Summary
이 프로토콜은 심부전 모델링하는 경질 마우스의 에피카듐에 3D 생체 인쇄 패치를 이식하는 것을 목표로합니다. 그것은 마취에 관한 세부 사항을 포함, 수술 가슴 개폐, 왼쪽 전방 내림차순 (LAD) 관상 동맥의 영구 결찰 및 심장의 경각진 영역에 생체 인쇄 패치의 적용.
Abstract
3D 생체 인쇄 심장 패치의 재생 특성을 영구적으로 왼쪽 전방 내림차순 (LAD) 결찰을 통해 심부전의 뮤린 모델을 사용하여 생체 내에서 재생 특성을 테스트하는 것은 도전적인 절차이며 특성으로 인해 높은 사망률을 가지고 있습니다. 우리는 세포와 하이드로겔의 생체 인쇄 패치를 일관되게 이식하여 원시 마우스 심장의 에피카듐에 이식하여 견고하고 실행 가능한 방식으로 재생 특성을 테스트하는 방법을 개발했습니다. 첫째, 깊은 마취 마우스는 신중하게 삽관및 통풍이 됩니다. 왼쪽 측면 흉부 절제술 (가슴의 외과 개방)에 따라, 노출 된 LAD는 영구적으로 리그화되고 생체 인쇄 패치가 에피카르듐에 이식됩니다. 마우스는 가슴 이닫기 후 절차에서 빠르게 회복됩니다. 이 강력하고 빠른 접근의 장점은 최대 30%의 예측된 28일 사망률을 포함합니다 (마우스에 있는 영구 LAD 결찰의 유사한 모형을 사용하여 그밖 연구 결과에 의해 보고된 44% 보다는 더 낮습니다). 더욱이, 이 프로토콜에 기술된 접근은 다재다능하고 최적으로 전력 연구 결과를 위해 많은 수의 동물이 필요한 다른 세포 모형 또는 하이드로겔을 사용하여 생체 인쇄 패치를 시험하기 위하여 적응될 수 있었습니다. 전반적으로, 우리는 심장 재생 및 조직 공학의 필드에 대한 미래 연구에서 전임상 시험을 변경할 수있는 유리한 접근 으로 이것을 제시한다.
Introduction
심장 이식은 말기 심부전 환자를 위한 금 본위제 치료이지만 기증자 기관의 부족이 있습니다. 이식 거부를 방지하기 위해 면역 체계 억제가 필요하며 1년 사망률은1전 세계 15%입니다. 따라서, 인체 실험2,,3,,,4,,5,6,57,8,9로번역하는 것을 볼 수 있는 전임상 동물 모델에서 심근을 재생하는 오랜 인센티브가있다., 줄기세포 또는 줄기세포 유래 심장세포의 3D 바이오프린팅의,최근 발전은,심근2,3,,9,10,,11,,12를재생하는 유망한 접근법으로 주목받고 있다.
심장을 재생하기 위해 패치를 적용한 최초의 인체 안전 실험은 콜라겐 또는 배아 줄기 세포 유래 심장 전구 세포에서 경축된 자가골골 단핵 세포와7함께 피브린의 혈청7,,8,,13에이식된 것으로 보고되었다. 그러나, 보다 정밀하고, 확장가능하며, 자율화및 재현가능한 방법의 경우, 심장의 상피 표면에 적용되는 최적화된 하이드로겔 패치의 3D 바이오프린팅은 심장 이식2,,10,,11,,12가필요로 하는 환자를 위한 심근을 재생하는 유망한 접근법이다.
인체 실험에 번역이 발생하기 전에 전임상 동물 연구가 필요합니다. 심근의 재생을 추구하는 생체 내 모델에서 돼지5,양14,쥐6 및 마우스4에서보고되었다. 마우스내 심근 경색(MI)의 일반적인 모델은 좌측 전방 내림차순(LAD)관상동맥(15,,16)의영구 결찰을 사용한다. 사용되는 마우스의 다른 균주 중, C57BL6 마우스의 영구 LAD 결찰은 허용 가능한 생존율을 가지며 일반적으로 MI16이후 일관된 리모델링 및 심장 변화를 제시한다. 설치류 모델에서는 손상된 심근4,6,617의효과적인 재생을 위해 심장 조직이 심장에 적용된 여러 가지접근법이설명되었다. 큰 동물은 여전히 심장 재생특성을테스트하기 위해 임상적으로 관련된 모델을 나타내지만5,14,마우스 모델의 다재다능함과 타당성은 빠르게 움직이는 연구 영역에 빌려준다. 이것은 (이에 국한되지 않음) 높은 동물 사망률 (대각선 관상 동맥이 예측할 수없는 세그먼트 비원색(14)로이어지는 리그화되지 않는 한, 큰 동물 연구의 전형적인 함정중 일부를 피할 수 있습니다, 또는 LAD의 말단은 영구 결찰5대신 재퍼루션 뒤에. 2) 마우스18에비해 큰 동물 프로토콜에 의한 상대적으로 증가 된 피해와 윤리적 문제; 3) 비용 및 / 또는 타당성 문제 증가, 예를 들어 MRI 스캐너(14)와같은 대형 동물 장비의 상대적 가용성. 또한 대규모 동물 연구의 전형적인 광범위한 기간과 헌신을 감안할 때, 그들은 특히이 분야의 전형적인 급속한 발전과 함께, 완료되기 전에 구식이 될 수있는 잠재력을 가지고 있다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 최근에는 심장 재생 조절에 염증세포 및 중재자에 의해 중요한 역할이나타났다는것이19,20으로나타났다. 더욱이, 작은 동물 모형과 같은 전임상 연구의 중요한 역할은, 인간적인 예심으로 이동하기 전에 강력한 지식을 얻기 위하여 필수적인 단계로 Lancet 위원회에 의해 강조되었습니다21.
생체 내 패치 기반 심장 재생 접근법에 대한 메커니즘 이해 및 최적화 조건의 진전을 촉진하기 위해 C57BL6 마우스의 경질 심장 표면에 3D 생체 인쇄 알기네이트/젤라틴 하이드로겔 패치를 적용하는 '스쿱 및 드레이프' 방법을 설명하는 새로운 접근법을 제시합니다. 이러한 접근법의 목적은 빠르게 진화하는 심장 재생2분야에대한 광범위한 연구 맥락에서 실현 가능할 가능성이 높은 3D 생체 인쇄 패치를 테스트하는 생체 내 다목적 모델을 제공하는 것이다. 이 방법은 생체 내 패치 내에서 비 생체 인쇄 방법, 상이한 하이드로겔 및 자가 또는 동종 줄기 세포 유래 세포에 의해 생성된 패치를 테스트하도록 조정할 수 있다. 그러나, 생체 인쇄의 상세한 고려, 하이드로겔 또는 세포 모형은 외과 이식 방법에 초점을 맞춘 이 연구 결과의 범위를 벗어납니다.
프로토콜의 장점은 생체 인쇄 패치의 심근 경색 및 적용이 쉽게 사용할 수 있고 비용 효율적인 실험실 도구와 상대적으로 낮은 사망률로 신속하게 수행 될 수있는 하나의 수술 절차에서 수행된다는 것을 포함한다. 또한 일반적으로 작은 공간에서 큰 동물 모델보다 더 많은 수의 동물을 허용하므로 여러 실험 그룹의 강력한 비교를 허용하며, 특히 생체 내의 여러 그룹 비교에 유용합니다. 한편, 이 프로토콜은 마우스 모델이 큰 동물 모델보다 인간의 심장 크기, 해부학 및 생리학에서 더 멀리 떨어져 있으며 인간으로 직접 번역되지 않는다는 단점이 있습니다. 2) 뮤린 LAD 는 근교로, 개별 마우스 사이의 상당한 가변성을 가지고, 이는 극단적 인 크기 가변성 (큰 동물 모델과 공유 하는 문제); 3) 패치는 특정 비원지대에 적용하는 것보다 덜 정확한 전체 전방 심장 표면에 적용되어야 합니다. 및 4) 패치는 MI시에 즉시 적용된다(인간용으로는 초기 MI14이후 만성극소성 심장 개월에 적용을 위한 패치를 개발하는 것이 더 임상적으로 유용할 가능성이 높다).
그럼에도 불구하고 테스트 중인 가설에 따라 적절하게 선택된 경우 이 프로토콜은 대부분의 실험실에서 사용할 수 있는 재료, 예산 및 전문 지식과 일치하는 방식으로 높은 n 숫자로 중요한 생체 내 데이터를 신속하게 제공할 수 있습니다. 대형 동물 모델에 비해, 그것은 신흥 3D 바이오 프린팅 기술에 적응 할 만큼 충분히 다재다능한 생체 내 모델입니다 (예를 들어 더 큰 동물 모델로 이동하기 전에 타당성과 안전을 테스트하기 위해 파일럿 연구를 수행의 상대적 용이성). 생체 내 데이터를 효율적이고 저렴하게 생성하려는 연구자에게 적합하며, 아마도 패치에 다른 생체 인쇄 매개 변수, 세포 또는 하이드로겔을 사용하여 3D 생체 인쇄 패치를 여러 비교하는 데 적합할 것입니다. 대규모 패치를 사용하는 경우 발생할 수 있는 고가의 세포 계보 또는 기타 물질의 과도한 낭비 없이 생체 내에서 하이드로겔을 사용하여 줄기 세포 및 줄기 세포 유래 세포의 상이한 혼합물의 상호 작용을 테스트하는 데 특히 유용할 것입니다. 마우스 모델을 사용하면 특정 면역 결핍을 가진 균일 한 마우스가 바람직한 종 호환 마우스 파생 세포 및 줄기 세포 계보 또는 인간 유래 세포를 포함하는 패치의 테스트를 용이하게할 것이다. 추가적으로, 유전자 변형마우스 긴장에서 시험은 연구원이 신호 통로및 심장 혈관 질병과 관련있는 특정 세포 모형에 특정 유전자의 효력을 격리하는 것을 허용할 수 있었습니다, 이는 현재 큰 동물 모형에서 가능하지 않을 것입니다.
Protocol
이 실험에 설명된 모든 절차는 호주 뉴사우스웨일즈 주 북부 시드니 지역 보건 지구의 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다(프로젝트 번호 RESP17/55).
1. 마취 및 삽관
참고: 스테레오마이크로코프, 열패드(흡수제 시트로 덮여 있음) 및 인공호흡기 시스템을 켜고 설정합니다.
- 70%의 에탄올이 있는 깨끗한 장갑, 수술 부위 및 도구.
- 마우스의 무게는 관면 경로(케타민 40 mg/kg, 자일라진 5 mg/kg, 아트로핀 0.15 mg/kg)에 의해 주입된 마취의 복용량을 계산하고 주사를 제공합니다.
- 마우스가 마취의 깊은 평면에 도달하면, 트리머와 흉부의 복부 왼쪽을 면도.
- 마우스를 2% 이소플루란(실내에 적절한 추출 환기보장)이 포함된 챔버에 놓습니다.
참고: 케타민/자일라진 주입의 상대적으로 낮은 복용량과 함께 2% 이소플루란 흡입 마우스를 깨우지 않고 최적의 삽관을 허용 하면서 마우스 죽음의 위험을 감소. - 마우스 supine을 놓고 비디오에 표시된 대로 3.0 봉합사가 벤치에 테이프로 표시된 상부 절개 치아에서 제지합니다. 발가락 핀치를 수행하여 감착을 확인합니다. 오로하린이 시각화될 수 있도록 고강도 조명을 마우스 목 위에 배치합니다.
참고: 또는, 마우스는 기관지 식별을 위해 입을 열어 놓고 상단 절개 아래에 고정된 탄성 밴드가 있는 관관 키트(예: 켄트 마우스 삽관 키트)에서 스탠드에 배치할 수 있다. - 구부러진 주걱을 사용하여 턱과 또 다른 주걱/무딘 집게를 열어 혀를 부드럽게 들어 올립니다. 마우스 본체와 함께 눈 높이 또는 약간 아래에 위치하는 동안 삽관하십시오.
- 성대의 개구부와 닫기를 시각화합니다. 열리면 삽관 키트와 함께 제공되는 20 G 플라스틱 카테터를 삽입하십시오.
- 관관된 마우스를 가열 패드가 장착된 작동 표면으로 조심스럽게 옮기습니다. 마우스 중량을 기준으로 대상 볼륨을 자동으로 설정하는 인공호흡기(예: MouseVent)에 마우스를 연결합니다.
- 산소로 1.5-2%의 이소플루란을 전달합니다(인공호흡기에 의해 자동으로 조절됨: 산소 실린더에서 1-2 L/min의 자동 인공호흡기에 1-2 L/min 유속이 있는 인공호흡기로 연결되는지 확인하십시오). 양측 가슴 상승을 확인하여 삽관을 확인합니다. 발가락 핀치를 수행하여 마취를 확인합니다.
- 두 눈에 옵탈믹 연고(예: Puralube Vet Opthalmic 연고)를 적용하여 건조를 방지하십시오.
2. 수술장 준비
- 인공 호흡기와 호흡 튜브 / 카테터 사이의 연결 부위에 테이프로 관착 튜브를 보호하십시오.
- 테이프의 긴 조각을 잘라 약간 높은 위치에서 작동 표면에 왼쪽 앞발을 고정합니다. 또한 다른 사지를 테이프로 테이프.
- 멸균 70% 이소프로판올과 포비도요오드 용액으로 가슴을 청소하고, 중앙에서 주변으로 이동하는 원형 동작으로 청소합니다.
- 발가락 핀치로 마취를 다시 한 번 확인합니다.
- 피하 주사를 통해 0.9% 식염수의 0.1 mL에서 0.08 mg/kg Temvet (buprenorphine)를 투여하십시오.
3. 왼쪽 측면 투라코토미
- 미세 팁 집게를 사용하여 눈에 띄는 시포이드 연골의 왼쪽에 약 5mm 지점에서 피부를 부드럽게 들어 올립니다. 외과 가위를 사용하여 이 시점부터 미드라인을 향해, 주브리움의 수준으로 피부에 초대형 절개를 만듭니다.
- 곡선 된 집게를 사용하여 피부와 근육 층을 부드럽게 분리하십시오. 피부 절개 다음 근육 층을 엽니 다.
- 흉곽의 자연적인 각도에 따라 세 번째 늑간 공간에서 절개를 식별하고 합니다.
- 리트랙터를 사용하여 3번째와 4번째 갈비뼈를 부드럽게 펴십시오.
- 집게로 얇은 심낭을 부드럽게 제거합니다.
- LAD가 시각화되지 않으면 왼쪽 오리경을 부드럽게 밀어 (보충 도 1참조) 위쪽으로 밀고 아래 관상 동맥을 찾습니다.
4. 왼쪽 전방 내림차순 (LAD) 영구 관상 동맥 결찰
- ~3mm 길이의 3-0 실크 봉합사를 자르고 LAD와 같은 방향으로 LAD 위에 이 강화3-0 실크 봉합사 조각을 넣습니다(시점 02:12 ~ 02:20).
- LAD를 식별하고 LAD에서 7-0 실크 봉합사를 통과합니다. LAD가 명확하게 시각화되지 않으면, 바늘 1mm 열등하고 심장의 동적 운동 중에 왼쪽 오리클의 끝에 도달 한 열등한 지점에 내측을 삽입하십시오.
참고: 이 구조는 심장의 심실 챔버에 빨간색이 가볍지만 인접한 폐보다 어둡고, 왼쪽 폐보다 우수한 암보다 열등하게 보이는 시점 01:54 – 01:55에서 비디오에서 가장 잘 시각화됩니다(왼쪽 폐보다 우수한 보조 도 1 참조). - 7-0 실크 봉합사로 2개의 던지기를 완료하고 LAD를 확보하기 위해 지지3-0 실크 봉합사 위에 단단히 전달합니다. 결단이 성공하면 합자에서 나온 전방 심실 영역이 희미해집니다.
- 매듭을 반대 방향으로 던져 고정하여 위쪽 견인력이 봉합사에게 전달되지 않도록 합니다. 추가 던지기는 봉합사 절단에 의한 심근 또는 LAD에 손상의 위험을 감소시키기 위하여 필요하지 않습니다.
5. 에피카르듐에 생체 인쇄 패치의 이식
- 열린 수술용 메스 패킷의 내부 멸균을 사용하여 6개의 웰 플레이트에서 경색 영역으로 생체 인쇄 패치를 조심스럽게 이동합니다.
- 생체 인쇄 패치를 전방 에피카원 표면에 조심스럽게 배치하여 전체 표면을 덮고 왼쪽 심실과 경색 영역(희게 영역)을 덮는 열등하고 측면 가장자리 위에 드레이프해야합니다.
- 날카로운 가장자리를 심장쪽으로 향하게 지시하지 않고 부드럽게 닫고 리트랙터를 제거합니다.
- 흉곽과 근육 층을 닫기 위해 간단한 중단 패턴에 6-0 prolene 봉합사를 사용합니다.
- 6-0 프렌 드 봉합사로 가슴을 닫는 동안 한숨 호흡 기능을 사용하면 폐를 팽창하여 흉막 구멍의 과도한 공기를 제거하여 흉막 구멍에 갇히고 폐렴을 유발합니다.
- 가슴이 단단히 밀봉되었는지 확인하십시오.
- 이소플루란을 1.0%로 줄입니다. 간단한 중단 패턴에 6-0 프렌 봉합사로 피부를 닫습니다. 이소플루란 기화기를 끕니다.
6. 마우스 복구
- 국소적용 2 mg/mL 부피바카인에 0.9% 식염수에 절개. 또한 관리: i) 안티세단 (atipamezole) 1 mg/kg; ii) 라식스 (furosemide) 8 mg/ kg; iii) 피하 주입을 통해 0.9% 식염수 용액의 600 μL.
참고: 안티세단은 마취제를 더 빠르게 되돌리는 것입니다. furosemide는 약물 주사로 투여 된 심장 출력 손상 및 추가 유체로 인해 과도한 유체를 하역하는 것입니다. - 마우스를 모니터링하고 독립적 인 호흡이 관관에서 마우스를 제거하기 위해 관찰 될 때까지 기다립니다.
- 마우스가 적절한 양측 호흡 속도와 깊이를 보여주고 발가락 핀치에 반응하면 마우스를 열 패드에 배치 한 깨끗한 복구 케이지에 놓습니다.
- 마우스에 촉촉한 음식(츄어질을 위해 촉촉한), 물병, 영양/수분 공급 젤을 제공합니다. 과장된 호흡 노력, 과도한 출혈 또는 잠재적으로 생명을 위협하는 다른 합병증을 모니터링합니다.
- 다음 3 일 동안, 관리 0.08 mg/kg Temvet (buprenorphine) 0.1 mL의 0.9% 피하 또는 복막 주사를 통해 식염수, 다음 시술 다음 5 일까지 매일 한 번.
- 케이지 칸막이에 의해 분리 된 쌍의 집 마우스는 전투 행동을 방지하는 동안 격리를 방지합니다. 실험이 끝날 때까지 적어도 매일 매일 마우스를 모니터링 (28 일) 그들의 웰빙에 주의 하 고 어떤 우려가 있는 경우 모니터링의 증가 주파수.
Representative Results
이식 시, 실온에서 패치의 점도(추가 크로스링커가 적용되지 않음) 심장의 윤곽위에 '드레이프'하고Figure 1심장 사이클로 동적으로 움직일 수 있게 하였다. 수술 후, 우리는 28일 동안 생체내에서 패치를 떠났으며, 이는 숙주 심장 기능33,4에 패치 효과를 허용하는 적절한 기간이라는 것을 발견했기 때문에(이식 후 3개월까지 완전한 기능 효과가 보이지 않을 수 있는 것으로 보고되었음에도 불구하고)22. 도 1의 마우스 심장에 앉아 나타난 패치의 사진은 적용 직후 촬영되었으며, 이식 시 심장에 드리우는 패치의 능력을 보여주었다. 이러한 대표적인 결과는 하이드로겔이 패치를 심장의 윤곽으로 성형할 수 있게 해주며, 하이드로겔이 도 1(이미지의 검은별으로 표시됨)에서 베어(hydrogel-free) 삼각형 영역으로 도시된 바와 같이 분할할 수 있었다. 생존 데이터(Kaplan-Meier 생존 곡선)는 가짜 시술을 받은 마우스에 비해 도 2에 도시된다(마우스 가슴의 폐쇄 뒤에 결찰 없이 LAD 하에서 바늘과 봉합의 통과).
그림 1: C57BL6 마우스 심장의 에피카듐에 적용된 생체 인쇄 심장 패치. 하이드로겔을 함유한 10mm x 10mm x 0.4mm 생체 인쇄 패치(이식 직후)는(알기네이트 4% (w/v)/젤라틴 8% (w/v) 미디어로 덮여 있는 것으로 나타났으며, 에피카 표면(흰색 화살촉 및 점선 =테두리)을 어설프게 하였다. 패치 점도는 심장의 윤곽에 성형할 수 있게 해주며, 패치가 분할된 우수한 측면에서 과도한 장력이 발생하여 하이드로겔(black star)이 커버하지 않는 삼각형 베어 영역을 만들 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 카플란 마이어 생존 분석 28 일 후 MI. 절차 군에서 9마리의 마우스가 사망(n=38)을 통해 전반적인 사망률이 24%에 달하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: 비디오 스틸 이미지 (비디오 시간 점 01:54 – 01:55) 왼쪽 auricle를 보여주는 (왼쪽 심방 부속서). 화살표는 심장의 우수한 왼쪽 가장자리에 삼각형 구조로 표시되는 왼쪽 오리클의 피복 끝을 가리킵니다. LAD가 명확하게 시각화되지 않은 경우, 왼쪽 오리클의 끝은 LAD 에서 봉합사를 통과하는 바늘 입구의 랜드 마크로 사용될 수 있습니다. 진입점은 심장의 역동적인 움직임 동안 왼쪽 오리클의 끝이 도달하는 열등한 지점으로 1mm 열등하고 내측됩니다(검은 화살표는 왼쪽 오리알의 피복 끝을 보여줍니다). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 방법은 영구 LAD 결찰 에 따라 경질 된 마우스 심장의 상각 표면에 적용하여 작업자가 생체 인쇄 패치를 효율적으로 이식할 수 있도록 합니다. 이 타당성 에 초점을 맞춘 방법에서, 우리는 근무 일당 8 개의 마우스에이 절차를 수행 할 수 있습니다 (전후 방의 준비 포함). 6웰 플레이트의 우물에서 8 개의 1cm2 패치를 생산하는 바이오 프린팅 실행은 2-3 시간이 걸립니다 (전후 준비 시간 포함). 우리는 쉽게 접근 할 수 있으며 일반적으로 알기네이트 / 젤라틴 하이드로겔 패치의 천연 접착 특성을 활용하여 심장의 전방 파각 표면을 가로 질러 패치를 드레이프하는 최소한의 비용을 추가하는 패치에 대한 특종으로 수술 메스 패킷의 내부 멸균을 사용했습니다. 우리의 경험에서, 마우스에 있는 LAD 결찰을 위한 프로토콜은 운영자 의존이고 28 일에 더 낮은 사망률은 한 모형에 전문화된 경험이 풍부한 연산자를 통해 달성될 수 있습니다. 반덴 보르네 등16은 C57BL6 마우스가 패치를 적용하지 않고 28일 동안 영구 LAD 결찰에 따른 사망률이 44%로, 이는 우리가 관찰한 30%의 상한보다 높은 것으로 나타났다.
삽관 단계는 중요하며 숙련 된 작업자가 수행하지 않는 한 마우스에 대한 사망률의 원천이 될 수 있습니다. 그것은 때문에 이 단계에 대한 운영자에 의해 돋보기 안경이 착용하는 이유입니다, 기관의 작은 크기로 인해 어렵게된다. 우리는 주입 된 케타민 / 자일라진뿐만 아니라 마우스가 각 약물의 상대적으로 낮은 용량으로 깊이 마취되도록 마취제의 유도를 위해 흡입 된 이소플루오란을 사용합니다. 따라서, 마우스가 이 삽관 단계 도중 깨어나기 위하여 리스크가 없습니다 그러나 높은 단하나 약 복용량과 관련되었던 높은 사망률은 피됩니다. Atropine은 또한 서맥과 과살리피와 같은 부작용을 중화하기 위해 주어졌습니다. 인후에 적용된 스포트라이트를 외부적으로 비추면 기관내부가 더 눈에 띄고 성대가 마우스의 호흡률(보통 분당 ~120회 호흡)으로 개폐되어야 합니다. 루프 스레드에 의해 유지 두 절개 치아와 함께 마우스를 완벽하게 배치하는 것이 중요합니다 (이 단계에 대한 마우스 아래 의 온난화 매트보다 하드 표면이 선호되는 이유)와 혀는 입을 열고 기관을 시각화하는 무딘 집게 / 주걱 으로 매우 부드럽게 후퇴합니다. 삽관이 완료되면 작업자는 삽관 영역에서 수술실로 이송하는 튜브를 빼내지 않도록 주의해야 합니다(저체온증을 방지하기 위해 열 매트가 있습니다). 호흡관을 인공호흡기에 연결할 때, 튜브를 한 손으로 안정시키고 인공호흡기 회로를 다른 손으로 연결하여 튜브의 인공호흡기 세그먼트를 연결할 때 기관으로 더 깊이 밀어 넣는 것과 같은 호흡 관의 움직임이 최소화되는 것이 중요합니다.
이 연구에서는 덜벡코의 수정된 이글 매체(DMEM)에서 알기네이트 4%(w/v)/젤라틴 8%(w/v)를 사용했습니다. 알기네이트/젤라틴 하이드로겔은 생체 적합성, 저렴한 비용 및 생체 역학 적 특성으로 알려져 있어 3D 조직 엔지니어링전략(23)에유용하다. 이 하이드로겔은 점도를 변경할 수 있도록 칼슘 이온을 추가하여 가벼운 젤레이션에 의해 교차 연결할 수 있습니다. 바이오 프린팅 후, 우리는 염화칼슘 (CaCl2)2 % (w /v) 인산염 완충 식염수 (PBS)를 패치에 적용한 다음 이식하기 전에 7-14 일 동안 6 개의 우물 판으로 DMEM에서 배양했습니다. 이것은 심장 세포를 포함하는 패치가 문화에서 이길 시작했지만 패치가 붕괴되기 전에 최적의 창이었습니다. CaCl2는 패치 붕괴를 줄이기 위해 포스트 바이오 프린팅 단계 전반에 걸쳐 정기적으로 첨가될 수 있지만, 우리는 하이드로겔의 본질적인 점도가 CaCl2의초기 투여량 1회만으로 이식까지 자신의 구조를 유지하기에 충분하다는 것을 발견했습니다.
이 방법은 봉합사 없이 성공적인 이식을 허용 (심장을 손상시킬 수 있습니다) 또는 접착제 (패치와 심장 사이의 인터페이스를 차단 할 수 있습니다). 향후 연구는 봉합제 및 접착제 이식이 패치가 심장에서 미끄러지거나 폐를 방해하지 않는 것이 중요하기 때문에 쥐의 이식에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 가설을 확인할 수 있습니다. 패치 기반 수리26 3을 가진 영구 LAD 결찰 모델에서 패치의 이식을 평가하는 다른 연구는시간 24,접목 패치 두께 (μm) 시간25,폴리머에 의한 이식 된 세포의 정량화를 남은 이식 영역 (mm2)을측정했습니다. 라벨이 부착된 살아있는 기증자 세포의 생물발광광자 방출 플루스(시간이 지남에 따라 살아있는 동물에서 살아남은 라벨이 부착된 이식세포를 정량화할 수 있는 초당 방출되는 광자의 측정)(27) . 향후 연구는 봉합술및 접착제 이식이 패치 이식에 영향을 미치는지 여부를 추가로 평가하기 위해 이러한 방법을 사용할 수 있습니다 (뿐만 아니라 호스트 심근에 구조적 및 기능적 효과). 그럼에도 불구하고, 우리의 면역 능력 마우스에서 생체 내에서 28 일 후 거시적으로, 전방 중질은 가변 섬유 물질과 접착을 제시했다. 패치 기반 심장 재생의 메커니즘은 수치 세포 보충보다는 숙주 대식세포 염증반응(19) 또는 분비된 면역학적인자(20)의 자극으로부터 일 수 있다. 염증이 긍정적 인 역할을하는 경우, 외국 하이드로겔 물질의 존재가 도움이 될 수 있습니다. 대안적으로, 이물질의 존재를 감소시키기 위해 하이드로겔 성분이 시간이 지남에 따라 분해되는 경우에 유리할 수 있다. 사실, 일부 접근법은 처음에 세포를 지원하고 붕괴하는 생체 물질을 사용하여 조직28,,29만둡시합니다. 패치 이식을 완전히 분석하고 패치 기반 심장 재생의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위한 향후 연구는 인체 실험2로번역하기 전에 최적화된 실험 설계로 이어질 수 있다.
전반적으로, 이 프로토콜은 넓게 실현 가능하고 또한 다른 세포 내용과 같은 3D 생체 인쇄 패치의 다중 단을 테스트하는 데 적합할 것입니다. 이 방법에 대한 향후 방향은 이전에 생체 내에서 테스트되지 않은 고급 하이드로겔을 함유한 패치의 생체 인쇄를 포함하거나, 큰 동물 모델로 진행하기 전에 최적화를 위해 상이한 자가 또는 동종 줄기 세포 유래 세포의 효과를 테스트한다.
Disclosures
없음.
자금 조달 명세서:
크리스토퍼 D. 로슈경은 존 로웬탈 경 장학금 2019 (시드니 대학), 르 그로스 레거시 펀드 뉴질랜드 (PhD012019) 및 심장 연구 호주 박사 학위 장학금 (2019-02)에 의해 지원되었다. 카민 이방인시드니 킥 스타트 그랜트 의 대학에 의해 지원되었다, 시드니 총리의 박사 인센티브 프로그램 보조금의 대학, UTS 종자 자금, 성인 줄기 세포 연구를위한 시드니 보조금의 가톨릭 대교구와 시드니 의과 대학 운동 심장 흉부 수술 연구 보조금.
Acknowledgments
비 수술 영상의 기록과 모든 비디오 편집 나탈리 존스턴 덕분에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
| 6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
| 7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
| Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
| Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
| Atropine sulphate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
| Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
| Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
| Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
| Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
| Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
| Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
| Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals - 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
| Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
| Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
| PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
| Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
| Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
| Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
| VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
| Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |
References
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