Summary
Presentert her er en protokoll for encellet elektroporasjon som kan levere gener i både eksitatoriske og hemmende nevroner over en rekke in vitro hippocampal skiver kultur aldre. Vår tilnærming gir presist og effektivt uttrykk for gener i enkeltceller, som kan brukes til å undersøke celle-autonome og intercellulære funksjoner.
Abstract
Elektroporasjon har etablert seg som en kritisk metode for å overføre spesifikke gener til celler for å forstå deres funksjon. Her beskriver vi en encellet elektroporasjonsteknikk som maksimerer effektiviteten (~ 80%) av in vitro gentransfeksjon i eksitatoriske og klassespesifikke hemmende nevroner i musen organotypisk hippocampal skiver kultur. Ved hjelp av store glasselektroder, tetrodtoksinholdig kunstig cerebrospinalvæske og milde elektriske pulser, leverte vi et gen av interesse for kultivert hippocampal CA1 pyramidale nevroner og hemmende interneuroner. Videre kan elektroporasjon utføres i dyrkede hippocampal skiver opptil 21 dager in vitro uten reduksjon i transfeksjonseffektivitet, noe som muliggjør studiet av ulike utviklingsstadier for skivekultur. Med interesse for å undersøke molekylære funksjoner av gener på tvers av et mangfoldig spekter av celletyper, viser vår metode en pålitelig og grei tilnærming til in vitro gentransfeksjon i musehjernevev som kan utføres med eksisterende elektrofysiologiutstyr og teknikker.
Introduction
I molekylærbiologi er en av de viktigste hensynene til en undersøker hvordan man skal levere et gen av interesse inn i en celle eller populasjon av celler for å belyse sin funksjon. De ulike leveringsmetodene kan kategoriseres som enten biologiske (f.eks. en virusvektor), kjemiske (f.eks. kalsiumfosfat eller lipid) eller fysiske (f.eks. elektroporasjon, mikroinjeksjon eller biolistics)1,2. Biologiske metoder er svært effektive og kan være celletypespesifikke, men begrenses av utviklingen av spesifikke genetiske verktøy. Kjemiske tilnærminger er svært kraftige in vitro, men transfections er generelt tilfeldige; Videre er disse tilnærmingene for det meste reservert bare for primærceller. Av de fysiske tilnærmingene er biolistikk den enkleste og enkleste fra et teknisk synspunkt, men gir igjen tilfeldige transfeksjonsresultater med relativt lav effektivitet. For applikasjoner som krever overføring til spesifikke celler uten behov for å utvikle genetiske verktøy, ser vi mot encellet elektroporasjon3,4.
Mens elektroporasjon som brukes til å referere bare til feltelektroporasjon, i løpet av de siste tjue årene, har flere in vitro- og in vivo encellede elektroporasjonsprotokoller blitt utviklet for å forbedre spesifisiteten og effektiviteten5,6,7, som viser at elektroporasjon kan brukes til å overføre gener til individuelle celler og kan derfor være ekstremt presis. Prosedyrene er imidlertid teknisk krevende, tidkrevende og relativt ineffektive. Faktisk har nyere papirer undersøkt muligheten for mekaniserte elektroporasjonsrigger8,9, som kan bidra til å eliminere flere av disse barrierene for etterforskere som er interessert i å installere slik robotikk. Men for de som leter etter enklere midler, forblir problemene med elektroporasjon, nemlig celledød, transfeksjonsfeil og pipettestopping, en bekymring.
Vi utviklet nylig en elektroporasjonsmetode som bruker større glasspipetter, mildere elektriske pulsparametere og et unikt trykksyklingstrinn, som genererte en mye høyere transfeksjonseffektivitet i eksitatoriske nevroner enn tidligere metoder, og gjorde det mulig for oss for første gang å transfekte gener i hemmende interneuroner, inkludert somatostatin-uttrykkende hemmende internuroner i hippocampal CA1-regionen av musorganotypisk skivekultur10. Påliteligheten til denne elektroporasjonsmetoden i forskjellige hemmende interneurontyper og nevronale utviklingsstadier er imidlertid ikke adressert. Her demonstrerte vi at denne elektroporasjonsteknikken er i stand til å transfekte gener til både eksitatoriske nevroner og forskjellige klasser av interneuroner. Det er viktig at transfeksjonseffektiviteten var høy uavhengig av dager in vitro (DIV) skivekultur alder testet. Denne etablerte og brukervennlige teknikken anbefales på det sterkeste til enhver undersøker som er interessert i å bruke encellet elektroporasjon for forskjellige celletyper i sammenheng med in vitro mus hjernevev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Massachusetts Medical School. Skivekulturforberedelse, plasmidpreparat og elektroporasjon er også detaljert i våre tidligere publiserte metoder og kan henvises til for ytterligere informasjon10.
1. Klargjøring av stykkekultur
- Forbered musen organotypisk hippocampal skiver kulturer som tidligere beskrevet11, ved hjelp av postnatal 6- til 7-dagers gamle mus av begge kjønn.
- Forbered disseksjonsmedier for organotypisk stykkekultur bestående av (i mM): 238 sukrose, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4og 11 glukose i deionisert vann, deretter gass med 5% CO2/95% O2 til en pH på 7,4.
- Forbered organotypiske stykkekulturmedier som består av: 78.8% (v / v) Minimum Essensiell Medium Eagle, 20% (v / v) hesteserum, 17,9 mM NaHCO3,26,6 mM glukose, 2 M CaCl2,2 M MgSO4, 30 mM HEPES, insulin (1 μg/ml) og 0,06 mM askorbinsyre, pH justert til 7,3. Juster osmolariteten til 310-330 osmol ved hjelp av et osmometer.
- Disseker hippocampi ut av hele hjernen ved hjelp av to spatler, og skjær (400 μm) ved hjelp av et vevshelikopter. Skill skiver ved hjelp av to tang og overfør til 30 mm cellekulturinnsatser i en 6 brønnplate fylt med kulturmedier (950 μL) under innsatsene.
- Oppbevar organotypiske skivekulturer i en vevskulturinkubator (35 °C, 5 % CO2) og endre skivekulturmediene annenhver dag.
2. Plasmid forberedelse
- Forbered plasmidet for genet av interesse.
- Subclone forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) gen i en pCAG vektor.
- Rens pCAG-EGFP plasmid med et endotoksinfritt rensesett og oppløs i en intern løsning som består av diettpyrokarbonatbehandlet vann som inneholder 140 mM K-metansulfat, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2og 10 mM HEPES, justert til pH 7,3 med KOH (plasmidkonsentrasjon: 0,1 μg/μL).
3. Klargjøring av glasspipette
- Trekk borosilikatglasspipetter (4,5 – 8 MΩ) på en mikropipettetrekker (figur 1A).
MERK: Glasspipettene som brukes til klemmeopptak i hele celler er ideelle for elektroporasjon. - Bake glasspipetter over natten ved 200 °C for å sterilisere.
- Kontroller størrelsen på pipettespissen under et disseksjonsmikroskop for å anslå den elektriske motstanden.
- Valgfritt:Kontroller pipettemotstanden ved å feste pipetten til elektroporasjonselektroden og bruk mikromanipulatoren til å manøvrere pipettespissen til filtersterilisert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) som inneholder (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 og 11 glukose i deionisert vann, gasset med 5% CO2/95% O2 til en pH på 7,4. Bekreft den faktiske motstanden ved hjelp av avlesningen på elektroporatoren.
MERK: Jo skarpere pipettespissen er, jo større er den elektriske motstanden. Pipettemotstanden skal være under 10 MΩ. Glasspipetter med høy pipettemotstand (Figur 1B) tetter ofte på spissen under gjentatt elektroporasjon.
- Valgfritt:Kontroller pipettemotstanden ved å feste pipetten til elektroporasjonselektroden og bruk mikromanipulatoren til å manøvrere pipettespissen til filtersterilisert kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) som inneholder (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2,5 MgCl2,26 NaHCO3,1 NaH2PO4 og 11 glukose i deionisert vann, gasset med 5% CO2/95% O2 til en pH på 7,4. Bekreft den faktiske motstanden ved hjelp av avlesningen på elektroporatoren.
4. Oppsett av elektroporasjonsrigger
- Installer elektroporatoren på en standard fullcellet elektrofysiologirigg, utstyrt med et oppreist mikroskop montert på et skiftende bord med en mikromanipulator og peristaltisk pumpe.
- Monter elektroporatorens hodelykt på en mikromanipulator og koble et par høyttalere til elektroporatoren. Koble elektroporatoren til en fotpedal som kan brukes til å sende en puls når den er klar.
MERK: Høyttalerne avgir en tone når de er slått på, noe som er en indikator på den elektriske motstanden ved elektroden. Dette gjør det mulig å bestemme relative endringer i motstand uten å trekke oppmerksomheten bort fra prosedyren.
5. Elektroporasjon forberedelse
- Overfør skivekulturinnlegg fra 6 brønnplater til 3 cm Petri-retter lastet med 900 μL kulturmedier og oppbevar i en bordplate CO2 inkubator til den er klar til å utføre elektroporasjon.
- Preincubate frisk kultur innlegg med skiver kulturmedier (1 ml) i minst 30 min i en 3,5 cm Petri parabolen til kultur skiver etter elektroporasjon.
- Rengjør og klargjør riggen for elektroporasjon.
- Perfuse linjene med 10% blekemiddel i 5 min for å sterilisere slangen og kammeret før du begynner eksperimentet for dagen.
- Forvreng linjene med deionisert autoklavert vann i minst 30 minutter for å skylle helt.
- Forvreng linjene med filtersterilisert aCSF som inneholder 0,001 mM tetrodotoxin (TTX).
MERK: TTX minimerer cellulær toksisitet og død på grunn av overeksponering av internurons10.
- Still inn elektroporatorens pulsparametere: amplitude på -5 V, firkantet puls, tog på 500 ms, frekvens på 50 Hz og en pulsbredde på 500 μs.
- Fyll glasspipetten med 5 μL plasmidholdig intern løsning.
- Fjern eventuelle fanget luftbobler fra pipettespissen ved å flikke og forsiktig trykke på spissen flere ganger.
- Kontroller spissen for skade ved å visualisere den under et disseksjonsmikroskop eller ved å gjenta trinn 3.3.1 for å kontrollere pipettemotstanden.
MERK: Hvis spissen er skadet, må glasspipetten kastes, og dette trinnet må gjentas med en ny glasspipette som tidligere er klargjort i trinn 3.
- Fest pipettespissen godt til elektroden og slå på høyttalerne. Registrer avlesningen (pipettens motstand) til elektroporatoren når spissen har kommet i kontakt med aCSF-mediet.
- Klipp kulturinnsatsmembranen ved hjelp av et skarpt blad og isoler en skivekultur. Overfør skjærekulturen forsiktig til elektroporasjonskammeret ved hjelp av skarpe vinklede tang og fest posisjonen med et stykkeanker.
- Ikke hold skivekulturen utenfor inkubatoren i mer enn 30 minutter om gangen for å forhindre bivirkninger som endringer i nevronhelse eller funksjon12.
6. Elektroporatceller av interesse
- Påfør positivt trykk på pipetten med munnen eller ved å bruke en 1 ml sprøyte (0,2 - 0,5 ml trykk) festet til slangen.
- Bruk mikromanipulatorens 3-dimensjonale knottkontroller til å manøvrere pipettespissen nær overflaten av stykkekulturen.
- Velg en målcelle og nærme deg den, og hold det positive trykket påført til en dimple dannes på celleoverflaten, synlig på mikroskopet.
- Utfør trykksykluser.
- Påfør raskt mildt negativt trykk ved munnen slik at en løs forsegling dannes mellom pipettespissen og plasmamembranen, indikert visuelt av membranen som går opp i pipettespissen noe. Vær oppmerksom på en økning (~2,5 ganger den første motstanden) i pipettemotstanden ved å lytte etter en økning i tonen som kommer fra høyttalerne. Påfør raskt positivt trykk på nytt slik at dimple dannes på nytt.
- Fullfør umiddelbart minst to trykksykluser til uten pause, og hold deretter negativt trykk i 1 s.
MERK: Hvis du setter syklusene på pause, legger for mye trykk eller holder det negative trykket for lenge, kan det føre til betydelig celleskade og muligens føre til at cellen dør under elektroporasjon.
- Pulser elektroporatoren raskt når du bruker fotpedalen når tonen fra høyttalerne når en stabil topp i tonehøyde, noe som indikerer maksimal elektrisk motstand. Ikke vent på toppmotstanden i mer enn 1 s før du sender pulsen.
MERK: Vi har ikke observert noen off-target elektroporasjon når du bruker denne protokollen10. Bare cellene i kontakt med glasspipetten under trykksykluser ble transfektert. Plassering av pipetten nær andre nevroner resulterer ikke i gentransfeksjon. - Trekk pipetten forsiktig tilbake ca. 100 μm fra cellen uten å bruke trykk.
- Påfør positivt trykk på nytt, og kontroller at motstanden ligner den registrerte avlesningen i trinn 5.5, og nærmer deg deretter neste celle.
- Fjern potensielle tilstoppinger, indikert visuelt eller ved en betydelig økt (>15% høyere) pipettemotstand etter elektroporasjon, ved å bruke positivt trykk.
MERK: Hvis det ikke er noen synlig tilstopping og motstanden fortsatt er betydelig høyere, kast pipetten og bruk en ny. I gjennomsnitt kan en pipette brukes til opptil 20 elektroporasjonshendelser hvis brukeren er forsiktig10.
- Fjern potensielle tilstoppinger, indikert visuelt eller ved en betydelig økt (>15% høyere) pipettemotstand etter elektroporasjon, ved å bruke positivt trykk.
- Etter elektroporasjon, overfør skivekulturen til en frisk kulturinnsats, og inkuber ved 35 °C i inkubatoren i opptil 3 dager.
7. Fiksering, farging og avbildning av organotypiske hippocampal skiver kulturer
- Fest elektroporerte organotypiske skivekulturer 2 - 3 dager etter transfeksjon med 4% paraformaldehyd og 4% sukrose i 0,01 M fosfatbufret saltvann (1x PBS) i 1,5 timer ved romtemperatur.
- Fjern fikserings- og inkuberskiver i 30 % sukrose i 0,1 M fosfatbuffer (1x PB) i 2 timer.
- Legg skiver på et glideglass og frys dem ved å sette glideglasset oppå knust tørris. Tine skivene ved romtemperatur og overfør dem til en 6 brønnplate fylt med 1x PBS.
- Flekk skivene med mus anti-GFP og kanin anti-RFP antistoffer i GDB buffer (0,1% gelatin, 0,3% Triton X-100, 450 mM NaCl, og 32% 1x PB, pH 7,4) i 2 timer ved romtemperatur.
- Vask skiver med 1x PBS tre ganger ved romtemperatur i 10 min hver vask.
- Inkuber skiver med antimus Alexa 488-konjugert sekundært antistoff og antikanin Alexa 594-konjugert sekundært antistoff i GDB-buffer i 1 time ved romtemperatur. Inkuber skiver med DAPI (4 μg/ml) i 1x PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vask skiver med 1x PBS tre ganger ved romtemperatur i 3 min hver vask.
- Monter skiver på glasssklier ved hjelp av monteringsmedium og utfør fluorescensavbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår encellede elektroporasjon er i stand til nettopp å levere gener til visuelt identifiserte eksitatoriske og hemmende nevroner. Vi elektroporerte tre forskjellige nevroncelletyper på tre forskjellige tidspunkter. Parvalbumin (Pv) eller vesikulær glutamat type 3 (VGT3) som uttrykker nevroner ble visualisert ved å krysse Pvcre (JAX #008069) eller VGT3cre (JAX #018147) linjer med TdTomato (en variant av rødt fluorescerende protein) reporterlinje (Jax #007905), henholdsvis kalt Pv / TdTomato og VGT3 / TdTomato linjer. Organotypiske skivekulturer ble tilberedt fra C57BL/6J-, Pv/TdTomato- og VGT3/TdTomato-mus.
For det første ble elektroporasjon utført i CA1 pyramidale nevroner (Py) enten ved 7, 14 eller 21 dager in vitro (DIV). EGFP ble transfektert til 5-20 pyramidale nevroner i hippocampal CA1-området på tvers av disse skivekulturalderene (Figur 2B-D). CA1 pyramidale nevroner ble identifisert ved hjelp av differensial interferenskontrast (DIC). For å demonstrere den anatomiske fordelingen og morfologiske forskjellene mellom pyramidale nevroner og hemmende interneuroner i stykkekulturen, ble CA1 pyramidale nevroner elektroporert med EGFP i en DIV7 Pv / TdTomato-mus og kjernefysiske motsendelser ble utført for å vise den distinkte plasseringen av EGFP-positive nevroner i CA1 pyramidalcellelaget (Figur 2A).
Deretter ble denne protokollen også brukt på TdTomato-positive Pv og VGT3 interneurons. EGFP-elektroporasjon ble utført i 1-10 fluorescerende merkede interneuroner. TdTomato-positive Pv (Figur 3) og VGT3 (Figur 4) nevroner ble vellykket elektroporert i hippocampal CA1-området. Interessant nok ble transfeksjon av EGFP-genet av interesse for alle disse hemmende nevronale typene ikke signifikant påvirket av DIV og var ikke forskjellig med transfeksjonseffektiviteten (~ 80%) observert i CA1 pyramidale nevroner (figur 5).
Figur 1: To representative glasspipettebilder.
(A) Vis pipetter med lavere motstand (6,5 MΩ), som brukes i denne protokollen, og (B) høyere motstand (10,4 MΩ) pipetter som er typiske for elektroporasjonsprotokoller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Organotypiske hippocampalskivekulturer ble elektroporert med EGFP (grønn) på tre forskjellige tidspunkter.
(A) Representativ organotypisk hippocampal stykke kultur i en DIV7 Pv / TdTomato mus. CA1 pyramidale nevroner ble elektroporert med EGFP (grønne, hvite pilspisser) og viste ingen overlapping med TdTomato (TdT)-positive Pv internurons (røde, gule pilspisser). DAPI kjernefysisk mottiltak (blå) ble utført. DG: dentate gyrus. (B-D) CA1 pyramidale nevroner ble elektroporert med EGFP på tre forskjellige tidspunkter: (B) DIV7, (C) DIV14 og (D) DIV21. Organotypiske skivekulturer ble festet med 4% sukrose, 4% paraformaldehyd / 1x PBS og avbildet uten videre seksjonering. Øverst til venstre, lav forstørrelse bilder av hippocampal CA1 området. Pilspisser representerer individuelle CA1 pyramidale nevroner rettet mot elektroporasjon. Transfekterte nevroner med gule pilspisser zoomes inn i bunnpanelene. Hvite pilspisser betyr ytterligere elektroporerte nevroner utenfor den høye forstørrelsesvisningen. Topp høyre, bilder med lav forstørrelse av overliggende (Sup) fluorescerende og Nomarski-bilder. Skalastenger: henholdsvis 500, 50, 100, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Pv/TdTomato organotypiske hippocampalskivekulturer ble elektroporert med EGFP (grønn) på tre forskjellige tidspunkter.
(A) DIV7, (B) DIV14 og (C) DIV21. Overlapping med Pv-merkede TdTomato (TdT)-positive celler (rød) ble observert i hippocampal CA1 pyramidalcellelag og oriens. I de lave forstørrelsessettene (øverste rad) representerer gule pilspisser individuelle Pv-internuroner som er målrettet mot elektroporasjon. Hvite pilspisser betyr ekstra TdTomato-positive Pv internurons elektroporated utenfor den høye forstørrelsesvisningen. Skalastenger: 50, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: VGT3/TdTomato organotypiske hippocampalskivekulturer ble elektroporert med EGFP (grønn) på tre forskjellige tidspunkter.
(A) DIV7, (B) DIV14 og (C) DIV21. Overlapping med VGT3-merkede TdTomato (TdT)-positive celler (rød) ble observert i hippocampal CA1 pyramidecellelag og oriens. I de lave forstørrelsessettene (øverste rad) representerer gule pilspisser individuelle VGT3-internuroner som er målrettet mot elektroporasjon. Hvite pilspisser betyr ekstra TdTomato-positiv VGT3 internurons elektroporated utenfor den høye forstørrelsesvisningen. Skalastenger: 50, 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenlignbare nivåer av transfeksjonseffektivitet i CA1 pyramidale nevroner, Pv/TdTomato og VGT3/TdTomato-internuroner i tre forskjellige in vitro-skivekulturalderer.
Sammendragslinjediagrammer over tre forskjellige stykkekulturalderer: DIV7 (venstre), DIV14 (midten) og DIV21 (høyre). Hvert symbol representerer transfeksjonseffektiviteten oppnådd fra en organotypisk stykkekultur CA1 Py: DIV7 (12 skivekulturer fra 2 mus), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Nåverdi: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). Enveis ANOVA; (ikke signifikant). Data som vises er gjennomsnittlige ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en elektroporasjonsmetode som transfekterer både eksitatoriske og hemmende nevroner med høy effektivitet og presisjon. Vår optimaliserte elektroporasjonsprotokoll har tre innovative gjennombrudd for å oppnå svært effektiv gentransfeksjon. Vår første modifikasjon var å øke pipettestørrelsen sammenlignet med tidligere publiserte protokoller3,5,6. Denne endringen gjorde det mulig for oss å elektroporate mange nevroner uten pipettestopping. I tillegg er det mulig at pipettene med lavere motstand tillater bruk av mildere elektriske pulsparametere sammenlignet med tidligere metoder, samtidig som de oppnår ønsket resultat3. Deretter gjentatt trykksykling før elektroporasjon redusertecelledøden markant 10. Vi observerte ofte at med påføring av en enkelt puls av negativt trykk før elektroporerende, plasmamembran fast på innsiden av pipettespissen, som skadet cellen. Trykksyklusene bidro til at langt mindre plasmamembran holdt seg til pipetten, noe som forbedret celleoverlevelse og utvinning under prosedyren10. Til slutt forbedret tilsetningen av TTX i aCSF i stor grad suksessen med elektroporasjon hos hemmende nevroner10. Vi anser at elektroporasjon kan forårsake dødelig celleovereksponering som kan forhindres av TTX. Fremfor alt tilbyr disse kritiske forbedringene bemerkelsesverdig høye suksessrater i elektroporasjon til både eksitatoriske og hemmende nevroner (figur 5). Selv om vi ikke fant noen elektrofysiologiske abnormiteter i nevronene våre etter transfeksjon med denne metoden10 i de målrettede cellene, har det blitt rapportert at lokale pH-endringer under elektroporasjon reduserer celle levedyktighet og optimalisering av elektroporasjonsparametere kan være relativt vanskelig sammenlignet med andre gentransfeksjonsmetoder13,14. Derfor er det viktig å vurdere uforutsette bivirkninger av elektroporasjon og å optimalisere de elektriske parametrene etter behov for å oppnå høy transfeksjonseffektivitet for enhver bestemt applikasjon.
Mikroinjeksjonsteknologi har også blitt brukt som en kraftig tilnærming for å levere transgenes til celle2,15,16. Imidlertid gir denne tilnærmingen generelt et lavere utbytte av transfeksjon og krever et høyt ferdighetsnivå. I motsetning til dette kan vår metode brukes relativt enkelt og til minimal kostnad for laboratorier som rutinemessig utfører elektrofysiologistudier i hele celler.
Nylig viste vi at flere gener kan transfekeres til både eksitatoriske og somatostatin som uttrykker hemmende nevroner uten bivirkninger på elektrofysiologiske egenskaper10. I denne studien viser vi at denne elektroporasjonsmetoden er svært effektiv i CA1 pyramidale nevroner (figur 2) og Pv (figur 3) og VGT3 (figur 4) hemmende interneuroner. Videre lar denne elektroporasjonsteknikken oss transfekt gener av interesse med en suksessrate på ~ 80% uavhengig av celletype eller antall dager in vitro (figur 5). Selv om teknikken bare har blitt testet in vitro, har organotypiske hippocampalskivekulturer på de samme DIV-tidspunktene vi testet vist seg å følge alderstilpasset in vivo synaptisk morfologi og aktivitet, som vist i akutt forberedte hippocampal skiver17. Videre, som vi bare har testet denne metoden i hippocampal nevroner, er det mulig at det kan være uforutsatt utfordringer med å bruke denne teknikken på nevroner i andre hjerneregioner. Metoden inviterer til utforskning av gener under organotypisk skivekulturutvikling der synaptisk overføring og tetthet, blant annet egenskaper, endres over tid.
Denne protokollen er en forbedring i forhold til tidligere etablerte ved at den samtidig er rimeligere, mindre teknisk utfordrende og mer effektiv i å generere en-neuron gentransfeksjon5,6,7,8,9. Det ser også ut til å være en forbedring i forhold til tidligere metoder når det gjelder lavere grad av celleskade eller død, da vi observerte at ~ 80% av cellene ble vellykket transfektert og sunne etter prosedyren. Denne metoden gir derfor en ny mulighet til å undersøke rollene til gener i flere nevroncelletyper ved hjelp av fluorescerende musemodeller. Fremtidige studier ved hjelp av denne metoden kan fokusere på proteinproteininteraksjoner mellom celler for å undersøke spesifikke molekylære eller fysiologiske funksjoner, inkludert transsynaptiske proteininteraksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants (R01NS085215 til K.F., T32 GM107000 og F30MH122146 til A.C.). Forfatterne takker Ms. Naoe Watanabe for dyktig teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A.
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F.
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).
