gelelektroforese. Figur 7 viser agarosegelelektroforesen til de samme prøvene og kontrollene som vises i figur 4. Den genetiske varianten i prøven kan identifiseres ved å sammenligne båndmønsteret til prøven med kontrollene og ved å kombinere HRM og agarose gelelektroforese. Riktig genetisk variantidentifikasjon kan imidlertid bare gjøres for prøvene som inneholder samme genetiske variant som en av kontrollene som brukes i HRM-analysen (figur 7). Prøver som inneholder sjeldne CALR genetiske varianter varierer i HRM-resultatet og elektroforesebåndmønsteret (figur 8). I dette tilfellet brukes Sanger-sekvensering eller til og med neste generasjons sekvenseringsmetode til å identifisere den nøyaktige genetiske varianten.
Figur 1: Skjematisk representasjon av algoritmen for den somatiske genetiske variantdeteksjonen i CALR-genet ved HRM, agarose gelelektroforese og sekvenseringsmetoder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Forsterkningsplan for qPCR HRM-analysen for påvisning av de genetiske variantene i CALR-genet. Forsterkningsplottet vises som den rå fluorescensen normalisert til fluorescensen fra den passive referansen (ΔRn) og som en funksjon av et syklusnummer. Grunnlinjen er satt fra 3 til 15 sykluser da DNA-interesseområdet effektivt ble forsterket ved hjelp av 20 ng av høyverdig DNA i qPCR-reaksjonen. De normale forsterkningsplottene i DNA-regionen av interesse for alle prøvene vises som grønne linjer. Plott viser en eksponentiell økning i fluorescens som overskrider terskelen mellom syklus 15 og 35 i eksperimentet ved hjelp av 20 ng dna av høy kvalitet i qPCR-reaksjon. Grafen viser ingen forsterkning i de ikke-malprøvebrønnene (NTC). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Derivat smeltekurver i qPCR HRM-analysen for påvisning av de genetiske variantene i CALR-genet. A) Et eksempel på riktig innstilte forhåndsinnstilte og ettersmeltede områder/temperaturlinjer. Stopptemperaturlinjen for forsmelting må ligge ved siden av starten av smelteovergangsområdet. Starttemperaturlinjen etter smelten må ligge ved siden av slutten av smelteovergangsområdet. (a)-etiketten angir linjeparet til venstre for toppene der forsmeltingen starter og stopptemperaturen stilles inn. Hver amplikon er dobbeltstrenget. (b)-etiketten angir datatoppene i det aktive smelteområdet som brukes til å opprette den justerte smeltekurven. (c)-etiketten angir linjeparet til høyre for toppene der ettersmeltingen starter og stopptemperaturene stilles inn. Hver amplikon er enstrenget. B) Et eksempel på feil innstilte forhåndsinnstilte og ettersmeltede områder/temperaturlinjer. Starten og stoppen på temperaturlinjene før og etter smelte er ikke ved siden av smelteovergangsområdene og er mer enn 0,5 °C bortsett fra hverandre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Justerte smeltekurver og differensplott i qPCR HRM-analysen for påvisning av de genetiske variantene i CALR-genet. A) og B) viser de justerte smeltekurvene og differensplottene etter at områdene/temperaturlinjene før og etter smelting er riktig angitt. A) De justerte smeltekurvene til de positive kontrollene med 52 bp-sletting (type 1 mutasjon), 5 bp-innsetting (type 2-mutasjon) og en wild-type vises som henholdsvis oransje, lilla og rød farge. B) Forskjellen på de samme prøvene som beskrevet i panel A. C) og D) viser de justerte smeltekurvene og differensplottene etter feil angitte forhåndsinnstilte og ettersmeltede områder/temperaturlinjer for samme sett med prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Gelelektroforesesystemet. A) De grunnleggende enhetene i gelelektroforesesystemet (se Materialtabell). B) Gel imager med fotodokumentasjonssystem bestående av et CCD-kamera, et kammer med egnede trans-/belysningslys og et fotografisk filter vises (se Materialfortegnelser). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Lasting av gelen med fortynnede prøver og standardløsning med DNA-størrelse eller RNase og DNase fri H2O for tomme brønner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Analyser av qPCR HRM-produktene på gelelektroforese. Gelen ble eksponert for UV-transilluminator. Bildet er tatt av fotodokumentasjonssystemet (Figur 5B). Brønner fra 1 til 3 viser kontroller: 52 bp sletting (type 1 mutasjon), 5 bp innsetting (type 2 mutasjon) og wild-type variant, henholdsvis. Båndmønsteret til de ukjente prøvene i brønnene 4-10 indikerer dem som den ville genetiske varianten. M-brønnen representerer fortynnet DNA-størrelsesstandardløsning (100 til 2000 bp). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: HRM- og gelelektroforeseanalyser av de genetiske variantene i CALR-genet. A) HRM-analyser. De justerte smeltekurvene for de positive kontrollene med 52 bp-sletting (type 1 mutasjon), 5 bp-innsetting (type 2-mutasjon) og en wild-type vises som henholdsvis oransje, lilla og rød farge. Den ukjente prøven med den forskjellige genetiske varianten er angitt som mørk blå farge. B) Gel elektroforese analyser. Brønner fra 1 til 3 viser kontroller: 52 bp sletting (type 1 mutasjon), 5 bp innsetting (type 2 mutasjon) og wild-type variant, henholdsvis. Båndmønsteret til den ukjente prøven i kjørefelt 9 indikerer den forskjellige genetiske varianten som kontroller. Andre ukjente prøver er wild-type varianten. M-brønnen representerer den fortynnede standardløsningen for DNA-størrelse (100 til 2000 bp). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Grensen for påvisning av HRM-analyse. En seriell fortynning av et utvalg på en 52 bp-sletting (type 1 mutasjon) og 5 bp-innsetting (type 2 mutasjon) presenteres som viser en genetisk variant allele byrde på ca. 50% i henhold til Sanger sekvenseringsanalyse og qPCR HRM-analysen i henhold til protokollen beskrevet i denne artikkelen. A) og B) viser de justerte smeltekurvene og differensplottene for ville og serielle fortynninger av en 52 bp-sletting (type 1-mutasjon). C) og D) viser de justerte smeltekurvene og differensplottene for ville og serielle fortynninger av en 5 bp-innsetting (type 2 mutasjon). I begge tilfeller kan CALR genetisk variant påvises i opptil 1,56% fortynning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Høyoppløselig smelting av DNA er en enkel løsning for genotyping og genetisk variantskanning14. Det avhenger av sekvensforskjeller som resulterer i heteroduplexer som endrer formen på smeltekurven. Ulike typer genetiske varianter med forskjellige frekvenser kan observeres i genet som er spesifikt for en bestemt gruppe pasienter med kreft1,2,15,16,10. Slettinger eller innsettinger i genet av interesse kan oppdages av HRM-analysen som vi har vist i figur 4A. Ved implementeringen av qPCR HRM-analysen i rutinetestingen har vi utført en innledende evalueringsstudie, inkludert 21 JAK2 V617F-negative ET-pasienter med en median alder på 63 år (varierer fra 24 til 90 år). En genetisk variant i CALR-genet ble påvist hos 12 av 21 JAK2 V617F-negative ET-pasienter (andel 0,57). En 52 bp sletting (type 1 mutasjon) ble påvist hos 9 av 21 (andel 0,43), en 5 bp innsetting (type 2 mutasjon) ble påvist hos 3 av 21 (andel 0,143) JAK2 V617F-negative ET-pasienter. Resultatene samsvarer med dataene fra litteraturen1,2,17.
Pålitelig identifisering av genetiske varianter ved HRM-analyse kan oppnås gjennom riktig analyseutvikling som sikrer at eksperimentet er optimalisert for HRM. Andre faktorer enn sekvens kan være en kilde til små forskjeller i HRM-kurver som primerdesign, amplikonlengde, fargevalg, valg av qPCR HRM-reagens og temperatur- og tidsprofiler for qPCR HRM-trinnene. Dette er den delen av den svært tidlige utviklingen og optimaliseringen av qPCR HRM-analysen og har allerede blitt diskutert andre steder12,14,18. Pålitelig identifisering av genetiske varianter i CALR-genet med sammenlignbar følsomhet for analysene kan imidlertid oppnås på forskjellige HRM-plattformer ved hjelp av de samme primersekvensene19. Det mest kritiske punktet i optimaliseringsprosessen til qPCR HRM-analysen var optimalisering av smelte- og forlengelsestemperaturen i qPCR-trinnet i qPCR HRM-analysen. Ingen endring var nødvendig for HRM trinn12. I rutinetestingen blir andre faktorer som påvirker HRM-resultatene viktigere å følge.
DNA av høy kvalitet som er resuspendert i en lavsaltbuffer som TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA eller lavere konsentrasjon) og samme mengde DNA i qPCR HRM-analysen er viktige faktorer for vellykket forsterket DNA-interesseområde med høyt signalplatå i qPCR-forsterkningsfasen (figur 2). Dette fører til pålitelig identifisering av genetiske varianter ved HRM-analyse (Figur 4A,4B)12,14. En høysaltbuffer som brukes til elution av DNA i ekstraksjonsprotokollen, kan subtilt endre termodynamikken i DNA-smelteovergangen. Nedbør og resuspension i lavsaltbuffer TE eller fortynning av prøven kan løse problemet med urenheter i DNA-prøven. DNA av lav kvalitet kan produsere ikke-spesifikke PCR-produkter eller mislykket forsterkning. Alt dette kan resultere i lavere reproduserbarhet og høyere feilfrekvens i HRM-variantdeteksjon. Ytterligere optimalisering for utfordrende prøver som DNA hentet fra parafin-innebygde prøver kan være nødvendig for å oppnå et optimalt HRM-resultat15.
Store forskjeller i DNA-mengden som brukes i qPCR HRM-analysen kan påvirke den resulterende smeltetemperaturen (Tm) og dermed føre til inkonklusive resultater. Derfor er den nøyaktige bestemmelsen av DNA-konsentrasjon og fortynning av alle DNA-prøver obligatorisk20. Ultrafiolett (UV) absorpsjon og fluorescensfargingsmetoder bestemmer nøyaktig konsentrasjonene av DNA-løsninger med høy renhet21. UV-absorbansmetoden kan brukes til å evaluere renheten til DNA-løsningene ved å utføre målinger av forholdsabsorbering ved A260/A280 og A260/230. Den fluorescerende fargingsmetoden er imidlertid mer følsom for nedbrytning av DNA enn UV-absorpsjonsmetoden og kan mer nøyaktig bestemme DNA-konsentrasjon21. Derfor er det mer hensiktsmessig for standardisering av kvantifisering og fortynning av alle DNA-prøver i HRM-analysen20,21.
Indels er de viktigste genetiske variantene i CALR-genet observert hos MPN-pasienter1. Etter hvert som produktlengden endres og øker, blir forskjellen mellom ville og heterozygote kurver mindre, og variantdeteksjonen blir vanskeligere7. Derfor bør en ekstra metode for avklaring av en slik genetisk variant brukes.
Et godt eksempel er agarose gel elektroforese. Dette er en enkel og effektiv metode for å skille DNA-fragmenter av forskjellige størrelser22,23. DNA-molekyler er skilt etter størrelse i agarose gel slik at den reiste avstanden er omvendt proporsjonal med logaritmen av sinmolekylvekt 24. Figur 4A, figur 4B og figur 7 viser eksempler der de to vanligste typene CALR genetisk variant, 52 bp sletting og 5 bp innsetting, identifiseres ved å kombinere qPCR HRM og agarose gel elektroforese resultater. Men når HRM-resultatet og agarose gelelektroforesebåndmønsteret indikerer en annen genetisk variant (inkludert enkelt nukleotidendring) som i kontrollene (figur 8), er Sanger-sekvensering fortsatt nødvendig for å identifisere den nøyaktige genetiske varianten10.
Et lavt nivå av somatisk genetisk variant i CALR-genet kan være til stede i pasientens prøve, noe som gjør en tolkning av qPCR HRM, agarose gelelektroforese og Sanger-sekvenseringsresultater mer krevende, spesielt ved deteksjonsgrensen for analysen (figur 9). Enhver smeltekurveformlinje som er forskjellig fra den ville typen, indikerer den genetiske varianten som skal være til stede i prøven. Følsomheten til qPCR HRM-analysen er lavere enn 5 % (figur 9 og referanse19) og er mer følsom enn Sanger-sekvenseringsmetoden, der følsomheten ble rapportert å være 15-20 %19. I disse tilfellene kan neste generasjons dypsekvenseringsmetode som oppdager større indels brukes og bekrefte HRM-resultatet. Avslutningsvis er HRM-analysen en kraftig metode for genotyping og genetisk variasjonsskanning av somatiske genetiske varianter i CALR-genet. Identifiseringen av ulike typer genetisk variant er for det meste basert på kontrollene som brukes i qPCR HRM-analysen. Mer pålitelige resultater oppnås ved å kombinere HRM-resultatene med resultater fra agarose gelelektroforese. Ved inkonklusive resultater kan standard Sanger-sekvensering eller enda mer sensitiv neste generasjons sekvenseringsmetode brukes til å identifisere den genetiske varianten på riktig måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke alle akademiske eksperter og ansatte ved Det spesialiserte hematologilaboratoriet, Institutt for hematologi, Institutt for indremedisin, Universitetssykehuset Ljubljana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al.
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D.
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
