Summary
Мы представляем метод высокой пропускной способности in vitro для количественной оценки регионального осаждения легких на уровне доли с использованием КТ-сканирования, 3D печатных моделей легких с настраиваемыми профилями воздушного потока.
Abstract
Разработка целевых методов лечения легочных заболеваний ограничена наличием методов доклинкического тестирования с возможностью прогнозирования доставки региональных аэрозолей. Используя 3D-печать для создания специфических для пациента моделей легких, мы наметим дизайн экспериментальной установки с высокой пропускной способностью in vitro для количественной оценки лобкулярного легочного осаждения. Эта система изготовлена с сочетанием коммерчески доступных и 3D печатных компонентов и позволяет контролировать скорость потока через каждую долей легких. Доставка флуоресцентных аэрозолей в каждую долей измеряется с помощью микроскопии флуоресценции. Этот протокол имеет потенциал для содействия росту персонализированной медицины для респираторных заболеваний через его способность моделировать широкий спектр демографических пациентов и заболеваний государств. Геометрия 3D-печатной модели легких и параметр профиля потока воздуха могут быть легко модулировано, чтобы отразить клинические данные для пациентов с разным возрастом, расой и полом. Клинически значимые устройства доставки лекарств, такие как эндотрахеальная трубка, показанная здесь, могут быть включены в установку тестирования, чтобы более точно предсказать способность устройства таргетировать терапевтические поставки в больной регион легких. Универсальность этой экспериментальной установки позволяет настроить ее, чтобы отразить множество ингаляционных условий, повышая строгость доклинического терапевтического тестирования.
Introduction
Многие легочные заболевания, такие как рак легких и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), демонстрируют региональные различия в характеристиках заболеваний; однако, Есть отсутствие терапевтических методов, доступных для целевой доставки лекарств только в больных регионах легких1. Несколько динамических вычислительных жидкостей (CFD) модели показали, что можно модулировать профили осаждения наркотиков путем выявления конкретныхрационализировать в легких 2,3. В нашей лаборатории продолжается разработка как ингаляторов, так и эндотрахеаля (ET) трубных адаптеров с региональными возможностями таргетинга для контроля распределения аэрозолей в больные области легких. Распространение этих принципов на клиническое использование ограничено текущими доклиническими возможностями тестирования. Точное расположение отложений препарата в легких, как известно, лучший предиктор эффективности; однако, текущие фармацевтические оценки ингаляционных терапевтических средств чаще всего предсказываются с использованием in vitro-in vivo корреляции размера частиц до просто приблизительногоосаждения 4. Этот метод не позволяет какой-либо пространственный анализ для определения влияния различных геометрий дыхательных путей на региональное распределение через различные доли легких. Кроме того, это тестирование не хватает анатомически точные геометрии легких, которые исследователи показали, может иметь значительное влияние на осаждение профилей5. Были предприняты некоторые усилия по включению геометрии легких, специфичных для пациентов, в протоколы тестирования путем добавления верхних дыхательных путей; однако, большинство из этих подходов образца доставки аэрозолей для различных поколений легких, а не каждыйдолей легких 6,7,8. Следующий протокол представляет собой метод высокой пропускной способности генерации конкретных пациентов легких моделей с возможностью количественной оценки относительного осаждения частиц в каждой из пятидолей легких 9.
Анатомически точная модель легких генерируется с помощью компьютерной томографии пациента 3D-печати (КТ). При использовании в сочетании с легко собранной системой потока относительные показатели потока через каждую из долей легких модели можно самостоятельно контролировать и адаптировать к различным демографическим показателям пациентов и/или состояниям заболеваний. С помощью этого метода исследователи могут проверить эффективность потенциальных терапевтических методов в соответствующей геометрии легких и соотнести производительность каждого метода с прогрессированием больной морфологии. Здесь, два устройства конструкций, разработанных в нашей лаборатории проверяются на их способность увеличить осаждение в желаемой доли легких, контролируя расположение выброса аэрозоля во рту или трахеи. Этот протокол также имеет потенциал, чтобы существенно повлиять на развитие персонализированных процедур для пациентов, облегчая быстрое прогнозирование эффективности лечения в модели легких, специфичных для данных КТ этого пациента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка 3D печатных экспериментальных компонентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все программное обеспечение, используемое в протоколе, указано в таблице материалов. Кроме того, используемое программное обеспечение для нарезки специфичен для 3D-принтера, перечисленного в таблице материалов; однако этот протокол может быть распространен на широкий спектр 3D-принтеров стереолитографии (SLA).
- Преобразование КТ пациента в 3D-объекты (.stl файлы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для более подробного обсуждения геометрических особенностей конкретной модели легких, используемых в этих исследованиях, обратитесь к Фэн и др.5.- Рендер КТ в 3D-объект с помощью программного обеспечения КТ (см. Таблицу материалов). Откройте компьютерную томографию и создайте маску в воздушном пространстве с помощью инструмента Threshold с параметром в диапазоне от -800 до -1000. Используя инструмент 3D Preview, просмотрите 3D-рендеринг и экспортйте объект(Файл | Экспорт)в качестве файла .stl.
- Импорт файлов в программное обеспечение для редактирования сетки (см. таблицу материалов),удалить любые зубчатые функции с помощью инструмента Select (Sculpt | Кисти: "Shrink/Smooth" | Свойства: Сила (50), Размер (10), Глубина (0)). Гладкая поверхность(Ctrl-A | Деформация | Гладкая | Сглаживание (0.2), шкала сглаживания (1)).
- В программном обеспечении для редактирования сетки удлините стену этих объектов на 2 мм(Ctrl-A | Редактировать | Offset), и позволить внутреннему объекту оставаться полым таким образом, что только стена остается. Нарежьте объект(Выберите | Редактировать | Плоскость Cut) на трахее, чтобы сформировать вход и в поколениях 2 или 3, где объект ветви к каждой доле для создания точек (Рисунок 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина 2 мм была выбрана на основе допустимых размеров функций, указанных производителем 3D-принтера, указанного в таблице материалов. Эта толщина может быть скорректирована на основе спецификаций 3D-принтера, доступных при 2-ти внутренних геометриях модели.
- Изменение геометрии розетки модели легких пациента, чтобы быть совместимым с ранее разработанными компонентами крышкирозетки доли (рисунок 1B,C), перечисленные в таблице материалов.
- Импорт 3D-объекта, который воспроизводит КТ на внутренней стороне, имеет толщину стены 2 мм, и открыт на входе и розетках, в программное обеспечение 3D моделирования (см. Таблица материалов) как твердое тело(Открытый | Сетчатые файлы | Варианты | Твердое тело).
- Создайте плоскость на основе лица в каждой из торговых точек(Вставьте | Справочная геометрия | Самолет). Используя инструмент сращивания, проследить внутреннюю стену и внешнюю стену розетки в эскизе на плоскости(Эскиз | Сплайн).
- Лофт цилиндр (OD 18,5 мм, ID 12,5 мм, H 15,15 мм) для подключения к внутренней и внешней стене модели, тем самым расширяя розетку, чтобы быть равномерной на каждой доле(Особенности | Лофт-босс / база). Добавить вырезку по краю розетки, чтобы соответствовать крышке(Особенности | Экструдированная | Смещение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка(рисунок 1D) является полый цилиндр, соответствующий размерам точек и имеющих полку, которая соединяется с вырезом модели розетки. Один конец крышки блокируется таким образом, что идентификатор меньше, чем остальная часть части, это обеспечивает плотную подгонку вокруг колючей трубки соединения (Рисунок 1E). Колючая трубка соединение колючей конуса формы так, что колючка помещается через отверстие крышки, но остальная часть части нет, что позволяет труб соединения надежно вписываются в крышку. Таким образом, крышка плотно помещается вокруг как колючей трубки связи и легких модели(рисунок 1F,G). - Измените вход модели легких в зависимости от желаемых экспериментальных условий. Горло и глоттальные области могут быть включены, чтобы имитировать пациента, который может дышать самостоятельно(рисунок 1B). Регионы над трахеей могут быть удалены с помощью экструдированного разреза, чтобы имитировать интубированного пациента на аппарате искусственной вентиляции легких(особенности | Экструдированная вырезать) (Рисунок 1C).
- Ориентация и поддержка экспериментальных компонентов в нарезке программного обеспечения, предоставляемого производителем 3D принтеров.
- Импорт 3D части файлов в 3D принтер нарезки программного обеспечения и выбрать соответствующую смолу. Используйте жесткий смолы для печати легких моделей и колючей трубки соединений, а также мягкой смолы для печати шапки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смола, используемая для печати колпачков, должна иметь эластичные свойства, чтобы она тянулась над торговой точкой и создавалась герметичная печать. - Установите ориентацию на часть так, чтобы любые «острова» и невоствертеемые объемы сведены к минимуму. Лучшая ориентация для легких моделей с долей точек, стоящих от печатной платформы. Убедитесь, что соединения колючих труб и колпачки имеют более широкие части, стоящие перед печатной платформой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Индивидуальные ломтики можно просмотреть, чтобы проверить появление "островов", разделы части, которые впервые появляются в ломтике, не будучи подключены к основному телу части. Функция обзора может быть использована для проверки ломтиков с невоствертых томов, областей, где неохвеная смола может попасть в ловушку внутри части во время печати. Как "острова", так и невоствертебленые объемы снижают качество печати и могут привести к отказу печати. - Просматривая каждый кусочек по отдельности, добавляйте опоры к любым оставшимся «островам» в части, а также к любым участкам со значительными навесами. Экспорт и просмотр срезов для печати для проверки правильной поддержки всех областей.
- Импорт 3D части файлов в 3D принтер нарезки программного обеспечения и выбрать соответствующую смолу. Используйте жесткий смолы для печати легких моделей и колючей трубки соединений, а также мягкой смолы для печати шапки.
- Печать экспериментальных компонентов и полная после обработки в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы после обработки, описанные ниже, специфичны для 3D-принтера, перечисленного в таблице материалов. При использовании альтернативных принтеров или материалов, настроить эти шаги, чтобы отразить инструкции производителя.- Для частей, напечатанных в мягкой смоле, мыть с ≥ 99% чистоты изопропилового спирта (IPA), чтобы удалить избыток неохватанной смолы и термического лечения в конвекционной печи на 8 ч в соответствии со спецификациями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Части, напечатанные в мягкой смоле, могут быть очень деликатными сразу после печати, поэтому особое внимание следует принимать во время уборки. Воздействие АПИ должно быть ниже предела воздействия растворителя материала, чтобы предотвратить деградацию части. - Для частей, напечатанных в твердой смоле, мыть с IPA, чтобы удалить избыток неохватимой смолы и вылечить в ультрафиолетовой печи (365 нм света при 5-10 мВт/см 2) в течение 1 мин с каждой стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки точности 3D печатной реплики рекомендуется использовать сканирование печатной части и программное обеспечение для КТ для сравнения, количественно, вариаций между исходной 3D визуализации и 3D печатной реплики.
- Для частей, напечатанных в мягкой смоле, мыть с ≥ 99% чистоты изопропилового спирта (IPA), чтобы удалить избыток неохватанной смолы и термического лечения в конвекционной печи на 8 ч в соответствии со спецификациями производителя.
2. Сборка трубной системы для контроля скорости потока
- Винт 1/4 "колючей трубки фитинги в сторону многообразия с 6 портов (Рисунок 2A-6) и 3/8" колючей трубки установки в оставшийся порт.
- Вырезать 1/4 "трубки до нужной длины и вставить в каждом конце толчок к подключению клапанов(рисунок 2A-5). Прикрепите каждый клапан к одному из 1/4"фитинга, вставленного в многообразие.
- Подключите счетчик потока(рисунок 2A-4)к другому концу каждого клапана.
- Распоить трубчатую систему поверх деревянной доски так, чтобы однообразная 3/8-" фитинга многообразия простирается мимо края доски. Чтобы закрепиться на месте, добавьте два винта в сторону деревянной доски и прикрепите многообразие к винтам с помощью проволоки.
- Добавьте четыре винта, расположенных вокруг каждого из клапанов и метров потока и используйте проволоку, чтобы обеспечить каждый из них на деревяннойдоске (рисунок 2E).
- С примерно 6 "из 3/8" ID трубки, подключить многообразие в строке 0,1 мкм поры размер вакуумного фильтра класса. Подключите другой конец фильтра к контроллеру потока, используя еще 6"из 3/8"ID трубки
ПРИМЕЧАНИЕ: Трубная система должна быть собрана только один раз.
3. Сборка крышки розетки доли с моделью легких пациента
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола должна быть завершена до каждого экспериментального запуска.
- Вставьте колючую трубчатую связь в крышку с соплом, выступающим через отверстие в крышке основания. Во-первых, вставьте один конец овальной колючей трубчатой основы соединения в крышку. Затем осторожно растянуть гибкую крышку над другим концом овальной базы, принимая особое внимание, чтобы не взломать тонкую основу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно напечатанные колпачки могут быть жестче, чем хотелось бы, и могут быть растянуты, запуская два пальца вдоль крышки интерьера. - Вырезать 10 мкм фильтровальной бумаги так, что это немного больше, чем площадь розетки. Сложите фильтровальную бумагу над розеткой доли и удерживайте на месте одной рукой.
- С другой стороны, используйте пинцет, чтобы растянуть крышку с колючей трубки связи над розеткой. Нажмите крышку вниз, пока вырез крышки совпадает с соответствующей выемкой на выходе доли (Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрыв фильтровальной бумаги на этом этапе может привести к аннулированию результатов, поэтому следует принять особые меры, чтобы избежать чрезмерной силы при нажатии крышки на розетку. - Повторите для всех оставшихся точек доли(рисунок 2D).
4. Поколение клинически соответствующего профиля воздушного потока
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола должна быть завершена до каждого экспериментального запуска.
- Подключите каждую розетку доли легких к трубе соответствующего счетчика потока и клапана, заботясь о том, чтобы не применять слишком большое боковое давление к колючему соединению труб. Прикрепите электронный счетчик потока к входу модели легких для измерения общей скорости потока воздуха к модели легких.
- Включите контроллер потока(рисунок 2A-7) и вакуумный насос(рисунок 2A-8). Выберитенастройку «теста»на контроллере потока и медленно увеличьте скорость потока до тех пор, пока электронный счетчик потока не отягостит желаемую общую скорость потока.
- Используя клапаны(рисунок 2E-5), отрегулируйтескорость потока через каждую из пяти долей легких: правую верхнюю (RU), правую среднюю (RM), правую нижнюю (RL), левую верхнюю (LU) и левую нижнюю (LL). После того, как скорость потока долей, показанная наметрах потока(рисунок 2 E-4), стабильна при желаемом значении, проверьте общую скорость потока снова на электронном счетчике потока, чтобы убедиться, что в системе нет утечек.
- При расхождении в общей скорости потока, снизить скорость потока с контроллером потока, установить все клапаны в полностью открытой конфигурации, и повторить шаги 4.2 и 4.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты, представленные здесь, были получены с использованием профилей воздушного потока на основе данных, представленных Sul et al.10 Эти фракции ломарного потока были рассчитаны с использованием тонконареза вычисленных томографических изображений легких пациента при полном вдохновении и истечении срока годности, сравнивая относительные изменения в объеме каждой доли легких. Результаты представлены для двух различных условий потока, как при общей скорости потока ввеся 1 л/мин. Здоровый профиль потока легочной доли распределяется по каждой торговой точке следующим процентом потока входов: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14.0%, RU-20.3%. Профиль потока долей ХОБЛ распределяется между каждой торговой точкой по следующему проценту потока входов: LL-10.0%, LU-29.0%, RL-13.0%, RM-5.0%, RU-43.0%9,10.
- При расхождении в общей скорости потока, снизить скорость потока с контроллером потока, установить все клапаны в полностью открытой конфигурации, и повторить шаги 4.2 и 4.3.
- Выйти из"тестовойустановки" функции контроллера потока, но оставить вакуумный насос на.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выключение вакуумного насоса между установлением частоты потока и выполнением эксперимента по осаждению может привести к неточностям в генерируемом профиле потока. Рекомендуется оставить вакуумный насос на один раз желаемые темпы потока устанавливаются для завершения тестирования аэрозольного осаждения.
5. Доставка аэрозоля модели легких
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты должны проводиться в дымовой капот с поясом закрыты, чтобы свести к минимуму воздействие любых аэрозолей, генерируемых небулайзером.
- Заполните небулайзер раствором желаемых флуоресцентных частиц(рисунок 2 A-1) и подключим к входу модели легких(рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты, представленные здесь были получены с использованием 30 мл 1:100 разбавления 1 мкм флуоресцентных частиц полистирола в метаноле.- Для проверки экспериментальной установки подключите небулайзер непосредственно к входу модели легких без какого-либо целевого устройства.
- Чтобы измерить эффективность устройства таргетинга, подключите небулайзер к устройству и вставьте устройство в модель легких.
- Подключите сжатую воздушную линию к небулайзеру и закройте пояс капота дыма как можно больше.
- Установите контроллер потока для запуска для одной пробной версии 10 s. Перед нажатием запустите, откройте сжатый клапан воздуха немного, чтобы начать генерацию аэрозоля в небулайзере.
- Нажмите на контроллер потока и немедленно откройте сжатый воздушный клапан полностью. Как только контроллер потока достигает около 9 с, начните закрывать сжатый воздушный клапан.
- После того, как сжатый воздушный клапан полностью закрыт, отсоедините небулайзер от линии сжатого воздуха, полностью закройте паровой капот, выключите вакуумный насос, и пусть любые аэрозоли очистить от дыма капот около 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы закрыть вакуумный насос после завершения запуска, чтобы предотвратить вакуум от создания в трубной системе. - Прожгая достаточное количество времени, отсоединив модель легких от трубной системы, заботясь о том, чтобы не взломать колючие трубные соединения.
- Удалите крышки розетки доли, запуская пару пинцетов под краем крышки и аккуратно снимите его с модели легких.
- Удалите фильтровальную бумагу из крышки и поместите ее в 24 хорошо пластины с стороны, на которой частицы откладываются находясь на дне перед колодец пластины. Повторите для остальных точек и этикетки хорошо соответствует каждой доле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить любое остаточное осаждение частиц от воздействия последующих экспериментов, важно, чтобы промыть как легких модели и крышка компонентов с IPA или соответствующий растворитель между работает. Это может быть собрано и включено в анализ по желанию. Кроме того, журнал хранится, чтобы убедиться, что все реплики, используемые были минимально подвержены IPA для поддержания целостности части, и визуальной проверки части рекомендуется до использования.
6. Выход фильтр бумаги изображения
- Поместите пластину хорошо в цифровой флуоресцентный микроскоп и установите микроскоп на 4x увеличение и соответствующий канал флуоресценции.
- Визуально определите, какая бумага фильтра доли имеет наибольшее количество осаждения частиц, и используйтефункцию «Auto Expose». Примите к сведению полученные значения времени экспозиции и интеграции.
- Примените это воздействие на все фильтры для запуска и оцените, производит ли параметр удовлетворительное изображение для всех областей с высоким уровнем осаждения фильтров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки фокусировки могут быть изменены с фильтра на фильтр; однако все фильтры для данного запуска должны быть проанализированы в тех же настройках экспозиции. Это возможно только иметь один кадр фокуса в то время, так изгибы или слезы в фильтровальной бумаге может предотвратить все на хранение частиц в представлении от фокуса. Этого можно избежать, гарантируя, что фильтровальную бумагу плоская против нижней части пластины хорошо. - Возьмите по крайней мере три изображения фильтровальной бумаги каждой доли в случайных местах и сохраните .tiff файлов.
7. Количественная оценка осаждения частиц
- Импорт всех изображений фильтровальной бумаги для данного запуска в сессии ImageJ.
- Измените тип каждого изображения на 8-битный, выбрав изображение | Тип | 8-битный.
- Откройте картинку с самой высокой флуоресценцией и выберите изображение | Отрегулируйте | Порог для открытия порогового окна. Отрегулируйте пороговые значения, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал от фильтровальной бумаги и четко определить края частиц. Смотрите рисунок 3 для изображений хорошего качества и низкого качества пороговых значений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для фильтров с высоким уровнем осаждения, "корона" флуоресценции, вызванные дифракцией света волокнами фильтровальной бумаги, может наблюдаться вокруг больших групп частиц. При пороге этих изображений, диапазон, который является слишком большим отображает небольшие точки или "перо-как" формы вокруг этих групп, как это наблюдается в "бедных" пороговых изображений на рисунке 3. Это может быть улучшено путем постепенного увеличения нижнего предела порога до тех пор, пока сигнал от волокон фильтровальной бумаги не будет сведен к минимуму, не заслоняя сигнал от самих частиц. - Распространение параметров порога для наивысшего изображения флуоресценции на все другие изображения.
- Количественная оценка количества частиц и общей флуоресцентной области путем выбора анализа | Анализ частиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наборы данных сравниваются с помощью теста Сидака «Множественные сравнения» и двухголового ANOVA. Кроме того, осаждение только в доле интереса сравнивается с помощью студенческого T-теста при условии равной дисперсии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Частицы в этом диапазоне размеров (1-5 мкм) и условиях потока (1-10 л/мин) следуют линиям потока жидкости на основе как их теоретического числа Стокса, так и данных in vivo; поэтому в отсутствие целевого устройства доставки частицы, высвобождаемые в модель легких, как ожидается, откладываются в соответствии с процентом от общего потока воздуха, перенаправленного на каждую долю. Относительные объемы доставки частиц на каждую долей можно сравнить с данными о скорости потока клинических долей, полученными путем анализа компьютерной томографии высокого разрешения пациента (HRCT)10. Проверенная экспериментальная настройка даст неугоменаправленный профиль осаждения частиц, который не имеет статистически значимой разницы от клинического профиля потока воздуха. Данные проверки представлены для двух различных условий потока: 1 л/мин в здоровомлегком (рисунок 4A) и 1 л/мин в легких, пострадавших от ХОБЛ(рисунок 4B). В обоих этих условиях экспериментально определяемый профиль осаждения статистически не отличался от клинических данных, демонстрируя, что настройка точно имитирует распределение воздушного потока по каждой из долей легких. Эти базовые профили осаждения служили в качестве контроля, с которым сравниваются целевые профили осаждения частиц.
Чтобы проиллюстрировать способность этого протокола количественно изменения в региональном осаждении легких, данные были включены для тестирования двух различных устройств таргетинга: модифицированная эндотрахеальная (ET) трубка(рисунок 5B) и концентрическое устройство цилиндра (Рисунок 5E). Оба этих устройства отличались 2-мм розеткой с настраиваемым расположением для целевого высвобождения частиц. Модифицированная et пробка была оценена с intubated моделью легкя для своей способности прицеть осаждение частицы к обоим левой более низкой (LL) Lobe и правой более низкой (RL) Lobe. По сравнению с не целевым профилем осаждения частиц, это устройство произвело почти четырехкратное увеличение доставки LL Lobe (T-test p'0.004, n'3) в дополнение к отвлечению более 96% доставленных частиц в левое легкое (T-test p'0.0001, n'3) (Рисунок 5A). Изменяя настройку местоположения релиза для целевой RL Lobe, это устройство произвело более чем в два раза доставку частиц в RL Lobe (T-test p'0.02, n'3) и перенаправило 94% доставленных частиц в правое легкое (T-test p'0.0005, n'3) (Рисунок 5C). Это указывает на то, что устройство является весьма успешным в производстве предполагаемого модуляции профиля осаждения. Концентрическое устройство цилиндра было протестировано в полной модели легких с предполагаемой мишенью левой верхней (LU) Lobe. По сравнению с не целевым профилем осаждения частиц, это устройство вызвало почти в три раза увеличение доставки LU Lobe (T-test p'0.0003, n'3) в дополнение к отвлечению более 87% доставленных частиц в левое легкое (T-test p'0.002, n'3) (Рисунок 5D). Эффективность таргетинга также можно наблюдать качественно, сравнивая изображения фильтра целевой доли с другими фильтрами розетки. Как по рисунку 3, наиболее эффективный метод таргетинга даст высокое осаждение частиц в предполагаемой доле интереса и низкое осаждение в остальных торговых точках доли. Для дальнейших демонстраций возможностей этого протокола, пожалуйста, смотрите эксперименты, выполненные Kolewe et al9.
Рисунок 1: 3D печатных экспериментальных компонентов. ( A )ПациентКТ преобразуется в 3D часть файла с помощью КТ и сетки редактирования программного обеспечения. (B)Модель легких с изменениями розетки доли, сделанными в редактировании сетки и программном обеспечении 3D-моделирования. (C) Модель легких с ввесятом доработанным в програмном обеспечении 3D моделирования для того чтобы отразить intubated пациента. (D) Колючее соединение труб и ( E )крышка разработанав 3D-моделирование программного обеспечения. (F)поперечное сечение 3D-модели, изображающее взаимосвязанный характер точек модели легких с крышкой и колючей трубчатой связью. (G) Взорван вид легкого модели розетки крышка сборки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Сборка экспериментальной установки. (A) Схема экспериментальной установки, включая (1) небулайзер, (2) модель легких, (3) колпачки розетки, (4) счетчики потока, (5) клапаны, (6) многообразный, (7) контроллер потока и (8) вакуумный насос. (B)Полностью собранная установка. (C)Крупным планом доли розетки со собранной крышкой. (D)Модель легких со всеми добавлены колпачки. (E) Крупным планом трубки сети для установления доли точки потока точек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Фильтр бумажной обработки изображений. Представленные необработанные изображения были собраны в ходе эксперимента по целевой левого легкого с использованием 1 мкм флуоресцентных частиц полистирола на 1 л / мин под здоровым профилем дыхания. На "высоких" и "низких" изображениях осаждения изображены фильтры LL и RU Lobe соответственно. "Хороший" порог, применяемый с диапазоном от 43 до 255, поддерживает определенные края между отдельными частицами и позволяет избежать обнаружения волокон фильтровальной бумаги. "Бедный" порог, применяемый с диапазоном от 17 до 255, скрывает границы отдельных частиц и переоценивает флуоресцентную область фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Экспериментальная проверка установки. (A)Результаты проверки для здоровых пациентови ( B) пациент ХОБЛ на 1 л / мин. Все представленные данные являются средними ± с тремя репликациями (за исключением клинических данных ХОБЛ, где только один пациент был зарегистрирован). Клинические справочные данные для здоровых и ХОБЛ пациентов были получены из Сул, идр. Наборы данных сравнивались с помощью теста Sidak Multiple Comparisons Test, и все различия не являются значительными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Пример данных для целевых экспериментов. (A) Левая нижняя доля и ( C )ПравоНижняя Доля ориентации достигнуто с помощью (B) модифицированной системы доставки ET трубки. (D) Левый Верхний Лоб ориентации достигнута с помощью (E) концентрической системы доставки трубки. Для всех трех наборов данных внутреннее кольцо представляет собой нецеленаправленный профиль осаждения, полученный во время проверки установки, а внешнее кольцо представляет профиль осаждения, полученный с добавлением указанного устройства таргетинга. Отображаются средства из трех репликаций для каждой настройки. Наборы данных сравнивались с помощью теста Sidak Multiple Comparisons Test и студенческого T-теста при условии равной дисперсии. Все три установки произвели значительное увеличение доставки в долей интереса: LL Lobe (T-test p'0.004, n'3), RL Lobe (T-test p'0.02, n'3) и LU Lobe (T-test p'0.0003, n'3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Текущее современное устройство для легочного фармацевтического тестирования полной дозы ингаляции является Next Generator Impactor (NGI), который измеряет аэродинамический диаметр аэрозоля4. Эти данные размеров затем используется для прогнозирования генерации легких, при которой аэрозоль будет депозит на основе корреляции, разработанной для здорового взрослогомужчины 11. К сожалению, этот метод ограничен в своей способности оценить различия в региональном осаждении легких, определить влияние заболеваний на фармацевтические роды, и предсказать осаждения профилей для различных возрастных групп, рас иполов 12,13,14. Протокол, изложенный здесь, имеет возможность выполнить эти потребности тестирования, позволяя исследователям генерировать настраиваемые, анатомически точные модели легких с возможностью количественной оценки относительного осаждения на уровне доли, на основе поведения потока жидкости, ранеепродемонстрированной в вычислительных моделях 3,5,15. Используя этот метод, фармацевтическая доза и доставка могут быть лучше оценены для детской и больной геометрии легких до ввода клинических испытаний.
Как показано на рисунках 4 и рисунке 5,осаждение уровня доли может быть точно и быстро измерено как для целевых, так и для не целевых ингаляционных аэрозолей. При отсутствии целевого устройства частицы в этом диапазоне размеров (1-5 мкм) и условиях потока (1-10 л/мин) следуют за рационализировать жидкость и общий профиль воздушного потока, перенаправленный на каждую долей(рисунок 4). Примечательно, что различные ингаляторные устройства и вложения ET трубки могут быть разработаны, чтобы сконцентрировать вдыхаемые лекарства для контролируемых мест доли. Как описано в нашей недавней работе и других, многие особенности ингалятора устройства, профиль потока, и геометрии дыхательных путей способствоватьцеленаправленному поведению осаждения 2,3,9,16. В целом, эффективная региональная таргетинга, о чем свидетельствуют наши уникальные модели in vitro, требует узкого распределения размеров аэрозолей и низких скоростей ингаляционного потока, чтобы избежать турбулентности дыхательных путей, конкретно обнаруженной в трахее. Включение полного верхнего дыхательных путей в нашей модели in vitro позволяет точно воссоздать эти модели воздушного потока, которые, как известно, влияют на распределение уровня доли ниже потечению 9. Из-за этих сложных потоков, недавняя работа продемонстрировала увеличение таргетинга снизу glottis9. Наши результаты на рисунке 5 конкретно подчеркивают преимущества использования адаптера трубки ET для региональной целевой отдельных долей от выпуска ниже glottis, с эффективной доли конкретных ориентации показано для долей как правого, так и левого легких при эффективности в диапазоне от 62-74% от общей дозы. Это представляет собой увеличение по отношению к ранее экспериментально сообщил рот-релиз региональных ориентации эффективности и является важным средством для клинического осуществления этого подхода9. Важно отметить, что протокол позволяет экспериментальные измерения распределения доли полной фармацевтической дозировки из широкого спектра потенциальных региональных устройств таргетинга за пределами тех, которые продемонстрированы здесь.
С помощью только КТ, пациент конкретных легких модель может быть быстро 3D напечатаны для проверки потенциального терапевтического метода доставки. Этот протокол не только обеспечит экспериментальный лабораторный подход к поддержке разработки новых ингаляторных устройств, но и создаст возможности для персонализированных ингаляционных устройств по требованию в клинической практике. Твердый смолы, используемый в этом протоколе стоит $ 0,12 / мл; таким образом, больницы с существующей инфраструктурой 3D-печати могут печатать модель легких всего за $ 15 вматериалах 17 и собрать персонализированные дыхательные пути в течение дня. Примечательно, что время печати и затраты на материалы в аддитивном производстве продолжают быстро сокращаться, увеличивая общую осуществимость этого подхода. Наша экспериментальная настройка может быть легко изменена, чтобы отразить ряд условий воздушного потока с помощью другой модели легких или параметра распределения воздушного потока, после экспериментальной проверки, показанной на рисунке 4. Различия в профилях потока легких и геометрии из-за таких характеристик, как возраст, раса и пол хорошо документированы в литературе и могут быть легко включены в нашподход к моделированию 18,19,20. В частности, геометрические колебания гортани, глотки и трахеи легких моделей могут оказать значительное влияние на воздушный поток и последующиерегиональные модели осаждения 15,21,22, которые этот протокол хорошо оборудован для обнаружения. Таким образом, внедрение этого персонализированного подхода к моделированию, как ожидается, будет иметь значительное влияние на развитие индивидуальных ингаляционных терапевтических средств.
Здесь, скорость потока доли были изменены, чтобы отразить те из состояния болезни ХОБЛ характеризуется снижением потока воздуха в нижниедоли (рисунок 4B), но ХОБЛ пациента полученных КТ также могут быть использованы для более точного имитации больной архитектуры легких и возможныхпрепятствий 23. С библиотекой моделей легких пациента и профилей потока, влияние прогрессирования заболевания на эффективность родов может быть исследовано. Существует широкий спектр сканирований с открытым исходным кодом, доступных в таких организациях, как Национальные институты здравоохранения (NIH) и Архив изображений рака (TCIA)24. Хотя эти модели в настоящее время могут воспроизводить геометрию пациента только до второго или третьего поколения для адекватного измерения распределения уровня доли, в настоящее время ведется работа по разработке изменений, которые могут включать нижние дыхательные пути для более детального анализа. Этот протокол может также включать клинически значимые устройства доставки лекарств, такие как ET трубки, как показано на рисунке 5B. Исследователи могут оценить несколько устройств доставки, чтобы выявить характеристики, которые могут увеличить или снизить эффективность лечения. Например, эффективность таргетинга снижается при попытке в полной модели легких, в отличие от интубированная модель легких(рисунок 5). Это различие указывает на то, что в обход области глоттала избегается области турбулентного смешивания, которые уменьшают способность к таргетингу.
Этот протокол ограничен своей неспособностью точно имитировать биологический воздушно-жидкий интерфейс. В результате аэрозоли, которые обычно откладываются при инерционном воздействии, могут вместо этого отскакивать от жестких стенок модели легких25. Чтобы улучшить это, будущие направления включают изучение поверхностных модификаций и покрытий для имитации слизистого слоя легочного эпителия. Покрытия, такие как кремниевое масло и глицерин были исследованы для предотвращения отскока частиц в NGI и могут быть легко включены на 3D печатных моделейлегких 26. Другие методы, такие как биопечать и культивирование клеток на 3D печатных моделях в настоящее время исследованы за их способность включать клеточный ответ впротокол 27. Кроме того, в этом протоколе используется оборудование, оптимизированное для скорость потока 1-15 л/мин; в будущем более высокие скорости потока 30-60 л/мин, нормальный диапазон пиковых скоростей потока, могут быть использованы путем переключения контрольных клапанов и счетчиков потока для тех, которые подходят для желаемогодиапазона скорости потока 28,29. При использовании модели контроллера потока система способна только моделировать вдохновение, а не полный циклический цикл дыхания. Включение переходных моделей дыхания с помощью аппарата искусственной вентиляции легких или более сложной системы потока, вероятно, повысит точность экспериментальных результатов в отношении эффективности осаждениячастиц 30. Наконец, эксперименты по осаждению проводились только с монодисперсными флуоресцентными полистиролами размером от 1-5 мкм. Количественная оценка осаждения зависит от аэрозольной флуоресценции, поэтому использование этого протокола с нефлуоресцентными аэрозолями может потребовать включения флуоресцентной этикетки, такой как фторсхейн изотиоцианат (FITC) дляанализа 31. Однако для анализа фильтра в зависимости от состава аэрозолей могут применяться дополнительные аналитические методы, такие как высокопрочная жидкая хроматография (HPLC) и масс-спектрометрия.
Наш протокол демонстрирует первую экспериментальную установку in vitro с возможностью количественной оценки лобкулярного легочного осаждения в геометрии легких, специфичной для пациента. Достижение контролируемого распределения уровня доли, как ожидается, повысит терапевтическую эффективность ингаляционных терапевтических средств, которые будут достигнуты только за счет достижений в пробирке все дозы измерений. С растущим интересом к персонализированной медицине, этот протокол имеет потенциал, чтобы стимулировать разработку новых целевых терапии легких, позволяя более точные прогнозы потенциальной эффективности лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят профессора Yu Feng, д-ра Дженну Бридделл, Иэна Вудворда и Лукаса Аттиа за их полезные дискуссии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
- Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
- Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
- Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
- Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90 (2017).
- Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
- Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
- Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
- Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
- Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
- Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
- Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
- Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
- Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
- Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
- Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
- Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087 (1997).
- Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
- Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532 (2020).
- Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
- The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
- Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
- Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
- Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
- Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
- Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
- Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
- Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650 (2020).
