Summary
Vi presenterar en hög genomströmning, in vitro-metod för kvantifiering av regionala pulmonell nedfall på lobnivå med hjälp av CT scan-härledda, 3D-printade lungmodeller med tunable luftflöde profiler.
Abstract
Utvecklingen av riktade terapier för lungsjukdomar begränsas av tillgången till prekliniska testmetoder med förmågan att förutsäga regional aerosoltillförsel. Med hjälp av 3D-utskrift för att generera patientspecifika lungmodeller beskriver vi utformningen av en hög genomströmning, in vitro experimentell installation för kvantifiering av lobular pulmonell nedfall. Detta system är tillverkat med en kombination av kommersiellt tillgängliga och 3D-utskrivna komponenter och gör att flödeshastigheten genom varje lob i lungan kan kontrolleras oberoende. Leverans av fluorescerande aerosoler till varje lob mäts med fluorescensmikroskopi. Detta protokoll har potential att främja tillväxten av personlig medicin för luftvägssjukdomar genom sin förmåga att modellera ett brett spektrum av patientdemografi och sjukdomsstater. Både geometrin hos den 3D-printade lungmodellen och inställningen av luftflödesprofilen kan enkelt moduleras för att återspegla kliniska data för patienter med varierande ålder, ras och kön. Kliniskt relevanta drug delivery enheter, såsom endotracheal röret som visas här, kan införlivas i testinställningen för att mer exakt förutsäga en enhets kapacitet att rikta terapeutisk leverans till en sjuk region i lungan. Mångsidigheten i denna experimentella inställning gör det möjligt att anpassa den för att återspegla en mängd inandningsförhållanden, vilket förbättrar strängheten i preklinisk terapeutisk testning.
Introduction
Många lungsjukdomar som lungcancer och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) uppvisar regionala skillnader i sjukdomsegenskaper; det finns dock en brist på terapeutiska tekniker tillgängliga för att rikta läkemedelsleverans till endast sjuka regioner i lungan1. Flera modeller av beräkningsvätskans dynamiska (CFD) har visat att det är möjligt att modulera läkemedelsdepositionsprofiler genom att identifiera specifika strömlinjeformningar ilungan 2,3. Utveckling av både inhalatorer och endotrakeala (ET) röradaptrar med regional inriktningsförmåga pågår i vårt labb för att kontrollera aerosoldistribution till sjuka lungregioner. Utvidgningen av dessa principer till klinisk användning begränsas av nuvarande preklinisk testkapacitet. Den exakta platsen för en läkemedelsavlagringar i lungan är känd för att vara den bästa prediktorn för effekt; Nuvarande farmaceutiska bedömningar av inhalerbara terapier förutspås dock oftast med hjälp av in vitro-in vivo-korrelationer av partikelstorlek till endast ungefärlig nedfall4. Denna teknik tillåter inte någon rumslig analys för att bestämma effekterna av olika luftvägsgeometrier på regional fördelning genom lungens olika lober. Dessutom saknar denna testning anatomiskt exakta lunggeometrier, som forskare har visat kan ha en betydande inverkan på depositionsprofiler5. Vissa ansträngningar har gjorts för att införliva patientspecifika lunggeometrier i testprotokoll genom tillägg av de övre luftvägarna; De flesta av dessa metoder provar dock aerosolleverans till olika generationer av lungan snarare än varje lunglob6,7,8. Följande protokoll presenterar en hög genomströmningsmetod för att generera patientspecifika lungmodeller med kapacitet att kvantifiera relativ partikeldeposition i var och en av lungans femlober 9.
Anatomiskt exakta modell lungor genereras av 3D skriva ut patienten datortomografi (CT) skanningar. När det används tillsammans med ett lättmonterat flödessystem kan de relativa flödeshastigheterna genom var och en av modellens lunglober kontrolleras oberoende och skräddarsys för att efterlikna olika patientdemografier och/eller sjukdomsstater. Med denna metod kan forskare testa effekten av potentiella terapeutiska metoder i en relevant lunggeometri och korrelera varje metods prestanda med utvecklingen av sjuk morfologi. Här testas två enhetsdesigner som utvecklats i vårt labb för deras förmåga att öka nedfallet i en önskad lunglob genom att kontrollera platsen för aerosolfrisättning i munnen eller luftstrupen. Detta protokoll har också potential att avsevärt påverka utvecklingen av personliga förfaranden för patienter genom att underlätta snabb förutsägelse av behandlingseffekt i en modell lunga som är specifik för patientens CT-skanningsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av 3D-printade experimentella komponenter
OBS: All programvara som används i protokollet anges i materialförteckningen. Dessutom är skivningsprogramvaran som används specifik för 3D-skrivaren som anges i materialförteckningen; Detta protokoll kan dock utökas till ett brett utbud av SLA-3D-skrivare (Stereolithography).
- Konvertera patient-CT-skanningar till 3D-objekt (.stl-filer).
OBS: För en mer detaljerad diskussion om de geometriska egenskaperna hos den specifika lungmodellen som används i dessa studier, se Feng et al.5.- Återge datortomografi till ett 3D-objekt med hjälp av ct-skanningsprogram (se Materialförteckning). Öppna datortomografin och skapa en mask på luftrummet med tröskelverktyget med en inställning i intervallet -800 till -1000. Med hjälp av 3D Preview-verktyget visar du 3D-renderingen och exporterar objektet (| Exportera) som en STL-fil.
- Importera filerna till meshredigeringsprogram (se Materialförteckning), tabort alla ojämna funktioner med select-verktyget (Sculpt | Borstar: "Krymp/släta" | Egenskaper: Styrka (50), Storlek (10), Djup(0). Jämna ut ytan (Ctrl+A | Deformera | Smidig | Utjämning (0,2), Utjämningsskala (1).
- I meshredigeringsprogram förlänger du väggen på dessa objekt med 2 mm (Ctrl + A | Redigera | Förskjutning), och låt det inre objektet förbli ihåligt så att endast väggen förblir. Segmenta objektet (Markera | Redigera | Planskärning) vid luftstrupen för att bilda ett inlopp och i generation 2 eller 3 där objektet förgrenar sig till varje lob för att skapa uttag (figur 1A).
OBS: Tjockleken på 2 mm valdes baserat på de acceptabla funktionsstorlekar som anges av tillverkaren av 3D-skrivaren som anges i materialförteckningen. Denna tjocklek kan justeras baserat på specifikationerna för 3D-skrivaren som finns tillgänglig om modellens inre geometri bibehålls.
- Modifiera utloppsgeometrier för patientens lungmodell så att de är kompatibla med tidigare konstruerade lobutloppslockkomponenter(figur 1B,C)som anges i materialförteckningen.
- Importera 3D-objektet, som replikerar datortomografin på insidan, har en väggtjocklek på 2 mm och är öppet vid inloppet och uttagen, till 3D-modelleringsprogram (se Materialförteckning)som en solid kropp (Open | Mesh-filer | Alternativ | Heldragen kropp).
- Skapa ett plan baserat på ett ansikte vid vart och ett av uttagen (Infoga | Referens geometri | Plan). Använd skarvverktyget och spåra utloppets innervägg och yttervägg i en skiss på planet (Skiss | Spline).
- Loft en cylinder (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) för att ansluta till modellens inre och yttre vägg, vilket förlänger utloppet för att vara enhetligt vid varjelobb (funktioner | Lofted Boss /Base). Lägg till ett hack runt kanten av uttaget för att matcha med locket (Funktioner | Extruderad | Förskjutning).
OBS: Locket (Figur 1D) är en ihålig cylinder som matchar utloppens dimensioner och har en hylla som förenar med skåran på modelluttaget. Ena änden av locket är blockerad så att ID:t är mindre än resten av delen, vilket säkerställer en tät passform runt taggrörsanslutningen (figur 1E). Taggtrådsanslutningen är en taggad konform så att taggtråden passar genom lockets öppning, men resten av delen gör det inte, vilket gör att slanganslutningen kan passa ordentligt i locket. Således passar locket tätt runt både taggrörsanslutningen och lungmodellen (Figur 1F,G). - Modifiera inloppet för lungmodellen beroende på önskade experimentella tillstånd. Hals- och glottalregionerna kan inkluderas för att efterlikna en patient som kan andas på egen hand (Figur 1B). Regioner ovanför luftstrupen kan avlägsnas med hjälp av ett extruderat snitt för att efterlikna en intuberade patient på ventilatorstöd (Funktioner | Extruderad skärning) (figur 1C).
- Orientera och stödja experimentella komponenter i skivningsprogram som tillhandahålls av 3D-skrivartillverkaren.
- Importera 3D-delfiler till 3D-skrivar skivningsprogram och välj lämpligt harts. Använd ett hårt harts för att skriva ut lungmodellerna och taggrörsanslutningarna och ett mjukt harts för att skriva ut locken.
OBS: Hartset som används för att skriva ut locken måste ha elastiska egenskaper så att det kan sträcka sig över lobutloppet och skapa en lufttät tätning. - Ställ in delorienteringen så att alla "öar" och ouppfunna volymer minimeras. Den bästa orienteringen för lungmodellerna är med lobuttagen vända bort från utskriftsplattformen. Se till att både taggrörsanslutningarna och locken har de bredare delarna vända mot utskriftsplattformen.
OBS: Enskilda skivor kan ses för att kontrollera utseendet på "öar", delar av delen som först visas i en skiva utan att vara ansluten till huvuddelens huvudkropp. Granskningsfunktionen kan användas för att söka efter segment med ouppfunna volymer, områden där oskyddat harts kan fastna i delen under utskrift. Både "öar" och ouppfunna volymer minskar utskriftskvaliteten och kan leda till tryckfel. - Visa varje skiva individuellt, lägg till stöd till eventuella återstående "öar" i delen samt alla områden med betydande överhäng. Exportera och visa segmenten för utskriften för att kontrollera att alla områden stöds på rätt sätt.
- Importera 3D-delfiler till 3D-skrivar skivningsprogram och välj lämpligt harts. Använd ett hårt harts för att skriva ut lungmodellerna och taggrörsanslutningarna och ett mjukt harts för att skriva ut locken.
- Skriv ut experimentella komponenter och slutför efterbehandling enligt tillverkarens instruktioner.
Obs: Alla steg efter bearbetningen som beskrivs nedan är specifika för 3D-skrivaren som listas i materialförteckningen. När du använder alternativa skrivare eller material justerar du dessa steg så att de återspeglar tillverkarens instruktioner.- För delar tryckta i mjukt harts, tvätta med ≥99% renhet isopropylalkohol (IPA) för att avlägsna överflödigt ocured harts och termisk härdning i en konvektionsugn i 8 timmar enligt tillverkarens specifikationer.
OBS: Delar som skrivs ut i mjukt harts kan vara mycket känsliga omedelbart efter utskrift, så särskild försiktighet bör vidtas under rengöringssteg. Exponering för IPA bör hållas under materialets lösningsmedelsexponeringsgräns för att förhindra delnedbrytning. - För delar tryckta i hårt harts, tvätta med IPA för att ta bort överflödigt ocured harts och härda i en UV-ugn (365 nm ljus vid 5-10 mW/cm2) i 1 min per sida.
OBS: För att utvärdera noggrannheten hos den 3D-utskrivna repliken rekommenderas att du använder μCT-skanning av den tryckta delen och CT-skanningsprogramvaran för att kvantitativt jämföra variationer mellan den ursprungliga 3D-renderingen och den 3D-utskrivna repliken.
- För delar tryckta i mjukt harts, tvätta med ≥99% renhet isopropylalkohol (IPA) för att avlägsna överflödigt ocured harts och termisk härdning i en konvektionsugn i 8 timmar enligt tillverkarens specifikationer.
2. Montering av slangsystem för flödeskontroll
- Skruva in 1/4"-taggrörsbeslag i grenrörets sida med 6 portar (figur 2A-6) och en 3/8" taggtrådsrörskoppling i den återstående porten.
- Kapa 1/4" slangar till önskade längder och sätt in i varje ände av push-to-connect-ventilerna(bild 2A-5). Fäst varje ventil på en av de 1/4"-beslag som sätts in i grenröret.
- Anslut en flödesmätare (bild 2A-4) till den andra änden av varje ventil.
- Placera slangsystemet ovanpå träbrädan så att grenrörets enda 3/8"-armatur sträcker sig förbi kanten på brädan. För att säkra på plats, lägg till två skruvar på sidan av träbrädan och fäst grenröret på skruvarna med hjälp av tråd.
- Lägg till fyra skruvar placerade runt var och en av ventilerna och flödesmätarna och använd tråd för att fästa var och en av dem på träbrädan (Figur 2E).
- Med cirka 6" 3/8" ID-slangar, anslut grenröret till ett in-line 0,1 μm vakuumkvalitetsfilter i porstorlek. Anslut den andra änden av filtret till flödesregulatorn med ytterligare 6" 3/8"-ID-slangar
OBS: Slangsystemet behöver endast monteras en gång.
3. Montering av lobuttagslock med patientens lungmodell
OBS: Denna del av protokollet måste slutföras före varje experimentell körning.
- För in taggtrådsanslutningen i locket med munstycket utskjutande genom öppningen i lockets bas. Sätt först in ena änden av den ovala taggrörsanslutningsbasen i locket. Sträck sedan försiktigt det flexibla locket över den andra änden av den ovala basen, var särskilt försiktig så att du inte knäcker den tunna basen.
OBS: Nytryckta kepsar kan vara styvare än önskat och kan sträckas ut genom att köra två fingrar längs lockets interiör. - Skär 10 μm filterpapper så att det är något större än utloppsområdet. Vik filterpapperet över lobuttaget och håll på plats med en hand.
- Med den andra handen, använd pincett för att sträcka locket med taggrörsanslutning över uttaget. Tryck ner locket tills lockets skåra matchar med motsvarande hack på lobutloppet (bild 2C).
OBS: Om du sliter filterpapperet i det här steget kan resultaten ogiltigförklaras, så särskild försiktighet bör vidtas för att undvika överdriven kraft när du trycker på locket på uttaget. - Upprepa för alla återstående lobuttag(bild 2D).
4. Generering av kliniskt relevant luftflödesprofil
OBS: Denna del av protokollet måste slutföras före varje experimentell körning.
- Anslut varje lungmodelllobutlopp till slangen på motsvarande flödesmätare och ventil, var försiktig så att du inte applicerar för mycket sidotryck på taggtrådsanslutningen. Fäst den elektroniska flödesmätaren på lungmodellens muninlopp för att mäta det totala luftflödet till lungmodellen.
- Slå på flödesregulatorn (bild 2A-7) och vakuumpumpen (Bild 2A-8). Välj inställningen "testinställning" på flödesregulatorn och öka långsamt flödeshastigheten tills den elektroniska flödesmätaren visar önskat totalt flöde.
- Använd ventilerna (Bild 2E-5), justera flödeshastigheten genom var och en av de fem lungloberna: Höger övre (RU), höger mitt (RM), höger nedre (RL), vänster övre (LU) och vänster nedre (LL). När lobflödet som visas på flödesmätarna (figur 2E-4) är konstanta vid önskat värde, kontrollera det totala flödet igen på den elektroniska flödesmätaren för att kontrollera att det inte finns några läckor i systemet.
- Om det finns en avvikelse i det totala flödet, sänk flödeshastigheten med flödesregulatorn, ställ in alla ventiler på den helt öppna konfigurationen och upprepa steg 4.2 och 4.3.
OBS: Resultat som presenteras här erhölls med hjälp av luftflöde profiler baserat på data rapporteras av Sul et al.10 Dessa lobar flöde fraktioner beräknades med hjälp av tunn skiva datortomografi bilder av patientens lungor vid full inspiration och utgång, jämföra de relativa förändringarna i volymen av varje lung caudat. Resultaten presenteras för två distinkta flödesförhållanden, båda med ett totalt inloppsflöde på 1 L/min. Den friska lunglobens utloppsprofil distribueras till varje utlopp med följande procentandel av inloppsflödet: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. KOL-lobutloppsflödesprofilen fördelas mellan varje utlopp med följande procentandel av inloppsflödet: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- Om det finns en avvikelse i det totala flödet, sänk flödeshastigheten med flödesregulatorn, ställ in alla ventiler på den helt öppna konfigurationen och upprepa steg 4.2 och 4.3.
- Avslutaflödesregulatornsfunktion " testinställning " men låt vakuumpumpen vara på.
OBS: Om du stänger av vakuumpumpen mellan att ställa in flödeshastigheterna och utföra deponeringsexperimentet kan det leda till felaktigheter i den flödesprofil som genereras. Vi rekommenderar att du lämnar vakuumpumpen på när önskade flödeshastigheter är inställda för att slutföra aerosoldepositionstestningen.
5. Leverans av aerosol till lungmodellen
OBS: Experiment måste utföras i en rökhuv med bågen stängd för att minimera exponeringen för aerosoler som genereras av nebulisatorn.
- Fyll nebulisatorn med lösning av önskade fluorescerande partiklar (figur 2A-1) och anslut till lungmodellinloppet (Figur 2B).
OBS: Resultaten som presenteras här erhölls med 30 ml av en utspädning på 1:100 av 1 μm fluorescerande polystyrenpartiklar i metanol.- För att validera den experimentella installationen, anslut nebulisatorn direkt till lungmodellinloppet utan någon inriktningsenhet.
- För att mäta effekten av en målanordning, anslut nebulisatorn till enheten och sätt in enheten i lungmodellen.
- Anslut tryckluftsledningen till nebulisatorn och stäng rökhuvens kåpa så mycket som möjligt.
- Ställ in flödes styrenheten så att den körs för en 10-s provperiod. Innan du trycker på start, öppna tryckluftsventilen något för att börja generera en aerosol i nebulisatorn.
- Tryck på start på flödesregulatorn och öppna omedelbart tryckluftsventilen helt. När flödesregulatorn når ca 9 s börjar du stänga tryckluftsventilen.
- När tryckluftsventilen är helt stängd, koppla bort nebulisatorn från tryckluftsledningen, stäng helt rökhuvens kåpa, stäng av vakuumpumpen och låt eventuella aerosoler rensas från rökhuven i ca 10 minuter.
OBS: Det är viktigt att stänga av vakuumpumpen efter avslutad körning för att förhindra att ett vakuum byggs upp i slangsystemet. - Efter att ha väntat tillräckligt med tid, koppla bort lungmodellen från slangsystemet, var särskilt försiktig så att du inte knäcker taggrörsanslutningarna.
- Ta bort lobuttagslocken genom att köra ett par pincett under lockets kant och försiktigt lyfta bort det från lungmodellen.
- Ta bort filterpapperet från locket och placera det i en 24 brunnsplatta med sidan på vilken partiklar deponeras på botten vänd mot plattans brunn. Upprepa för de återstående uttagen och märk brunnen som motsvarar varje lob.
OBS: För att förhindra att kvarvarande partikeldeponering påverkar efterföljande experiment är det viktigt att skölja både lungmodellen och lockkomponenterna med IPA eller lämpligt lösningsmedel mellan körningarna. Detta kan samlas in och inkluderas i analysen efter önskemål. Dessutom sparas en logg för att säkerställa att alla repliker som används har utsatts minimalt för IPA för att upprätthålla en delintegritet, och visuell delinspektion rekommenderas före användning.
6. Avbildning av utloppsfilterpapper
- Placera brunnsplattan i det digitala fluorescensmikroskopet och ställ in mikroskopet på 4x förstoring och lämplig fluorescenskanal.
- Identifiera visuellt vilket lobes filterpapper som har den högsta mängden partikeldeposition och använd funktionen "Auto Expose". Notera de resulterande tidsvärdena för exponering och integration.
- Tillämpa den här exponeringen på alla filter för körningen och utvärdera om inställningen ger en tillfredsställande bild för alla områden med hög deposition i filtren.
Fokusinställningar kan ändras från filter till filter. Alla filter för en viss körning måste dock analyseras med samma exponeringsinställningar. Det är bara möjligt att ha en ram av fokus i taget, så böjningar eller tårar i filterpapperet kan förhindra att alla deponerade partiklar i vyn är i fokus. Detta kan undvikas genom att se till att filterpapperet är platt mot botten av brunnsplattan. - Ta minst tre bilder av varje lobes filterpapper på slumpmässiga platser och spara som .tiff filer.
7. Kvantifiering av partikeldeponering
- Importera alla filterpappersbilder för en viss körning till en ImageJ-session.
- Ändra varje bilds typ till 8-bitars genom att välja Bild | Skriv | 8-bitars.
- Öppna bilden med den högsta fluorescensen och välj Bild | Justera | Tröskelvärde för att öppna ett tröskelfönster. Justera tröskelvärdena för att minimera bakgrundssignalen från filterpapperet och definiera tydligt partiklarnas kanter. Se figur 3 för skildringar av tröskelvärden av god kvalitet och dålig kvalitet.
OBS: För filter med höga nivåer av nedfall kan en "korona" av fluorescens, orsakad av ljusdiffraktion av ljus av filterpappersfibrerna, observeras runt stora grupper av partiklar. När du trösklar dessa bilder visas små punkter eller "fjäderliknande" former runt dessa grupperingar, vilket observeras i de "dåliga" tröskelbilderna i figur 3. Detta kan förbättras genom att gradvis öka tröskelns nedre gräns tills signalen från filterpappersfibrerna minimeras utan att signalen skymdas från själva partiklarna. - Sprid tröskelvärdesinställningarna för den högsta fluorescensbilden till alla andra bilder.
- Kvantifiera antalet partiklar och det totala fluorescerande området genom att välja Analysera | Analysera partiklar.
Datamängder jämförs med Sidaks multipla jämförelsetest och en tvåvägs ANOVA. Dessutom jämförs deposition i bara intresseloben med hjälp av ett student T-test som antar lika varians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Partiklar i detta storleksområde (1-5 μm) och flödesförhållanden (1-10 L/min) följer vätskeströmledningarna baserat på både deras teoretiska Stokes-nummer och in vivo-data. I avsaknad av en riktad leveransanordning förväntas därför partiklar som släpps ut i lungmodellen deponeras enligt den procentandel av det totala luftflödet som avleds till varje lob. De relativa mängderna partikelleverans till varje lob kan sedan jämföras med data om klinisk lobflöde som erhållits genom att analysera patientspecifika högupplösta datortomografi (HRCT)skanningar 10. En validerad experimentell uppsättning kommer att ge en icke-riktad partikeldepositionsprofil som inte har någon statistiskt signifikant skillnad från den kliniska luftflödesprofilen. Valideringsdata presenteras för två distinkta flödesförhållanden: 1 L/min i en frisk lunga (figur 4A) och 1 L/min i en lunga som påverkas av KOL (Figur 4B). Under båda dessa förhållanden var den experimentellt bestämda nedfallsprofilen inte statistiskt annorlunda än de kliniska uppgifterna, vilket visar att uppsättningen korrekt efterliknar fördelningen av luftflödet till var och en av lungloberna. Dessa baslinjedepositionsprofiler fungerade som den kontroll mot vilken riktade partikeldepositionsprofiler jämförs.
För att illustrera detta protokolls förmåga att kvantifiera förändringar i regional lungdeposition inkluderades data för testning av två olika inriktningsanordningar: ett modifierat endotrakealrör (ET)(figur 5B)och en koncentrisk cylinderanordning (figur 5E). Båda dessa enheter hade ett 2 mm ID-uttag med tunable plats för riktad partikelfrisättning. Det modifierade ET-röret bedömdes med den intubererade lungmodellen för dess förmåga att rikta partikeldeposition till både vänster nedre (LL) lob och höger nedre (RL) lob. Jämfört med den icke-riktade partikeldepositionsprofilen genererade denna anordning en nästan fyrfaldig ökning av LL Lobe-leveransen (T-test p=0,004, n=3) förutom att avleda över 96% av levererade partiklar till vänster lunga (T-test p=0,0001, n=3) (Figur 5A). Genom att ändra inställningen för frisättningsplats för att rikta in sig på RL-loben genererade denna anordning mer än fördubblad partikeltillförsel till RL-loben (T-test p=0,02, n=3) och avledde 94 % av de levererade partiklarna till höger lunga (T-test p=0,0005, n=3) (figur 5C). Detta indikerar att enheten är mycket framgångsrik när det gäller att producera den avsedda depositionsprofilmoduleringen. Den koncentriska cylindern enheten testades i full lung modell med ett avsett mål för vänster övre (LU) Lobe. Jämfört med den icke-riktade partikeldepositionsprofilen orsakade denna anordning en nästan trefaldig ökning av LU Lobe-leveransen (T-test p=0,0003, n=3) förutom att avleda över 87% av levererade partiklar till vänster lunga (T-test p=0, 002, n=3) (Figur 5D). Inriktningseffektivitet kan också observeras kvalitativt genom att jämföra bilderna på mållobens filter med de andra utloppsfiltren. Som visas i figur 3kommer den mest effektiva målmetoden att ge hög partikeldeposition vid den avsedda fliken av intresse och lågt nedfall vid de återstående lobuttagen. För ytterligare demonstrationer av kapaciteten i detta protokoll, se de experiment som utförs av Kolewe et al9.
Figur 1: 3D-utskrivna experimentella komponenter. (A) Patient CT-skanning omvandlad till 3D-delfil med hjälp av CT-skanning och meshredigeringsprogram. (B) Lungmodell med lobuttagsändringar gjorda i meshredigering och 3D-modelleringsprogram. (C) Lungmodell med inlopp modifierat i 3D-modelleringsprogram för att återspegla en intuberad patient. (D)Taggrörsanslutning och(E)lock konstruerat i 3D-modelleringsprogram. F)Tvärsnitt av 3D-modell som visar lungmodellutloppens förreglingskaraktär med locket och taggrörsanslutningen. G) Sprängskiss av lungmodellutloppslocket. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Montering av experimentell installation. a)Schematisk experimentell installation inklusive (1) nebulisator, (2) lungmodell, (3) utloppslock, (4) flödesmätare, (5) ventiler, (6) grenrör, (7) flödesregulator och (8) vakuumpump. (B) Helt monterad installation. (C) Näring av lobuttag med monterat lock. (D) Lungmodell med alla kepsar tillagda. (E) Näring av slangnätet för inställning av lobutloppsflöden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3: Filtrera bearbetning av pappersbilder. De råa bilderna som presenterades samlades in under ett experiment för att rikta in sig på den vänstra lungan med hjälp av 1 μm fluorescerande polystyrenpartiklar vid 1 L/min under en hälsosam andningsprofil. De "höga" och "låga" depositionsbilderna visar LL- respektive RU Lobe-filtren. Den "goda" tröskeln, applicerad med ett intervall på 43 till 255, upprätthåller definierade kanter mellan enskilda partiklar och undviker detektion av filterpappersfibrer. Den "dåliga" tröskeln, som tillämpas med ett intervall på 17 till 255, skymmer enskilda partikelgränser och överskattar filtrets fluorescerande område. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Validering av experimentella inställningar. (A) Valideringsresultat för friska patienteroch ( B) en KOL- patient vid 1 L/min. Alla data som presenteras är ± sd med tre replikat (utom kliniska KOL-data, där endast en patient rapporterades). Kliniska referensdata för friska och KOL patienter erhölls från Sul, et al10. Datamängder jämfördes med Sidaks multipla jämförelsetest, och alla skillnader är inte signifikanta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Exempeldata för att rikta experiment. a)Vänster nedre lob och ( C )Högernedre lob riktad uppnådd med hjälp av( B) ett modifierat ET-rörtillförselsystem. D)Vänster övre lob riktad mot uppnådd medhjälp av (E)ett koncentriskt rörtillförselsystem. För alla tre datauppsättningarna representerar den inre ringen den icke-riktade depositionsprofilen som erhålls under inställningsvalidering, och den yttre ringen representerar depositionsprofilen som produceras med tillägg av den angivna målenheten. Medel på tre replikat för varje installation visas. Datamängder jämfördes med Sidaks multipla jämförelsetest och ett student-T-test som antog lika varians. Alla tre inställningarna gav en betydande ökning av leveransen till den intresseinrättade loben: LL Lobe (T-test p=0,004, n=3), RL Lobe (T-test p=0,02, n=3) och LU Lobe (T-test p=0,0003, n=3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande toppmoderna enheten för lungmedicinisk testning av en fullständig inhalationsdos är Next Generator Impactor (NGI), som mäter den aerodynamiska diametern hos en aerosol4. Denna storleksdata används sedan för att förutsäga lunggenerationen där aerosolen kommer att deponeras baserat på en korrelation utvecklad för en frisk vuxenhane 11. Tyvärr är denna metod begränsad i sin förmåga att bedöma skillnader i regional lungdeposition, bestämma effekterna av sjukdomsförhållanden på läkemedelsleverans och förutsäga nedfallsprofiler för olika åldersgrupper, raser och kön12,13,14. Protokollet som beskrivs här har kapacitet att uppfylla dessa testbehov genom att tillåta forskare att generera tunable, anatomiskt exakta lungmodeller med förmågan att kvantifiera relativ nedfall på lobnivå, baserat på vätskeflödesbeteende som tidigare visats i beräkningsmodeller3,5,15. Med denna metod kan farmaceutisk dosering och leverans bättre bedömas för pediatriska och sjuka lunggeometrier innan du går in i kliniska prövningar.
Som visas i figurerna 4 och figur 5kan lobnivådepositionen mätas noggrant och snabbt för både riktade och icke-riktade inhalations aerosoler. I avsaknad av en målanordning följer partiklar i detta storleksområde (1-5 μm) och flödesförhållanden (1-10 L/min) vätskan strömlinjeformning och total luftflödesprofil avledd till varje lob(figur 4). Särskilt olika inhalatorenheter och ET-rörtillbehör kan utvecklas för att koncentrera inhalerade läkemedel till kontrollerade lobplatser. Som beskrivs i vårt senaste arbete och andras, bidrar många funktioner i inhalatorenheten, flödesprofilen och luftvägsgeometrin till riktat depositionsbeteende2,3,9,16. I allmänhet kräver effektiv regional inriktning som framgår av våra unika in vitro-modeller en smal aerosolstorleksfördelning och låga inandningsflöden för att undvika luftvägsturbulens som specifikt finns i luftstrupen. Införandet av hela övre luftvägarna i vår in vitro-modell möjliggör noggrann rekreation av dessa luftflödesmönster som är kända för att påverka fördelningen av lobbnivånedströms 9. På grund av dessa komplexa flöden har det senaste arbetet visat ökad inriktning underifrån glottis9. Våra resultat i figur 5 belyser specifikt fördelen med att använda en ET-röradapter för att regionalt rikta in sig på enskilda lober från frisättning under glottis, med effektiv lobspecifik inriktning som visas för lober av både höger och vänster lungor vid effektivitetsvinster som sträcker sig mellan 62-74% av den totala dosen. Detta innebär en ökning jämfört med tidigare experimentellt rapporterade mun-release regionala inriktning effektivitet och är en viktig väg för kliniskt genomförande av denna strategi9. Viktigt, protokollet tillåter experimentella lob distribution mätningar av en komplett farmaceutisk dosering från ett brett spektrum av potentiella regionala inriktning enheter utöver de som visas här.
Med endast en datortomografi kan en patientspecifik lungmodell snabbt 3D-printas för att testa en potentiell terapeutisk leveransmetod. Detta protokoll kommer inte bara att ge en experimentell labbskala för att stödja design av nya inhalatorenheter, men också skapa möjlighet för personliga inhalationsenheter på begäran i klinisk praxis. Det hårda hartset som används i detta protokoll kostar ~$0.12/ml; Därför kan sjukhus med befintlig 3D-utskriftsinfrastruktur skriva ut en lungmodell för så lite som $ 15 imaterial 17 och montera en personlig luftväg på under en dag. Framför allt fortsätter trycktiderna och materialkostnaderna inom additiv tillverkning att minska snabbt, vilket ökar den övergripande genomförbarheten av detta tillvägagångssätt. Vår experimentella uppsättning kan enkelt modifieras för att återspegla ett antal luftflödesförhållanden genom att använda en annan lungmodell eller luftflödesfördelningsinställning, efter den experimentella validering som visas i figur 4. Skillnader i lungflödesprofiler och geometrier på grund av egenskaper som ålder, ras och kön är väl dokumenterade i litteraturen och kan lätt införlivas i vår modelleringsmetod18,19,20. Specifikt kan geometriska variationer i lungmodellernas struphuvud, spånad och luftstrupe ha en betydande inverkan på luftflödet och efterföljande regionala nedfallsmönster15,21,22, som detta protokoll är väl utrustat för att upptäcka. Således förväntas införlivandet av denna personliga modelleringsmetod ha betydande inverkan på utvecklingen av anpassade inhalationsterapier.
Här ändrades lobflödet för att återspegla de av ett KOL sjukdomstillstånd som kännetecknas av minskat luftflöde till de nedre loberna (Figur 4B), men KOL patient-härledda CT-skanningar kunde också användas för att mer exakt efterlikna den sjuka lungarkitekturen och möjliga hinder23. Med ett bibliotek med patient lungmodeller och flödesprofiler kan effekterna av sjukdomsprogression på leveranseffektivitet undersökas. Det finns ett brett utbud av open source-skanningar tillgängliga från organisationer, till exempel National Institutes of Health (NIH) och Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Även om dessa modeller för närvarande endast kan replikera patientgeometri upp till andra eller tredje generationen för att på ett adekvat sätt mäta fördelningen på lobnivå, pågår arbetet med att utveckla modifieringar som kan införliva de nedre luftvägarna för mer detaljerad analys. Detta protokoll kan också innehålla kliniskt relevanta drug delivery-enheter såsom ett ET-rör enligt figur 5B. Forskare kan utvärdera flera leveransenheter för att avslöja egenskaper som kan öka eller minska behandlingseffektiviteten. Till exempel reduceras inriktningseffektiviteten vid försök i hela lungmodellen i motsats till den intuberade lungmodellen (figur 5). Denna skillnad indikerar att kringgå den glottala regionen undviker områden med turbulent blandning som minskar inriktningsförmågan.
Detta protokoll begränsas av dess oförmåga att exakt efterlikna det biologiska luft-flytande gränssnittet. Som ett resultat kan aerosoler som normalt deponeras genom inertial impaction istället studsa av lungmodellens styva väggar25. För att lindra detta inkluderar framtida riktningar att utforska ytmodifieringar och beläggningar för att efterlikna slemhinnan i lungepiteleriet. Beläggningar som kiselolja och glycerin har undersökts för att förhindra partikel studsa i en NGI och kan enkelt införlivas på 3D-tryckta lungmodeller26. Andra tekniker som bioprinting och odling av celler på 3D-printade modeller undersöks för deras förmåga att införliva ett cellulärt svar i protokollet27. Dessutom använder detta protokoll utrustning optimerad för flödeshastigheter på 1-15 L/min; I framtiden kan högre flödeshastigheter på 30-60 L/min, det normala intervallet för toppinspiratoriska flödeshastigheter, användas genom att stänga ut reglerventilerna och flödesmätarna för de som är lämpliga för önskat flödesområde28,29. Med den flödesregulatormodell som används kan systemet bara modellera inspiration snarare än en fullständig cyklisk andningscykel. Införlivande av övergående andningsmönster genom användning av en ventilator eller ett mer komplext flödessystem skulle sannolikt förbättra noggrannheten hos experimentella resultat med avseende på partikeldeponeringseffektivitet30. Slutligen har depositionsexperiment endast utförts med monodisperse fluorescerande polystyrensfärer i storlek från 1-5 μm. Deponerings kvantifiering förlitar sig på aerosol fluorescens, så användningen av detta protokoll med icke-fluorescerande aerosoler kan kräva införlivande av en fluorescerande etikett såsom fluorescein isothiocyanate (FITC) för analys31. Ytterligare analystekniker kan dock tillämpas för att analysera filtret beroende på aerosolsammansättningen, såsom högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och eller masspektrometri.
Vårt protokoll visar den första in vitro experimentella inställningen med förmågan att kvantifiera lobular pulmonell nedfall i en patient-specifika lung geometri. Uppnå kontrollerad lob-nivå distribution förväntas öka terapeutisk effekt av inhalation terapeutiska, som endast kommer att uppnås genom framsteg i in vitro hel dos mätningar. Med det växande intresset för personlig medicin har detta protokoll potential att stimulera utvecklingen av nya riktade lungterapier genom att möjliggöra mer exakta förutsägelser om potentiell behandlingseffekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar professor Yu Feng, Dr. Jenna Briddell, Ian Woodward och Lucas Attia för deras hjälpsamma diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
- Goel, A., Baboota, S., Sahni, J. K., Ali, J. Exploring targeted pulmonary delivery for treatment of lung cancer. International Journal of Pharmaceutical Investigation. 3 (1), 8-14 (2013).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Li, Z., Roberts, W. L., Rojas, C. A new methodology for targeting drug-aerosols in the human respiratory system. International Journal of Heat and Mass Transfer. 51 (23), 5578-5589 (2008).
- Feng, Y., Chen, X., Yang, M. An In Silico Investigation of a Lobe-Specific Targeted Pulmonary Drug Delivery Method. Design of Medical Devices Conference. , (2018).
- Marple, V. A., et al. Next generation pharmaceutical impactor (a new impactor for pharmaceutical inhaler testing). Part I: Design. Journal of Aerosol Medicine. 16 (3), 283-299 (2003).
- Feng, Y., Zhao, J., Chen, X., Lin, J. An In Silico Subject-Variability Study of Upper Airway Morphological Influence on the Airflow Regime in a Tracheobronchial Tree. Bioengineering. 4 (4), 90 (2017).
- Huynh, B. K., et al. The Development and Validation of an In Vitro Airway Model to Assess Realistic Airway Deposition and Drug Permeation Behavior of Orally Inhaled Products Across Synthetic Membranes. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 31 (2), 103-108 (2018).
- Lizal, F., Elcner, J., Hopke, P. K., Jedelsky, J., Jicha, M. Development of a realistic human airway model. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 226 (3), 197-207 (2011).
- Wei, X., Hindle, M., Delvadia, R. R., Byron, P. R. In Vitro Tests for Aerosol Deposition. V: Using Realistic Testing to Estimate Variations in Aerosol Properties at the Trachea. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 30 (5), 339-348 (2017).
- Kolewe, E. L., Feng, Y., Fromen, C. A. Realizing Lobe-Specific Aerosol Targeting in a 3D-Printed In Vitro Lung Model. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. , (2020).
- Sul, B., et al. Assessing Airflow Sensitivity to Healthy and Diseased Lung Conditions in a Computational Fluid Dynamics Model Validated In Vitro. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
- Martonen, T. B., Katz, I. Deposition Patterns of Polydisperse Aerosols Within Human Lungs. Journal of Aerosol Medicine. 6 (4), 251-274 (1993).
- Nahar, K., et al. In vitro, in vivo and ex vivo models for studying particle deposition and drug absorption of inhaled pharmaceuticals. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 49 (5), 805-818 (2013).
- Nichols, S. C., et al. A Multi-laboratory in Vitro Study to Compare Data from Abbreviated and Pharmacopeial Impactor Measurements for Orally Inhaled Products: a Report of the European Aerosol Group (EPAG). AAPS PharmSciTech. 17 (6), 1383-1392 (2016).
- Yoshida, H., Kuwana, A., Shibata, H., Izutsu, K. I., Goda, Y. Comparison of Aerodynamic Particle Size Distribution Between a Next Generation Impactor and a Cascade Impactor at a Range of Flow Rates. AAPS PharmSciTech. 18 (3), 646-653 (2017).
- Feng, Y., et al. An in silico inter-subject variability study of extra-thoracic morphology effects on inhaled particle transport and deposition. Journal of Aerosol Science. 123, 185-207 (2018).
- Kleinstreuer, C., Seelecke, S. Inhaler system for targeted maximum drug-aerosol delivery. United States patent. , (2005).
- Pietila, T. How Medical 3D Printing is Gaining Ground in Top Hospitals. , Available from: https://www.materialise.com/en/blog/3d-printing-hospitals (2019).
- Weber, P. W., Price, O. T., McClellan, G. E. Demographic Variability of Inhalation Mechanics: A Review. Defense Threat Reduction Agency. , (2016).
- Jiang, Y. Y., Xu, X., Su, H. L., Liu, D. X. Gender-related difference in the upper airway dimensions and hyoid bone position in Chinese Han children and adolescents aged 6-18 years using cone beam computed tomography. Acta Odontologica Scandinavica. 73 (5), 391-400 (2015).
- Martin, S. E., Mathur, R., Marshall, I., Douglas, N. J. The effect of age, sex, obesity and posture on upper airway size. European Respiratory Journal. 10 (9), 2087 (1997).
- Xi, J., Longest, P. W., Martonen, T. B. Effects of the laryngeal jet on nano- and microparticle transport and deposition in an approximate model of the upper tracheobronchial airways. Journal of Applied Physiology. 104 (6), 1761-1777 (2008).
- Zhao, J., Feng, Y., Fromen, C. A. Glottis motion effects on the particle transport and deposition in a subject-specific mouth-to-trachea model: A CFPD study. Computers in Biology and Medicine. 116, 103532 (2020).
- Kim, S. S., et al. Chronic obstructive pulmonary disease: lobe-based visual assessment of volumetric CT by Using standard images--comparison with quantitative CT and pulmonary function test in the COPDGene study. Radiology. 266 (2), 626-635 (2013).
- The Cancer Imaging Archive. , Available from: https://www.cancerimagingarchive.net/ (2020).
- Li, A., Ahmadi, G. Computer Simulation of Deposition of Aerosols in a Turbulent Channel Flow with Rough Walls. Aerosol Science and Technology. 18 (1), 11-24 (1993).
- Khalili, S. F., Ghanbarzadeh, S., Nokhodchi, A., Hamishehkar, H. The effect of different coating materials on the prevention of powder bounce in the next generation impactor. Research in Pharmaceutical Sciences. 13 (3), 283-287 (2018).
- Galliger, Z., Vogt, C. D., Panoskaltsis-Mortari, A. 3D bioprinting for lungs and hollow organs. Translational Research. 211, 19-34 (2019).
- Schwarz, K., Biller, H., Windt, H., Koch, W., Hohlfeld, J. M. Characterization of exhaled particles from the healthy human lung--a systematic analysis in relation to pulmonary function variables. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23 (6), 371-379 (2010).
- Patton, J. S., Byron, P. R. Inhaling medicines: delivering drugs to the body through the lungs. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (1), 67-74 (2007).
- Zhang, Z., Kleinstreuer, C., Kim, C. S. Cyclic micron-size particle inhalation and deposition in a triple bifurcation lung airway model. Journal of Aerosol Science. 33 (2), 257-281 (2002).
- Ju, Y., et al. Engineering of Nebulized Metal-Phenolic Capsules for Controlled Pulmonary Deposition. Advanced Science. 7 (6), 1902650 (2020).
