Summary
Högupplöst smältanalys (HRM) är en känslig och snabb lösning för genetisk variantdetektering. Det beror på sekvensskillnader som resulterar i att heteroduplex ändrar smältkurvans form. Genom att kamma HRM och agarose gel elektrofores kan olika typer av genetiska varianter såsom indels identifieras.
Abstract
Högupplöst smältanalys (HRM) är en kraftfull metod för genotypning och genetisk variationsskanning. De flesta HRM-applikationer är beroende av mättande DNA-färgämnen som upptäcker sekvensskillnader och heteroduplex som ändrar smältkurvans form. Utmärkt instrumentupplösning och speciell dataanalysprogramvara behövs för att identifiera de små smältkurvorna som identifierar en variant eller genotyp. Olika typer av genetiska varianter med olika frekvenser kan observeras i genen specifikt för patienter med en specifik sjukdom, särskilt cancer och i CALR genen hos patienter med Philadelphia kromosom-negativa myeloproliferative tumörer. Enstaka nukleotidförändringar, införanden och/eller borttagningar (indels) i den av intressegenen kan detekteras genom HRM-analysen. Identifieringen av olika typer av genetiska varianter baseras främst på de kontroller som används i qPCR HRM-analysen. Men när produktlängden ökar blir skillnaden mellan vildtyp och heterozygotkurvor mindre, och typen av genetisk variant är svårare att bestämma. Därför, där indels är den utbredda genetiska varianten som förväntas i den gen av intresse, kan en ytterligare metod såsom agarose gel elektrofores användas för att klargöra HRM-resultatet. I vissa fall måste ett ofullständigt resultat kontrolleras/omdiagnostiseras genom standard Sanger-sekvensering. I denna retrospektiva studie tillämpade vi metoden på JAK2 V617F-negativa patienter med MPN.
Introduction
Somatiska genetiska varianter i calreticulin genen(CALR) erkändes 2013 hos patienter med myeloproliferative tumörer (MPN) såsom essentiell trombocytemi och primär myelofibrosis1,2. Sedan dess har mer än 50 genetiska varianter i CALR-genen upptäckts, vilket inducerar en +1 (−1+2) frameshift3. De två vanligaste genetiska varianterna av CALR är en 52 bp borttagning (NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs *46)), även kallad typ 1 mutation, och en 5 bp insättning (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs *47)), även kallad typ 2 mutation. Dessa två genetiska varianter representerar 80% av alla CALR genetiska varianter. De andra har klassificerats som typ 1-liknande eller typ 2-liknande med hjälp av algoritmer baserade på bevarandet av en α spiral nära vild typ CALR4. Här presenterar vi en av de mycket känsliga och snabba metoderna för CALR genetisk variantdetektering, den högupplösta smältanalysmetoden (HRM). Denna metod möjliggör snabb detektion av genetiska varianter av typ 1 och typ 2, som representerar majoriteten av CALR-mutationer 5. HRM introducerades i kombination med realtid »polymeraskedjereaktion« (qPCR) 1997 som ett verktyg för att upptäcka mutationen i faktor V Leiden6. I jämförelse med Sanger sekvensering som representerar den gyllene standardtekniken är HRM en känsligare och mindre specifik metod5. HRM-metoden är en bra screeningmetod som möjliggör en snabb analys av ett stort antal prover med en stor kostnads-nyttodel5. Det är en enkel PCR-metod som utförs i närvaro av ett fluorescerande färgämne och kräver inte specifika färdigheter. En annan fördel är att själva proceduren inte skadar eller förstör det analyserade provet som gör att vi kan återanvända provet för elektrofores eller Sanger-sekvensering efter HRM-proceduren7. Den enda nackdelen är att det ibland är svårt att tolka resultaten. HRM detekterar inte heller den exakta mutationen hos patienter med mutationer av icke-typ 1 eller typ 28. Hos dessa patienter ska Sanger-sekvensering utföras (figur 1).
HRM är baserad på förstärkning av den specifika DNA-regionen i närvaro av mättande DNA-fluorescerande färgämne, som ingår i dubbelsträngat DNA (dsDNA). Det fluorescerande färgämnet avger ljus när det ingår i dsDNA. Efter en progressiv temperaturökning bryts dsDNA ner i enkelsträngat DNA, vilket kan detekteras på smältkurvan som en plötslig minskning av fluorescensintensiteten. Smältkurvans form beror på den DNA-sekvens som används för att upptäcka mutationen. Smältkurvor av prover jämförs med smältkurvor av kända mutationer eller vild typ CALR. Distinkta smältkurvor representerar en annan mutation som inte är typ 1 eller typ 29.
Algoritmen för somatisk genetisk variantdetektering i CALR-genen genom HRM, agarose gel elektrofores och sekvenseringsmetod (figur 1) användes och validerades i den retrospektiva studien publicerad före10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien godkändes av Sloveniens medicinska etikkommitté. Alla förfaranden var förenliga med Helsingforsdeklarationen.
1. Fluorescensbaserad kvantitativ PCR-analys i realtid (qPCR) och analys efter qPCR av HRM
- Resuspend primers listade i tabellen över material till 100 μM med sterila, RNase och DNase fria H2O (se Tabell över material). Gör en 10 μM arbetskoncentrationsprimer. Primers som används i protokollet publicerades före2.
- Mängdgranulocyter DNA genom fluorescensfärgningsmetoden enligt tillverkarens instruktion11 (se Tabell över material). Förbered en 20 ng/μL DNA-lösning med 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (se Materialtabell).
- Förutom DNA-prover, förbered minst tre DNA-kontroller: två positiva kontroller med NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, s.(Leu367Thrfs*46) (52 bp borttagning eller typ 1 mutation) och NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs * 47) (5 bp insättning eller typ 2 mutation) genetisk variant, samt wild-type DNA och negativ kontroll som en genetisk variant av vildtyp.
OBSERVERA: Innan du utför HRM-installationen, bekräfta att qPCR-instrumentet är kalibrerat för HRM-experiment.
- Förutom DNA-prover, förbered minst tre DNA-kontroller: två positiva kontroller med NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52, s.(Leu367Thrfs*46) (52 bp borttagning eller typ 1 mutation) och NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs * 47) (5 bp insättning eller typ 2 mutation) genetisk variant, samt wild-type DNA och negativ kontroll som en genetisk variant av vildtyp.
- Förbered qPCR HRM Master Mix enligt tillverkarens protokoll (se Tabell över material)enligt följande: 10 μL 2x qPCR Master Mix med Dye, 0,2 μL 10 μM Forward Primer, 0,2 μL 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL steril, RNase och DNase free H2O. Använd primererna . Kör tre replikat för varje DNA-prov och kontroll.
- Förbered qPCR HRM Master Mix enligt antalet prover som bearbetas. Inkludera en överskottsvolym på minst 10 % i beräkningarna för att ge överskottsvolym för den förlust som uppstår vid reagensöverföringar.
- Blanda reaktionsinnehållet genom att försiktigt knacka och invertera röret och virvla i 2-3 s. Samla alla spridda droppar från rörets vägg till botten med en kort snurr.
- Förbered en reaktionsplatta som är lämplig för instrumentet och HRM-experimentet (se Materialtabell). Överför 19 μL av qPCR HRM Master Mix till lämpliga brunnar på den optiska reaktionsplattan med 96 brunnar.
- Pipet 1 μL av de negativa kontrollerna, positiva kontroller och prover i lämpliga brunnar på den optiska reaktionsplattan. För NTC överför du 1 μL steril, RNase- och DNasefri H2O som används för att förbereda qPCR HRM Master Mix istället för DNA.
- Försegla reaktionsplattan med den optiska självhäftande filmen. Gör det ordentligt för att förhindra avdunstning under körningen. Kontrollera att den optiska självhäftande filmen är plan över alla brunnar i reaktionsplattan för att säkerställa korrekt fluorescensdetektering.
- Snurra reaktionsplattan vid 780 x g vid rumstemperatur (RT) i 1 minut. Kontrollera att vätskan finns i botten av brunnarna i reaktionsplattan. Fortsätt att köra analysen.
PROTOKOLLET kan pausas här. Förvara plattan vid 4 °C i högst 24 timmar. Låt plattan som förvaras vid 4 °C värmas upp till RT och snurra sedan plattan en kort stund innan den körs. - Enligt tillverkarens instruktioner förbereda och starta körningen för att förstärka och smälta DNA och för att generera HRM fluorescensdata i qPCR-instrumentet. I instrumentsystemprogramvaran tilldelar du kontrollerna och proverna till lämpliga brunnar.
- För detektion av den genetiska varianten av CALR, ändra standardprotokollet för förstärkning av instrumentet och förstärka DNA:t med hjälp av följande termiska cykelprotokoll: 95 °C i 10 minuter, följt av 50 cykler på 95 °C för 10 s och 62,5 °C för 60 s.
- Utför smältkurvan/dissociationssteget (HRM) omedelbart efter qPCR enligt tillverkarens instruktioner12 enligt följande: 95 °C för 10 s, 60 °C i 1 min och sedan en ramphastighet på 0,025 °C/s fram till 95 °C. Håll temperaturen vid 95 °C i 15 s och vid 60 °C i 15 s.
- Körningen avslutas automatiskt. Granska och kontrollera först förstärkningsdiagrammet (figur 2).
- Välj alternativet för förstärkningsdiagram i experimentmenyn i instrumentsystemprogramvaran. Om inga data visas klickar du på den gröna knappen Analysera.
- På fliken förstärkningsdiagram, från listrutan för rittyp, väljer du det diagram som visar förstärkningsdata när de råa fluorescensavläsningarna normaliseras till fluorescensen från den passiva referensen (ΔRn) som en funktion av cykelnummer (ΔRn vs Cykel). Välj Exempel pålistrutan ritfärg .
- Välj den linjära förstärkningsdiagramtypen på listrutan graftyp för diagramtyp. Visa baslinjestart- och slutcykeln i det linjära förstärkningsdiagrammet genom att välja startalternativet för baslinjen. Kontrollera att baslinjen är korrekt inställd. Slutcykeln bör ställas in några cykler före cykelnumret där betydande fluorescerande signal detekteras. Baslinjen är vanligtvis inställd från 3 till 15 cykler(figur 2).
- Välj listrutan log10-förstärkningsdiagram på listrutan för diagramtypen graftyp för diagramtyp. Visa tröskelvärderaden i diagrammet genom att välja tröskelvärdet. Justera tröskelvärdet i enlighet därmed om det inte anges korrekt. Det korrekt inställda tröskelvärdet innebär att tröskelvärdet korsar den exponentiella fasen av qPCR-kurvorna(bild 2).
- Kontrollera att normala förstärkningskurvor finns i alla prov- och positiva kontrollbrunnar. Kontrollera att det inte finns någon förstärkning i NTC-brunnarna före cykel 40. Ett normalt förstärkningsdiagram visar en exponentiell ökning av fluorescens som överskrider tröskelvärdet mellan cyklerna 15 och 35 (figur 2). Exkludera provbrunnarna från analysen om det inte finns någon förstärkning i brunnsläget.
OBS: Om förstärkningsdiagrammet ser onormalt ut eller NTC-brunnen indikerar förstärkningen, identifiera och lösa problemet enligt tillverkarens felsökningsguide. - Exkludera avvikande värden med kvantifieringscykeln (Cq) som skiljer sig från replikat med mer än 2 i instrumentsystemprogramvaran12. Avvikande värden kan ge felaktiga HRM-resultat.
- I derivatsmältkurvorna granskar du pre- och post-melt-regionerna/temperaturlinjerna. För- och eftersmältningsregionerna bör ligga inom ett plan område där det inte finns några stora toppar eller sluttningar i fluorescerande nivåer(figur 3). Justera den vid behov i enlighet med detta. Ställ in start- och stopp för temperaturlinjerna före och efter smältningen med cirka 0,5 °C från varandra(figur 3). Starta om analysen om parametrarna justeras genom att klicka på knappen Analysera.
- På fliken skillnadsdiagram väljer du en av kontrollen av vildtyp (homozygot) som referens-DNA på fliken ritinställningar och startar om analysen genom att klicka på knappen Analysera.
- På fliken justerade smältkurvor bekräftar du att alla positiva kontroller har rätt genotyp och NTC kunde inte förstärkas (bild 4). Välj brunnarna som innehåller en positiv kontroll i brunnstabellen för att markera motsvarande smältkurva i analysdiagrammet. Bekräfta att linjens färg motsvarar rätt genotyp. Upprepa steg för brunnarna som innehåller de andra positiva kontrollerna och NTC.
- På fliken justerade smältkurvor granskar du noggrant diagramdisplayerna för de okända exemplen och jämför dem med ritytans displayer för kontroller(bild 4). Från brunnstabellen väljer du brunnarna som innehåller det okända exemplet replikerar, kontrollerar smältkurvans färg och justerar dem med kontrollerna i en ordnad sekvens genom att välja brunnarna som innehåller positiva kontroller en efter en. Upprepa processen för alla okända exempel.
OBS: Det okända exemplet innehåller varianten av en av kontrollerna om dess smältkurva är tätt anpassad till den. Olika variantgrupper (olika färger) kan visas som anger att det okända exemplet består av en okänd variant som inte motsvarar kontrollerna (bild 8). En låg nivå av den somatiska genetiska varianten kan finnas i patientens prov. Detta kan påverka tolkningen av hrm-resultatet, särskilt vid analysgränsen (figur 9). I dessa fall kan färgen eller till och med formen på linjen nära likna den för den vilda genotypen.- När resultatet är ofullständigt, kombinera HRM-resultaten med resultaten av agarose gel elektrofores och sekvenseringsmetoder. Testa exemplet eller begäran igen och testa ett nytt exempel igen om det behövs.
- Granska noggrant data uppsättningen för replikat kurvor och kontrollera att justeringen för varje replikat i gruppen är snäv. Exkludera replikat om det inte justeras tätt mot de andra exemplen i gruppen (avvikande). Testa provet igen om det finns fler avvikande värden och resultaten är ofullständiga. Tänk på att DNA-provets kvantitet och kvalitet påverkar HRM-resultaten.
- Analysera resultatet för det okända exemplet på fliken Differensdiagram. Upprepa proceduren som beskrivs i steg 1.21 och kontrollera att de resultat som erhållits för det okända provet är desamma.
- Kör sedan qPCR HRM-produkterna på agarosgelen.
PROTOKOLLET kan pausas här. Förvara plattan vid 4 °C i högst 24 timmar eller vid -20 °C under en längre tid men högst 7 dagar. Låt plattan som förvaras vid 4 °C värmas upp till RT och snurra sedan plattan en kort stund innan den körs. Låt plattan som lagras vid - 20 °C tina och värmas upp till RT, och snurra sedan plattan en kort stund innan du kör den.
2. Agarose gel elektrofores
- Kör qPCR HRM-produkter på en 4% agarose förgjuten gel som innehåller en fluorescerande nukleinsyrafläck med lämpligt gelelektroforessystem (se Tabell över material, figur 5). Kör bara en positiv, negativ, NTC och exempel qPCR HRM replikera.
OBS: Handskar ska alltid bäras vid hantering av geler. Alla andra gelelektroforessystem kan uppfylla detta syfte om motsvarande agarosprocent, fluorescerande nukleinsyrafläck och brunnsformat väljs. - Kör gelelektroforessystemet enligt tillverkarens protokoll (se Tabell över material). Ta bort den förgjutna gelen i kassetten från förpackningen, ta bort kammen och sätt in den i apparaten enligt tillverkarens instruktioner (se Materialtabell).
OBS: Ladda gelén inom 15 minuter efter att förpackningen öppnats. - Späd ut ett 10 μL-prov till 20 μL med sterilt, RNase- och DNasefritt H2O. Lasta varje brunn med 20 μL utspädd prov.
- Späd ut 3 μL standardlösning av DNA-storlek till 20 μL med steril, RNase- och DNasefri H2O (se Materialtabell). Ladda M-brunnen med 20 μL utspädd DNA-storlekslösning(figur 6).
- Fyll eventuella tomma brunnar med 20 μL steril, RNase och DNase fri H2O.
- Välj omedelbart programmet enligt procentandelen gel som körs och ställ in körtiden på apparaten till 10 minuter.
- Starta elektroforesen inom 1 minut från lastprovet genom att trycka på GO-knappen. Elektroforestiden kan förlängas om otillräcklig upplösning erhålls.
OBS: Överskrid inte den maximala rekommenderade agaroselektroforesens driftstid enligt tillverkarens instruktioner. - När elektroforesen är klar, visualisera DNA i gelén med hjälp av ett blått ljus eller UV-transillumination. Visualisering, analys och lagring av elektroforesbilder görs mestadels av en gelbildare med fotodokumentationssystem (figur 5).
- Analysera och tolka det visualiserade gelmönstret qPCR HRM products genom att jämföra resultaten av det okända provet med positiva kontroller (figur 7 och figur 8).
- Om det okända provet HRM och gelelektroforesresultat indikerar att en okänd genetisk variant finns, sekvensera qPCR HRM-produkten med primers som beskrivs i Tabell över material enligt det protokoll som beskrivs13.
VARNING: Agarosgelerna som innehåller en fluorescerande nukleinsyrafläck måste kasseras på rätt sätt enligt institutionens föreskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den framgångsrikt förstärkta DNA-regionen av intresse med en exponentiell ökning av fluorescens som överskrider tröskelvärdet mellan cyklerna 15 och 35 och mycket smala värden för kvantifieringscykeln (Cq) i alla replikerade prover och kontroller(figur 2) är en förutsättning för tillförlitlig identifiering av genetiska varianter genom HRM-analys. Detta uppnås genom att använda en exakt bestämning av DNA med fluorescensfärgning och lika mycket DNA i qPCR HRM-experimentet (se steg 1.2). Figur 2 visar en lyckad förstärkning av dna-området av intresse där Cq-värdena för alla prover och kontroller befinner sig i ett mycket snävt intervall. Det finns ingen förstärkning i NTC-brunnarna.
HRM-fasen utförs omedelbart efter qPCR med hjälp av protokollet som beskrivs i steg 1.11. De aktiva smältområdena (figur 3, etikett c) för proverna, kontrollerna och NTC används för att skapa sina justerade smältkurvor(figur 4). Därför är de korrekt inställda pre- och post-melt-regionerna/temperaturlinjerna(figur 3A) viktiga för korrekt visualisering och identifiering av genetiska varianter i proverna. Figur 4A och figur 4B visar de justerade smältkurvorna respektive differensområdena, där identifiering av genetiska varianter är möjlig. De okända exemplen är tätt anpassade till en av de positiva kontrollerna. Bild 3B visar felaktigt inställda regioner/temperaturlinjer före och efter smältning. Detta resulterar i en justerad smältkurva och differensdiagram där korrekt identifiering av de genetiska varianterna är svårare (figur 4C och figur 4D).
För att bekräfta HRM-resultaten och för att upptäcka om standard eller nästa generations sekvenseringsmetod krävs för att identifiera den genetiska varianten som finns i provet används agarosgelelektrofores. Figur 7 visar agarosegelelektroforesen för samma prover och kontroller som visas i figur 4. Den genetiska varianten i provet kan identifieras genom att jämföra provets bandmönster med kontrollerna och genom att kombinera HRM och agarose gel elektrofores. Korrekt genetisk variantidentifiering kan dock endast göras för de prover som innehåller samma genetiska variant som en av de kontroller som används i HRM-analysen (figur 7). Prover som innehåller sällsynta genetiska CALR-varianter skiljer sig åt i HRM-resultatet och elektroforesbandmönstret (figur 8). I det här fallet används Sanger-sekvensering eller till och med nästa generations sekvenseringsmetod för att identifiera den exakta genetiska varianten.
Figur 1: Schematisk representation av algoritmen för den somatiska genetiska variantdetekteringen i CALR-genen med HRM, agarosegelelektrofores och sekvenseringsmetoder. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Förstärkningsdiagram för qPCR HRM-analysen för påvisande av de genetiska varianterna i CALR-genen. Förstärkningsdiagrammet visas som den råa fluorescensen normaliserad till fluorescensen från den passiva referensen (ΔRn) och som en funktion av ett cykelnummer. Baslinjen är inställd från 3 till 15 cykler när DNA-regionen av intresse effektivt förstärktes med 20 ng högkvalitativt DNA i qPCR-reaktionen. De normala förstärkningsområdena i DNA-området av intresse för alla prover visas som gröna linjer. Diagram visar en exponentiell ökning av fluorescens som överskrider tröskeln mellan cyklerna 15 och 35 i experimentet med 20 ng högkvalitativt DNA i qPCR-reaktion. Diagrammet visar ingen förstärkning i icke-mallprovbrunnarna (NTC). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Derivatsmältkurvor i qPCR HRM-analysen för påvisande av de genetiska varianterna i CALR-genen. A) Ett exempel på korrekt inställda regioner/temperaturlinjer före och efter smältning. Temperaturlinjen före smältstoppet måste ligga intill början av smältövergångsområdet. Temperaturlinjen efter smältningen måste ligga intill slutet av smältövergångsregionen. A) Etiketten anger det par linjer till vänster om topparna där försmältningen börjar och stopptemperaturerna är inställda. Varje amplicon är dubbelsträngad. (b) etiketten anger datatopparna för det aktiva smältområde som används för att skapa det justerade smältkurvorna. C-etiketten anger det linjepar till höger om de toppar där eftersmältningen börjar och stopptemperaturerna är inställda. Varje amplicon är enkelsträngad. B) Ett exempel på felaktigt inställda regioner/temperaturlinjer före och efter smältning. Start och stopp för temperaturledningarna före och efter smältningen ligger inte i anslutning till smältövergångsregionerna och är mer än 0,5 °C från varandra. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: De justerade smältkurvorna och differensområdena i qPCR HRM-analysen för påvisande av de genetiska varianterna i CALR-genen. A) och B) visar de justerade smältkurvorna och differensområdena efter att pre- och post-melt-regionerna/temperaturlinjerna har ställts in korrekt. A) De justerade smältkurvorna för de positiva kontrollerna med 52 bp borttagning (typ 1 mutation), 5 bp insättning (typ 2 mutation) och en vild typ visas som orange, lila respektive röd färg. B) Differensdiagrammet för samma prov som beskrivs i panel A. C) och D) visar de justerade smältkurvorna och differensområdena efter de felaktigt inställda för- och eftersmältningsregionerna/temperaturlinjerna för samma uppsättning prov. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Gelelektroforessystemet. A) De grundläggande enheterna i gelelektroforessystemet (se Materialförteckning). B) Gelbildare med fotodokumentationssystem bestående av ccd-kamera, en kammare med lämpliga trans/lysande lampor och ett fotografiskt filter visas (se Materialförteckning). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Lastning av gelén med utspädda prover och standardlösning i DNA-storlek eller RNase- och DNase-fri H2O för tomma brunnar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Analyser av qPCR HRM-produkterna på gelelektrofores. Gelen utsattes för UV-transilluminator. Bilden togs av fotodokumentationssystemet (figur 5B). Brunnar från 1 till 3 visar kontroller: 52 bp borttagning (typ 1 mutation), 5 bp insättning (typ 2 mutation) respektive wild-typ variant. Bandmönstret för de okända proverna i brunnarna 4-10 indikerar dem som den vilda genetiska varianten. M-brunnen representerar utspädd STANDARDLÖSNING FÖR DNA-storlek (100 till 2 000 bp). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: HRM och gel elektrofores analyser av de genetiska varianterna i CALR genen. A) HRM-analyser. De justerade smältkurvorna för de positiva kontrollerna med 52 bp borttagning (typ 1 mutation), 5 bp insättning (typ 2 mutation) och en vild typ visas som orange, lila och röd färg, respektive. Det okända provet med den olika genetiska varianten anges som mörkblå färg. B) Gelelektroforesanalyser. Brunnar från 1 till 3 visar kontroller: 52 bp borttagning (typ 1 mutation), 5 bp insättning (typ 2 mutation) respektive wild-typ variant. Bandmönstret för det okända provet i körfältet 9 anger den olika genetiska varianten som kontroller. Andra okända exempel är wild-typvarianten. M-brunnen representerar den utspädda STANDARDLÖSNINGEN FÖR DNA-storlek (100 till 2 000 bp). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 9: Gränsen för detektion av HRM-analys. En seriell utspädning av ett prov av en 52 bp borttagning (typ 1 mutation) och 5 bp införing (typ 2 mutation) presenteras visar en genetisk variant allel börda på cirka 50% enligt Sanger sekvensering analys och qPCR HRM analys enligt protokollet beskrivs i denna artikel. A) och B) visar de justerade smältkurvorna och differensområdena för vilda och seriella utspädningar av en 52 bp borttagning (typ 1 mutation). C) och D) visar de justerade smältkurvorna och differensområdena för vilda och seriella utspädningar av en 5 bp-insättning (typ 2-mutation). I båda fallen kan CALR genetiska varianten detekteras i upp till 1,56% utspädning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Högupplöst smältning av DNA är en enkel lösning för genotypning och genetisk variantskanning14. Det beror på sekvensskillnader som resulterar i heteroduplex som ändrar smältkurvans form. Olika typer av genetiska varianter med olika frekvenser kan observeras i genen specifik för en viss grupp patienter med cancer1,2,15,16,10. Borttagningar eller införanden i den av intressegenen kan detekteras av HRM-analysen som vi har visat i figur 4A. Vid implementeringen av qPCR HRM-analysen i rutintestningen har vi utfört en inledande utvärderingsstudie med 21 JAK2 V617F-negativa ET-patienter med en medianålder på 63 år (intervall från 24 till 90 år). En genetisk variant i CALR genen upptäcktes i 12 av 21 JAK2 V617F-negativa ET patienter (andel 0, 57). En 52 bp borttagning (typ 1 mutation) upptäcktes i 9 av 21 (proportion 0, 43), en 5 bp insättning (typ 2 mutation) upptäcktes i 3 av 21 (proportion 0,143) JAK2 V617F-negativa ET patienter. Resultaten överensstämmer med uppgifterna från litteraturen1,2,17.
Tillförlitlig identifiering av genetiska varianter genom HRM-analys kan uppnås genom rätt analysutveckling som säkerställer att experimentet är optimerat för HRM. Andra faktorer än sekvens kan vara en källa till små skillnader i HRM-kurvorna som primerdesign, ampliconlängd, färgval, val av qPCR HRM-reagens och temperatur- och tidsprofiler för qPCR HRM-stegen. Detta är den del av den mycket tidiga utvecklingen och optimeringen av qPCR HRM-analysen och har redan diskuterats någon annanstans12,14,18. Tillförlitlig identifiering av genetiska varianter i CALR-genen med jämförbar känslighet för analyserna skulle dock kunna uppnås på olika HRM-plattformar med samma primersekvenser19. Den mest kritiska punkten i optimeringsprocessen av qPCR HRM-analysen var optimering av smält- och töjningstemperaturen i qPCR-steget i qPCR HRM-analysen. Ingen ändring behövdes för HRM steg12. I rutintestningen blir andra faktorer som påverkar HRM-resultaten viktigare att följa.
Högkvalitativt DNA som återanvänds i en lågsaltbuffert som TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA eller lägre koncentration) och samma mängd DNA i qPCR HRM-analysen är viktiga faktorer för framgångsrikt förstärkt DNA-område av intressen med en hög signalplatå i qPCR-förstärkningsfasen(figur 2). Detta leder till tillförlitlig identifiering av genetiska varianter genom HRM-analys(figur 4A,4B)12,14. En högsaltbuffert som används för elution av DNA i extraktionsprotokollet kan subtilt förändra termodynamiken i DNA-smältövergången. Utfällning och resuspension i te för lågsaltbuffert eller utspädning av provet kan lösa problemet med föroreningarna i DNA-provet. DNA av låg kvalitet kan producera ospecificerade PCR-produkter eller misslyckad förstärkning. Allt detta kan resultera i en lägre reproducerbarhet och högre felfrekvens vid detektering av HRM-varianter. Ytterligare optimering för utmanande prover som DNA extraherat från paraffininbäddade prover kan behövas för att få ett optimalt HRM-resultat15.
Stora skillnader i dna-mängden som används i qPCR HRM-analysen kan påverka den resulterande smälttemperaturen (Tm) och följaktligen leda till ofullständiga resultat. Därför är det obligatoriskt att exakt bestämma DNA-koncentrationen och utspädningen av alla DNA-prover20. Ultravioletta (UV) absorptions- och fluorescensfärgningsmetoder bestämmer noggrant koncentrationerna av DNA-lösningar med hög renhet21. UV-absorbansmetoden kan användas för att utvärdera renheten hos DNA-lösningarna genom att utföra ratio absorbansmätningar vid A260/A280 och A260/230. Den fluorescerande färgningsmetoden är dock mer känslig för nedbrytning av DNA än UV-absorptionsmetoden och kan mer exakt bestämma DNA-koncentrationen21. Det är därför lämpligare att standardisera kvantifiering och utspädning av alla DNA-prover i HRM-analysen20,21.
Indels är de viktigaste genetiska varianterna i CALR-genen som observerats hos MPN-patienter1. När produktlängden ändras och ökar blir skillnaden mellan kurvor av vildtyp och heterozygot mindre och variantdetekteringen blir svårare7. Därför bör en ytterligare metod för förtydligande av en sådan genetisk variant användas.
Ett bra exempel är agarose gel elektrofores. Detta är en enkel och effektiv metod för att separera DNA-fragment av olika storlekar22,23. DNA-molekyler separeras med storlek inom agarosgelen så att det tillryggalagda avståndet är omvänt proportionellt mot logaritmen av dess molekylvikt24. Figur 4A, figur 4B och figur 7 visar exempel där de två vanligaste typerna av CALR genetisk variant, 52 bp borttagning och 5 bp insättning, identifieras genom att kombinera qPCR HRM och agarose gel elektrofores resultat. Men när HRM-resultatet och agarosgelelektroforesbandmönstret indikerar en annan genetisk variant (inklusive enstaka nukleotidförändring) som i kontrollerna (figur 8), behövs Sanger-sekvensering fortfarande för att identifiera den exakta genetiska varianten10.
En låg nivå av somatisk genetisk variant i CALR-genen kan förekomma i patientens prov och göra en tolkning av qPCR HRM, agarosgelelektrofores och Sanger sekvenseringsresultat mer krävande, särskilt vid detektionsgränsen för analysen (figur 9). Varje smältkurva formlinje som skiljer sig från den vilda typen en anger den genetiska varianten som ska finnas i provet. Känsligheten hos qPCR HRM-analysen är lägre än 5% (figur 9 och referens19) och är känsligare än Sanger-sekvenseringsmetoden, vars känslighet rapporterades vara 15-20%19. I dessa fall kan nästa generations djupsekvenseringsmetod som identifierar större indels tillämpas och bekräfta HRM-resultatet. Sammanfattningsvis är HRM-analysen en kraftfull metod för genotypning och genetisk variationsskanning av somatiska genetiska varianter i CALR-genen. Identifieringen av olika typer av genetiska varianter baseras främst på de kontroller som används i qPCR HRM-analysen. Mer tillförlitliga resultat erhålls genom att kombinera HRM-resultaten med resultat från agarose gel elektrofores. Vid ofullständiga resultat kan standard Sanger sekvensering eller ännu känsligare nästa generations sekvenseringsmetod användas för att korrekt identifiera den genetiska varianten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka alla akademiska experter och anställda vid Specialized Hematology Laboratory, Institutionen för hematologi, avdelningen för internmedicin, University Medical Centre Ljubljana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E-Gel EX 4% Agarose | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| Fuorometer 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Optical adhesive film | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | Gel documentation systems |
| Primer CALRex9 Forward | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| Primer CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | 51306 | DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution. |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS assay | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp. |
| ViiA7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| Water nuclease free | VWR, Life Science | 436912C | RNase, DNase and Protease free water |
References
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al.
- Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
- Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
- Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
- Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
- Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
- Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
- Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
- Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (last accessed 16 August 2020) (2015).
- Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (last accessed 16 August 2020) (2011).
- Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/cms_070934.pdf (last accessed16 August 2020) (2010) (2010).
- Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
- Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
- Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
- Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
- Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
- Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
- Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
- Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
- Voytas, D.
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).
