Summary
이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.
Abstract
종양 발생은 세포가 적대적인 조건하에서 그들의 성장, 생존 및 보급을 허용하는 기능을 취득하는 다단계 프로세스입니다. 다른 시험은 암 세포의 이 특징을 확인하고 정량화하기 위하여 노력합니다; 그러나, 그들은 종종 세포 변환의 단일 측면에 초점을 맞추고, 사실, 여러 테스트는 그들의 적절 한 특성에 대 한 필요. 이 작업의 목적은 연구원에게 광범위한 관점에서 체외의 세포 변환을 평가하는 도구 세트를 제공하여 건전한 결론을 도출 할 수 있도록하는 것입니다.
지속적인 증식 신호 활성화는 종양 조직의 주요 특징이며 시간이 지남에 따라 달성 된 인구 두 배수를 계산하여 체외 조건에서 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 게다가, 3D 배양에 있는 세포의 성장은 생체 내에서 일어나는 무슨을 닮은 주변 세포와의 상호 작용을 허용합니다. 이것은 세포 집계의 평가를 가능하게 하고, 특유한 세포 마커의 면역 형광 표시와 더불어, 종양 변환의 또 다른 관련 특징에 대한 정보를 얻기 위하여: 적당한 조직의 손실. 변형 된 세포의 또 다른 놀라운 특성은 앵커리지 분석으로 평가 할 수있는 다른 세포 및 세포 외 매트릭스에 부착하지 않고 성장하는 능력입니다.
세포 성장속도를 평가하고, 3D 배양에서 세포 계보 마커의 면역형광 라벨링을 수행하고, 연한 한천에서 앵커리지 독립적인 세포 성장을 테스트하는 상세한 실험 절차가 제공됩니다. 이러한 방법론은 유방암에 있는 그것의 관련성 때문에 유방 1 차상피 세포 (BPEC)를 위해 최적화됩니다; 그러나 일부 조정 후 다른 세포 유형에 절차를 적용할 수 있습니다.
Introduction
신생물 개발에는 여러 개의 연속이벤트가 필요합니다. 2011년 하나한과 웨인버그는 변형된 세포의 성장, 생존 및 보급을 가능하게 하는 10가지 기능을 설명했습니다: 소위 "암의 특징"1. 여기에 설명된 방법론은 종양 세포의 독특한 특징 중 일부에 집중하여 체외 세포 변환을 평가하는 세 가지 다른 도구를 컴파일합니다. 이러한 기술은 세포 증식율, 3D로 배양될 때 세포의 행동 및 앵커리지 독립성을 가진 식민지를 형성하는 능력을 평가합니다.
세포 모델은 시험관 내가설을 테스트하는 데 매우 중요합니다. 암2,3,4의연구를 위한 세포 변환의 실험 모델을 생성하기 위해 상이한 접근법이 개발되었다. 유방암은 전 세계 여성들 사이에서 가장 흔한 암이고 여자 중 암 죽음의 대략 15%를 책임지고 있기 때문에5,유방 상피 세포의 적당한 세포 모형을 제공하는 것은 추가 조사를 위해 가장 중요합니다. 이 문서에서는, 우리는 2007년에 Ince와 동료에 의해 처음에 기술된 유방 1 차상피 세포 (BpECs) 변환의 실험 모형을 사용하여 세포 변환을 평가하는 3개의 기술의 잠재력을 설명하고 나중에 우리의 실험실7에서실행되었습니다. 이러한 실험 모델은 3개의 표적 유전자(SV40 Large T 및 소형 t항원)의 순차적 변화를 기반으로 Ttag, hTERT및 HRAS라고불임) 비변형 BPEC의 게놈에 기초한다. 더욱이, BpECs 파생에 사용되는 방법은 발광 또는 근피성 마커를 가진 유방 상피 세포의 유지보수를 선호하며, 그 결과 일부 유방 선 및 생리적 특성을 유지하는 이질적인 세포 배양의 결과.
유방 선에서, 우유 생산을 담당하는 발광 유방 상피 세포는 루멘 근처에 위치하고, 심근 세포는 발광 세포 주위에 처분되고 젖꼭지로 우유를 이끄는 수축 운동을 돌봅니다. 이러한 세포 계보 사이의 적절한 조직의 손실은 3D 세포 배양에서 독특한 계보 마커의 면역 형광 검출 후 시험관 내에서 평가 될 수있는 종양 변환8의 특징입니다. 종양 세포의 또 다른 주요 특징은 다른 세포와 세포 외 매트릭스1에부착하지 않고 성장하는 능력입니다. 건강한 세포가 현탁액에서 성장하도록 강요될 때, 아노이키스 \u2012와 같은 메커니즘은 세포외 매트릭스 \u2012로부터 분리에 반응하여 유도된 세포 사멸의 유형이활성화되어 9. 세포 사멸의 회피는 암의 독특한 특징 중 하나이며, 따라서 변형 된 세포는 아노이키스를 비활성화하고 앵커 독립적 인 방식으로 살아남을 수 있습니다. 이 용량은 소프트 한천을 사용하여 앵커리지 독립적 인 분석으로 시험관 내에서 평가 할 수 있습니다. 더욱이, 종양 조직의 내재된 특징은 그들의 지속적인 증식 신호 용량이며, 이는 현탁액 검사기뿐만 아니라 단층 부착 배양의 성장 속도를 모니터링하여 시간에 따라 세포 수의 증가를 측정하여 체외 조건에서 쉽게 모니터링 할 수 있습니다.
종양성 잠재력을 시험하는 가장 좋은 모델은 뮤린 모델에서 종양 세포의 접종과 종양 발달의 평가에도 불구하고, 실험 적 절차에서 사용되는 동물의 수를 가능한 한 최소화하는 것이 중요하다. 따라서 시험관 내 변환을 평가하기 위한 적절한 테스트를 갖는 것이 최우선 과제입니다. 여기서, 우리는 세포 변환 모형으로 작동하는 실험실의 대부분에서 쉽게 구현될 수 있는 부분적으로 그리고 완전히 변형된 유방 상피 세포의 종양 성 잠재력을 평가하는 공구세트를 제공합니다.
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Protocol
다음과 같은 실험에 사용된 인간 샘플은 표준 절차 동의하에 클리니카 필라르 산트 조르디(바르셀로나)에서 수행된 감소 유방성형술로부터 수득되었다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. 인간 유방 상피 세포 및 성장 곡선 플롯 축적의 체외 배양
-
유방 1 차상성 세포의 체외 배양 (BPECs): 세포 통과
참고: BPEC 파생 및 세포 배양의 경우 Ince 외, 20076에의해 기술된 지침을 따릅니다.- 중간 준비.
- P 또는 T 보충제와 보충 WIT 기초 정의 매체, 제조 업체에 의해 제공, 기본 또는 변형 된 BpEC 배양 여부에 따라.
- 변환된 BpEC에 대해 100 ng/mL또는 25 ng/mL의 최종 농도에 보충된 WIT 매체에 콜레라 독소를 추가합니다.
주의: 콜레라 독소는 삼키면 치명적입니다. 개인 보호 장비를 사용합니다. 환경에 대한 릴리스를 피하십시오.
- 세포 배양 유지 및 패시징.
참고: 다음 단계의 경우 T25 플라스크에서 세포가 증가하고 있음을 명심하십시오. 그럼에도 불구하고, 부피가 표면적 측면에서 비례성을 유지하는 다른 세포 배양 형식에 적응할 수 있다.- 매일 세포 소모성을 확인하십시오. 배양이 90% 수렴되면 세포 패시징을 수행합니다.
- 각 플라스크에 대해 1x PBS, 3배 트립신, 중간 및 15mL 원추형 튜브를 획득하여 2mL의 태아 소 세럼(FBS)을 함유하고 있습니다.
- 플라스크에서 배지를 제거하고 FBS를 포함하는 15 mL 원추형 튜브에 보관하십시오.
- 1x PBS로 세포를 헹구는 다.
- 3배 트립신1mL을 추가하여 표면에서 세포를 분리합니다. 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 셀이 분리되었는지 확인합니다. 세포가 완전히 분리되지 않으면 격렬한 흔들림을 적용하십시오.
- FBS로 보충 된 예약 된 매체를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
- 셀룰러 서스펜션을 수확하고 15 mL 원추형 튜브에 놓습니다.
- 500 x g에서 원심분리기는 5 분 동안 상퍼를 제거하고 손가락으로 튜브의 바닥을 가볍게 하여 펠릿 세포를 다시 중단합니다.
- 펠릿에 신선한 매체1-2mL을 추가하고 자동 세포 카운터 또는 혈류계를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 이 데이터는 나중에 인구 두 배를 계산하고 성장 곡선을 그리는 데 사용됩니다. 종자 12,000 세포/cm2 (예를 들어, T25 플라스크에 대 한 300,000 세포) 변형 된 세포 배양 표면 플라스크에서 (재료의 표참조).
참고: 농도가 너무 높으면 세포 현탁액을 희석하여 적절한 정량화를 보장합니다. - 5mL의 최종 부피에 배지를 추가하고 37°C 및 5% CO2 대기에서 세포를 배양한다.
- 세포 배양 배지를 48h마다 교체한다.
- 중간 준비.
-
계산 및 데이터 시각화를 두 배로 늘리는 인구
- 1.1.2.10 단계에서 얻은 셀 수의 데이터를 사용하여 다음 수식을 적용하여 누적된 인구 두 배(PD) 값을 얻습니다.
여기서, PDi는 이전 하위 배양(이전 하위 문화에 축적된 PD를 지칭함)까지 세포에 의해 달성된 인구 두 배의 수를 나타내며,Nh는 수확된 세포의 수이며, Ns는 종자 세포의 개수이다. - 배양(x-축)과 축적된 PD(y-축)의 일수가 표시되는 XY 그래프를사용하여 특정 시간 간격에 대한 데이터를 나타냅니다.
- 가장 적합한 선과 피팅 방정식을 가져옵니다.
참고: 경사(b)가 증가하면 증식률이 증가합니다.
- 1.1.2.10 단계에서 얻은 셀 수의 데이터를 사용하여 다음 수식을 적용하여 누적된 인구 두 배(PD) 값을 얻습니다.
2. 지하 막 매트릭스 및 면역 형광 단백질 검출의 3차원 (3D) 배양
- 지하 막 매트릭스의 3D 배양
참고: 이 프로토콜은 Debnath 등, 200310에서 적용되었으며 24 개의 웰 플레이트에 최적화되었습니다 (재료 표참조).- 실험 하루 전에 재료를 준비 : 4 °C에서 밤새 전 냉각 지하 멤브레인 매트릭스와 파이펫 팁, 미세 원심 분리기 튜브, 냉동고에서 냉각 잘 플레이트를 보자.
참고: 매트릭스는 장기 저장을 위해 -20°C로 유지해야 합니다. 여러 동결 해동 주기를 피하기 위해 알리쿼트를 만듭니다. - 실험 당일, 미리 냉각된 재료를 얼음 위에 놓습니다.
- 표면 장력을 줄이기 위해 차가운 멸균 1x PBS로 우물을 헹구십시오.
- 지하 멤브레인 매트릭스의 100 μL로 각 우물의 바닥을 덮습니다.
참고: 매트릭스를 천천히 분배하고 우물 전체에 퍼뜨리십시오. 단층 세포 배양 성장을 피하기 위해 바닥 층의 거품 형성을 피하는 것이 중요합니다. - 플레이트를 인큐베이터에 37°C로 배치하여 매트릭스 층이 고화하게 합니다.
참고: 일반적으로 고형화하는 데 약 20분이 걸립니다. - 한편, 트립시니화 세포는 1.1 단계에서 이전에 설명한 바와 같이. 5 분 동안 500 x g에서 세포를 원심 분리하고 중간에서 다시 중단합니다. 400,000 개의 셀 / mL 현탁액을 준비하고 파이펫팅으로 모든 세포 덩어리를 부드럽게 분해합니다.
- 8% 지하 멤브레인 매트릭스로 배지를 준비하고 세포 현탁액과 1:1 (v/v)을 혼합하여 4% 매트릭스에서 200,000세포/mL 용액을 얻습니다.
참고: 매트릭스 불필요한 낭비를 방지하는 데 필요한 매체의 양을 계산합니다. - 이미 고화화된 매트릭스 층 위에 500μL의 셀 서스펜션을 배치하여 4% 지하 막 매트릭스를 사용하여 배지에 총 100,000개의 세포를 시드한다.
- 세포를 37°C에서 몇 분 동안 배양한 다음, 4% 지하 멤브레인 매트릭스로 배지의 500 μL을 추가합니다. 14일 동안 5%CO2를 가진 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다. 시드 세포는 아시니와같은 구조를 생성하기 위해 그룹화되고 증식합니다.
참고: 세포 운동성 및 응집은 3D 형성 과정에서 시간 경과에 의해 모니터링될 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어(예: 피지/ImageJ 또는 Imaris)를 사용하여 이러한 이벤트를 평가합니다. 아시니의 수와 크기는 집계 과정과 증식속도에 따라 달라지며 세포 유형마다 다를 수 있다. 원하는 3D 구조를 얻기 위해 지하 막 매트릭스 농도 및 시드 세포를 조정합니다. - 매체의 500 μL을 초당 2~3회 지하 멤브레인 매트릭스로 추가합니다.
참고: 조작 하는 동안 접시를 부드럽게 들고 레이어의 방해를 방지 합니다. - 원하는 경우, 아시니의 수와 크기는 배양 기간 동안 측정될 수 있다. 이렇게하려면 위상 대비 또는 DIC 반전 현미경을 사용하여 시드 후 다른 시간에 임의의 사진을 찍습니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 100~200개의 3D 구조의 직경을 측정합니다.
- 실험 하루 전에 재료를 준비 : 4 °C에서 밤새 전 냉각 지하 멤브레인 매트릭스와 파이펫 팁, 미세 원심 분리기 튜브, 냉동고에서 냉각 잘 플레이트를 보자.
- 면역 염색
참고: 프로토콜의 이 부분에서는 멸균 조건이 필요하지 않습니다.- 배양 배지를 제거합니다.
- 끝이 잘라 p200 파이펫 팁을 사용하여 지하 멤브레인 매트릭스를 찢어. 유리 슬라이드 위에 분해 된 매트릭스의 ~50 μL을 놓고 1-2cm2의영역에 얼룩을 놓습니다.
- 시료를 실온에서 완전히 건조시키거나 37°C의 가열 판을 사용하여 공정을 가속화하십시오. 메탄올:아세톤(1:1, v/v)으로 샘플을 -20°C에서 30분 동안 수정합니다.
참고: 세포에 의해 발현된 형광 단백질과 같은 이전 마커의 형광 신호는 지워질 것입니다.
주의: 메탄올은 인화성, 흡입, 삼킨 경우 또는 피부와 접촉하는 경우에 독성이 있습니다. 개인 보호 장비를 착용하고 연기 후드 내부에서 작업하십시오. - 고정 용액을 버리고 필터 용지의 슬라이드를 기울임으로써 초과 를 제거합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 일단 건조되면, 슬라이드는 몇 달 동안 -20 °C에 저장할 수 있습니다. - 실온에서 2시간 동안 1x PBS(블로킹 용액)에서 일반 염소 세럼 5%, 트리톤-X-10000을 갖춘 샘플 에피토프를 차단합니다.
- 한편, 차단용액의 원하는 농도에서 1차 또는 이차 항체를 희석시킴으로써 항체 작업 용액을 준비한다.
참고: 항체 농도는 세포 유형 및 항체 참조에 따라 정확하게 조정되어야 합니다. 가이드로서, BPEC에서 발광 및 근피상선으로부터 세포를 식별하기 위해, 1차 항 세포근자(14) 및 항클라우렌-IV 항체(재료표참조)를 사용할 수 있다. 권장 작업 용액 농도는 이러한 1 차형 항체에 대해 1:100, 항마우스 및 항래빗 이차 항체의경우 1:500입니다(재료표 참조). - 1차 항체 작동 용액의 30 μL을 추가하고 증발을 피하기 위해 실험실 포장 필름 스트립으로 덮습니다. 습한 챔버에서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 1x PBS로 3회 세척하여 각각 1h로 세척합니다.
- 이차 항체에 대한 반복 단계 2.2.7. 인큐베이션은 어둠 속에서 수행되어야 합니다.
- 2 시간 동안 1 x PBS로 씻어.
참고: 항체 농도, 인큐베이션 시간 및 세척 경도를 조정하여 특정 시료의 신호/소음 비율을 개선합니다. - 나머지 PBS를 제거하고, 일단 건조하면, 안티페이드 장착 매체에서 희석 된 0.25 μg / mL에서 DAPI와 카운터 스테인. 압력을 가하지 않고 정착하게 하여 커버슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 매니큐어로 밀봉하십시오.
참고: 샘플은 몇 주 동안 4°C에서 저장할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 -20°C로 보관하십시오. - 공초점 현미경을 사용하여 각 아시누스에 대한 형광 신호 분포를 분석합니다.
참고: 공초점 현미경 구성은 사용되는 장비와 시료에 적용되는 항체에 따라 정확하게 결정되어야 합니다. 가이드로서, 재료의 표에상세한 장비 및 시약, 40배 목표 및 다음 레이저 및 검출기 설정을 사용: DAPI사용 여기에 405 레이저(3%-5%), PMT 검출기(800V)를 사용한 검출, 오프셋: -9) 및 스펙트럼 대역410 nm에서 500 nm까지; A488 (Claudin-IV)의 경우 488 레이저 (7 %-10%), PMT 검출기 (800V)로 감지된 채 운석을 사용하십시오. 오프셋: -20) 및 490 nm에서 550 nm까지의 스펙트럼 밴드; Cy3 (사이토케라틴 14)는 555 레이저 (2 %-10%), PMT 검출기 (800V, 오프셋 : -35) 및 560 nm에서 600nm까지 의 스펙트럼 밴드와 함께 흥분을 사용합니다.
3. 앵커리지 독립적 인 분석, MTT 염색 및 자동 식민지 정량화
- 앵커리지 독립적 분석: 한천 및 셀룰러 서스펜션 도금
참고: 2014년11일 Borowicz 등에서 BpEC에서 실험을 수행하기 위해 프로토콜이 적용되었습니다.- 멸균 병에 초순수에 희석된 1.2% 원고 용액을 준비한다. 용액을 자동 클로브하고 실험 중에 42 °C에서 유지관리합니다. 이 천용액은 4°C로 저장할 수 있습니다. 필요한 경우, 다시 액체가 될 때까지 천 용액을 가열합니다.
주의: 내열 장갑을 사용하여 오토클레이브 후 화상을 방지하십시오.
참고: 지금부터는 멸균 상태를 유지해야 합니다. - 1:1(v/v) 완전 사전 데운 매체를 1.2% 한천 용액으로 혼합하여 0.6% 한천 용액을 준비합니다. 조기 응고를 피하기 위해 42 °C에서 유지하십시오.
참고: 매체는 이전에 완전히 보충 된 0.6 % 한천 + 중간 용액을 한 번 혼합하기 위해 이중 보충 될 수 있습니다. - 중간 용액에서 0.6 %의 1.5 mL로 35mm의 바닥을 잘 덮고 실온에서 고화시키십시오. 플레이트의 바닥이 화고가 고화되기 전에 완전히 덮여 있는지 확인하십시오, 그렇지 않으면, 세포는 접시에 부착하고 단층에서 성장할 수 있습니다.
참고: 부착 및 비 부착 표면 플레이트를 사용할 수 있습니다. - 한편, 트립시뉴화하고, 원심분리되고 배지에서 재중단되면 50,000개의 세포/ml 용액을 준비하고 반복적으로 파이펫팅으로 모든 세포 덩어리를 부드럽게 분해합니다.
- 25,000세포/mL의 최종 농도에서 배지내 0.3% 천 /세포 현탁액을 준비한다.
참고: 최적의 세포 농도세포 유형 간에 다를 수 있습니다. 개별 식민지가 형성 될 때까지 다른 농도를 보십시오.- 40 μm 스트레이너 필터를 50mL 멸균 튜브 위에 놓고 50,000개의 셀/mL 용액을 필터링하여 튜브 바닥으로 떨어뜨립니다.
- 50mL 멸균 관에서 필터를 제거하고, 세포 함유 튜브를 45° 각도로 기울이고 튜브의 내부 벽을 통해 붓는 0.6% 천 +중간 용액의 동일한 부피를 떨어뜨립니다. 이렇게 하면 한천 용액이 세포를 손상시키지 않고 조기 응고를 피할 수 있을 만큼 식힐 수 있습니다.
- 혼합물을 균질화하고 이전에 고화된 바닥 천 층 위에 배지내0.3% 천 +세포 현탁액(25,000개의 세포 함유)의 혼합물및 침전물 1mL을 균일화한다.
- 반전된 현미경을 사용하여 종자 세포를 시각화하여 세포가 개별화되었는지 확인합니다. 그렇지 않으면 실험을 반복해야 합니다.
- 한천 층이 완전히 굳어질 때까지 기다린 다음, 아래 섬세한 한천 층을 방해하지 않고 신선한 배지 1mL을 조심스럽게 위에 넣습니다.
- 3주 동안 인큐베이터에서 세포를 37°C 및 5% CO2로 배양한다.
참고: 식민지 형성에 필요한 시간은 다른 세포 모형 에 따라 다를 수 있습니다, 그러나 일반적으로 3 주 는 충분합니다. - 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 이렇게하려면 접시를 부드럽게 기울여 아래 모서리에 매체를 흡인하고 신선한 매체 1 mL를 추가합니다.
참고: 접시에서 쉽게 분리할 때 한천 층을 만지지 마십시오.
- 멸균 병에 초순수에 희석된 1.2% 원고 용액을 준비한다. 용액을 자동 클로브하고 실험 중에 42 °C에서 유지관리합니다. 이 천용액은 4°C로 저장할 수 있습니다. 필요한 경우, 다시 액체가 될 때까지 천 용액을 가열합니다.
- MTT 염색
- 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 병 및 필터 용액의 초순수수에 티아졸리블루 테트라졸륨 브로마이움 브로마이드(MTT) 스톡 용액을 6mg/mL로 준비한다. 이 MTT 용액은 -20 °C에서 최대 6 개월 동안 저장할 수 있습니다.
주의: MTT는 자극을 일으킬 수 있으며 유전 적 결함을 일으키는 것으로 의심됩니다. 안전 안경, 장갑 및 호흡기 필터를 사용합니다.
참고: 반복되는 동결 해동 주기를 피하십시오. - 멸균 초순수로 스톡 용액을 희석하여 1 mg/mL에서 MTT의 작업 용액을 준비합니다.
- 식민지 형성 기간이 끝나면 플레이트에서 배지를 제거하고 각 우물에 1 mg /mL MTT의 1 mL을 추가하십시오.
- 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. MTT 용액을 부드럽게 흡입하여 제거합니다. 플레이트는 몇 주 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.
참고: 비특이적 결정 형성을 방지하기 위해 광 노출을 피하십시오.
- 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 병 및 필터 용액의 초순수수에 티아졸리블루 테트라졸륨 브로마이움 브로마이드(MTT) 스톡 용액을 6mg/mL로 준비한다. 이 MTT 용액은 -20 °C에서 최대 6 개월 동안 저장할 수 있습니다.
- 식민지 정량화
- 반전 된 현미경을 사용하여 각 플레이트의 이미지를 가져옵니다. 배율을 조정하여 더 적은 이미지로 최대 시야를 확보하고 작은 식민지(보통 4배 또는 10배 목표)를 감지할 수 있습니다.
참고: 이미지가 균일한 배경을 표시해야 합니다. 얼룩이 없는 식민지가 정량화되지 않기 때문에 위상 대비나 차동 간섭 대비가 필요하지 않습니다. - ImageJ/Fiji 소프트웨어12에 이미지를 업로드하여 식민지 수와 각 MTT 양성 식민지의 면적을 계산합니다.
참고: 자동 정량화를 위한 스크립트는 보충 파일로제공됩니다. 코드를 실행하려면 매크로 편집기(플러그인 | 붙여넣기 새로운 | 매크로)및 지침을 따르십시오.- 원본 이미지(이미지 | 임계값을 사용하여 이진 마스크를가져옵니다. 조정 | 임계값)잘 구분된 식민지를 얻기 위해(그림 1).
참고: 일반적으로 이 단계를 수행하려면 8비트 또는 16비트 이미지가 필요합니다. "최소 임계값" 메서드를 권장합니다. - 바이오볼셀 플러그인13(플러그인 |에서 확장 입자 분석기 실행 바이오볼셀 | 확장 입자 분석기)MTT 양성 식민지를 식별하기 위해(그림 2). 초기 안내 조건: 크기(μm2)= 250-인피니티; 견고성 = 0.75-1.00.
- 원본 이미지(이미지 | 임계값을 사용하여 이진 마스크를가져옵니다. 조정 | 임계값)잘 구분된 식민지를 얻기 위해(그림 1).
- 수식에 따라 각 콜로니 영역 값(A)의 평균 직경(D)을 추정합니다.
- 낮은 증식 식민지(예: 저직경)를 제외하여 결과를 필터링합니다.
- 고려될 주당 최소 구분수(m)를선택합니다(예: 1).
- 다음 수식에 따라 n 세포를 사용하여식민지(R)의반경을 추정합니다.
여기서, r은 현탁액에서 개별 세포의 평균 반경이며, n은 배양에서 w 주 동안 매주 m 분열을 겪은 식민지를 형성하는 세포의 수이다. 기하급수적 성장: n = 2(m *w). 포장 효율입니다. 임의의 움직임에서 포장 효율은 ~0.64이고 동일한 구체에 대한 가장 조밀한 포장 분획은 0.7414이다. - 그들의 세포가 단계 3.3.4.1에서 고려된 분열의 최소 수를 달성하지 않았기 때문에 2R 보다 낮은 직경을 제시하는 모든 식민지를 폐기하십시오.
- 반전 된 현미경을 사용하여 각 플레이트의 이미지를 가져옵니다. 배율을 조정하여 더 적은 이미지로 최대 시야를 확보하고 작은 식민지(보통 4배 또는 10배 목표)를 감지할 수 있습니다.
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Representative Results
BPECs에서 3개의 유전적 원소의 도입과 함께 세포 변환의 실험 모델은6,7(그림 3)의대표적인 결과를 생성하도록 선택되었다. 비변형 BPEC(N)는Ince 및동료에 의해 기술된 바와 같이 질병이 없는 유방 조직에서 유래되었다 6 여기에 표시된 프로토콜에 따라 배양되었다. STASIS를 극복한 후 (스트레스 또는 비정상적인 신호 유도-노화, 일반적으로 세포 배양 후 약 4 주 극복 되는 시험관 내의 유방 상피 세포에서 관찰 되는 현상), 세포는 연속적으로 렌티바이러스 입자 pRRL-CMV-IRES-EGFP 및 pRRL-CMV-TERT-변환-IFP를 획득 했다 D).바이러스 성 Ttag의 발현은 p53 및 망막 모세포종 기능을 억제하고, hTERT 유전자의 자궁 외 발현은 증식 의존형 텔로미어 길이 감소에 대한 보상. 세포 분류에 의한 형광 선택 후, 세포는 지속적인 미토겐성 신호를 부여하는 풍부한 CMV/TORasV12-Puro로 변환된 다음 항생제의 존재에서 성장하여 트랜스포닝된 세포를 선택합니다(트리플 트랜스포칭; T)이는 Ince와 동료6에따라 완전히 변형되었습니다.
도 4에도시된 바와 같이, 회귀선의 경사의 상승(방정식 1.2.3의 파라미터 b)은 BPEC(N :0.47, D: 0.93, T: 1.13)에 도입된 유전자 변형의 증가와 함께 관찰된다. 특정 간격동안,부분적으로(D)및 완전히 변형된(T)세포는 비변형 세포(N)에 비해 더많은 수의 인구 두 배를 달성하여, 따라서 세포 분열율은 변환 과정에 따라 증가하였다. 동일한 결과는 또한 수식 y = bx에서 1 (PD)로 y를 대체 한 후 얻을 수있는 세포의 집단(td)을복제하는 데 필요한 시간으로 표현 될 수 있으며, 따라서 td = 1/b. 경사와는 달리 td는 변환으로 감소합니다. 비 변형 된 세포는 그들의 인구를 복제하기 위해 2 일 이상 필요했지만(N: td = 2.13 일), 부분적으로 변형 된 세포는 절반 시간(D: td = 1.08 일)에서 그것을했다. 구성 프로모터의 규정에 따라 HRAS를 첨가하여 증식 활성및 세포가 본 종양유전자의 미토겐 활성에 합의하여복제(T: td = 0.89일) 미만이 필요하였다.
단층 세포 배양은 체외 세포 거동을 연구하는 유용한 도구이지만, 대부분의 생리적 조건을 재현할 수 없기 때문에 강하게 제한된 접근법이다. 대신, 여기서 설명된 3차원 세포 배양 기법은 셀 세포 및 세포 매트릭스 접합생성(도 5A)에의해 아시나르 구조를 형성하는 3D 환경에서 다른 계보로부터의 세포가 정확하게 응집및 움직일 수 있게 한다. 시간 경과). 다음 2 주 동안, 세포는 원래 조직 기능에 따라 분포하고 아시니 크기(도 5B)를증가 증식. 각 아시누스의 적절한 편광은 공초점 현미경검사법(도6A)에의한 3차원 신호 위치와 발광(Claudin-IV) 및 근피피톨리알(Cytokeratin 14) 계보 마커의 면역형광 검출의 조합덕분에 정확하게 평가될 수 있다. 비 변형 BPEC에 의해 형성된 모든 acini가 제대로 조직되었지만(키토케라틴 14 양성 세포에 둘러싸인 클라렌-IV 양성 세포; 도 6Ai),편광손실(도 6Aii)은부분적으로 완전히 변형된 BPEC(도6B)에의해 형성된 아시니에서 관찰되었다.
변형 된 세포의 주요 특성 중 하나는 기저 라미나와의 접촉의 독립성과 함께 성장하는 능력입니다. 이 성질은 3주 동안 한천에 내장된 세포를 성장시켜 플레이트 표면에 대한 앵커리지를 피함으로써 평가되었다(도7A). 다음 동안 3 주, 앵커리지 독립적 인 성장 능력을 가진 그 세포는 여러 세포로 구성된 식민지를 초래했다. 그림 8에도시된 바와 같이, 2일 후에 한천에서 씨를 뿌린 후, 일부 세포는 이미 2-3개의 분열을 겪었습니다. 1 주 후, 죽음과 같은 형태학을 가진 세포는 이 조건의 밑에 살아남을 수 없는 세포가 결국 아노이키스에의해 정지되었다는 것을 나타내는 관찰될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 일부 세포 분할 하 고 문화의 두 번째와 세 번째 주 동안 성장 하는 작은 식민지형성 계속.
배양에 MTT를 추가한 후, 그 세포만이 대사활성, 즉 살아있는, 24시간 후에 보라색 MTT 포르마잔 결정의 결과로 MTT의 테트라졸륨 링을 갈라낼 수 있다(도7B). 그러나, 이들 결정은 살아있는 세포를 가진 식민지뿐만 아니라 한 천에서 3주 후에도 살아있는 단일 세포에 의해 형성된다(그림9). 이 기술의 목적은 기판 독립적 인 방식으로 증식하는 세포의 능력을 결정하는 것입니다 때문에, MTT 양성 식민지의 크기를 평가 할 필요가있다. 콜로니 지름의 측정은 자동 이미지분석(도 7C)에의해 평가될 수 있으므로 작은 식민지 또는 개별화된 세포를 여과할 수 있다. 도 10에도시된 바와 같이, 회색 점은 3주 만에 3개 미만의 분열을 겪은 식민지에 해당하므로 직경의 65 μm 미만을 측정한다. 이러한 이벤트는 데이터 시각화에 포함되었지만 최종 정량화에서 제외되었습니다.
전반적으로, 이러한 결과는 앵커리지 독립 분석이 서로 다른 변형정도(그림 10)를구분할 수 있음을 나타낸다. 비 변형 BPEC에 의해 형성된 콜로니의 수는 부분적으로 완전히 변형된 BPEC(콜로니 넘버: N = 3;) 형성된 것과 비교하여 무시할 수 있었다; D = 278; T = 243). 또한, 식민지 크기를 고려했을 때, 부분적으로 완전히 변형 된 상태 사이의 차이가 분명해졌다 (식민지 중앙 크기 : N = 70 μm; D = 83 μm; T = 114 μm). 식민지 크기를 고려하면 연구 된 세포주의 종양 유발 잠재력에 관한 보다 정확한 정보를 제공하므로 고려하는 것이 좋습니다.
그림 1: 피지 소프트웨어를 사용하여 MTT 염색 후 이미지 임계값을 예시하는 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 피지 소프트웨어의 Biovoxxel 플러그인 조건 및 결과에서 확장 된 입자 분석기의 스크린 샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 세포 변환의 실험 모델의 회로도 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 변형되지 않은, 부분적으로 및 완전히 변형된 BpE의 확산 속도입니다. 선형 회귀의 가장 적합한 라인과 95% 신뢰 도선(점선)이 표시됩니다. 선형 회귀 모델에 대한 ANCOVA는 조건 간의 비교를 위해 적용되었다; * p-값 & 0.0001. 이 수치는 Repullés 등에서 적응되었습니다. 20197. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 지하 막 매트릭스에서 BPEC를 시드한 후 아시니 형성 및 성장. (A)지하 막 매트릭스에서 BPEC를 시드한 후 초기 시간 경과(0~7시간)의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 100 μm.(B) 아키니 크기는 비 변형, 부분적으로 및 완전히 변형된 BPEC를 위한 지하 멤브레인 매트릭스에서 14일간의 배양식에 걸쳐 있다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. 14일째 조건 간의 통계적 차이가 없습니다(편도 ANOVA 및 투키 보정; p-값 > 0.05). 이 수치는 Repullés 등에서 적응되었습니다. 20197. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 지하 막 매트릭스에서 3D 배양 후 비변형,부분적으로(D)및 완전히 변형된(T)BPEC에서 아시니 편광. (A)사이토케라틴 14(K14, 레드) 및 클라딘-IV(Cl-IV, 녹색) 면역형광 후 편광 및 비편광 아시누스의 대표적인 이미지. 편광 아시니 (i)는 세포케라틴 14 양성 세포가 클라렌-IV 양성 세포를 포위했을 때 고려되었다; 그렇지 않으면, 아시니는 사이토케라틴 14 및 클라렌-IV 양성 세포가 중간 및 주변 위치(ii)에 모두 위치했기 때문에 비편광으로 간주되었다. 스케일 바 = 25 μm.(B) 아시니 편광의 백분율. 각 조건에 대해 최소 10개의 아시니를 분석했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: BpEC의 앵커리지 독립적인 성장 분석에 사용되는 다양한 단계의 회로도 표현. 세포는 부드러운 한천(A)에서3주 동안 배양한 다음 MTT염색(B)을적용하였다. 스케일 바 = 5mm.(C)MTT 양성 식민지피지 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 이미지 처리에 대한 다양한 단계가 강조 표시됩니다. 스케일 바 = 200 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 8: 0.3% 한천에서 개별화된 세포를 시드한 후 3주 동안 세포 성장의 진화. 이미지는 부분적으로 변형된 BPEC 문화에서 획득됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: MTT 염색 및 정량화의 대표적인 이미지입니다. MTT 양성 식민지(행 1), MTT-음의 콜로니 2개(행 2) 및 MTT 염색(row 3)에 대한 단일 세포 양성 또는 음수를 가진 예가 도시된다. A는 MTT 양성 식민지 또는 세포의 영역을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 10: 비변형(N) 및 부분적으로 변형된(D)에서 앵커리지-독립적인 분석 후 콜로니 정량화및 완전히 변형된(T)BPEC. (A)상이한 조건에 대해 얻어진 콜로니의 수와 직경. 각 점은 하나의 식민지에 해당합니다. 연약한 회색 점은 MTT 양성 식민지를 나타내며, 이는 직경이 65 μm보다 낮았기 때문에 결과에서 제외되었습니다(방정식 번호 4를 적용하고 주당 적어도 하나의 분할을 고려한 후 고려되는 최소 크기). 빨간색 선은 각 그룹의 중앙값 콜로니 직경을 나타냅니다. 각 조건에 대해 두 개의 독립적인 복제본이 수행되었습니다. 다른 문자 (a, b, c)는 식민지 수에 대한 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다 (어부의 정확한 테스트; p-값& 0.05) 및 그들의 중앙지름에 대한 (여러 비교 보정크루스칼- 월리스 테스트; p-값 & 0.05). 이 그래프는 Repullés 등에서 적응되었습니다. 20197. (B)MTT 염색 후 전체 우물의 대표적인 이미지. 스케일 바 = 5mm; 인셋 스케일 바 = 2.5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문에 설명된 실험 프로토콜은 체외 배양 세포의 온코겐 변환을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 각 기술은 변환 프로세스의 특정 측면을 평가하므로 단일 분석에서 결론을 도출할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 성장 곡선 빌드업은 다른 목적을 위해 세포를 배양할 때 이미 사용할 수 있는 정보를 요구하는 접근 방식입니다. 즉, 이 기술은 다른 세포 증식 에세이에 비해 저렴하고 쉽게 적용 할 수 있습니다. 그러나 유효한 결과를 얻으려면 하위 배양 될 때마다 셀을 계산하고 파종 할 때 특별한주의를 기울여야합니다. 증가된 성장속도는세포변환(1)을나타내지만, 항생제 및 항진균물질의 첨가/제거 또는 배양 조건의 변화(예를 들어, 온도,CO2)와같은 다른 외인성 인자가 세포 분열에도 영향을 미칠 수 있기 때문에 단독으로 사용해서는 안 된다. 또한 약물을 가진 세포의 트랜스퍼션 또는 치료가 다가오는 일 또는 몇 주 안에 그들의 성장 속도에 영향을 미치고 따라서 장기 증식 용량의 왜곡된 보기를 줄 수 있다는 것을 고려하는 것이 중요합니다. 이와 관련하여 적절한 컨트롤을 수행해야 합니다.
지하 막 매트릭스의 3D 배양은 전체 기능적 실체 내에서 세포 분포의평가를 허용한다. 변경된 조직은 기능의 손실, 종양 조직의 특성으로 이끌어 낼 수 있는 세포 간 통신 손상의 표시입니다. 일부 acini가 비편광 조직을 제시한다는 사실은 일부 세포가 변환 프로세스를 시작했다는 것을 나타냅니다. 기술적 문제에 관해서는, 시드 세포의 최적 농도와 매트릭스의 농도를 정확하게 결정하는 것이 중요하다. 이 두 매개 변수는 결과 acini의 수와 크기에 영향을 줄 수 있으며 이로 인해 조직 용량이 방해될 수 있습니다. 또한 지하 막 매트릭스의 조작은 부드럽게 처리해야하므로 어느 정도의 경험이 필요합니다. 힘든 기술임에도 불구하고, 3차원의 세포의 성장은 이들 세포의 생리적 맥락과 유사하며, 유방 계보 마커7,15의 분포뿐만 아니라 지하막(16)의 중단과 같은종양적 특징에 대한 정보를 제공하는 다른 구조물의 평가를 가능하게 한다. 3D 세포 배양은 세포 배양 연구의 미래를 나타냅니다. 사실, 3D 성장은 마이크로 환경 요소를 고려하고 치료 대상의 식별 및 평가, 세포 상호 작용에 세포, 또는 줄기 세포 조사를 많이 제공하면서 더 생리적이고 흥미로운 결과를 초래할 수 있습니다.
부착 셀의 앵커리지 독립적 인 성장은 변환 과정의 명백한 치료입니다. 부분적으로 완전히 변형 된 BpEC 중 일부는 여전히 구조화 된 acinus를초래할 수 있었지만, 그들은 서스펜션에서 개별적으로 성장하도록 강요 할 때 식민지를 형성하는 능력을 나타낸다. 기술적 수준에서, 앵커리지 분석은 또한 단고 조작(예를 들어, 고온) 또는 트립시화 후 세포의 분리 중에 작은 변화가 세포 식민지 형성에 악명 높게 영향을 미칠 수 있기 때문에 복잡하다. 그러나, 요구되는 물질은 앵커리지 독립적 인 성장의 평가를 보다 저렴하게 만드는 3D 세포 배양에 사용되는 지하 막 매트릭스보다 저렴하다. 또한 MTT 가추가 되기 전에 단일 콜로니를 골라 서 부착된 표면이 있는 판에서 한천에서 자랄 수 있습니다. 이러한 식민지 는 현탁액에서 성장을 계속하거나 다시 부착 할 수있는 복제 세포주를 초래할 수 있습니다. DNA, RNA 및/또는 단백질은 추가 분석을 위해 이러한 세포 배양에서 추출될 수 있다.
여기에 설명된 방법에 대한 일반적인 제한이 있습니다: 그들은 매우 시간이 많이 걸리며 결과를 얻는 데 몇 주가 걸립니다. 그러나, 각 시험은 특정 종양 특성을 평가하기 때문에, 결과의 전체 세트를 고려한 결론은 아주 건전합니다. 따라서 세 가지 테스트모두 세포 변환의 강력한 지표입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
AG 연구소는 스페인 원자력 안전 위원회의 지원을 받습니다. T.A.와 A.G.는 일반 타탈룬야 (2017-SGR-503)에 의해 인식 연구 그룹의 구성원입니다. MT는 과학 재단 아소시아시온 에스파냐라 콘트라 엘 콘트라 엘 칸서 [AECC-INVES1902TERR]에 의해 투자 계약을 보유하고 있습니다. G.F. 계약은 셀렉스 재단의 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91001 | |
| 1.5 ml Eppendorfs | Thermo Fisher Scientific | 3451 | Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage |
| 10 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-0010 | |
| 100 ml glass bottle | With cap, autoclavable | ||
| 1000 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | LAB1000ULFNL | |
| 1000 μl Pipette tips w/o filter | Biologix | 20-1000 | |
| 15 ml Conical tubes | VWR | 525-0400 | |
| 2 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91002 | |
| 200 μl Pipette tips w/ filter | Labclinics | FTR200-96 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Labclinics | PLC91005 | |
| 50 ml Conical Tubes | VWR | 525-0304 | |
| Acetone | PanReac AppliChem | 211007 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Used for anchorage assay |
| Anti-Claudin 4 antibody | Abcam | 15104, RRID:AB_301650 | Working dilution 1:100, host: rabbit |
| Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody | Abcam | 9220, RRID:AB_307087 | Working dilution 1:100, host: mouse |
| Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody | Jackson ImmunoResearch Inc. | 115-165-146, RRID:AB_2338690 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034, RRID:AB_2576217 | Working dilution 1:500, host: goat |
| Autoclave | |||
| BioVoxxel Toolbox | RRID:SCR_015825 | ||
| Cell culture 24-well Plate | Labclinics | PLC30024 | Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom |
| Cell culture 6-well Plate | Labclinics | PLC30006 | Used for anchorage assay |
| Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2) | |||
| Cell Strainers | Fisherbrand | 11587522 | Mesh size: 40 μm |
| CellSense software | Olympus | Used to image acquisition | |
| Centrifuge | |||
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | Used to supplement cell culture medium |
| Class II Biological Safety Cabinet | Herasafe | HAEREUS HS12 | |
| Confocal inverted Microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Cover glasses | Witeg Labortechnik GmbH | 4600122 | 22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm |
| DAPI | 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine | ||
| Fetal Bovine Serum | Biowest | S1810 | Used to inactivate trypsine action |
| Fiji software (ImageJ) | National Institutes of Health | RRID:SCR_002285 | Free download, no license needed |
| Glass Pasteur Pipettes | |||
| Glass slides | Fisherbrand | 11844782 | |
| Goat Serum | Biowest | S2000 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Heat-Resistant Gloves | Used for agar manipulation after autoclave | ||
| Heater bath (37 ºC) | Used to temper solutions prior to cell subculture | ||
| Heater bath (42 ºC) | Used to keep agar warm | ||
| Heating plate | Used for Matrigel dehydration | ||
| Humid chamber | Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence | ||
| Ice | Used during Matrigel manipulation | ||
| Ice-box | |||
| Inverted Optic Microscope | Olympus | IX71 | |
| Matrigel Matrix | Becton Dickinson | 354234 | Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix |
| Methanol | PanReac AppliChem | 131091 | Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling |
| Micropipette | p1000, p200 and p10 | ||
| Microsoft Office Excel | Microsoft | RRID:SCR_016137 | Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation |
| MilliQ water | Referred to as ultrapure water | ||
| Nail Polish | Used to seal samples after mounting | ||
| Parafilm M | Bemis | PM-999 | Used to cover antibody solution during incubation |
| PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium) | Gibco | 10010-056 | Sterile. Used for cell subculture |
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417 | Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence |
| Pipette Aid | |||
| Primaria T25 flasks | Corning | 353808 | Used for BPEC culture |
| Scepter Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20060 | Alternatively, use an haemocytometer |
| Scissors | Used to cut pipette tips and parafilm | ||
| Sterile filters 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | Used to filter MTT solution |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M2128 | Store at -20 ºC |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used for immunofluorescence of 3D structures |
| Trypsin-EDTA 10X | Biowest | X0930 | Dilute in PBS to obtain 3X solution |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| WIT-P-NC Culture Medium | Stemgent | 00-0051 | Used for primary BPEC culture |
| WIT-T Culture Medium | Stemgent | 00-0047 | Used for transformed BPEC culture |
References
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