Summary
Le suc pancréatique est une source précieuse de biomarqueurs du cancer du pancréas humain. Nous décrivons ici une méthode de procédure de collecte peropératoire. Pour surmonter le défi de l’adoption de cette procédure dans des modèles murins, nous suggérons un échantillon alternatif, le liquide interstitiel tumoral, et décrivons ici deux protocoles pour son isolement.
Abstract
L’adénocarcinome pancréatique (PDAC) est la quatrième cause de décès lié au cancer, et deviendra bientôt la deuxième. Il existe un besoin urgent de variables associées à des pathologies pancréatiques spécifiques pour faciliter le diagnostic différentiel préopératoire et le profilage des patients. Le suc pancréatique est un fluide corporel relativement inexploré qui, en raison de sa proximité avec le site tumoral, reflète les changements dans les tissus environnants. Nous décrivons ici en détail la procédure de collecte peropératoire. Malheureusement, la traduction de la collecte de sucs pancréatiques en modèles murins de PDAC, pour effectuer des études mécanistes, est techniquement très difficile. Le liquide interstitiel tumoral (TIF) est le liquide extracellulaire, à l’extérieur du sang et du plasma, qui baigne les cellules tumorales et stromales. Tout comme le suc pancréatique, pour sa propriété de collecter et de concentrer les molécules qui se trouvent diluées dans le plasma, le TIF peut être exploité comme indicateur d’altérations microenvironnementales et comme source précieuse de biomarqueurs associés à la maladie. Le FIT n’étant pas facilement accessible, diverses techniques ont été proposées pour son isolement. Nous décrivons ici deux méthodes simples et techniquement peu exigeantes pour son isolement: la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire.
Introduction
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’une des tumeurs les plus agressives et deviendra bientôt la deuxième cause de décès 1,2,3. Il est bien connu pour son microenvironnement immunosuppresseur et pour son manque de réponse aux protocoles d’immunothérapie4. Actuellement, la résection chirurgicale est toujours la seule option curative pour PDAC, mais il existe une fréquence élevée de rechutes précoces et de complications postopératoires. L’absence de symptômes spécifiques jusqu’à un stade avancé ne permet pas un diagnostic précoce, contribuant ainsi aux délais de la maladie. En outre, le chevauchement des symptômes entre PDAC et d’autres pathologies pancréatiques bénignes peut entraver la réalisation d’un diagnostic rapide et fiable avec les stratégies de diagnostic actuelles. L’identification de variables associées à des pathologies pancréatiques spécifiques pourrait faciliter le processus de prise de décision chirurgicale et améliorer le profilage des patients.
Des résultats prometteurs dans la découverte de biomarqueurs ont été obtenus en utilisant des fluides corporels facilement accessibles, tels que le sang 5,6,7, l’urine 8, la salive9 et le suc pancréatique 10,11,12. De nombreuses études ont exploité des approches « omiques » globales, telles que des techniques génomiques, protéomiques et métabolomiques, pour identifier des molécules candidates ou des signatures qui pourraient faire la distinction entre l’ACPE et d’autres affections pancréatiques bénignes. Nous avons récemment démontré que le suc pancréatique, un fluide corporel relativement inexploré, peut être utilisé pour identifier les signatures métaboliques de patients ayant des profils cliniques distincts12. Le suc pancréatique est un liquide riche en protéines, qui accumule le sécrétome des cellules canalaires pancréatiques et s’écoule vers le canal pancréatique principal, puis vers le canal cholédoque principal. En raison de sa proximité avec le pancréas, il pourrait être fortement affecté par les perturbations microenvironnementales induites par la masse tumorale (Figure 1), et donc plus informatif que le sang ou l’urine, ou le profilage tissulaire. Plusieurs études ont exploré le potentiel du suc pancréatique pour identifier de nouveaux biomarqueurs de la maladie en utilisant diverses approches, y compris l’analyse cytologique 13, l’analyse protéomique effectuée par spectrométrie de masse 14,15, l’évaluation de marqueurs génétiques et épigénétiques tels que les mutations K-ras et p53 16,17, les altérations de la méthylation de l’ADN18 et les miARN 19 . Techniquement, le suc pancréatique peut être collecté en peropératoire ou avec des procédures mini-invasives, telles que l’échographie endoscopique, la cholangio-pancréatographie rétrograde ou par collecte endoscopique de la sécrétion de suc duodénal20. On ne sait pas encore dans quelle mesure la composition du suc pancréatique est affectée par la technique de collecte utilisée. Nous décrivons ici la procédure de prélèvement peropératoire et montrons que le suc pancréatique peut représenter une source précieuse pour les biomarqueurs PDAC.
Figure 1 : Représentation schématique de la collection de sucs pancréatiques. (A) Représentation schématique représentant la sécrétion de suc pancréatique dans le canal pancréatique et sa collecte pendant la chirurgie. L’encart montre un gros plan du microenvironnement tumoral: le suc pancréatique recueille les molécules libérées par les cellules tumorales et stromales dans les canaux pancréatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La collecte de suc pancréatique dans des modèles murins génétiques et orthotopiques de PDAC serait appréciée dans la perspective d’exploiter ce biofluide dans des études mécanistiques précliniques ; Cependant, cette procédure peut être techniquement très difficile et n’est pas réalisable pour des modèles plus simples tels que les tumeurs sous-cutanées. Pour cette raison, nous avons identifié le liquide interstitiel tumoral (TIF) comme une source alternative au suc pancréatique, pour sa caractéristique similaire d’agir comme un indicateur des perturbations environnantes. Le liquide interstitiel (SI) est le liquide extracellulaire, trouvé à l’extérieur des vaisseaux sanguins et lymphatiques, qui baigne les cellules tissulaires21. La composition de la FI est affectée à la fois par la circulation sanguine vers l’organe et par la sécrétion locale; en fait, les cellules environnantes produisent et sécrètent activement des protéines dans l’IF21. L’interstitium reflète les changements microenvironnementaux des tissus environnants et pourrait donc représenter une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs dans plusieurs contextes pathologiques, tels que les tumeurs. La forte concentration de protéines sécrétées localement dans le TIF peut être utilisée pour identifier les molécules candidates à tester comme biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques dans le plasma22,23,24. Plusieurs études ont prouvé que le TIF est un échantillon approprié pour les approches protéomiques à haut débit, telles que les techniques de spectrométrie de masse 23,24,25, ainsi que les approches ELISA multiplex 26 et le profilage des microARN 27.
Plusieurs approches ont été proposées pour l’isolement de la FI dans les tumeurs, qui peuvent être largement classées comme in vivo (ultrafiltration capillaire 28,29,30,31 et microdialyse 32,33,34,35) et ex vivo (centrifugation tissulaire 22,36,37,38 et élution tissulaire 39,40,41,42). Ces techniques ont été examinées en détail43,44. Le choix de la méthode appropriée devrait tenir compte de questions telles que les analyses et les applications en aval et le volume récupéré. Nous avons récemment utilisé cette approche comme preuve de principe pour démontrer l’activité métabolique différente des tumeurs de deux lignées cellulaires d’adénocarcinome pancréatique murin12. Sur la base de la littérature24,38, nous avons choisi d’utiliser la méthode de centrifugation à basse vitesse pour éviter la rupture cellulaire et la dilution du contenu intracellulaire. La quantité de glucose et de lactate dans le TIF reflétait les différentes caractéristiques glycolytiques des deux lignées cellulaires différentes. Nous décrivons ici en détail le protocole des deux méthodes les plus couramment utilisées pour l’isolement du FIT : la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire (Figure 2).
Figure 2 : Représentation schématique des méthodes d’isolement du liquide interstitiel tumoral. Illustration schématique des techniques décrites en détail dans le protocole, à savoir la centrifugation tissulaire (A) et l’élution tissulaire (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
Pour tous les patients recrutés, le sang périphérique et le suc pancréatique ont été prélevés au moment de la chirurgie selon les protocoles approuvés par le comité d’éthique de l’établissement. Tous les patients ont été recrutés dans l’étude après avoir signé un consentement éclairé, y compris la collecte d’échantillons biologiques et de données cliniques. L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’institution (protocole numéro ICH-595, approbation délivrée en mai 2009). Les procédures impliquant des souris et leurs soins ont été conformes aux directives européennes et institutionnelles (protocole ID 121/2016-PR).
1. Isolement du suc pancréatique
REMARQUE : Le retrait du suc pancréatique est effectué dans le cadre d’une procédure ouverte de résection pancréatique (p. ex. pancréaticoduodénectomie, pancréatectomie totale, pancréatectomie distale) par une équipe de chirurgiens pancréatiques experts.
- Sélection des patients
- Considérez pour la procédure tout patient prévu pour une résection pancréatique ouverte.
- Confirmer l’inclusion si la taille du canal pancréatique principal est jugée suffisante pour permettre le prélèvement du suc pancréatique. La limite minimale de diamètre du canal pancréatique principal est considérée comme de 2 mm à l’imagerie CT avec contraste amélioré.
- Étude préopératoire du canal pancréatique à l’imagerie CT améliorée par contraste pour aider à la planification de la récupération du suc pancréatique
- Localiser tridimensionnellement le canal pancréatique principal dans la glande au niveau du col pancréatique : mesurer la distance du canal pancréatique principal par rapport à la marge pancréatique antérieure, supérieure et inférieure sur les diapositives transversales et les rendus coronaux et sagittaux. Une fois dans la salle d’opération, utilisez ces mesures pour approximer le bon endroit où percer le pancréas pour canuler le canal Wirsung et récupérer le suc pancréatique.
- Préparation du matériel
- Matériel stérile : Ouvrez l’enveloppe stérile d’une aiguille de 25 G et d’une seringue de 3 mL et placez-les dans le champ stérile avec la collaboration de l’infirmière de récurage.
- Matériel non stérile : Gardez un tube à essai sous vide K2EDTA de 3 ml à portée de main dans la salle d’opération pour le stockage du liquide.
- Préparation du patient
- Placez le patient sur le lit de la salle d’opération. Induire une anesthésie générale mixte, en utilisant Remifentanil, Sevorane et Rocuronium, puis intuber et commencer à ventiler le patient. Placez le patient dans un décubitus dorsal avec le bras droit replié contre le corps et le bras gauche enlevé à 90° fixé sur un bras.
- Désinfectez la peau de l’abdomen au site de l’incision. Créer et maintenir un champ stérile sur l’abdomen draguant le patient.
- Intervention chirurgicale
- Effectuez une incision sous-costale et accédez à la cavité abdominale. Positionner une rétraction abdominale de Rochard pour l’exposition des organes.
- Exposer et mobiliser le pancréas par la manœuvre de Kocher, l’ouverture du ligament gastrocolique, l’incision du tissu rétropéritonéal le long du bord supérieur et inférieur du pancréas créant un plan de dissection entre le col pancréatique et la veine mésentérique supérieure située postérieurement.
- Une fois le pancréas mobilisé et exposé, procéder au retrait du suc pancréatique avant la section du col pancréatique.
- Identification et localisation du canal pancréatique
- Estimer l’emplacement du canal pancréatique à l’aide de la mesure prise à l’imagerie, puis palper la surface antérieure du pancréas pour identifier son emplacement précis.
- Collection de suc pancréatique
- Tenez la tête pancréatique et le duodénum par le dessous et élevez-le avec la main gauche, en marquant l’emplacement du canal pancréatique avec le premier chiffre.
- Tenez avec la main droite de la seringue de 3 ml avec l’aiguille de 25 G montée.
- Utilisez la main droite pour insérer l’aiguille dans le pancréas juste distale au pouce gauche. Décider de la profondeur de pénétration et du degré d’inclinaison de l’aiguille en fonction des mesures préopératoires et de la perception d’avoir pénétré la paroi du conduit.
- Retirer le jus avec la seringue. S’il n’est pas possible de récupérer le jus, déplacez l’aiguille dans les quatre directions en essayant de canuler le canal pancréatique.
- Une fois le suc pancréatique récupéré, déplacez-le à l’extérieur du champ stérile et transférez-le dans le tube à essai sous vide K2EDTA de 3 mL. Conserver à 4 °C jusqu’à ce que l’échantillon soit transféré au laboratoire et procéder à un traitement ultérieur le plus tôt possible.
REMARQUE: Le volume de suc pancréatique qui peut être récupéré avec cette procédure varie considérablement, allant d’environ 0,2 mL à 3 mL selon notre expérience. La quantité de jus prélevée dépend fortement du patient : la dimension du canal Wirsung et l’état fonctionnel du pancréas (fonctionnement versus glande atrophique). D’après notre expérience, il n’y a pas d’expédient qui puisse être utilisé pour augmenter la quantité de suc pancréatique récupérée.
2. Traitement du suc pancréatique
- Centrifuger le suc pancréatique à 400 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les cellules ou les débris.
REMARQUE: Le suc pancréatique doit être de couleur claire et transparente avant la centrifugation. Une contamination du sang pendant la chirurgie peut parfois se produire, rendant l’échantillon plus trouble et de couleur plus rouge. Envisager d’exclure ces échantillons des analyses ultérieures. - Récupérer l’aliquote surnageant et conserver à -80 °C jusqu’à de nouvelles analyses.
3. Induction de tumeurs sous-cutanées
NOTE: Les lignées cellulaires murines Panc02 et DT6606 ont été obtenues respectivement auprès du Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milan, Italie) et du Prof. Francesco Novelli (Center for Experimental Research and Medical Studies, Turin, Italie), comme décrit précédemment12.
- Croissance des cellules tumorales
- Culture de cellules Panc02 et DT6606 dans un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2mM de L-Glutamine et 1% d’antibiotique pénicilline-streptomycine.
- Décongeler les cellules congelées 1-2 semaines avant l’injection de la tumeur, selon le taux de croissance de la lignée cellulaire.
- Cultiver des cellules à 37 °C avec 5% de CO2 et 95% d’humidité dans des conditions stériles.
- Détacher les cellules avec une solution de trypsine/EDTA à 0,025 % pendant 5 min à 37 °C lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence et éliminer la trypsine par centrifugation.
REMARQUE: Les DT6606 sont des cellules primaires, non immortalisées, dérivées de la souris LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, et ne doivent pas être passées plus de 3 fois avant injection in vivo afin de maintenir leurs caractéristiques d’origine. Il est recommandé de décongeler les cellules DT6606 7 à 10 jours avant l’injection.
- Injection de cellules tumorales in vivo
- Trypsiniser les cellules (voir étape 3.1.4) et les laver une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Éliminer le PBS par centrifugation et remettre en suspension les cellules dans du PBS frais avant de compter.
- Compter les cellules et les remettre en suspension dans du PBS à une concentration de 0,5-1 x 107 cellules/mL afin d’avoir une concentration finale de 0,5-1 x 106 cellules/100 μL à injecter dans chaque souris. Préparez les cellules en excès. Gardez les cellules à 4 °C ou sur de la glace jusqu’à la fin de la procédure.
- Regroupez les animaux (souris C57BL/6J femelles âgées de 8 semaines) dans différentes cages en fonction de différentes lignées cellulaires ou traitements.
- Maîtriser les animaux manuellement et les anesthésier en utilisant un mélange de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou selon des procédures approuvées localement.
- Rasez le site d’injection, généralement un flanc au-dessus d’une jambe, avec un rasoir électrique et nettoyez soigneusement le site d’injection avec de l’alcool.
- Pipeter de haut en bas la suspension cellulaire avec une seringue de 1 mL, en éliminant les bulles d’air en déplaçant le piston de haut en bas. Fixez une aiguille de 25 G à la seringue et poussez le piston vers le haut jusqu’à ce que la suspension de la cellule atteigne l’ouverture de l’aiguille.
- Pincez la peau du flanc avec une pince à pointe plate et insérez délicatement l’aiguille à la base du pli cutané entre les pinces sans perforer la cavité péritonéale ou la musculature. Pour vérifier la position correcte de l’aiguille, essayez doucement de déplacer la pointe de l’aiguille latéralement sous la peau. L’aiguille doit bouger librement.
- Injectez lentement 100 μL de suspension cellulaire (contenant 0,5-1 x 106 cellules ), serrez doucement le site d’injection pendant quelques secondes et retirez lentement l’aiguille sans aucun mouvement latéral.
- Remettez la souris dans sa cage et surveillez la récupération de l’anesthésie.
- Vérifiez la croissance tumorale à l’aide d’un pied à coulisse pendant 3-4 semaines. Euthanasier les animaux lorsque les tumeurs atteignent environ 0,5-1cm3 en utilisant du CO2 ou selon des procédures approuvées localement.
4. Isolement du liquide interstitiel tumoral (TIF)
- Excision des tumeurs sous-cutanées
- Bloquez les membres des animaux avec du ruban adhésif et nettoyez la peau avec de l’alcool. Coupez la peau ouverte sur l’abdomen afin de la séparer du péritoine et continuez jusqu’aux membres. Excise la tumeur cultivée sous la peau du flanc à l’aide de ciseaux, de pinces et éventuellement d’un scalpel.
- Pesez la tumeur et conservez-la dans un tube propre sur de la glace jusqu’à l’isolement du TIF.
- Isolement du FIT par centrifugation
- Coupez la tumeur en deux, rincez rapidement les deux parties dans du PBS et épongez-les doucement sur du papier filtre pour éliminer l’excès de PBS. Effectuez ces étapes le plus rapidement possible pour éviter l’évaporation de la tumeur.
- Transférer immédiatement la tumeur dans une crépine à cellules en nylon de 20 μm fixée au sommet d’un tube conique de 50 mL.
- Centrifuger le tube à 400 x g pendant 10 min à 4 °C.
REMARQUE: Cette centrifugation à basse vitesse préserve l’intégrité cellulaire en évitant la contamination du TIF par le compartiment intracellulaire. La fuite de contenu intracellulaire peut être testée dans des applications en aval, par exemple en évaluant la présence de protéines internes intracellulaires, telles que les protéines ribosomales25. - Récupérez le TIF au fond du tube, éventuellement aliquote-le et congelez-le immédiatement sur de la glace sèche et conservez-le à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
Facultatif : Sur la base de l’analyse protéomique en aval à effectuer, diluer l’échantillon dans du PBS avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase pour éviter la dégradation de molécules spécifiques.
REMARQUE: Selon la composition de la tumeur, dans certains cas, les très petites tumeurs ne produisent pas de liquide.
- Isolement du FIT par élution
- Couper la tumeur en petits morceaux (≈1-3 mm3) avec des ciseaux ou un scalpel et rincer soigneusement avec du PBS froid.
REMARQUE: Dans cette étape, il est très important de travailler rapidement et d’effectuer un minimum de manipulation pour éviter d’endommager les cellules. - Transférer les morceaux tumoraux dans un tube de 1,5 mL et ajouter 500 μL de PBS avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase pour éviter la dégradation des analytes. Incuber pendant 1 heure à 37 °C et 5% de CO2.
- Récupérez le surnageant et transférez-le dans un nouveau tube de 1,5 mL. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer les cellules de l’échantillon.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à nouveau à 2 000 x g pendant 8 min à 4 °C.
- Transférer le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à nouveau à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les débris. Récupérez le surnageant. Immédiatement aliquote et congeler l’échantillon de FIT sur de la glace sèche et conserver à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.
- Couper la tumeur en petits morceaux (≈1-3 mm3) avec des ciseaux ou un scalpel et rincer soigneusement avec du PBS froid.
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Representative Results
Nous avons suivi la procédure décrite ci-dessus pour obtenir le suc pancréatique de patients atteints de PDAC (n = 31) et d’autres affections pancréatiques bénignes (non-PDAC, n = 9), y compris la pancréatite (n = 2), les tumeurs papillaires de l’ampoule (n = 4), les tumeurs neuroendocrines (n = 2), la néoplasie mucineuse papillaire intracanalaire (IPMN; n = 1) 12. Les échantillons de suc pancréatique ont ensuite été soumis à une analyse métabolomique par résonance magnétique nucléaire (1H-RMN)12. En filtrant les signaux RMN larges des macromolécules (par exemple, lipoprotéines, lipides, etc.), nous avons pu apprécier en détail les métabolites de faible poids moléculaire, comme le montrent les spectres 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) (Figure 3A). L’analyse OPLS-DA supervisée a montré que le profil métabolique détecté dans le suc pancréatique était capable de distinguer les patients PDAC et non-PDAC avec une précision de 82,4% obtenue par validation croisée (Figure 3B). Il est intéressant de noter que l’analyse métabolomique effectuée sur des échantillons de plasma provenant des mêmes patients n’a pas donné le même pouvoir discriminatif (précision de 75,2% obtenue par validation croisée) (Figure 3C). Ces résultats indiquent que le suc pancréatique est un échantillon riche en protéines et convient à des analyses « omiques » complètes. En outre, le pouvoir discriminatif supérieur du suc pancréatique par rapport au plasma suggère que le déplacement « en amont » vers des échantillons plus proches du site tumoral pourrait être une stratégie efficace pour identifier les biomarqueurs qui aident à distinguer PDAC des autres maladies pancréatiques.
Figure 3 : Contenu métabolomique du suc pancréatique et du plasma. (A) 1spectres CPMG H-RMN d’échantillons PDAC (n = 31, bleu) et non PDAC (n = 9, vert) montrant des détails sur les métabolites de faible poids moléculaire contenus dans les sucs pancréatiques. ppm, parties par million. (B) Scores d’analyse OPLS-DA multivariée supervisée sur les spectres CPMG provenant d’échantillons PDAC du suc pancréatique (cercles bleus) et d’échantillons non PDAC (triangles violets). L’analyse sépare les deux groupes (chacun décrit par un diagramme en araignée), avec une précision de 82,4% obtenue par validation croisée. (C) Scores d’analyse OPLS-DA multivariée supervisée sur des spectres 1D-NOESY provenant d’échantillons plasmatiques de PDAC (n = 22, cercles bleus) et d’échantillons non PDAC (n = 7, triangles violets). Précision de 75,2% obtenue par validation croisée. Cette figure a été modifiée à partir de Cortese et al.12 avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour démontrer que la teneur en FIT reflète de manière fiable les changements dans le microenvironnement tumoral, nous avons injecté par voie sous-cutanée deux lignées cellulaires de cancer du pancréas avec un taux glycolytique opposé, Panc02 (hautement glycolytique) et DT6606 (faiblement glycolytique), en suivant le protocole décrit ci-dessus. Nous avons ensuite isolé le TIF des tumeurs excisées en utilisant la méthode de centrifugation à basse vitesse décrite ci-dessus (voir paragraphe 4.2). Sur des tumeurs de poids compris entre 0,25 et 1 g, nous avons récupéré une gamme de 5 à 15 μL de TIF, qui a ensuite été utilisée pour quantifier la concentration de glucose et de lactate. Le TIF des tumeurs hautement glycolytiques contenait moins de glucose et plus de lactate que les tumeurs faiblement glycolytiques (Figure 4). Ces données montrent que le TIF peut être utilisé comme source de métabolites dérivés de tumeurs et de changements en fonction de la tumeur elle-même.
Figure 4 : La teneur en glucose et en lactate du TIF reflète les caractéristiques intrinsèques de la tumeur. (A) Concentration de glucose et (B) de lactate dans le liquide interstitiel, isolé à l’aide de la méthode de centrifugation tissulaire, à partir de tumeurs implantées par voie sous-cutanée Panc02 (hautement glycolytique, n = 10 dans A, n = 9 dans B) et DT6606 (faiblement glycolytique, n = 5 dans A, n = 4 dans B). Les diagrammes en boîte donnent la médiane, le quartile inférieur et le quartile supérieur par la boîte, et le minimum et le maximum par les moustaches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, nous avons décrit la technique de collecte peropératoire du suc pancréatique, une biopsie liquidienne largement inexplorée. Nous avons récemment montré que le suc pancréatique peut être exploité comme source de marqueurs métaboliques de la maladie12. L’analyse métabolomique sur d’autres biopsies liquides, telles que le sang 5,6,7, l’urine8 et la salive9, a montré des résultats prometteurs dans la discrimination entre PDAC et les sujets sains ou la pancréatite. Le suc pancréatique, cependant, est directement sécrété par les cellules canalaires pancréatiques, et en raison de sa proximité avec le site tumoral, il pourrait être un indicateur plus fiable des changements dans les tissus environnants, même dans les premiers stades de la maladie. En fait, alors que les données spectrales de la RMN-H du suc pancréatique ont permis de faire une distinction entre les patients PDAC et d’autres maladies pancréatiques bénignes, les échantillons de plasma ne l’ont pas fait. Par conséquent, bien que moins accessible que d’autres biopsies liquidiennes, le suc pancréatique représente une source précieuse de biomarqueurs cliniques et pourrait aider à identifier des maladies en évolution rapide. Nous avons décrit ici la technique peropératoire pour la collecte du suc pancréatique; Cependant, il pourrait également être effectué lors de procédures mini-invasives, dans la perspective d’identifier des marqueurs précoces précieux de la maladie. Il reste à déterminer si les différentes procédures de collecte affectent la composition protéomique du suc pancréatique.
Alors que d’autres biopsies fluides sont facilement accessibles dans les modèles murins PDAC, la collecte de suc pancréatique in vivo peut être très difficile si l’on considère des modèles génétiques ou orthotopiques, et n’est pas réalisable du tout dans les modèles sous-cutanés. Par conséquent, dans cet article, nous avons suggéré l’utilisation du liquide interstitiel tumoral comme une alternative précieuse et largement applicable. En fait, la composition du liquide interstitiel, semblable au suc pancréatique, est directement affectée par les altérations du milieu local. Le profilage protéomique sur TIF de différentes tumeurs, telles que les carcinomes hépatocellulaires 45,46, les cellules rénales41, les ovaires 22,47,48 et les seins 42,49, a montré des résultats encourageants dans la recherche de biomarqueurs candidats. Cependant, il y a peu de chevauchement dans les protéines candidates identifiées, ce qui suggère que l’approche utilisée pour isoler le TIF, ainsi que l’analyse en aval effectuée et la collecte de données, pourraient affecter les analytes détectés. Une étude récente sur le carcinome épidermoïde comparant les deux méthodes d’isolement du TIF décrites ici, centrifugation et élution, a observé une forte cohérence dans la composition du TIF indépendamment de la méthode utilisée, bien que la centrifugation ait donné une teneur plus élevée en protéines extracellulaires25.
Les deux méthodes décrites ici pour l’isolement du TIF, la centrifugation tissulaire et l’élution tissulaire, ont l’avantage d’être techniquement peu exigeantes, rapides et ne nécessitent qu’un équipement de laboratoire de base. Par rapport à d’autres approches, telles que la microdialyse et l’ultrafiltration capillaire, les techniques de centrifugation et d’élution présentent la limitation intrinsèque de n’être réalisables qu’ex vivo. Il est important de prendre en compte plusieurs questions lors du choix de la méthode appropriée, telles que le but analytique de l’expérience, le volume récupéré et la rupture cellulaire. La composition de la tumeur doit également être prise en compte, car elle peut influencer le volume de TIF récupéré. La centrifugation tissulaire a été développée à l’origine pour les tissus pauvres en cellules et riches en collagène tels que la cornée38; Les tumeurs, d’autre part, sont généralement des tissus caractérisés par une cellularité élevée et une vascularisation riche, deux caractéristiques qui augmentent la conductivité hydraulique, et devraient donc faciliter l’isolement du TIF par centrifugation. Cependant, certaines tumeurs, dont la PDAC, présentent une composante stromale ou fibrotique abondante, riche en protéines de la matrice extracellulaire, comme les collagènes, qui ont tendance à retenir les macromolécules dans le tissu[21].
L’élution tissulaire, quant à elle, est basée sur la diffusion passive de protéines du tissu vers l’éluat, et a été exploitée avec succès pour une grande variété de tumeurs43. Elution permet la récupération de plus grands volumes, mais les protéines seront diluées. Pour cette raison, l’élution tissulaire pourrait ne pas convenir aux molécules à très faible abondance. De plus, l’élution nécessite un plus grand degré de manipulation de la tumeur, ce qui peut entraîner une fuite du contenu intracellulaire dans le TIF. Cela pourrait ne pas être pertinent pour la découverte de biomarqueurs, mais pourrait introduire un biais si l’objectif est de déterminer la production locale de protéines. La quantité de rupture cellulaire doit être testée dans les applications en aval afin de choisir la méthode la plus appropriée en fonction du type de tumeur. Cela peut être effectué de plusieurs manières, par exemple en testant la présence de protéines ménagères, telles que les protéines ribosomiques, dans TIF25. Une autre approche suggérée consiste à comparer les concentrations de substances extracellulaires sélectionnées, telles que la créatinine ou le Na+, dans le TIF et le plasma, qui devraient être similaires22. La fuite du contenu intracellulaire doit également être envisagée pour la méthode de centrifugation; En fait, il n’y a toujours pas de consensus général sur ce qui devrait être considéré comme « à basse vitesse » afin d’éviter la rupture cellulaire, peut-être en raison des différences de composition tumorale. Nous avons choisi d’utiliser une vitesse de 400 x g, car il a été démontré qu’aucune dilution du contenu intracellulaire ne se produit pour les forces g <42438.
Quelle que soit l’approche, le TIF représente une source précieuse et largement applicable pour échantillonner le microenvironnement tumoral. Nous avons montré qu’il récapitule les caractéristiques intrinsèques de la tumeur et pourrait être utile pour l’identification de biomarqueurs de maladies ou de cibles thérapeutiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Roberta Migliore pour son assistance technique. La recherche menant à ces résultats a reçu un financement de l’Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) dans le cadre du projet IG2016-ID.18443 – P.I. Marchesi Federica. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
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