Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Summary

Ce protocole fournit des outils expérimentaux in vitro pour évaluer la transformation des cellules mammaires humaines. Des étapes détaillées pour le taux de prolifération cellulaire de suivi, la capacité de croissance ancre-indépendante, et la distribution des lignées cellulaires dans les cultures 3D avec la matrice de membrane de sous-sol sont décrites.

Abstract

Tumorigenesis est un processus en plusieurs étapes dans lequel les cellules acquièrent des capacités qui permettent leur croissance, survie et diffusion dans des conditions hostiles. Différents tests visent à identifier et quantifier ces caractéristiques des cellules cancéreuses; cependant, ils se concentrent souvent sur un seul aspect de la transformation cellulaire et, en fait, plusieurs tests sont nécessaires pour leur caractérisation appropriée. Le but de ces travaux est de fournir aux chercheurs un ensemble d’outils pour évaluer la transformation cellulaire in vitro d’un point de vue large, permettant ainsi de tirer des conclusions solides.

Une activation proliférative soutenue de signalisation est la principale caractéristique des tissus tumoraux et peut être facilement surveillée dans des conditions in vitro en calculant le nombre de doublons de population réalisés au fil du temps. En outre, la croissance des cellules dans les cultures 3D permet leur interaction avec les cellules environnantes, ressemblant à ce qui se passe in vivo. Ceci permet l’évaluation de l’agrégation cellulaire et, avec l’étiquetage immunofluorescent des marqueurs cellulaires distinctifs, d’obtenir l’information sur une autre caractéristique pertinente de la transformation tumorale : la perte de l’organisation appropriée. Une autre caractéristique remarquable des cellules transformées est leur capacité à croître sans attachement à d’autres cellules et à la matrice extracellulaire, qui peut être évaluée avec l’analyse d’ancrage.

Des procédures expérimentales détaillées pour évaluer le taux de croissance cellulaire, pour effectuer l’étiquetage immunofluorescent des marqueurs de lignée cellulaire dans les cultures 3D, et pour tester la croissance cellulaire indépendante de l’ancrage chez les agars mous sont fournies. Ces méthodologies sont optimisées pour les cellules épithéliales primaires du sein (BPEC) en raison de sa pertinence dans le cancer du sein; cependant, les procédures peuvent être appliquées à d’autres types de cellules après quelques ajustements.

Introduction

Plusieurs événements successifs sont nécessaires pour le développement du néoplasme. En 2011, Hanahan et Weinberg ont décrit 10 capacités qui permettent la croissance, la survie et la diffusion des cellules transformées : les « caractéristiques du cancer^{» 1}. La méthodologie décrite ici compile trois outils différents pour évaluer la transformation cellulaire in vitro en se concentrant sur certaines des caractéristiques distinctives des cellules tumorales. Ces techniques évaluent le taux de prolifération cellulaire, le comportement des cellules lorsqu’elles sont cultivés en 3D et leur capacité à former des colonies avec l’indépendance de l’ancrage.

Les modèles cellulaires sont essentiels pour tester l’hypothèse in vitro. Différentes approches ont été développées pour générer des modèles expérimentaux de transformation cellulaire pour l’étude du cancer^2,3,4. Étant donné que le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes dans le monde et est responsable d’environ 15% des décès par cancer chez^{les femmes 5}, fournir des modèles cellulaires appropriés de cellules épithéliales mammaires est de la plus haute importance pour une enquête plus approfondie. Dans cet article, nous avons illustré le potentiel de trois techniques pour évaluer la transformation cellulaire à l’aide d’un modèle expérimental de transformation des cellules épithéliales primaires du sein (BPECs) initialement décrite par Ince et ses collègues en 2007^{6 et} mise en œuvre ultérieurement dans notre^{laboratoire 7}. Ce modèle expérimental est basé sur l’altération séquentielle de trois gènes ciblés (SV40 Gros T et petits antigènes t ci-dessous appelés Ttag, hTERTet HRAS)au génome des BPECs non transformés. En outre, la méthode utilisée pour la dérivation bpecs favorise le maintien des cellules épithéliales mammaires avec des marqueurs luminaux ou myoepithelial, résultant en une culture cellulaire hétérogène qui conserve certains des traits physiologiques de la glande mammaire.

Dans la glande mammaire, les cellules épithéliales mammaires luminaires, qui sont responsables de la production laitière, sont situées près du lumen, tandis que les cellules myoepitheliales sont éliminées autour des cellules luminaires et prennent soin des mouvements de contraction menant le lait au mamelon. La perte de l’organisation appropriée entre ces lignées cellulaires est une caractéristique de la transformation tumorale^{8 qui} peut être évaluée in vitro après détection immunofluorescente des marqueurs distinctifs de lignée dans les cultures cellulaires 3D. Une autre caractéristique majeure des cellules tumorales est leur capacité à croître sans attachement à d’autres cellules et à la matrice extracellulaire¹. Lorsque les cellules saines sont forcées de croître en suspension, des mécanismes tels que anoikis \u2012 un type de mort cellulaire induite en réponse au détachement de la matrice extracellulaire \u2012 sont activés⁹. L’évasion de la mort cellulaire est l’une des caractéristiques distinctives du cancer et, par conséquent, les cellules transformées sont capables d’inactiver les anoikis et de survivre d’une manière indépendante de l’ancre. Cette capacité peut être évaluée in vitro avec l’analyse indépendante de l’ancrage à l’aide d’une agar molle. En outre, une caractéristique inhérente des tissus tumoraux est leur capacité de signalisation proliférative soutenue, qui peut être facilement surveillée dans des conditions in vitro en mesurant l’augmentation du nombre de cellules le long du temps, non seulement dans les tests de suspension, mais aussi en surveillant le taux de croissance des cultures adhérentes monocouches.

En dépit du meilleur modèle pour tester le potentiel tumorigenic est l’inoculation des cellules tumorales dans les modèles murins et l’évaluation du développement de tumeur in situ, il est important de réduire au minimum le nombre d’animaux employés dans les procédures expérimentales autant que possible. Par conséquent, avoir des tests appropriés pour évaluer la transformation in vitro est une priorité absolue. Ici, nous fournissons un ensemble d’outils pour évaluer le potentiel tumoriogène des cellules épithéliales du sein partiellement et entièrement transformées qui peuvent être facilement mises en œuvre dans la plupart des laboratoires qui travaillent avec des modèles de transformation cellulaire.

Protocol

Des échantillons humains utilisés dans les expériences suivantes ont été obtenus à partir de mammoplasties de réduction réalisées à Clínica Pilar Sant Jordi (Barcelone) sous le consentement standard de la procédure. Toutes les procédures sont effectuées dans un cabinet de sécurité biologique de classe II, sauf indication contraire.

1. Culture in vitro des cellules épithéliales mammaires humaines et accumulation de parcelles courbes de croissance

1. Culture in vitro des cellules épithéliales primaires du sein (BPECs) : passage cellulaire
   REMARQUE : Pour la dérivation et la culture cellulaire du BPEC, suivez les instructions décrites par Ince et coll., 2007⁶.
   1. Préparation moyenne.
      1. Supplément WIT milieu basal défini avec des suppléments de P ou T, fournis par le fabricant, selon que les BPECs primaires ou transformés sont cultivés.
      2. Ajouter la toxine du choléra au milieu wit complété à une concentration finale de 100 ng/mL pour les BPECs primaires ou de 25 ng/mL pour les BPECs transformés.
         ATTENTION : La toxine du choléra est mortelle si elle est avalée. Utilisez de l’équipement de protection individuelle. Évitez sa libération dans l’environnement.
   2. Entretien et passage de la culture cellulaire.
      REMARQUE : Pour les étapes suivantes, gardez à l’esprit que les cellules poussent dans un flacon T25. Néanmoins, les volumes peuvent être adaptés à d’autres formats de culture cellulaire en conservant la proportionnalité en termes de surface.
      1. Vérifiez la confluence cellulaire tous les jours. Lorsque la culture est 90% confluente, effectuer le passage cellulaire.
      2. Acquérir 1x PBS, trypsine 3x, moyenne et un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de sérum bovin fœtal (FBS) pour chaque flacon.
      3. Retirez le milieu du flacon et gardez-le dans le tube conique de 15 mL contenant du FBS.
      4. Rincer les cellules avec 1x PBS.
      5. Détachez les cellules de la surface en ajoutant 1 mL de trypsine 3x. Incuber pendant 5 min à 37 °C.
      6. Vérifiez si les cellules ont été détachées. Appliquer des secousses vigoureuses si les cellules ne sont pas complètement détachées.
      7. Inactivez la trypsine en ajoutant le milieu réservé complété par FBS.
      8. Récoltez la suspension cellulaire et placez-la dans le tube conique de 15 mL.
      9. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min, éliminer le supernatant, et resuspendre les cellules granulées en feuilletant le fond du tube avec un doigt.
      10. Ajouter 1 à 2 mL de médias frais à la pastille et mesurer la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatique ou d’un hémocytomètre. Ces données seront ensuite utilisées pour calculer le doublement de la population et tracer la courbe de croissance. Graine 12 000 cellules/cm² (p. ex., 300 000 cellules pour un flacon T25) dans des flacons de surface de culture cellulaire modifiée (voir tableau des matériaux).
          REMARQUE : Diluer la solution de suspension cellulaire si la concentration est trop élevée pour assurer une quantification adéquate.
      11. Ajouter du milieu à un volume final de 5 mL et incuber les cellules à 37 °C et 5 % d’atmosphère de CO_2.
      12. Remplacer le milieu de culture cellulaire toutes les 48 h.
2. Calcul du doublement de la population et visualisation des données
   1. À l’aide des données du nombre de cellules obtenues au cours de l’étape 1.1.2.10, appliquez la formule suivante pour obtenir les valeurs de doublement de la population accumulée :
      
      Lorsque, PD_{i désigne} le nombre de doublements de population atteints par les cellules jusqu’à la sous-culture précédente (il se réfère à la MP accumulée sur la sous-culture précédente), Nh_{est le} nombre de cellules récoltées, et Ns_{est le} nombre de cellules ensemencées.
   2. Représenter les données pour un intervalle de temps spécifique à l’aide d’un graphique XY où le nombre de jours en culture(x-axe)et la accumulée(y-axe)sont représentés.
   3. Obtenez la ligne la mieux adaptée et l’équation d’ajustement :
      
      REMARQUE : Une pente accrue b) signifie un taux de prolifération accru.

2. Culture tridimensionnelle (3D) dans la matrice membranaire du sous-sol et la détection des protéines immunofluorescentes

1. Culture 3D dans la matrice membranaire du sous-sol
   REMARQUE : Ce protocole a été adapté de Debnath et coll., 2003¹⁰ et est optimisé pour 24 plaques de puits (voir Tableau des matériaux).
   1. Préparez le matériau un jour avant l’expérience : pré-refroidissement de la matrice membranaire du sous-sol pendant la nuit à 4 °C et laissez refroidir les pointes de pipette, les tubes de microcentrifugeuse et les plaques de puits dans le congélateur.
      REMARQUE : La matrice doit être maintenue à -20 °C pour le stockage à long terme. Faire des aliquots pour éviter plusieurs cycles de gel-dégel.
   2. Le jour de l’expérience, placez du matériel pré-refroidi sur la glace.
   3. Rincer les puits à l’aide d’un 1x PBS stérile à froid afin de réduire la tension de surface.
   4. Couvrir le fond de chaque puits de 100 μL de matrice membranaire du sous-sol.
      REMARQUE : Distribuez lentement la matrice et étalez-la dans tout le puits; il est crucial d’éviter la formation de bulles dans la couche inférieure pour éviter la croissance de la culture cellulaire monocouche.
   5. Placez la plaque dans l’incubateur, à 37 °C, pour laisser la couche matricielle se solidifier.
      REMARQUE : Il faut habituellement environ 20 min pour se solidifier.
   6. Pendant ce temps, trypsinize cellules comme expliqué précédemment dans l’étape 1.1. Centrifugeuse les cellules à 500 x g pendant 5 min et resuspendre à moyen. Préparer une suspension de 400 000 cellules/mL et désaggréger délicatement toute touffe cellulaire par pipetting.
   7. Préparer le milieu avec une matrice membranaire de sous-sol de 8 % et mélanger 1:1 (v/v) avec une suspension cellulaire pour obtenir une solution de 200 000 cellules/mL dans une matrice de 4 %.
      REMARQUE : Calculez la quantité de milieu nécessaire pour éviter les déchets inutiles de matrice.
   8. Placez 500 μL de suspension cellulaire dans la solution matricielle au-dessus de la couche matricielle déjà solidifiée pour ensemencer une quantité totale de 100 000 cellules en moyenne avec une matrice membranaire de sous-sol de 4 %.
   9. Incuber les cellules à 37 °C pendant quelques minutes, puis ajouter 500 μL du milieu avec une matrice membranaire de sous-sol de 4 %. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur avec 5 % de CO₂ pendant 14 jours. Les cellules ensemencées se regroupent et prolifèrent pour être à l’origine des structures acini-like.
      REMARQUE : La motilité et l’agrégation cellulaires peuvent être surveillées par time-lapse pendant le processus de formation 3D. Utilisez un logiciel d’analyse d’images (p. ex., Fidji/ImageJ ou Imaris) pour évaluer ces événements. Le nombre et la taille de l’acini dépendent du processus d’agrégation et du taux de prolifération et peuvent varier d’un type de cellule à l’autre. Ajuster la concentration de la matrice membranaire du sous-sol et les cellules ensemencées pour obtenir les structures 3D souhaitées.
   10. Ajouter 500 μL du milieu avec une matrice membranaire de sous-sol de 4 % 2 à 3 fois par semaine.
       REMARQUE : Évitez les perturbations des couches portant doucement la plaque pendant la manipulation.
   11. Si vous le souhaitez, le nombre et la taille de l’acini peuvent être mesurés pendant la période de culture. Pour ce faire, prenez des photos aléatoires à différents moments après l’ensemencement à l’aide d’un contraste de phase ou d’un microscope inversé DIC. Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour mesurer le diamètre des structures 3D de 100 à 200.
2. Immunomarquage
   REMARQUE : Les conditions stériles ne sont pas requises pendant cette partie du protocole.
   1. Supprimer le milieu de culture.
   2. Déchirer la matrice membranaire du sous-sol à l’aide d’une pointe de pipette p200 avec l’extrémité coupée. Placez ~50 μL de matrice désagrégée sur une lame de verre et enduitez-la dans une zone de 1-2 cm².
   3. Laissez sécher complètement l’échantillon à température ambiante ou utilisez une plaque chauffante à 37 °C pour accélérer le processus. Fixer les échantillons avec du méthanol: acétone (1:1, v/v) à -20 °C pendant 30 min.
      REMARQUE : Le signal fluorescent des marqueurs précédents, comme celui des protéines fluorescentes exprimées par les cellules, sera effacé.
      MISE EN GARDE : Le méthanol est inflammable, toxique s’il est inhalé, avalé ou au cas où il entre en contact avec la peau. Portez de l’équipement de protection individuelle et travaillez à l’intérieur d’un capot à fumée.
   4. Jetez la solution de fixation et retirez l’excédent, le cas échéant, en inclinant la glissière sur du papier filtre.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Une fois sèches, les glissières peuvent être stockées à -20 °C pendant plusieurs mois.
   5. Les échantillons de blocs épitopes avec 5% de sérum de chèvre normal et 0,1% triton-X-100 en 1x PBS (solution de blocage) pendant 2 h à température ambiante.
   6. Pendant ce temps, préparer des anticorps solutions de travail en diluant les anticorps primaires ou secondaires à la concentration désirée dans la solution de blocage.
      REMARQUE : La concentration d’anticorps doit être ajustée avec précision en fonction du type de cellule et de la référence des anticorps. À titre de guide, pour identifier les cellules des lignées luminales et myoepitheliales dans BPEC, l’anti cytokératine primaire 14 et les anticorps anti-Claudin-IV (voir tableau des matériaux)peuvent être utilisés. La concentration recommandée de solution de travail est de 1:100 pour ces anticorps primaires et de 1:500 pour les anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin (voir tableau des matériaux).
   7. Ajouter 30 μL d’anticorps primaires solution de travail et le couvrir avec une bande de film d’emballage de laboratoire pour éviter l’évaporation. Incuber toute la nuit à 4 °C dans une chambre humide.
   8. Laver trois fois avec 1x PBS pendant 1 h chacun.
   9. Répétez l’étape 2.2.7 pour les anticorps secondaires. L’incubation doit être effectuée dans l’obscurité.
   10. Laver avec 1x PBS pendant 2 h.
       REMARQUE : Ajustez la concentration des anticorps, le temps d’incubation et la dureté du lavage afin d’améliorer le rapport signal/bruit pour des échantillons spécifiques.
   11. Retirer le PBS restant et, une fois sec, contre-détenir avec dapi à 0,25 μg/mL dilué dans un milieu de montage antifade. Couvrir les diapositives d’un coverslip en le laissant s’installer sans appliquer de pression. Sceller avec du vernis à ongles.
       REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés à 4 °C pendant plusieurs semaines. Pour un stockage à long terme, gardez-les à -20 °C.
   12. Analyser la distribution du signal fluorescent pour chaque acinus à l’aide d’un microscope confocal.
       REMARQUE : La configuration du microscope confocal doit être déterminée avec précision en fonction de l’équipement utilisé et des anticorps appliqués à l’échantillon. À titre de guide, avec l’équipement et les réadageurs détaillés dans le tableau des matériaux, utilisez un objectif 40x et les paramètres laser et détecteur suivants: pour l’excitation utilisation DAPI avec un laser 405 (3%-5%), détection avec un détecteur PMT (800V, Offset: -9) et une bande spectrale de 410 nm à 500 nm; pour l’A488 (Claudin-IV) utiliser excitation avec un laser 488 (7%-10%), détection avec un détecteur PMT (800V, Offset: -20) et une bande spectrale de 490 nm à 550 nm; et pour Cy3 (Cytokeratin 14) utiliser excitation avec un laser 555 (2%-10%), détection avec un détecteur PMT (800V, Offset: -35) et une bande spectrale de 560 nm à 600 nm.

3. Analyse indépendante d’Anchorage, coloration de MTT et quantification automatique de colonie

1. Analyse indépendante de l’ancrage : placage d’agar et de suspension cellulaire
   REMARQUE : Le protocole a été adapté de Borowicz et coll., 2014¹¹ pour effectuer des expériences dans les BPECs.
   1. Préparer une solution d’agar de 1,2 % diluée dans de l’eau ultrapure dans une bouteille stérile. Autoclavez la solution et maintenez-la à 42 °C pendant l’expérience. La solution d’agar peut être stockée à 4 °C; au besoin, chauffer la solution d’agar jusqu’à ce qu’elle soit à nouveau liquide.
      ATTENTION : Utilisez des gants résistants à la chaleur pour éviter les brûlures après l’autoclave.
      REMARQUE : Désormais, les conditions stériles doivent être maintenues.
   2. Préparez une solution d’agar de 0,6 % en mélangeant 1:1 (v/v) milieu préchauffé complet avec une solution d’agar de 1,2 %. Maintenir à 42 °C pour éviter une solidification prématurée.
      REMARQUE: Moyen peut être préalablement double complété pour obtenir un entièrement complété 0,6% agar + solution moyenne une fois mélangé.
   3. Couvrez le fond d’un puits de 35 mm avec 1,5 mL d’agar de 0,6 % en solution moyenne et laissez-le se solidifier à température ambiante. Assurez-vous que le fond de la plaque est complètement couvert avant la solidification de l’agar, sinon, les cellules peuvent adhérer à la plaque et se développer en monomeuse.
      REMARQUE : Des plaques de surface adhérentes et non adhérentes peuvent être utilisées.
   4. Pendant ce temps, trypsiniser les cellules et, une fois centrifugées et résuspendées en milieu, préparer une solution de 50 000 cellules/ml et désaggréger délicatement n’importe quelle touffe cellulaire par pipetting à plusieurs reprises.
   5. Préparer une suspension de 0,3% d’agar + cellule dans le milieu à une concentration finale de 25.000 cellules/mL.
      REMARQUE : La concentration optimale de cellules peut différer d’un type de cellule à l’autre. Essayez différentes concentrations jusqu’à formation de colonies individualisées.
      1. Placez un filtre de passoire de 40 μm sur un tube stérile de 50 mL et filtrez la solution de 50 000 cellules/mL en la laissant tomber au fond du tube.
      2. Retirez le filtre du tube stérile de 50 mL, inclinez le tube contenant des cellules à un angle de 45° et laissez tomber le même volume de 0,6% d’agar + solution moyenne le déversant à travers la paroi interne du tube. Cela permettra à la solution d’agar de refroidir juste assez pour ne pas endommager les cellules et éviter sa solidification prématurée.
   6. Homogénéiser le mélange et déposer 1 mL de 0,3% d’agar + suspension cellulaire dans le milieu (contenant 25.000 cellules) sur le dessus de la couche d’agar inférieur précédemment solidifié.
   7. Visualisez les cellules ensemencées à l’aide d’un microscope inversé pour s’assurer que les cellules sont individualisées. Sinon, l’expérience doit être répétée.
   8. Attendez que la couche d’agar soit complètement solidifiée, puis ajoutez soigneusement 1 mL du milieu frais sur le dessus sans déranger les couches délicates d’agar en dessous.
   9. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur pendant 3 semaines.
      REMARQUE : Le temps requis pour la formation des colonies peut varier d’un type de cellule à l’autre, mais habituellement 3 semaines sont suffisantes.
   10. Changez moyen deux fois par semaine. Pour ce faire, inclinez doucement la plaque vers vous, aspirez le milieu dans le coin inférieur et ajoutez 1 mL de milieu frais.
       REMARQUE : Évitez de toucher les couches d’agar car elles se détachent facilement de la plaque.
2. Coloration MTT
   1. Préparer la solution de bouillon thiazolyl bleu tetrazolium bromure (MTT) à 6 mg/mL dans de l’eau ultrapure dans une bouteille stérile et une solution de filtre à l’aide de filtres de 0,2 μm. Cette solution MTT peut être stockée jusqu’à 6 mois à -20 °C.
      ATTENTION: MTT peut causer une irritation et est soupçonné de causer des défauts génétiques. Utilisez des lunettes de sécurité, des gants et un filtre respiratoire.
      REMARQUE : Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
   2. Préparer une solution de travail de MTT à 1 mg/mL en diluant la solution de stock avec de l’eau ultrapure stérile.
   3. Une fois la période de formation de la colonie terminée, retirer le milieu de la plaque et ajouter 1 mL de 1 mg/mL de MTT à chaque puits.
   4. Incuber pendant 24 h dans l’incubateur. Retirez la solution MTT en l’aspirant doucement. Les plaques peuvent être conservées à 4 °C pendant plusieurs semaines.
      REMARQUE : Évitez l’exposition à la lumière pour prévenir la formation de cristaux non spécifiques.
3. Quantification des colonies
   1. Obtenez des images de chaque plaque à l’aide d’un microscope inversé. Ajustez le grossissement afin d’acquérir le champ de vision maximum avec moins d’images tout en étant capable de détecter de petites colonies (généralement des objectifs 4x ou 10x).
      REMARQUE : Assurez-vous que les images présentent un arrière-plan homogène. Ni le contraste de phase ni le contraste différentiel n’est nécessaire puisque les colonies non tachées ne seront pas quantifiées.
   2. Téléchargez des images sur le logiciel ImageJ/Fiji¹² pour compter le nombre de colonies et la superficie de chaque colonie positive au MTT.
      REMARQUE : Un script pour la quantification automatique est fourni sous forme de fichier supplémentaire. Pour exécuter le code, coller à l’éditeur macro(Plugins | Nouveau | Macro) et suivez les instructions.
      1. Obtenez un masque binaire en seuilant l’imaged’origine (Image | Ajuster | Seuil) pour obtenir des colonies bien délimitées (figure 1).
         REMARQUE : Des images 8 ou 16 bits sont généralement nécessaires pour effectuer cette étape. La méthode du « seuil minimum » est recommandée.
      2. Exécutez l’analyseur de particules étendus à partir du plugin Biovoxxel¹³ (Plugins | BioVoxxel | Analyseur de particules étendu) pour identifier les colonies positives du MTT( figure 2). Conditions directrices initiales : Taille (μm²) = 250-Infinity; Solidité = 0,75-1,00.
   3. Estimer le diamètre moyen (D) de chaque valeur de la zone de la colonie (A) selon la formule :
      
   4. Filtrer les résultats en excluant les colonies proliférantes faibles (p. ex., faible diamètre).
      1. Choisissez un nombre minimum de divisions par semaine(m)à considérer (p. ex., 1).
      2. Estimer le rayon d’une colonie (R) avec des cellules n selon la formule suivante:
         
         Où, r est le rayon moyen des cellules individuelles en suspension, n est le nombre de cellules formant une colonie qui a souffert de divisions m chaque semaine pendant les semaines w dans la culture. En croissance exponentielle : n = 2^(m*w). c’est l’efficacité de l’emballage. Notez que, dans le mouvement aléatoire, l’efficacité de l’emballage est ~0.64 et la fraction d’emballage la plus dense possible pour les sphères identiques est de 0.74¹⁴.
      3. Jetez toutes les colonies qui présentent un diamètre inférieur à 2R car leurs cellules n’ont pas atteint le nombre minimum de divisions considérées à l’étape 3.3.4.1.

Representative Results

Un modèle expérimental de transformation cellulaire avec l’introduction de trois éléments génétiques dans les BPEC a été choisi pour générer des résultats représentatifs de la transformation^{oncogène 6,7} (Figure 3). Les BPECs non transformés (N) ont été dérivés du tissu mammaire sans maladie tel que décrit par Ince et ses^{collègues 6} et cultivés suivant le protocole indiqué ici. Après avoir surmonté le STASIS (stress ou signalisation aberrante induite-sénescence, phénomène typiquement observé dans les cellules épithéliales mammaires in vitro qui est surmonté environ 4 semaines après l’établissement de la culture cellulaire), les cellules ont été transduced consécutivement avec les particules lentiviral pRRL-CMV-Ttag-IRES-eGFP et pRRL-CMV-TERT-IRES-CherryFP pour obtenir des cellules partiellement transformées (double transduced; D). L’expression du Ttag viral inhibe la fonction p53 et le rétinoblastome, et l’expression ectopique du gène hTERT compense l’attrition de longueur de telomere dépendante de prolifération. Après sélection fluorescente par tri cellulaire, les cellules ont été transduced avec pLenti-CMV/TORasV12-Puro, qui confère un signal mitogenic soutenu, et puis croissance en présence d’antibiotiques pour sélectionner les cellules transduced (triple transduced ; T), qui ont été entièrement transformés selon Ince et ses collègues⁶.

Comme le montre la figure 4, on observe une augmentation de la pente de la ligne de régression (paramètre b dans l’équation 1.2.3) avec le nombre croissant de modifications génétiques introduites dans bpec (N: 0,47, D: 0,93, T: 1,13). Pendant un intervalle de temps spécifique, partiellement (D) et entièrement transformé (T) cellules ont atteint un nombre plus élevé de doublements de population par rapport aux cellules non transformées ( N ),ainsile taux de division cellulaire a été augmenté avec le processus de transformation. Le même résultat peut également être exprimé comme le temps nécessaire pour dupliquer la population_{de cellules}(t d ), qui peut être obtenue après le remplacement y par 1 (PD) dans l’équation y = bx, donc t_d = 1/b. Contrairement à la pente, t_d diminue avec la transformation. Alors que les cellules non transformées avaient besoin de plus de 2 jours pour dupliquer leur population (N: t_d = 2,13 jours), les cellules partiellement transformées l’ont fait en deux fois moins de temps (D: t_d = 1,08 jours). L’ajout de HRAS en vertu de la réglementation d’un promoteur constitutif a conduit à une activité de prolifération accrue et les cellules ont eu besoin de moins d’un jour pour dupliquer (T: t_d = 0,89 jours) en accord avec l’activité mitogénique de cet oncogène.

Bien que la culture cellulaire monocouche soit un outil utile pour étudier le comportement des cellules in vitro, il s’agit d’une approche fortement limitée parce qu’elle ne peut pas reproduire la plupart des conditions physiologiques. Au lieu de cela, la technique tridimensionnelle de culture cellulaire décrite ici permet aux cellules de différentes lignées de s’agréger et de se déplacer librement dans un environnement 3D formant des structures acinaires grâce à la création de cellules cellulaires et de jonctions cellulaires(figure 5A. Time-lapse). Au cours des 2 semaines suivantes, les cellules se répartir en fonction de leur fonction tissulaire d’origine et proliférer en augmentant la taille de l’acini ( Figure5B). La polarisation appropriée de chaque acinus peut être évaluée avec précision grâce à la combinaison de la détection immunofluorescente des marqueurs de lignée luminaire (Claudin-IV) et myoepithelial (Cytokératine 14) avec emplacement tridimensionnel du signal par microscopie confocale(figure 6A). Tandis que tous les acini formés par les BPECs non transformés ont été correctement organisés (cellules positives de Claudin-IV entourées par cytokeratine 14 cellules positives ; Figure 6Ai), perte de polarisation (Figure 6Aii) a été observée chez acini formé par des BPECs partiellement et entièrement transformés (Figure 6B).

Une des principales propriétés d’une cellule transformée est sa capacité à croître avec l’indépendance du contact avec le lamina basal. Cette propriété a été évaluée en cultivant les cellules encastrées sur l’agar pendant 3 semaines, en évitant son ancrage à la surface de la plaque (Figure 7A). Au cours des 3 semaines suivantes, les cellules ayant une capacité de croissance indépendante de l’ancrage ont donné naissance à des colonies composées de cellules multiples. Comme le montre la figure 8,2 jours après avoir été ensemencées en agar, certaines cellules ont déjà souffert de 2 à 3 divisions. Après 1 semaine, des cellules avec la morphologie mort-comme peuvent être observées indiquant que les cellules qui ne sont pas capables de survivre dans ces conditions sont par la suite mortes, très probablement par anoikis. Néanmoins, certaines cellules continuent de diviser et de former de petites colonies qui poussent au cours des deuxième et troisième semaines de culture.

Après avoir ajouté le MTT à la culture, seules les cellules métaboliquement actives, c’est-à-dire vivantes, sont capables de fendre l’anneau de tétrazolium du MTT, ce qui entraîne des cristaux violets de formazan MTT 24 heures plus tard (figure 7B). Cependant, ces cristaux ne sont pas seulement formés par des colonies avec des cellules vivantes, mais aussi par des cellules individuelles encore vivantes après 3 semaines dans l’agar (Figure 9). Puisque le but de cette technique est de déterminer la capacité des cellules à proliférer d’une manière indépendante du substrat, la taille des colonies mtt-positives doit être évaluée. La mesure du diamètre de la colonie peut être évaluée par analyse automatique de l’image(figure 7C)afin que les petites colonies ou les cellules individualisées puissent être filtrées. Comme le montre la figure 10,les points gris correspondent aux colonies qui ont subi moins de trois divisions en 3 semaines, mesurant ainsi moins de 65 μm de diamètre. Ces événements ont été inclus dans la visualisation des données, mais exclus de la quantification finale.

Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que l’analyse de l’indépendance d’ancrage permet de discriminer entre les différents degrés de transformation (figure 10). Le nombre de colonies formées par des BPEC non transformés était négligeable par rapport à ceux formés par des BPECs partiellement et entièrement transformés (nombre de colonies : N = 3; D = 278; T = 243). De plus, lorsque la taille de la colonie a été prise en considération, les différences entre les États partiellement et entièrement transformés sont devenues évidentes (taille médiane de la colonie : N = 70 μm; D = 83 μm; T = 114 μm). La prise en compte de la taille de la colonie fournit des informations plus précises sur le potentiel tumoriogène des lignées cellulaires étudiées et il est donc fortement recommandé de l’envisager.

Figure 1 : Capture d’écran ilplifiant le seuil d’image après la coloration du MTT à l’aide du logiciel Fidji. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Capture d’écran de l’analyseur de particules étendues des conditions et des résultats du plugin Biovoxxel dans le logiciel fidjien. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Représentation schématique du modèle expérimental de transformation cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Taux de prolifération dans les BPEC non transformés, partiellement et entièrement transformés. Les lignes les mieux adaptées et les bandes de confiance à 95 % (lignes pointillées) de la régression linéaire sont affichées. ANCOVA pour un modèle de régression linéaire a été appliqué pour la comparaison entre les conditions; * p-value < 0.0001. Ce chiffre a été adapté de Repullés et coll. 2019⁷. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Formation et croissance d’Acini après l’ensemencement des BPECs dans la matrice membranaire du sous-sol. (A) Images représentatives d’un laps de temps pour les heures initiales (de 0 à 7 heures) après l’ensemencement bpecs dans la matrice membranaire du sous-sol. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Taille d’Acini au cours des 14 jours de culture dans la matrice membranaire du sous-sol pour le BPEC non transformé, partiellement et entièrement transformé. Les barres d’erreur indiquent SEM. Aucune différence statistique entre les conditions du jour 14 (correction à sens unique d’ANOVA et de Tukey; p-valeur > 0,05). Ce chiffre a été adapté de Repullés et coll. 2019⁷. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Polarisation d’Acini dans les BPECs non transformés, partiellement (D),et entièrement transformés(T)après culture 3D dans la matrice membranaire du sous-sol. (A) Images représentatives d’un acinus polarisé et non polarisé après l’immunofluorescence de cytokératine 14 (K14, rouge) et de Claudin-IV (Cl-IV, vert). L’acini polarisé (i) a été considéré quand cytokeratin 14 cellules positives ont entouré des cellules positives de Claudin-IV ; autrement, acini ont été considérés non polarisés puisque cytokeratin 14 et cellules positives de Claudin-IV ont été localisées dans les emplacements moyens et périphériques (ii). Barre d’échelle = 25 μm. (B) Pourcentage d’acini polarisé. Un nombre minimum de 10 acini ont été analysés pour chaque condition. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Représentation schématique des différentes étapes utilisées pour l’analyse de croissance indépendante de l’ancrage dans les BPEC. Les cellules ont été cultivés pendant 3 semaines dans l’agar mou (A) et puis la coloration de MTT a été appliquée (B). Barre d’échelle = 5 mm. ( C )Colonies positivesMTT ont été quantifiées à l’aide du logiciel Fidji. Différentes étapes du traitement d’image sont mises en évidence. Barre d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Évolution de la croissance cellulaire pendant 3 semaines après l’ensemencement des cellules individualisées chez 0,3 % d’agar. Les images sont acquises à partir d’une culture BPEC partiellement transformée. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9 : Images représentatives de la coloration et de la quantification du MTT. Des exemples avec une colonie MTT-positive (rangée 1), deux colonies MTT-négatives (rangée 2), et des cellules simples positives ou négatives pour la coloration de MTT (ligne 3) sont montrés. A indique la zone de la colonie ou de la cellule positive du MTT. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10 : Quantification des colonies après analyse indépendante de l’ancrage dans les BPECs non transformés (N), partiellement (D), et entièrement transformés (T). (A) Nombre et diamètre des colonies obtenues pour les différentes conditions. Chaque point correspond à une colonie. Les points gris mous représentent les colonies positives de MTT, qui ont été exclues dans les résultats parce que leur diamètre était inférieur à 65 μm (taille minimale considérée après l’application de l’équation numéro 4 et en tenant compte d’au moins une division par semaine). La ligne rouge indique le diamètre médian de la colonie pour chaque groupe. Deux répliques indépendantes ont été exécutées pour chaque condition. Différentes lettres (a, b, c) indiquent des différences statistiquement significatives pour le nombre de colonies (test exact de Fisher; p-value < 0.05) et pour leur diamètre médian (test Kruskal-Wallis avec correction de comparaisons multiples; p-valeur < 0,05). Ce graphique a été adapté de Repullés et coll. 2019⁷. (B) Images représentatives de puits entiers après coloration MTT. Barre d’échelle = 5 mm; Barre d’échelle d’encart = 2,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Les protocoles expérimentaux décrits dans cet article fournissent des outils utiles pour évaluer la transformation oncogène des cellules de culture in vitro. Chaque technique évalue des aspects spécifiques du processus de transformation et, par conséquent, une attention particulière doit être accordée lors de l’élaboration de conclusions à partir d’une seule analyse. L’accumulation des courbes de croissance est une approche qui exige des informations déjà disponibles lors de la culture des cellules à d’autres fins. Cela rend cette technique moins chère et plus facile à appliquer par rapport à d’autres analyses de prolifération cellulaire. Toutefois, pour obtenir des résultats valides, une attention particulière doit être accordée lors du comptage et de l’ensemencement des cellules chaque fois qu’elles sont sous-cultures. Un taux de croissance accru est indicatif de la transformation^{cellulaire 1}, mais il ne doit pas être utilisé seul parce que d’autres facteurs exogènes, tels que l’ajout /élimination de substances antibiotiques et antifongiques ou la variation des conditions de culture (par exemple, la température, le CO₂₎peuvent également affecter la division cellulaire. Il est également important de considérer que la transduction ou le traitement des cellules avec des médicaments peuvent affecter leur taux de croissance dans les jours ou les semaines à venir et ainsi donner une vision déformée de la capacité de prolifération à long terme. À cet égard, des contrôles appropriés doivent être effectués.

La culture 3D dans la matrice membranaire du sous-sol permet l’évaluation de la distribution cellulaire au sein d’une entité fonctionnelle entière, l’acinus. Une organisation altérée est indicative d’une affaiblissement intercellulaire de communication qui pourrait mener à une perte de fonction, une caractéristique des tissus tumoraux. Le fait que certains acini présentent une organisation non polarisée indique que certaines cellules ont initié le processus de transformation. En ce qui concerne les questions techniques, il est important de déterminer avec précision la concentration optimale des cellules ensemencées et la concentration de la matrice. Ces deux paramètres peuvent influencer le nombre et la taille de l’acini résultant, ce qui pourrait nuire à leur capacité organisationnelle. En outre, la manipulation de la matrice de membrane de sous-sol exige un certain degré d’expérience car elle doit être manipulée doucement. En dépit d’être une technique laborieuse, la croissance des cellules en trois dimensions ressemble au contexte physiologique de ces cellules et permet l’évaluation non seulement de la distribution des marqueurs de lignée mammaire^{7,15 mais}aussi d’autres structures qui fournissent des informations sur les dispositifs tumoraux, tels que la perturbation de la membrane du sous-sol¹⁶. Les cultures cellulaires 3D représentent l’avenir de la recherche sur la culture cellulaire. En fait, les croissances 3D peuvent donner lieu à des résultats plus physiologiques et intéressants tout en tenant compte des éléments de microenvironnement et en nous fournissant beaucoup d’études différentes ainsi que l’identification et l’évaluation des cibles thérapeutiques, les interactions cellule à cellule, ou les investigations sur les cellules souches.

La croissance indépendante de l’ancrage des cellules adhérentes est un traitement sans équivoque du processus de transformation. Alors que certains bpecs partiellement et entièrement transformés étaient encore en mesure de donner lieu à un acinus structuré,ils manifestent leur capacité à former des colonies lorsqu’ils sont forcés de croître individuellement en suspension. Au niveau technique, l’analyse d’ancrage est également complexe puisque de petites variations lors de la manipulation de l’agar (p. ex., température élevée) ou lors de la désagrégation des cellules après la trypsinisation peuvent notoirement affecter la formation de colonies cellulaires. Cependant, le matériel requis est meilleur marché que la matrice de membrane de sous-sol employée pour des cultures 3D de cellules rendant l’évaluation de la croissance anchorage-indépendante plus accessible. En outre, avant l’ajout de MTT, les colonies simples peuvent être cueillies et autorisées à pousser hors de l’agar dans des plaques avec une surface adhérente. Ces colonies peuvent entraîner des lignées cellulaires clonales qui peuvent continuer à croître en suspension ou adhérer à nouveau. L’ADN, l’ARN et/ou les protéines peuvent être extraits de ces cultures cellulaires pour des analyses plus approfondies.

Il y a une limitation générale en ce qui concerne les méthodes décrites ici: elles prennent beaucoup de temps, et il faut plusieurs semaines pour obtenir les résultats. Cependant, puisque chaque essai évalue une caractéristique spécifique de tumeur, les conclusions faites considérant l’ensemble des résultats sont très saines. Par conséquent, les trois tests ensemble sont de puissants indicateurs de transformation cellulaire.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91001
1.5 ml Eppendorfs	Thermo Fisher Scientific	3451	Dark eppendorfs are preferred for MTT long-term storage
10 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-0010
100 ml glass bottle			With cap, autoclavable
1000 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	LAB1000ULFNL
1000 μl Pipette tips w/o filter	Biologix	20-1000
15 ml Conical tubes	VWR	525-0400
2 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91002
200 μl Pipette tips w/ filter	Labclinics	FTR200-96
5 ml Serological Pipettes	Labclinics	PLC91005
50 ml Conical Tubes	VWR	525-0304
Acetone	PanReac AppliChem	211007	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Agar	Sigma-Aldrich	A1296	Used for anchorage assay
Anti-Claudin 4 antibody	Abcam	15104, RRID:AB_301650	Working dilution 1:100, host: rabbit
Anti-Cytokeratin 14 [RCK107] antibody	Abcam	9220, RRID:AB_307087	Working dilution 1:100, host: mouse
Anti-mouse Cyanine Cy3 antibody	Jackson ImmunoResearch Inc.	115-165-146, RRID:AB_2338690	Working dilution 1:500, host: goat
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11034, RRID:AB_2576217	Working dilution 1:500, host: goat
Autoclave
BioVoxxel Toolbox		RRID:SCR_015825
Cell culture 24-well Plate	Labclinics	PLC30024	Used for 3D cultures in Matrigel. Flat Bottom
Cell culture 6-well Plate	Labclinics	PLC30006	Used for anchorage assay
Cell incubator (37 ºC and 5 % CO2)
Cell Strainers	Fisherbrand	11587522	Mesh size: 40 μm
CellSense software	Olympus		Used to image acquisition
Centrifuge
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Used to supplement cell culture medium
Class II Biological Safety Cabinet	Herasafe	HAEREUS HS12
Confocal inverted Microscope	Leica	TCS SP5
Cover glasses	Witeg Labortechnik GmbH	4600122	22 X 22 mm, thickness 0.13 - 0.17 mm
DAPI			2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine
Fetal Bovine Serum	Biowest	S1810	Used to inactivate trypsine action
Fiji software (ImageJ)	National Institutes of Health	RRID:SCR_002285	Free download, no license needed
Glass Pasteur Pipettes
Glass slides	Fisherbrand	11844782
Goat Serum	Biowest	S2000	Used for immunofluorescence of 3D structures
Heat-Resistant Gloves			Used for agar manipulation after autoclave
Heater bath (37 ºC)			Used to temper solutions prior to cell subculture
Heater bath (42 ºC)			Used to keep agar warm
Heating plate			Used for Matrigel dehydration
Humid chamber			Used for the incubation of antibodies during immunofluorescence
Ice			Used during Matrigel manipulation
Ice-box
Inverted Optic Microscope	Olympus	IX71
Matrigel Matrix	Becton Dickinson	354234	Store at -20 ºC and keep cold when in use. Referred to as basement membrane matrix
Methanol	PanReac AppliChem	131091	Used for 3D structure fixation prior to immunofluorescent labelling
Micropipette			p1000, p200 and p10
Microsoft Office Excel	Microsoft	RRID:SCR_016137	Used to calculate population doubling and to obtain growth rate equation
MilliQ water			Referred to as ultrapure water
Nail Polish			Used to seal samples after mounting
Parafilm M	Bemis	PM-999	Used to cover antibody solution during incubation
PBS pH 7.4 (w/o calcium & magnesium)	Gibco	10010-056	Sterile. Used for cell subculture
PBS tablets	Sigma-Aldrich	P4417	Dilute in milliQ water. No sterility required. Used for immunofluorescence
Pipette Aid
Primaria T25 flasks	Corning	353808	Used for BPEC culture
Scepter Automated Cell Counter	Millipore	PHCC20060	Alternatively, use an haemocytometer
Scissors			Used to cut pipette tips and parafilm
Sterile filters 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS	Used to filter MTT solution
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128	Store at -20 ºC
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used for immunofluorescence of 3D structures
Trypsin-EDTA 10X	Biowest	X0930	Dilute in PBS to obtain 3X solution
Vectashield Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
WIT-P-NC Culture Medium	Stemgent	00-0051	Used for primary BPEC culture
WIT-T Culture Medium	Stemgent	00-0047	Used for transformed BPEC culture