Summary
Bukspyttkjerteljuice er en verdifull kilde til biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen. Vi beskriver her en metode for intraoperativ innsamlingsprosedyre. For å overvinne utfordringen med å vedta denne prosedyren i murine modeller, foreslår vi en alternativ prøve, tumor interstitiell væske, og beskriver her to protokoller for isolasjon.
Abstract
Pankreas adenokarsinom (PDAC) er den fjerde ledende årsaken til kreftrelatert død, og snart å bli den andre. Det er et presserende behov for variabler knyttet til spesifikke pankreaspatologier for å hjelpe preoperativ differensialdiagnose og pasientprofilering. Bukspyttkjerteljuice er en relativt uutforsket kroppsvæske, som på grunn av sin nærhet til tumorstedet reflekterer endringer i det omkringliggende vevet. Her beskriver vi i detalj den intraoperative innsamlingsprosedyren. Dessverre er det teknisk svært utfordrende å oversette bukspyttkjerteljuiceinnsamling til murine-modeller av PDAC, for å utføre mekanistiske studier. Tumor interstitiell væske (TIF) er den ekstracellulære væsken, utenfor blod og plasma, som bader tumor og stromale celler. På samme måte som bukspyttkjerteljuice, for sin egenskap å samle og konsentrere molekyler som finnes fortynnet i plasma, kan TIF utnyttes som en indikator på mikromiljøendringer og som en verdifull kilde til sykdomsassosierte biomarkører. Siden TIF ikke er lett tilgjengelig, har ulike teknikker blitt foreslått for isolasjon. Vi beskriver her to enkle og teknisk lite krevende metoder for isolering: vevsentrifugering og vevseluering.
Introduction
Pankreas ductal adenokarsinom (PDAC) er en av de mest aggressive svulstene, og snart å bli den nest største dødsårsaken 1,2,3. Det er kjent for sitt immunosuppressive mikromiljø og for sin manglende respons på immunterapiprotokoller4. For tiden er kirurgisk reseksjon fortsatt det eneste kurative alternativet for PDAC, men det er en høy frekvens av tidlige tilbakefall og postkirurgiske komplikasjoner. Mangelen på spesifikke symptomer til et avansert stadium tillater ikke en tidlig diagnose, noe som bidrar til sykdommens tidsfrister. Videre kan overlappingen av symptomer mellom PDAC og andre godartede pankreaspatologier hindre oppnåelsen av en rask og pålitelig diagnose med dagens diagnostiske strategier. Identifisering av variabler knyttet til spesifikke pankreaspatologier kan lette den kirurgiske beslutningsprosessen og forbedre pasientprofilering.
Lovende resultater i biomarkøroppdagelse er oppnådd ved bruk av lett tilgjengelige kroppsvæsker, som blod 5,6,7, urin8, spytt 9 og bukspyttkjerteljuice10,11,12. Mange studier har utnyttet omfattende "omics" tilnærminger, for eksempel genomiske, proteomiske og metabolomiske teknikker, for å identifisere kandidatmolekyler eller signaturer som kan diskriminere mellom PDAC og andre godartede pankreasforstyrrelser. Vi har nylig vist at bukspyttkjerteljuice, en relativt uutforsket kroppsvæske, kan brukes til å identifisere metabolske signaturer hos pasienter med forskjellige kliniske profiler12. Bukspyttkjerteljuice er en proteinrik væske som akkumulerer sekretomet av bukspyttkjertelen og strømmer til hovedpankreaskanalen, og deretter til den viktigste vanlige gallekanalen. På grunn av nærheten til bukspyttkjertelen kan den bli sterkt påvirket av mikromiljøforstyrrelser indusert av tumormassen (figur 1), og derfor mer informativ enn blod eller urin eller vevsbasert profilering. Flere studier har undersøkt potensialet for bukspyttkjerteljuice for å identifisere nye biomarkører av sykdom ved hjelp av ulike tilnærminger, inkludert cytologisk analyse 13, proteomisk analyse utført ved massespektrometri 14,15, vurdering av genetiske og epigenetiske markører som K-ras og p53 mutasjoner 16,17, endringer i DNA-metylering18 og miRNA 19 . Teknisk sett kan bukspyttkjerteljuice samles intraoperativt eller med minimalt invasive prosedyrer, for eksempel endoskopisk ultralyd, retrograd kolangio-pankreatografi, eller ved endoskopisk samling av duodenal juice sekresjon20. Det er ennå ikke klart i hvilken grad sammensetningen av bukspyttkjerteljuice påvirkes av innsamlingsteknikken som brukes. Vi beskriver her den intraoperative innsamlingsprosedyren og viser at bukspyttkjerteljuice kan representere en verdifull kilde for PDAC-biomarkører.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av bukspyttkjerteljuicesamling. (A) Skjematisk fremstilling som viser sekresjonen av bukspyttkjerteljuice i bukspyttkjertelen og dens samling under operasjonen. Innfellingen viser et nærbilde av svulstens mikromiljø: bukspyttkjerteljuice samler molekyler frigjort av tumor- og stromale celler i bukspyttkjertelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Samlingen av bukspyttkjerteljuice i genetiske og ortotopiske musemodeller av PDAC vil bli verdsatt i perspektivet for å utnytte denne biofluiden i prekliniske mekanistiske studier; Imidlertid kan denne prosedyren være teknisk svært utfordrende og er ikke mulig for enklere modeller som subkutane svulster. Av denne grunn identifiserte vi tumor interstitiell væske (TIF) som en alternativ kilde til bukspyttkjerteljuice, for sin lignende egenskap for å fungere som en indikator på omgivende forstyrrelser. Interstitiell væske (IF) er den ekstracellulære væsken, funnet utenfor blod og lymfekar, som bader vevsceller21. IF-sammensetningen påvirkes av både blodsirkulasjon til orgelet og lokal sekresjon; Faktisk produserer og utskiller omkringliggende celler aktivt proteiner i IF21. Interstitium reflekterer mikromiljøendringer i omkringliggende vev og kan derfor representere en verdifull kilde for biomarkøroppdagelse i flere patologiske sammenhenger, for eksempel svulster. Den høye konsentrasjonen av lokalt utskilte proteiner i TIF kan brukes til å identifisere kandidatmolekyler som skal testes som prognostiske eller diagnostiske biomarkører i plasma22,23,24. Flere studier har vist at TIF er en egnet prøve for proteomiske tilnærminger med høy gjennomstrømning, for eksempel massespektrometriteknikker 23,24,25, samt multiplex ELISA-tilnærminger 26 og mikroRNA-profilering 27.
Flere tilnærminger har blitt foreslått for isolering av IF i svulster, som i stor grad kan kategoriseres som in vivo (kapillær ultrafiltrering 28,29,30,31 og mikrodialyse 32,33,34,35) og ex vivo metoder (vevsentrifugering 22,36,37,38 og vev eluering 39,40,41,42). Disse teknikkene har blitt gjennomgått i omfattende detalj43,44. Valg av egnet metode bør ta hensyn til blant annet nedstrømsanalyser og anvendelser og gjenværende volum. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen som et prinsippbevis for å demonstrere den forskjellige metabolske aktiviteten til svulster fra to murine pankreas adenokarsinomcellelinjer12. Basert på litteratur 24,38 valgte vi å bruke lavhastighets sentrifugeringsmetoden for å unngå cellebrudd og fortynning fra intracellulært innhold. Både mengden glukose og laktat i TIF reflekterte de forskjellige glykolytiske egenskapene til de to forskjellige cellelinjene. Her beskriver vi i detalj protokollen for de to mest brukte metodene for isolering av TIF: vevsentrifugering og vevseluering (figur 2).
Figur 2: Skjematisk fremstilling av interstitiell væskeisolasjonsmetode i tumor. Skjematisk illustrasjon av teknikkene beskrevet i detalj i protokollen, nemlig vevsentrifugering (A) og vevseluering (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For alle pasienter som ble registrert, ble perifert blod og bukspyttkjerteljuice samlet på operasjonstidspunktet i henhold til protokoller godkjent av institusjonens etiske komité. Alle pasientene ble inkludert i studien etter signert informert samtykke, inkludert innsamling av biologiske prøver og kliniske data. Studien ble godkjent av institusjonens etiske komité (protokollnummer ICH-595, godkjenning utstedt i mai 2009). Prosedyrer som involverer mus og deres omsorg ble overholdt EUs og institusjonens retningslinjer (protokoll ID 121/2016-PR).
1. Isolering av bukspyttkjerteljuice
MERK: Tilbaketrekking av bukspyttkjerteljuice utføres i sammenheng med en åpen prosedyre for bukspyttkjertelreseksjon (f.eks. pankreaticoduodenektomi, total pankreatektomi, distal pankreatektomi) av en equipe av ekspert bukspyttkjertel kirurger.
- Seleksjon av pasienter
- Vurder for prosedyren enhver pasient som er planlagt for en åpen bukspyttkjertelreseksjon.
- Bekreft inklusjon hvis hovedstørrelsen på bukspyttkjertelen anses å være tilstrekkelig til å tillate henting av bukspyttkjerteljuice. Minimumsgrensen i diameter på hovedpankreaskanalen betraktes som 2 mm ved kontrastforsterket CT-avbildning.
- Preoperativ studie av bukspyttkjertelkanal ved kontrastforsterket CT-avbildning for å hjelpe planleggingen av henting av bukspyttkjerteljuice
- Tredimensjonalt lokalisere hovedpankreaskanalen i kjertelen på nivået av bukspyttkjertelhalsen: måle avstanden til hovedpankreaskanalen fra fremre, overlegen og dårligere bukspyttkjertelmargin på tverrsnittssklier og koronale og sagittale gjengivelser. Når du er i operasjonsstuen, bruk disse målingene til å tilnærme riktig sted hvor du skal punktere bukspyttkjertelen for å kanylere Wirsung-kanalen og for å hente bukspyttkjerteljuice.
- Fremstilling av materiale
- Sterilt materiale: Åpne den sterile konvolutten med en 25 G kanyle og en 3 ml sprøyte, og plasser dem i det sterile feltet i samarbeid med skrubbesykepleieren.
- Usterilt materiale: Oppbevar et 3 ml K2EDTA vakuumreagensrør klart for hånden i operasjonssalen for oppbevaring av væsken.
- Forberedelse av pasienten
- Plasser pasienten på operasjonssengen. Induser blandet generell anestesi, bruk Remifentanil, Sevorane og Rocuronium, intuber deretter og begynn å ventilere pasienten. Plasser pasienten i liggende decubitus med høyre arm gjemt til kroppen og venstre arm bortført til 90° grader festet på et armbrett.
- Desinfiser huden på magen på snittstedet. Opprett og vedlikehold et sterilt felt på magen som draperer pasienten.
- Kirurgisk prosedyre
- Utfør et subcostal snitt og få tilgang til bukhulen. Plasser en Rochard abdominal tilbaketrekning for organeksponering.
- Utsett og mobiliser bukspyttkjertelen gjennom Kocher-manøver, åpning av det gastrokoliske ligamentet, snitt av retroperitonealvevet langs bukspyttkjertelens overlegne og nedre grense som skaper et disseksjonsplan mellom bukspyttkjertelhalsen og overlegen mesenterisk vene som ligger bakre.
- Når bukspyttkjertelen er mobilisert og utsatt, fortsett til bukspyttkjerteljuiceuttak før seksjonering av bukspyttkjertelhalsen.
- Identifikasjon og lokalisering av bukspyttkjertelen
- Beregn plasseringen av bukspyttkjertelen ved hjelp av målingen tatt ved avbildning, og palperer deretter den fremre overflaten av bukspyttkjertelen for å identifisere den nøyaktige plasseringen.
- Innsamling av bukspyttkjerteljuice
- Hold bukspyttkjertelhodet og tolvfingertarmen fra undersiden og løft den med venstre hånd, og merk plasseringen av bukspyttkjertelen med det første sifferet.
- Ta tak i høyre hånd på sprøyten på 3 ml med 25 G kanylen montert på.
- Bruk høyre hånd til å sette nålen i bukspyttkjertelen bare distalt til venstre tommel. Bestem dybden av penetrasjon og graden av tilbøyelighet til nålen basert på preoperative målinger og på oppfatningen av å ha penetrert kanalveggen.
- Trekk opp saften med sprøyten. Hvis det ikke er mulig å hente saften, flytt nålen i de fire retningene og prøv å kanylere bukspyttkjertelen.
- Når bukspyttkjerteljuice er hentet, flytt den utenfor det sterile feltet og overfør det til 3 ml K2EDTA vakuumreagensrør. Oppbevares ved 4 °C til prøven er overført til laboratoriet, og fortsett til videre bearbeiding så tidlig som mulig.
MERK: Volumet av bukspyttkjerteljuice som kan gjenvinnes med denne prosedyren varierer sterkt, alt fra 0,2 ml til 3 ml etter vår erfaring. Mengden juice som hentes er svært avhengig av pasienten: dimensjonen av Wirsung-kanalen og funksjonell status i bukspyttkjertelen (funksjon versus atrofisk kjertel). Etter vår erfaring er det ingen hensiktsmessig som kan brukes til å øke mengden bukspyttkjerteljuice hentet.
2. Behandling av bukspyttkjerteljuice
- Sentrifuge bukspyttkjerteljuice ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne celler eller rusk.
MERK: Bukspyttkjerteljuice skal være klar og gjennomsiktig i fargen før sentrifugering. Blodforurensning under operasjonen kan noen ganger forekomme, noe som gjør at prøven virker mørkere og rødere i fargen. Vurder å ekskludere slike prøver fra videre analyser. - Gjenopprett supernatant, aliquot og oppbevar ved -80 °C inntil videre analyser.
3. Induksjon av subkutane svulster
MERK: Murine Panc02- og DT6606-cellelinjene ble hentet fra henholdsvis Prof. Lorenzo Piemonti (San Raffaele Diabetes Institute, Milano, Italia) og Prof. Francesco Novelli (Senter for eksperimentell forskning og medisinske studier, Torino, Italia), som tidligere beskrevet12.
- Vekst av tumorceller
- Kultur Panc02 og DT6606 celler i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium som inneholder 10% føtalt bovin serum (FBS), 2mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin antibiotika.
- Tine frosne celler 1-2 uker før tumorinjeksjon, i henhold til vekstraten til cellelinjen.
- Dyrk celler ved 37 °C med 5 % CO2 og 95 % fuktighet under sterile forhold.
- Løsne celler med 0,025% Trypsin/EDTA-løsning i 5 minutter ved 37 °C når de når 80 % konfluens og eliminerer trypsin ved sentrifugering.
DT6606 er primære, ikke udødeliggjorte, celler, avledet fra musen LSL-KrasG12D-Pdx1-Cre, og bør ikke passeres mer enn 3 ganger før injeksjon in vivo for å opprettholde sine opprinnelige egenskaper. Det anbefales å tine DT6606-celler 7-10 dager før injeksjon.
- Injeksjon av tumorceller in vivo
- Trypsiniser celler (se trinn 3.1.4) og vask dem én gang med fosfatbufret saltvann (PBS). Eliminer PBS ved sentrifugering og resuspender celler i fersk PBS før du teller.
- Tell cellene og resuspender dem i PBS i en konsentrasjon på 0,5-1 x 107 celler / ml for å få en endelig konsentrasjon på 0,5-1 x 106 celler / 100 μL for å injisere i hver mus. Forbered cellene i overkant. Hold cellene på 4 °C eller på is til slutten av prosedyren.
- Grupper dyrene (8 uker gamle C57BL/6J-mus) i forskjellige bur i henhold til forskjellige cellelinjer eller behandlinger.
- Hold dyrene fast manuelt og bedøv dem ved hjelp av en blanding av ketamin (80 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) eller i henhold til lokalt godkjente prosedyrer.
- Barber injeksjonsstedet, vanligvis en flanke over et ben, med en elektrisk barbermaskin og rengjør injeksjonsstedet forsiktig med alkohol.
- Pipett opp og ned cellesuspensjonen med en 1 ml sprøyte, fjern eventuelle luftbobler ved å bevege stempelet opp og ned. Fest en 25 G kanyle til sprøyten og skyv stempelet oppover til cellesuspensjonen når kanyleåpningen.
- Klyp huden på flanken med flate tang og stikk nålen forsiktig inn i bunnen av hudfolden mellom tangen uten å punktere bukhulen eller muskulaturen. For å kontrollere nålens korrekte posisjon, prøv forsiktig å bevege spissen av nålen sidelengs under huden. Kanylen skal bevege seg fritt.
- Injiser langsomt 100 μL cellesuspensjon (inneholdende 0,5-1 x 106 celler), klem forsiktig injeksjonsstedet i noen sekunder og trekk kanylen sakte ut uten sidelengs bevegelse.
- Returner musen tilbake til buret og overvåk utvinningen fra anestesi.
- Kontroller tumorvekst ved hjelp av en tykkelse i 3-4 uker. Avliving av dyrene når svulster når ca. 0,5-1 cm3 ved bruk av CO2 eller i henhold til lokalt godkjente prosedyrer.
4. Isolering av tumor interstitiell væske (TIF)
- Eksisjon av subkutane svulster
- Blokker lemmer av dyrene med papirbånd og rengjør huden med alkohol. Klipp huden åpen på magen for å skille den fra bukhinnen og gå videre opp til lemmer. Excise svulsten vokst under huden på flanken ved hjelp av saks, klemmer og til slutt en skalpell.
- Vei svulsten og hold den i et rent rør på is til etter isolering av TIF.
- Isolering av TIF ved sentrifugering
- Klipp svulsten i to, skyll de to delene raskt i PBS og fjern dem forsiktig på filterpapir for å fjerne overskudd av PBS. Utfør disse trinnene så fort som mulig for å unngå fordampning fra svulsten.
- Overfør umiddelbart svulsten til en 20 μm nyloncellesil festet på toppen av et 50 ml konisk rør.
- Sentrifuge røret ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Denne lavhastighets sentrifugeringen bevarer celleintegriteten og unngår kontaminering av TIF med intracellulært rom. Intracellulær innholdslekkasje kan testes i nedstrøms applikasjoner for eksempel ved å vurdere tilstedeværelsen av intracellulære rengjøringsproteiner, som ribosomale proteiner25. - Gjenopprett TIF fra bunnen av røret, til slutt aliquot det og frys det umiddelbart på tørris og lagre ved -80 ° C til videre analyse.
Valgfritt: Basert på nedstrøms proteomisk analyse som skal utføres, fortynn prøven i PBS med en proteaseinhibitorcocktail for å unngå nedbrytning av spesifikke molekyler.
MERK: Avhengig av sammensetningen av svulsten, gir i noen tilfeller svært små svulster ingen væske.
- Isolering av TIF ved eluering
- Klipp svulsten i små biter (≈1-3 mm3) med saks eller skalpell og skyll forsiktig med kald PBS.
MERK: I dette trinnet er det svært viktig å jobbe raskt og utføre minimal manipulasjon for å unngå celleskader. - Overfør tumorbitene til et 1,5 ml rør og tilsett 500 μL PBS med en proteaseinhibitorcocktail for å unngå nedbrytning av analytter. Inkuber i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
- Gjenopprett supernatanten og overfør den til et nytt 1,5 ml rør. Sentrifuge ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C for å fjerne celler fra prøven.
- Overfør supernatanten til et nytt rør og sentrifuger igjen ved 2000 x g i 8 minutter ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til et nytt rør og sentrifuger igjen ved 20 000 x g i 30 minutter ved 4 °C for å fjerne rusk. Gjenopprett supernatanten. Umiddelbart aliquot og frys TIF-prøve på tørris og lagre ved -80 °C inntil videre analyse.
- Klipp svulsten i små biter (≈1-3 mm3) med saks eller skalpell og skyll forsiktig med kald PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fulgte prosedyren beskrevet ovenfor for å få pancreasjuice fra pasienter med PDAC (n = 31) og andre godartede pankreasplager (ikke-PDAC, n = 9), inkludert pankreatitt (n = 2), papillære ampullatumorer (n = 4), nevroendokrine svulster (n = 2), intraduklær papillær mucinøs neoplasi (IPMN; n = 1) 12. Bukspyttkjerteljuiceprøvene ble deretter utsatt for metabolomisk analyse ved hjelp av kjernemagnetisk resonans (1H-NMR)12. Ved å filtrere de brede NMR-signalene til makromolekyler (f.eks. lipoproteiner, lipider, etc.) kunne vi sette pris på små molekylvektmetabolitter i detalj, som vist i 1D Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spektra (figur 3A). Overvåket OPLS-DA-analyse viste at den metabolske profilen oppdaget i bukspyttkjerteljuice var i stand til å diskriminere mellom PDAC og ikke-PDAC-pasienter med en nøyaktighet på 82,4% oppnådd ved kryssvalidering (figur 3B). Interessant nok ga metabolomisk analyse utført på plasmaprøver fra de samme pasientene ikke den samme diskriminerende kraften (nøyaktighet på 75,2% oppnådd ved kryssvalidering) (figur 3C). Disse resultatene indikerer at bukspyttkjerteljuice er en proteinrik prøve og egnet for omfattende "omics" analyser. Videre antyder den overlegne diskriminerende kraften til bukspyttkjerteljuice sammenlignet med plasma at flytting "oppstrøms" til prøver mer proksimale til tumorstedet kan være en vellykket strategi for å identifisere biomarkører som hjelper til med å utpeke PDAC fra andre bukspyttkjertel sykdommer.
Figur 3: Metabolomisk innhold i bukspyttkjerteljuice og plasma. (A) 1H-NMR CPMG-spektra av PDAC (n = 31, blå) og ikke-PDAC-prøver (n = 9, grønn) som viser detaljer om de små molekylvektmetabolittene som finnes i bukspyttkjerteljuice. ppm, deler per million. (B) Score av overvåket multivariat OPLS-DA-analyse på CPMG-spektra fra PDAC-prøver av bukspyttkjerteljuice (blå sirkler) og ikke-PDAC-prøver (lilla trekanter). Analysen segregerer de to gruppene (hver skissert av et edderkoppplott), med en nøyaktighet på 82,4% oppnådd ved kryssvalidering. (C) Skår av overvåket multivariat OPLS-DA-analyse på 1D-NOESY-spektra fra plasma PDAC-prøver (n = 22, blå sirkler) og ikke-PDAC-prøver (n = 7, lilla trekanter). Nøyaktighet på 75,2% oppnådd ved kryssvalidering. Dette tallet er endret fra Cortese et al.12 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å demonstrere at TIF-innholdet pålitelig reflekterer endringer i tumormikromiljøet, injiserte vi subkutant to bukspyttkjertelkreftcellelinjer med motsatt glykolytisk hastighet, Panc02 (svært glykolytisk) og DT6606 (lavt glykolytisk), etter protokollen beskrevet ovenfor. Vi isolerte deretter TIF fra de utskårne svulstene ved hjelp av lavhastighets sentrifugeringsmetoden beskrevet ovenfor (se punkt 4.2). Fra svulster med vekt mellom 0,25-1 g gjenvunnet vi et område på 5-15 μL TIF, som deretter ble brukt til å kvantifisere konsentrasjonen av glukose og laktat. TIF fra høyglykolytiske svulster inneholdt mindre glukose og mer laktat sammenliknet med lite glykolytiske svulster (figur 4). Disse dataene viser at TIF kan brukes som kilde for tumoravledede metabolitter og endres i henhold til selve svulsten.
Figur 4: Glukose- og laktatinnhold i TIF gjenspeiler indre tumoregenskaper. (A) Glukose og (B) laktatkonsentrasjon i interstitiell væske, isolert ved hjelp av vevsentrifugeringsmetoden, fra Panc02 (høyt glykolytisk, n = 10 i A, n = 9 i B) og DT6606 (lavt glykolytisk, n = 5 i A, n = 4 i B) subkutant implanterte svulster. Boksplott gir median, nedre kvartil og øvre kvartil ved boksen, og minimum og maksimum av værhårene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien har vi beskrevet teknikken for intraoperativt oppsamling av bukspyttkjerteljuice, en stort sett uutforsket væskebiopsi. Vi har nylig vist at bukspyttkjerteljuice kan utnyttes som en kilde til metabolske markører av sykdom12. Metabolomisk analyse på andre flytende biopsier, som blod 5,6,7, urin8 og spytt9, har vist lovende resultater i å diskriminere mellom PDAC og friske personer eller pankreatitt. Bukspyttkjerteljuice utskilles imidlertid direkte av bukspyttkjertelen ductale celler, og på grunn av sin nærhet til tumorstedet, kan det være en mer pålitelig indikator på endringene i det omkringliggende vevet, selv i de svært tidlige stadiene av sykdommen. Faktisk, mens H-NMR spektrale data av bukspyttkjerteljuice oppnådde en diskriminering mellom PDAC-pasienter og andre godartede bukspyttkjertel sykdommer, gjorde plasmaprøver ikke. Derfor, selv om det er mindre tilgjengelig enn andre væskebiopsier, representerer bukspyttkjerteljuice en verdifull kilde til kliniske biomarkører, og kan bidra til å identifisere raskt utviklende sykdommer. Vi har beskrevet her den intraoperative teknikken for innsamling av bukspyttkjerteljuice; Det kan imidlertid også utføres under minimalt invasive prosedyrer, i perspektivet for å identifisere verdifulle tidlige markører for sykdom. Det gjenstår å fastslå om de forskjellige innsamlingsprosedyrene påvirker den proteomiske sammensetningen av bukspyttkjerteljuice.
Mens andre væskebiopsier er lett tilgjengelige i PDAC murine modeller, kan samlingen av bukspyttkjerteljuice in vivo være svært utfordrende hvis man vurderer genetiske eller ortotopiske modeller, og er ikke mulig i det hele tatt i subkutane modeller. Derfor har vi i dette papiret foreslått bruk av tumor interstitiell væske som et verdifullt og allment anvendelig alternativ. Faktisk er interstitiell væskesammensetning, på samme måte som bukspyttkjerteljuice, direkte påvirket av endringer i det lokale miljøet. Proteomisk profilering på TIF fra forskjellige svulster, som hepatocellulær 45,46, nyrecelle 41, eggstokk 22,47,48 og bryst 42,49 karsinomer, har vist oppmuntrende resultater i forskningen for kandidatbiomarkører. Det er imidlertid lite overlapping i de identifiserte kandidatproteinene, noe som tyder på at tilnærmingen som brukes til å isolere TIF, sammen med nedstrømsanalysen som utføres og datainnsamlingen, kan påvirke de oppdagede analyttene. En nylig studie på plateepitelkarsinom som sammenlignet de to TIF-isolasjonsmetodene beskrevet her, sentrifugering og eluering, observerte en sterk konsistens i TIF-sammensetningen uavhengig av metoden som ble brukt, selv om sentrifugering ga et høyere innhold av ekstracellulære proteiner25.
Begge metodene beskrevet her for isolering av TIF, vevsentrifugering og vevseluering, har fordelen av å være teknisk krevende, raske og krever bare grunnleggende laboratorieutstyr. Sammenlignet med andre tilnærminger, som mikrodialyse og kapillær ultrafiltrering, presenterer sentrifugerings- og elueringsteknikkene den iboende begrensningen av bare å være mulig ex vivo. Det er viktig å ta hensyn til flere problemer når du velger riktig metode, for eksempel eksperimentets analytiske formål, volumet gjenvunnet og cellebrudd. Sammensetningen av svulsten bør også vurderes, da det kan påvirke volumet av TIF gjenvunnet. Vevssentrifugering ble opprinnelig utviklet for cellefattige og kollagenrike vev som hornhinnen38; svulster derimot, er vanligvis vev preget av høy cellularitet og rik vaskularisering, begge funksjoner som øker hydraulisk ledningsevne, og bør derfor lette isoleringen av TIF ved sentrifugering. Imidlertid er noen svulster, inkludert PDAC, tilstede med en rikelig stromal eller fibrotisk komponent, rik på ekstracellulære matriksproteiner, slik som kollagener, som har en tendens til å beholde makromolekyler i vevet21.
Vevseluering er derimot basert på passiv diffusjon av proteiner fra vevet til eluatet, og har blitt utnyttet med hell for et bredt spekter av svulster43. Elution gir utvinning av større volumer, men proteiner vil bli fortynnet. Av denne grunn kan vevseluering ikke være egnet for molekyler med svært lav overflod. Videre krever eluering en større grad av manipulering av svulsten, noe som muligens resulterer i intracellulær innholdslekkasje i TIF. Dette kan være irrelevant for biomarkøroppdagelse, men kan introdusere en skjevhet hvis målet er å bestemme lokal produksjon av proteiner. Mengden cellebrudd bør testes i nedstrøms applikasjoner for å velge den mest hensiktsmessige metoden i henhold til tumortypen. Dette kan utføres på flere måter, for eksempel ved å teste tilstedeværelsen av husholdningsproteiner, som ribosomale proteiner, i TIF25. En annen foreslått tilnærming er å sammenligne konsentrasjonene av utvalgte ekstracellulære stoffer, som kreatinin eller Na +, i TIF og plasma, som skal være like22. Intracellulær innholdslekkasje bør også vurderes for sentrifugeringsmetoden; Faktisk er det fortsatt ingen generell konsensus om hva som skal betraktes som "lavhastighet" for å unngå cellebrudd, muligens på grunn av forskjellene i tumorsammensetning. Vi valgte å bruke 400 x g hastighet, da det er vist at det ikke forekommer fortynning fra intracellulært innhold for g-krefter <42438.
Uansett tilnærming representerer TIF en verdifull og allment anvendelig kilde for å prøve tumormikromiljøet. Vi har vist at det rekapitulerer tumor-inneboende egenskaper og kan være nyttig for identifisering av biomarkører av sykdom eller terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Roberta Migliore for teknisk assistanse. Forskningen som fører til disse resultatene har mottatt finansiering fra Associazione Italiana per la ricerca sul cancro (AIRC) under IG2016-ID.18443-prosjektet - PI Marchesi Federica. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Greiner BioOne | GR616201 | |
| 20 µm nylon cell strainer | pluriSelect | 43-50020-03 | |
| 25G needle | BD Biosciences | 305122 | |
| 3 mL K2EDTA vacutainer | BD Biosciences | 366473 | |
| 3 mL syringe | BD Biosciences | 309656 | |
| 50 mL Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Clamps | Medicon | 06.20.12 | |
| Disposable scalpel | Medicom | 9000-10 | |
| Fetal bovine serum | Microtech | MG10432 | |
| Flat-tipped forceps | Medicon | 06.00.10 | |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | ECB3001D | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 34044100 | |
| RPMI medium | Euroclone | ECB9006L | |
| Scissors | Medicon | 02.04.09 | |
| Trypsin/EDTA 1x | Lonza | BE17-161F | |
| Ultraglutamine 100x | Lonza | BE17-605E/U1 |
References
- Costello, E., Greenhalf, W., Neoptolemos, J. P. New biomarkers and targets in pancreatic cancer and their application to treatment. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (8), 435-444 (2012).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Neoptolemos, J. P., et al. Therapeutic developments in pancreatic cancer: current and future perspectives. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (6), 333-348 (2018).
- Sahin, I. H., Askan, G., Hu, Z. I., O'Reilly, E. M. Immunotherapy in pancreatic ductal adenocarcinoma: an emerging entity. Annals of Oncology. 28 (12), 2950-2961 (2017).
- Mayerle, J., et al. Metabolic biomarker signature to differentiate pancreatic ductal adenocarcinoma from chronic pancreatitis. Gut. 67 (1), 128-137 (2018).
- Bathe, O. F., et al. Feasibility of identifying pancreatic cancer based on serum metabolomics. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 20 (1), 140-147 (2011).
- Mayers, J. R., et al. Elevation of circulating branched-chain amino acids is an early event in human pancreatic adenocarcinoma development. Nature Medicine. 20 (10), 1193-1198 (2014).
- Napoli, C., et al. Urine metabolic signature of pancreatic ductal adenocarcinoma by (1)h nuclear magnetic resonance: identification, mapping, and evolution. Journal of Proteome Research. 11 (1), 1274-1283 (2012).
- Sugimoto, M., Wong, D. T., Hirayama, A., Soga, T., Tomita, M. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles. Metabolomics. 6 (1), 78-95 (2010).
- Chen, R., et al. Comparison of pancreas juice proteins from cancer versus pancreatitis using quantitative proteomic analysis. Pancreas. 34 (1), 70-79 (2007).
- Mori, Y., et al. A minimally invasive and simple screening test for detection of pancreatic ductal adenocarcinoma using biomarkers in duodenal juice. Pancreas. 42 (2), 187-192 (2013).
- Cortese, N., et al. Metabolome of Pancreatic Juice Delineates Distinct Clinical Profiles of Pancreatic Cancer and Reveals a Link between Glucose Metabolism and PD-1+ Cells. Cancer Immunology Research. , (2020).
- Tanaka, M., et al. Cytologic Analysis of Pancreatic Juice Increases Specificity of Detection of Malignant IPMN-A Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 17 (11), 2199-2211 (2019).
- Chen, K. T., et al. Potential prognostic biomarkers of pancreatic cancer. Pancreas. 43 (1), 22-27 (2014).
- Tian, M., et al. Proteomic analysis identifies MMP-9, DJ-1 and A1BG as overexpressed proteins in pancreatic juice from pancreatic ductal adenocarcinoma patients. BMC Cancer. 8, 241 (2008).
- Shi, C., et al. Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis, potential for early detection. Cancer Biology & Therapy. 7 (3), 353-360 (2008).
- Rogers, C. D., et al. Differentiating pancreatic lesions by microarray and QPCR analysis of pancreatic juice RNAs. Cancer Biology & Therapy. 5 (10), 1383-1389 (2006).
- Matsubayashi, H., et al. DNA methylation alterations in the pancreatic juice of patients with suspected pancreatic disease. Cancer Research. 66 (2), 1208-1217 (2006).
- Cote, G. A., et al. A pilot study to develop a diagnostic test for pancreatic ductal adenocarcinoma based on differential expression of select miRNA in plasma and bile. The American Journal of Gastroenterology. 109 (12), 1942-1952 (2014).
- Yu, J., et al. Digital next-generation sequencing identifies low-abundance mutations in pancreatic juice samples collected from the duodenum of patients with pancreatic cancer and intraductal papillary mucinous neoplasms. Gut. , (2016).
- Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiological Reviews. 92 (3), 1005-1060 (2012).
- Haslene-Hox, H., et al. A new method for isolation of interstitial fluid from human solid tumors applied to proteomic analysis of ovarian carcinoma tissue. PLoS One. 6 (4), 19217 (2011).
- Zhang, J., et al. In-depth proteomic analysis of tissue interstitial fluid for hepatocellular carcinoma serum biomarker discovery. British Journal of Cancer. 117 (11), 1676-1684 (2017).
- Sullivan, M. R., et al. Quantification of microenvironmental metabolites in murine cancers reveals determinants of tumor nutrient availability. Elife. 8, (2019).
- Matas-Nadal, C., et al. Evaluation of Tumor Interstitial Fluid-Extraction Methods for Proteome Analysis: Comparison of Biopsy Elution versus Centrifugation. Journal of Proteome Research. 19 (7), 2598-2605 (2020).
- Espinoza, J. A., et al. Cytokine profiling of tumor interstitial fluid of the breast and its relationship with lymphocyte infiltration and clinicopathological characteristics. Oncoimmunology. 5 (12), 1248015 (2016).
- Halvorsen, A. R., et al. Profiling of microRNAs in tumor interstitial fluid of breast tumors - a novel resource to identify biomarkers for prognostic classification and detection of cancer. Molecular Oncology. 11 (2), 220-234 (2017).
- Yang, S., Huang, C. M. Recent advances in protein profiling of tissues and tissue fluids. Expert Review of Proteomics. 4, 515-529 (2007).
- Huang, C. M., et al. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6 (22), 6107-6116 (2006).
- Leegsma-Vogt, G., Janle, E., Ash, S. R., Venema, K., Korf, J. Utilization of in vivo ultrafiltration in biomedical research and clinical applications. Life Sciences. 73 (16), 2005-2018 (2003).
- Schneiderheinze, J. M., Hogan, B. L. Selective in vivo and in vitro sampling of proteins using miniature ultrafiltration sampling probes. Analytical Chemistry. 68 (21), 3758-3762 (1996).
- Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clinical Applications. 5 (11-12), 636-643 (2011).
- Xu, B. J., et al. Microdialysis combined with proteomics for protein identification in breast tumor microenvironment in vivo. Cancer Microenvironment. 4 (1), 61-71 (2010).
- Bendrik, C., Dabrosin, C. Estradiol increases IL-8 secretion of normal human breast tissue and breast cancer in vivo. The Journal of Immunology. 182 (1), 371-378 (2009).
- Ao, X., Stenken, J. A.
- Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
- Choi, J., et al. Intraperitoneal immunotherapy for metastatic ovarian carcinoma: Resistance of intratumoral collagen to antibody penetration. Clinical Cancer Research. 12 (6), 1906-1912 (2006).
- Wiig, H., Aukland, K., Tenstad, O. Isolation of interstitial fluid from rat mammary tumors by a centrifugation method. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (1), 416-424 (2003).
- Li, S., Wang, R., Zhang, M., Wang, L., Cheng, S. Proteomic analysis of non-small cell lung cancer tissue interstitial fluids. World Journal of Surgical Oncology. 11, 173 (2013).
- Fijneman, R. J., et al. Proximal fluid proteome profiling of mouse colon tumors reveals biomarkers for early diagnosis of human colorectal cancer. Clinical Cancer Research. 18 (9), 2613-2624 (2012).
- Teng, P. N., Hood, B. L., Sun, M., Dhir, R., Conrads, T. P. Differential proteomic analysis of renal cell carcinoma tissue interstitial fluid. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1333-1342 (2011).
- Turtoi, A., et al. Novel comprehensive approach for accessible biomarker identification and absolute quantification from precious human tissues. Journal of Proteome Research. 10 (7), 3160-3182 (2011).
- Wagner, M., Wiig, H. Tumor Interstitial Fluid Formation, Characterization, and Clinical Implications. Frontiers in Oncology. 5, 115 (2015).
- Haslene-Hox, H., Tenstad, O., Wiig, H. Interstitial fluid-a reflection of the tumor cell microenvironment and secretome. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2336-2346 (2013).
- Hsieh, S. Y., et al. Secreted ERBB3 isoforms are serum markers for early hepatoma in patients with chronic hepatitis and cirrhosis. Journal of Proteome Research. 10, 4715-4724 (2011).
- Sun, W., et al. Characterization of the liver tissue interstitial fluid (TIF) proteome indicates potential for application in liver disease biomarker discovery. Journal of Proteome Research. 9 (2), 1020-1031 (2010).
- Haslene-Hox, H., et al. Increased WD-repeat containing protein 1 in interstitial fluid from ovarian carcinomas shown by comparative proteomic analysis of malignant and healthy gynecological tissue. Biochimica Biophysica Acta. 1834 (11), 2347-2359 (2013).
- Wang, T. H., et al. Stress-induced phosphoprotein 1 as a secreted biomarker for human ovarian cancer promotes cancer cell proliferation. Molecular & Cellular Proteomics. 9, 1873-1884 (2010).
- Gromov, P., et al. Up-regulated proteins in the fluid bathing the tumour cell microenvironment as potential serological markers for early detection of cancer of the breast. Molecular Oncology. 4 (1), 65-89 (2010).
