Summary
MAPS-technologie is ontwikkeld om het targetoom van een specifiek regulerend RNA in vivo te onderzoeken. De sRNA van belang is gelabeld met een MS2 aptamer die de co-zuivering van zijn RNA-partners en hun identificatie door RNA-sequencing mogelijk maakt. Dit gewijzigde protocol is bijzonder geschikt voor Gram-positieve bacteriën.
Abstract
Hoewel kleine regelgevende RNA's (sRNAs) wijdverspreid zijn onder het bacteriële domein van het leven, blijven de functies van veel van hen slecht gekarakteriseerd, met name vanwege de moeilijkheid om hun mRNA-doelen te identificeren. Hier beschreven we een aangepast protocol van de MS2-Affinity Purification in combinatie met RNA Sequencing (MAPS) technologie, met als doel alle RNA-partners van een specifieke sRNA in vivo te onthullen. In grote lijnen is de MS2 aptamer versmolten met het 5' uiteinde van het sRNA van belang. Deze constructie wordt vervolgens in vivo uitgedrukt, waardoor de MS2-sRNA kan communiceren met zijn cellulaire partners. Na het oogsten van bacteriën worden cellen mechanisch gelyseerd. Het ruwe extract wordt geladen in een op amylose gebaseerde chromatografiekolom die eerder was bedekt met het MS2-eiwit dat is gesmolten met het maltosebindende eiwit. Dit maakt het mogelijk om MS2-sRNA specifiek vast te leggen en RNA's te gebruiken. Na elutie worden co-gezuiverde RNA's geïdentificeerd door RNA-sequencing met hoge doorvoer en daaropvolgende bio-informatische analyse. Het volgende protocol is geïmplementeerd in de Gram-positieve menselijke ziekteverwekker Staphylococcus aureus en is in principe transponeerbaar op grampositieve bacteriën. Kortom, MAPS-technologie is een efficiënte methode om het regelgevende netwerk van een bepaalde sRNA diep te verkennen en biedt een momentopname van het hele doeloom. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat putatieve doelstellingen die door MAPS zijn geïdentificeerd, nog steeds moeten worden gevalideerd door aanvullende experimentele benaderingen.
Introduction
Honderden, misschien zelfs duizenden kleine regelgevende RNA's (sRNAs) zijn geïdentificeerd in de meeste bacteriële genomen, maar de functies van de overgrote meerderheid van hen blijven niet gekarakteriseerd. Over het algemeen zijn sRNAs korte niet-coderende moleculen, die een belangrijke rol spelen in de bacteriële fysiologie en aanpassing aan fluctuerende omgevingen1,2,3. Inderdaad, deze macromoleculen staan centraal in tal van ingewikkelde regulerende netwerken, die van invloed zijn op metabolische routes, stressreacties, maar ook virulentie en antibioticaresistentie. Logischerwijs wordt hun synthese geactiveerd door specifieke omgevingsprikkels (bijv. nutriëntenhongering, oxidatieve of membraanspanningen). De meeste sRNAs reguleren meerdere doel-mRNAs op posttranscriptieniveau door middel van korte en niet-aaneengesloten basiskoppeling. Zij verhinderen gewoonlijk de initiatie van vertalingen door te concurreren met ribosomen voor regio 's voor het initiëren van vertalingen4. De vorming van sRNA:mRNA duplexen resulteert ook vaak in de actieve afbraak van de doel mRNA door rekrutering van specifieke RNases.
De karakterisering van een sRNA-doeloom (d.w.z. de hele set van zijn doel-RNA's) maakt het mogelijk om de metabolische routes te identificeren waarin het ingrijpt en het potentiële signaal waarop het antwoordt. Bijgevolg kunnen de functies van een specifiek sRNA in het algemeen worden afgeleid uit het doeloom. Hiervoor zijn verschillende in silico voorspellingstools ontwikkeld zoals IntaRNA en CopraRNA5,6,7. Ze vertrouwen met name op sequentie complementariteit, koppelingsenergie en toegankelijkheid van de potentiële interactiesite om putatieve sRNA-partners te bepalen. Voorspellingsalgoritmen integreren echter niet alle factoren die van invloed zijn op base-pairing in vivo, zoals de betrokkenheid van RNA-chaperonnes8 die suboptimale interacties of de co-expressie van beide partners bevorderen. Vanwege hun inherente beperkingen blijft het vals-positieve percentage voorspellingstools hoog. De meeste experimentele grootschalige benaderingen zijn gebaseerd op de co-zuivering van sRNA:mRNA-paren die interageren met een gelabeld RNA-bindend eiwit (RBP)6,9. De RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) methode identificeerde bijvoorbeeld RNA duplexen die samen met RNA-chaperonnes zoals Hfq en ProQ werden gezuiverd in Escherichia coli10,11. Een vergelijkbare technologie genaamd UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) werd toegepast op RNase E- en Hfq-geassocieerde sRNAs in E. coli12,13. Ondanks de goed beschreven rollen van Hfq en ProQ in sRNA-gemedieerde regulatie bij meervoudige bacteriën8,14,15, lijkt sRNA-gebaseerde regulatie RNA-chaperonne-onafhankelijk te zijn in verschillende organismen zoals S. aureus16,17,18. Zelfs als de zuivering van RNA-duplexen in combinatie met RNases haalbaar is, zoals aangetoond door Waters en collega's13,blijft dit lastig omdat RNases hun snelle afbraak veroorzaken. Daarom vormt de MS2-Affinity Purification in combinatie met RNA Sequencing (MAPS) benadering19,20 een solide alternatief in dergelijke organismen.
In tegenstelling tot bovengenoemde methoden gebruikt MAPS een specifieke sRNA als lokaas om alle interacterende RNA's vast te leggen en vertrouwt daarom niet op de betrokkenheid van een RBP. Het hele proces is weergegeven in figuur 1. Kortom, de sRNA wordt op de 5' getagd met de MS2 RNA aptamer die specifiek wordt herkend door het MS2 coat eiwit. Dit eiwit wordt gefuseerd met het maltosebindende eiwit (MBP) dat geïmmobiliseerd moet worden op een amylosehars. Daarom blijven MS2-sRNA en haar RNA-partners behouden op de kolom affiniteitschromatografie. Na elutie met maltose worden co-gezuiverde RNA's geïdentificeerd met behulp van RNA-sequencing met hoge doorvoer, gevolgd door bio-informatische analyse (figuur 2). De MAPS-technologie tekent uiteindelijk een interacterende kaart van alle mogelijke interacties die in vivo plaatsvinden.
MAPS-technologie werd oorspronkelijk geïmplementeerd in de niet-pathogene gramnegatieve bacterie E. coli21. Opmerkelijk genoeg hielp MAPS bij het identificeren van een tRNA-afgeleid fragment dat specifiek interageert met zowel RyhB- als RybB-sRNAs en het voorkomen van sRNA-transcriptieruis om mRNA-doelen te reguleren in niet-inducerende omstandigheden. Daarna is MAPS met succes toegepast op andere E. coli sRNAs zoals DsrA22, RprA23, CyaR23 en GcvB24 (Tabel 1). Naast het bevestigen van eerder bekende doelen, breidde MAPS het targetome van deze bekende sRNAs uit. Onlangs is MAPS uitgevoerd in Salmonella Typhimurium en onthulde dat SraL sRNA bindt aan rho mRNA, codering voor een transcriptie beëindiging factor25. Door deze koppeling beschermt SraL rho mRNA tegen de voortijdige transcriptie-beëindiging die door Rho zelf wordt geactiveerd. Interessant is dat deze technologie niet beperkt is tot sRNAs en kan worden toegepast op elk type cellulaire RNA's, zoals blijkt uit het gebruik van een tRNA-afgeleid fragment26 en een 5'-onvertaald gebied van mRNA22 (Tabel 1).
Maps methode is ook aangepast aan de pathogene Gram-positieve bacterie S. aureus19. In het bijzonder is het lysisprotocol op grote schaal aangepast om cellen efficiënt te breken als gevolg van een dikkere celwand dan gramnegatieve bacteriën en om de RNA-integriteit te behouden. Dit aangepaste protocol ontrafelde reeds het interactoom van RsaA27, RsaI28 en RsaC29. Deze aanpak gaf inzicht in de cruciale rol van deze sRNAs in regulerende mechanismen van celoppervlakeigenschappen, glucoseopname en oxidatieve stressreacties.
Het protocol dat in 2015 in E. coli is ontwikkeld en geïmplementeerd, is onlangs uitvoerig beschreven30. Hier bieden we het aangepaste MAPS-protocol, dat bijzonder geschikt is voor het bestuderen van sRNA-regulerende netwerken in Gram-positieve (dikkere celwand) bacteriën, of ze nu niet-pathogeen of pathogeen zijn (veiligheidsmaatregelen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffers en media
- Bereid voor MAPS-experimenten de volgende buffers en media voor:
- Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 en 1 mM DTT)
- Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 en 1 mM DTT)
- RNA-laadbuffer (0,025% xyleencyaan en 0,025% bromoffenolblauw in 8 M ureum)
- Brain Heart Infusion (BHI) medium (12,5 g kuithersenen, 10 g pepton, 5 g runderhart, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 en 2 g glucose voor 1 L)
- Lysogeny Broth (LB) medium (10 g pepton, 5 g gistextract en 10 g NaCl voor 1 L) - Bereid voor noordelijke vlektesten de volgende buffers voor:
- Blokkerende oplossing (1x maleïnezuur en 1% blokkerend reagens)
- Hybridisatieoplossing (50% formamide, 5x SSC, 7% SDS, 1% blokkerende oplossing en 0,2% N-lauryl sarcosine, 50 mM natriumfosfaat). Verwarm met agitatie om op te lossen.
LET OP: Volg zorgvuldig de veiligheidsmaatregelen met betrekking tot elk product.
- 1 M natriumfosfaat (58 mM natriumfosfaatdibasic en 42 mM natriumfosfaatmonobasisch)
- Zoutoplossing, natriumcitraatbuffer (SSC), 20x concentraat (3 M NaCl en 300 mM trinatriumcitraat)
2. Veiligheidskwesties
- Voer alle stappen uit met levensvatbare pathogene bacteriën in een niveau 2-insluitingslaboratorium.
OPMERKING: Na de lysis mogen alleen celextracten naar buiten worden gebracht (stap 5). - Trek een labjas en handschoenen aan.
- Zorg ervoor dat de polsen bedekt zijn.
- Reinig de biologische veiligheidskast (klasse II) met een desinfecterende oplossing.
- Gooi vast afval dat aan bacteriën is blootgesteld in de daarvoor bestemde biomedische bak.
- Behandel kolven die verontreinigde vloeistoffen bevatten met een desinfecterende oplossing. Gooi het vervolgens weg in een gootsteen.
- Was de handen en polsen zorgvuldig met zeep en verwijder de labjas voordat u het niveau 2-insluitingslab verlaat.
3. Plasmide bouw
OPMERKING: Voor kloondoeleinden is het van cruciaal belang om eerst de grenzen van het endogene sRNA te identificeren. De pCN51-P3 en pCN51-P3-MS2 plasmiden worden beschreven in Tomasini et al. (2017)27. De P3-promotor maakt een hoge expressie van het sRNA mogelijk op een celdichtheidsafhankelijke manier (d.w.z. wanneer bacteriën de stationaire groeifase ingaan). Veel stafylokokken sRNAs accumuleren tijdens deze groeifase.
- Versterk de sRNA-sequentie door PCR met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase en een PCR-machine. Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig op en lees Garibyan en Avashia (2013)31 voor meer informatie.
- Gebruik de volgende sjablonen om de specifieke primers te ontwerpen:
en 5'-CGCGGATCC(N)-3' voor respectievelijk voorwaartse en omgekeerde primers.
OPMERKING: Deze oligonucleotiden maken het mogelijk om de MS2-reeks (vetgedrukt) te fuseren tot het 5'-uiteinde van het sRNA van belang. Pst I en BamHI restrictie sites (onderstreept) worden toegevoegd aan de 5' en 3' extremiteiten van de MS2-sRNA constructie om het amplicon te klonen in de pCN51-P3 plasmide27. (N) komt overeen met de genspecifieke sequentie (15-20 nucleotiden). - Verteer 1 μg pCN51-P3 plasmide en 1 μg van het MS2-sRNA PCR-product met 2 U PstI en 1 U BamHI in de juiste buffer volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Incubeer 1 uur bij 37 °C en zuiver DNA met behulp van een PCR-zuiveringskit (zie tabel met materialen).
- Meng de verteerde pCN51-P3 plasmide (300 ng) en MS2-sRNA amplicon (molaire verhouding voor vector:insert = 1:3) in een buis van 1,5 ml. Zie Revie et al. (1988)32 om de ligatie-efficiëntie te maximaliseren. Voeg 1 μL ligasebuffer en 10 U T4-ligase toe aan elke buis. Stel het volume in op 10 μL met ultrapure water.
- Incubeer bij 22 °C gedurende ten minste 2 uur.
- Voeg 5 μL ligatiemengsel toe aan 50 μL bevroren DH5α chemisch competente E. coli-cellen. Lees Seidman et al. (2001)33 voor meer informatie over plasmidetransformatie en chemisch competente cellen.
- Incubeer 30 minuten op ijs.
- Hitteschok (45 s bij 42 °C) de transformatiebuis met behulp van een warmteblok of waterbad.
- Voeg 900 μL LB medium toe en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
- Plaat 100 μL van de bacteriële suspensie op een LB-agarplaat aangevuld met ampicilline (100 μg/μL).
OPMERKING: de pCN51-P3 vector codeert voor een ampicilline resistentie gen, waarmee alleen E. coli klonen met de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide kunnen worden geselecteerd. - Extracteer de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide uit een nachtelijke bacteriecultuur (5 ml) gekweekt in aanwezigheid van ampicilline (100 μg/μL) met behulp van een plasmide DNA miniprep kit (zie tabel met materialen).
- Controleer de constructie door Sanger sequencing34 met behulp van de volgende primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
- Transformeer de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide in DC10B chemisch competente E. coli cellen. Herhaal stap 3.7 tot en met 3.11.
- Extracteer de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide (zie stap 3.12) en transformeer 1-5 μg plasmide-DNA in HG001 ΔsRNA-elektrocompetente S. aureuscellen met behulp van een elektroporatieapparaat. Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig op. Lees Grosser en Richardson (2016)35 voor meer informatie over methoden voor het voorbereiden van elektrocompetente S. aureus.
LET OP: Deze stap omvat de behandeling van pathogene bacteriën (zie stap 2). - Voeg 900 μL BHI-medium toe en incubeer bij 37 °C gedurende 3 uur.
- Centrifugeer 1 min bij 16.000 x g. Gooi het supernatant weg.
- Resuspend de pellet in 100 μL BHI en plaat de bacteriële suspensie op BHI agar platen aangevuld met erytromycine (10 μg/μL).
OPMERKING: De pCN51-P3 vector codeert ook voor een erytromycine resistentie gen, waarmee alleen S. aureus klonen met de pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide kunnen worden geselecteerd.
4. Bacteriën oogsten
LET OP: Deze stap omvat de behandeling van pathogene bacteriën (zie stap 2).
- Kweek één kolonie stammen met pCN51-P3-MS2-sRNA of pCN51-P3-MS227 plasmiden in 3 ml BHI-medium aangevuld met erytromycine (10 μg/μL) in duplicaten.
- Verdun elke nachtcultuur in 50 ml (≈1/100) vers BHI-medium aangevuld met erytromycine (10 μg/μL) om een OD600nm van 0,05 te bereiken. Gebruik gesteriliseerde kolven van 250 ml (verhouding 5:1 kolf-gemiddelde verhouding).
OPMERKING: De gemiddelde en groeiomstandigheden moeten worden vastgesteld volgens het expressiepatroon van het onderzochte sRNA. - Kweek culturen bij 37 °C met schudden bij 180 tpm gedurende 6 uur.
- Breng elke cultuur over in een centrifugebuis van 50 ml.
- Centrifugeer bij 2.900 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
- Houd pellets op ijs en voer direct mechanische cellysis uit (stap 5) of vries en bewaar pellets bij -80 °C.
5. Mechanische cellysis
LET OP: De volgende stappen moeten op ijs worden uitgevoerd en buffers moeten bij 4 °C zijn. Gebruik handschoenen en neem alle voorzorgsmaatregelen om monsters tegen RNases te beschermen.
- Resuspend pellets (stap 4.6) in 5 ml buffer A.
- Breng de geresuspendeerde cellen over in centrifugebuizen van 15 ml met 3,5 g silicaparels (0,1 mm).
- Plaats buizen in een mechanisch cellyse-instrument (zie tabel met materialen). Loop een cyclus van 40 s bij 4,0 m/s.
OPMERKING: Als één cyclus niet genoeg is om cellen te breken, laat het apparaat dan 5 minuten afkoelen terwijl u monsters op ijs houdt. Herhaal vervolgens een andere cyclus van 40 s bij 4,0 m/s. De efficiëntie van cellysis kan worden getest door het supernatant op BHI-agarplaat te plateren. - Centrifugeer op 15.700 x g gedurende 15 min. Herstel het supernatant en houd het op ijs.
6. Kolomvoorbereiding
LET OP: Zorg ervoor dat de amylosehars niet droogt. Sluit de kolom indien nodig af met een eindkap. Bereid alle oplossingen voor voordat u begint met de affiniteitszuivering.
- Plaats een chromatografiekolom in een kolomrek (zie Materiaaltabel).
- Verwijder de kolomtip en was de kolom met ultrapure water.
- Voeg 300 μL amylosehars toe.
- Was de kolom met 10 ml buffer A.
- Verdun 1.200 pmol MBP-MS2-eiwit in 6 ml buffer A en laad het in de kolom.
- Was de kolom met 10 ml buffer A.
7. MS2-affiniteit zuivering (Figuur 1)
- Laad het cellysaat in de kolom.
OPMERKING: Houd 1 ml van het cellysaat (ruw extract, CE) om het totale RNA (stap 8) te extraheren en de noordelijke vlek (stap 9) en transcriptomische (stap 10) analyse uit te voeren. - Verzamel de doorstroomfractie (FT) in een schone opvangbuis.
- Was de kolom 3 keer met 10 ml buffer A. Verzamel de wasfractie (W).
- Eluteer de kolom met 1 ml buffer E en verzamel de elutiefractie (E) in een microbuis van 2 ml.
- Bewaar alle verzamelde fracties op ijs tot RNA-extractie (stap 8) of vries ze in bij -20 °C voor later gebruik.
8. RNA-extractie van verzamelde fracties (CE, FT, W en E)
- Gebruik 1 ml van elke fractie (inclusief FT en W) voor RNA-extractie.
- Voeg 1 volume fenol toe. Meng krachtig.
LET OP: Fenol is vluchtig en corrosief, let op en werk veilig onder een zuurkast. - Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 10 min bij 20 °C.
- Breng de bovenste fase over in een schone microbuis van 2 ml.
- Voeg 1 volume chloroform/isoamylalcohol (24:1) toe en herhaal stap 8.3 tot 8.4.
LET OP: Werk veilig onder een zuurkast. - Voeg 2,5 volume koude ethanol 100% en 1/10 volume 3 M natriumacetaat (NaOAc) pH 5,2 toe.
- 's Nachts neerslaan bij -20 °C.
OPMERKING: Neerslag kan ook worden uitgevoerd in een ethanol/droogijsbad gedurende 20 minuten of bij -80 °C gedurende 2 uur. - Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Verwijder langzaam ethanol met een pipet terwijl u voorzichtig bent om de pellet niet te verstoren.
LET OP: De RNA pellet is niet altijd zichtbaar en zit soms los in aanwezigheid van ethanol. - Voeg 500 μL 80% koude ethanol toe.
- Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Gooi ethanol weg door het langzaam te pipetten. Droog de pellet met behulp van een vacuümconcentrator, 5 minuten in de run-modus.
- Resuspend de pellet in een geschikt volume (15-50 μL) ultrapure water. Vries de pellet in bij -20 °C voor later gebruik.
- Beoordeel de RNA-hoeveelheid (260 nm) en kwaliteit (260/280 en 260/230 golflengteverhoudingen) met behulp van een spectrofotometer/fluorometer (zie tabel met materialen). Volg de instructies van de fabrikant zorgvuldig op.
OPMERKING: 3-4 μg wordt over het algemeen verkregen in de elutiefractie (E). Dit hangt vooral af van geteste omstandigheden.
9. Analyse van MS2-affiniteitszuivering door Noordelijkevlek 36
- Verdun 5 μg RNA van CE, FT, W fracties en 500 ng E fractie in 10 μL ultrapure water en meng met 10 μL RNA laadbuffer.
- Incubeer 3 min bij 90 °C.
- Laad monsters in putten van een 1% agarose gel aangevuld met 20 mM guanidium thiocyanaat en voer de gel uit op 100-150 V in TBE 1x buffer bij 4 °C. Lees Koontz (2013)37 voor meer informatie.
- Breng RNA's over op een nitrocellulosemembraan door vacuümoverdracht gedurende 1 uur of capillariteitsoverdracht 's nachts.
OPMERKING: De capillariteitsmethode is efficiënter voor grote RNA's. - UV cross-link RNA's op het membraan (120 mJ bij 254 nm) met behulp van een ultraviolette crosslinker.
- Steek het membraan in een hybridisatiefles met de RNA-kant naar boven gericht.
- Voeg 10-20 ml voorverwarmde hybridisatieoplossing toe. Incubeer 30 min bij 68 °C.
- Gooi de oplossing weg en voeg 10-20 ml verse hybridisatieoplossing toe, aangevuld met 1 μL van de sRNA-specifieke sonde. Incubeer 's nachts bij 68 °C.
OPMERKING: De RNA-sonde met DIG-label wordt gesynthetiseerd met behulp van een DIG RNA-etiketteringskit en volgens de instructies van de fabrikant. Als alternatief kan een radioactief gelabelde sonde worden gebruikt. - Was het membraan met 10-20 ml wasoplossing 1 (2x SSC en 0,1% SDS) gedurende 5 minuten bij 20 °C. Herhaal dit één keer.
- Was het membraan met 10-20 ml wasoplossing 2 (0,2x SSC en 0,1% SDS) gedurende 15 minuten bij 68 °C. Herhaal dit één keer.
- Incubeer met 10-20 ml blokkeeroplossing gedurende ten minste 30 minuten bij 20 °C.
- Gooi de oplossing weg en voeg 10-20 ml van de blokkerende oplossing toe, aangevuld met het polyklonale anti-digoxigenine-antilichaam (1/1000), geconjugeerd aan alkalische fosfatase. Incubeer 30 min bij 20 °C.
- Was het membraan met 10-20 ml van de wasoplossing 3 (1x maleïnezuur en 0,3% Tween 20) gedurende 15 minuten bij 20 °C. Herhaal dit één keer.
- Incubeer het membraan met 10-20 ml van de detectieoplossing (0,1 M Tris HCl en 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min bij 20 °C.
- Leg het membraan op een plastic folie en week het met het substraat (zie Tabel met materialen). Incubeer 5 minuten in het donker.
- Sluit het membraan af in een plastic folie. Doe het membraan in een autoradiografiecassette.
- Stel het membraan bloot aan een autoradiografiefilm in de speciale donkere kamer.
OPMERKING: De expositietijd is afhankelijk van de signaalsterkte, van enkele seconden tot minuten. - Onthul de blootgestelde film in een automatisch ontwikkelapparaat.
10. Bereiding van de monsters voor RNA-sequencing
OPMERKING: Deze stap heeft alleen betrekking op RNA's die worden geëxtraheerd uit E- en CE-fracties.
- Voeg aan elk monster 10 μL 10x DNase buffer en DNase I (1 U/μg behandelde RNA's) toe. Voeg water toe voor een eindvolume van 100 μL.
- Incubeer 1 uur bij 37 °C.
- RNA's extraheren en zuiveren zoals eerder beschreven (stappen 8.2 tot en met 8.11).
- Resuspend de RNA pellet in 20 μL ultrapure water.
OPMERKING: De aanwezigheid van het resterende DNA kan worden gecontroleerd met behulp van PCR en specifieke primers (bijv. 16S-gen). - Beoordeel de hoeveelheid en kwaliteit van RNA met behulp van een elektroforeseanalysesysteem op basis van microfluïdica (zie tabel met materialen).
OPMERKING: 1 μg wordt over het algemeen verkregen in de elutiefractie (E) na behandeling met DNase. - Verwijder ribosomale RNA's met een bacteriële rRNA-uitputtingskit.
OPMERKING: Grote en overvloedige RNA's (d.w.z. rRNAs) hebben de neiging om niet specifiek te communiceren met de affiniteitskolom. 500 ng geëxtraheerd RNA is vereist om deze stap uit te voeren. - Beoordeel opnieuw de hoeveelheid en kwaliteit van RNA met behulp van een op microfluïdica gebaseerd elektroforeseanalysesysteem.
- Bereid cDNA-bibliotheken voor met 10-20 ng ribodepleted RNA met behulp van een cDNA-bibliotheekvoorbereidingskit en volgens de instructies van de fabrikant.
- Volg de verkregen bibliotheken met behulp van een sequencing-instrument (bijv. single-end, 150 bp; zie Tabel met materialen).
OPMERKING: 5-10 miljoen keer lezen per monster is over het algemeen voldoende.
11. RNAseq-gegevensanalyse (Figuur 2)
- Download de FastQ-sequencingbestanden van het sequencingplatform.
- Toegang tot het Galaxy-exemplaar van het biologische station Roscoff(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)en inloggen.
OPMERKING: Elk genoemd algoritme is gemakkelijk te vinden via de zoekbalk. Voor elke tool is een gebruikershandleiding beschikbaar.
LET OP: De versie van de vereiste tools kan afwijken van de openbare Galaxy-server38. - Klik op het pictogram Gegevens ophalen en upload vervolgens Bestand vanaf uw computer. Upload FastQ-sequencingbestand van elk MS2-besturingselement en MS2-sRNA-voorbeelden. Upload ook FASTA referentie genoombestand en GFF annotatiebestand.
- Voer FastQC Read Quality-rapporten uit (Galaxy versie 0.69).
OPMERKING: Deze tool biedt een kwaliteitsbeoordeling van onbewerkte sequenties (bijv. kwaliteitsscore, aanwezigheid van adaptersequenties). - Voer trimmomatische flexibele leessnijgereedschappen uit (Galaxy versie 0.36.6) om met name adaptersequenties en leesprogramma's van slechte kwaliteit te verwijderen. Geef adaptersequenties aan die worden gebruikt voor de voorbereiding van de bibliotheek (bijv. TruSeq 3, single-ended). Voeg de volgende trimmomatische bewerkingen toe: SLIDINGWINDOW (Aantal bases=4; Gemiddelde kwaliteit=20) en MINLEN (Min lengte van reads=20).
- Voer fastqc read quality rapporten (Galaxy versie 0.69) opnieuw uit.
- Run Bowtie2 - kaart leest tegen referentiegenoom (Galaxy Versie 2.3.2.2). Gebruik het FASTA-bestand Genome Reference uit de geschiedenis om lees bewerkingen met standaardinstellingen (zeer gevoelig lokaal) toe te kaarten.
OPMERKING: BAM-bestand gegenereerd door Bowtie2 tool kan worden gevisualiseerd met behulp van de Integrative Genomics Viewer (IGV). Gekoppeld BAI-bestand is ook vereist. - Voer eventueel Flagstat uit, waarmee statistieken worden gecompileerd voor bam-gegevensset (Galaxy versie 2.0).
- Voer htseq-count - Count (Galaxy Versie 0.6.1) uit die leesoverlappende functies in het GFF-annotatiebestand uitlijnt. Gebruik de modus Snijpunt (niet leeg).
- Archiveer alle raw-tellingsbestanden van htseq-count-analyse in één Zip-bestand.
- Voer SARTools DESeq2 uit om gegevens te vergelijken (Galaxy Versie 1.6.3.0). Geef het Zip-bestand op met onbewerkte tellingsbestanden en het ontwerpbestand, een door tabbladen gescheiden bestand dat het experiment beschrijft. Volg de meegeleverde instructies om het ontwerpbestand te genereren zorgvuldig op.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten zijn afkomstig van het onderzoek naar RsaC-doeloom bij S. aureus29. RsaC is een onconventionele 1.116 nt-lange sRNA. Het 5'-uiteinde bevat verschillende herhaalde regio's, terwijl het 3'-uiteinde (544 nt) structureel onafhankelijk is en alle voorspelde interactiesites bevat met zijn mRNA-doelstellingen. De expressie van dit sRNA wordt geïnduceerd wanneer mangaan (Mn) schaars is, wat vaak wordt aangetroffen in de context van immuunrespons van de gastheer. Met behulp van MAPS-technologie identificeerden we verschillende mRNAs die rechtstreeks met RsaC interageren, wat zijn cruciale rol in oxidatieve stress(sodA, ldh1 en sarA)en metaalgerelateerde (znuBC-zur en sufCDSUB) reacties onthulde.
Validatie van de MS2-sRNA constructie en experimentele omstandigheden
Voordat MAPS-experimenten worden uitgevoerd, is het belangrijk om de optimale expressieomstandigheden van het bestudeerde sRNA te bepalen. Als een niet-native promotor wordt gebruikt, zal deze definitief helpen bij het produceren van de MS2-sRNA-constructie wanneer de doelen aanwezig zijn. Bovendien moet de MS2-sRNA-constructie zorgvuldig worden gevalideerd met betrekking tot grootte, stabiliteit, expressie en functie. De MS2 aptamer werd versmolten tot het 5' uiteinde van ofwel de full-length RsaC (MS2-RsaC1116) ofwel de kortere vorm (MS2-RsaC544) die overeenkomt met het 3' deel van RsaC. Beide constructies werden in vivo uitgedrukt onder controle van de quorumdetectieafhankelijke P3-promotor in S. aureus HG001 ΔrsaC. De deletie van het rsaC-gen vermijdt een concurrentie tussen de endogene RsaC en MS2-RsaC. De wild-type stam die dezelfde vector bevat met alleen de MS2 tag werd gebruikt als controle. Met dit besturingselement kunt u niet-specifieke interacties aftrekken die plaatsvinden met de MS2-tag.
Om de constructies te bevestigen en hun expressiepatroon te visualiseren, werden bacteriële cellen geoogst na 2 uur, 4 uur en 6 uur groei in BHI-medium bij 37 °C. Na RNA-extractie werd noordelijke vlekanalyse uitgevoerd met behulp van RsaC-specifieke DIG-sonde (figuur 3A). Het niveau van endogene RsaC (banen 1-3) nam aanzienlijk toe na 6 uur groei, wat de selectie van dit tijdspunt voor MAPS-experimenten rechtvaardigde. Belangrijk is dat de niveaus van MS2-RsaC544 (rijstroken 7-9) en MS2-RsaC1.116 (rijstroken 10-12) vergelijkbaar waren met endogene RsaC om 6 uur. Daarom moeten ze het endogene expressiepatroon van RsaC nabootsen. Een grotere maar kleine vorm van RsaC was te onderscheiden en kan te wijten zijn aan een inefficiënt einde van de transcriptie. Dit verschijnsel wordt vaak waargenomen wanneer een MS2-sRNA wordt uitgedrukt onder controle van een sterke promotor van eenplasmide 21. Er werden geen kortere vormen waargenomen als gevolg van afwijkende transcriptiebeëindiging of degradatie.
De toevoeging van de MS2 aptamer aan de 5' van sRNAs kan ook hun juiste vouwen verstoren en hun functies beïnvloeden. Deze stap is van cruciaal belang voor zeer gestructureerde sRNAs als RsaC. Daarom moet de MS2-sRNA-activiteit worden getest en waar mogelijk worden vergeleken met endogene sRNA. Een eerder bekend doelwit of een waarneembaar fenotype kan helpen om het te controleren. De impact van RsaC op intracellulaire ROS-accumulatie werd bijvoorbeeld gebruikt om MS2-RsaC544 te valideren en MS2-RsaC1.116 constructies29.
Analyse van verzamelde fracties tijdens affiniteitszuivering
RNA's werden geëxtraheerd uit CE-, FT- en E-fracties in WT-stam die alleen de MS2-tag uitdrukten en deΔ-rsaC-stam die ms2-RsaC544-constructie uitdrukte. We toonden met behulp van Noordelijke vlekanalyse aan dat de 1.116 nt-lange endogene RsaC werd verrijkt in de elutiefractie, maar niet specifiek bleek te interageren met de affiniteitskolom(figuur 3B,rijstroken 2-3). We hebben hetzelfde fenomeen waargenomen met MS2-RsaC1.116 (gegevens niet weergegeven). Dit komt zeker door de lengte en complexe secundaire structuur. Daarom werd slechts een minder gestructureerde en kortere vorm (544 nt) RsaC gebruikt die overeenkomt met het 3'-deel ervan om MAPS-experimenten uit te voeren. In figuur 3Bwerd de MS2-RsaC544 sterk verrijkt in de elutiefractie, wat aantoont dat deze met succes werd vastgehouden door het MS2-MBP-fusie-eiwit (baan 6). Een grotere maar kleine vorm van MS2-RsaC544 werd waargenomen zoals in figuur 3A. Hier kunnen de strengheid en het aantal wasbeurten worden aangepast aan een verminderde niet-specifieke binding of, integendeel, om het verlies van echte interacterende partners te beperken.
Validatie van putatieve mRNA-doelen na MAPS-analyse
Na bioinformatische analyse worden putatieve mRNA-doelen vermeld volgens de fold-change tussen MS2-sRNA en MS2-besturing, verkregen met Behulp van DeSeq2 (Figuur 2). Ms2-RsaC544 MAPS-gegevens29 suggereerden bijvoorbeeld dat sodA mRNA, codering voor een superoxidedismutase in S. aureus, een hoofddoel is (beste hit, hogere Fold-change). Een noordelijke vlekanalyse, uitgevoerd met een sodA-specifiekeDIG-sonde na ms2-affiniteitszuivering, toont aan dat sodA efficiënt werd gecoverd met MS2-RsaC544 in vergelijking met de MS2-regeling (figuur 3C).
Een globale transcriptomische analyse wordt systematisch uitgevoerd op de CE-fractie. De vergelijking van MAPS-gegevens en deze transcriptomische analyse helpt de verrijkingsratio aan te passen en onthult een potentiële doelhiërarchie. Inderdaad, een slecht uitgedrukt mRNA, dat sterk verrijkt is na MS2-affiniteitszuivering, heeft zeker een grotere bindingsaffiniteit dan een sterk verrijkt en sterk uitgedrukt mRNA.
Het is belangrijk op te merken dat alle kandidaten die door MAPS worden geïdentificeerd, individueel moeten worden gevalideerd met behulp van in vitro en/of in vivo experimenten zoals Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) of reporter gentesten (zie Jagodnik et al. (2017)39 voor meer informatie).
Figuur 1. Schematische illustratie van het MAPS-protocol aangepast aan S. aureus. Van plasmideconstructie tot data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. MAPS-analyseworkflow en verwerkte gegevens. Elke stap, controlepunt en bestandsindeling worden weergegeven (zie ook stap 11). FastQ-formaat is een tekstbestand dat bestaat uit de DNA-sequenties en bijbehorende kwaliteitsscores. BAM-indeling is een gecomprimeerd bestand met uitgelijnde sequenties. Tabelvorm is een door tabs gescheiden tekstbestand met tellingen voor elk gen. De resultatengrafiek illustreert het soort gegevens dat is verkregen na bio-informatische analyse. Gepresenteerde resultaten zijn fictief en komen niet voort uit een studie. Voor meer informatie, basiszelfstudies zijn beschikbaar op galaxy project website (https://galaxyproject.org/). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Hiermee worden validatie- en MAPS-besturingselementen gemaakt. A. Noordelijke vlekanalyse van endogene RsaC sRNA en verwante MS2-constructies. WT-stam draagt de pCN51-P3-MS2 (controle) en ΔrsaC mutant stam dragen ofwel de pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 of pCN51-P3-MS2-RsaC1,116. De monsters werden genomen na 2 uur, 4 uur en 6 uur groei in BHI bij 37 °C. Noordelijke vlektesten werden uitgevoerd met behulp van een RsaC-specifieke DIG-sonde. B. Noordelijke vlekanalyse van MS2-affiniteitszuiveringsfracties met behulp van een RsaC-specifieke DIG-sonde. De co-zuivering werd uitgevoerd met WT-stam + pCN51-P3-MS2 (controle) en ΔrsaC mutant stam + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Cellen werden geoogst na 6 uur groei in BHI bij 37 °C. Ruw extract (CE), doorstroom (FT), elutie (E). C. Noordelijke vlekanalyse van MS2-affiniteitszuiveringsfracties (CE en E) met behulp van een sodA-specifiekeDIG-sonde. Zie (B) voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| RNA | type | referentie |
| Escherichia coli | ||
| RyhB | sRNA | Lalaouna et al. (2015) |
| RybB | sRNA | Lalaouna e.a. (2015) 21 |
| 3'ETSleuZ | tRNA-afgeleid fragment | Lalaouna en Massé (2015)26 |
| DsrA | sRNA | Lalaouna e.a. (2015) 22 |
| Hns | mRNA (5'UTR) | Lalaouna e.a. (2015) 22 |
| CyaR | sRNA | Lalaouna e.a. (2018) 23 |
| RprA | sRNA | Lalaouna e.a. (2018) 23 |
| GcvB | sRNA | Lalaouna e.a. (2019) 24 |
| Salmonella Typhimurium | ||
| SraL | sRNA | Silva e.a. (2019) 25 |
| Aureus van Staphylococcus | ||
| RsaA | sRNA | Tomasini e.a. (2017) 27 |
| RsaC | sRNA | Lalaouna e.a. (2019) 29 |
| RsaI | sRNA | Bronesky et al. (2019) 27 |
Tabel 1. MAPS-technologie onthulde het doel van verschillende RNA's in verschillende organismen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een aangepast protocol voor Gram-positieve bacteriën
Het initiële protocol van MAPS werd ontwikkeld om sRNA interactoom te bestuderen in het modelorganisme E. coli20,30. Hier beschrijven we een aangepast protocol dat geschikt is voor de karakterisering van sRNA-afhankelijke regulerende netwerken in de opportunistische menselijke pathogene S. aureus en zeker kan worden omgezet naar andere grampositieve bacteriën, pathogeen of niet.
Bijzondere aandacht werd besteed aan de cellysisstap. De Franse pers is vervangen door een mechanisch cellyse-instrument. Deze methode is effectief om grampositieve cellen te breken en de risico's in verband met de behandeling van pathogene stammen te beperken. Om de opbrengst van de MS2-affiniteitszuivering te verbeteren, is de hoeveelheid MS2-MBP geïmmobiliseerd op de amylosehars drastisch verhoogd. Hiervoor moesten de strengheid en het aantal wasbeurten worden aangepast.
In tegenstelling tot het oorspronkelijke protocol wordt MAPS hier in tweevoud uitgevoerd, van twee biologische replica's. Er is een workflow ontwikkeld om statistische analyse (figuur 2) te implementeren, wat de robuustheid van verkregen gegevens definitief verhoogt.
MS2-constructie en de expressie ervan
Dit MAPS-protocol is opgesteld om het doeloom van stafylokokken sRNAs te identificeren. De MS2-sRNA-constructie wordt uitgedrukt uit een plasmide met een laag aantal kopieën (pCN51, 20 tot 25 kopieën/cel) en onder controle van de quorumdetectieafhankelijke P3-promotor, voornamelijk geïnduceerd tijdens de stationaire fase. Dit expressiepatroon komt overeen met bestudeerde sRNAs in S. aureus (d.w.z. RsaA, RsaI en RsaC) en zorgt voor een vrij sterke MS2-sRNA-synthese. We kunnen echter niet uitsluiten dat in andere gevallen de P3-promotor mogelijk niet geschikt is en niet de natuurlijke fysiologische toestand van bacteriën weerspiegelt wanneer het sRNA wordt geïnduceerd. Een andere manier om de ms2-sRNA-productie te beheersen, is door chemisch induceerbare promotors te gebruiken (bv. tetracycline-induceerbare promotors). Deze tools maken een pulsexpressie van de MS2-sRNA-constructie mogelijk, maar deze instelling garandeert niet dat RNA-doelen gelijktijdig worden uitgedrukt. Een ander nadeel is dat expressie van een plasmide kan leiden tot de overproductie van de bestudeerde sRNA, nog meer benadrukt met een hoge kopieernummervector. Dit kan mogelijk leiden tot artefactuele interacties of de verstoring van bijbehorende RNA-chaperonnefuncties. Het meest geschikte alternatief is om een MS2-tag in te voegen aan het 5'-uiteinde van het endogene sRNA-gen. Zo zou de MS2-sRNA chromosoom gecodeerd zijn en onder controle staan van de oorspronkelijke promotor. Dit zou beter de endogene expressie van bestudeerd sRNA moeten nabootsen en bias als gevolg van de overproductie van het bestudeerde sRNA moeten voorkomen. In ieder geval is de cruciale stap om de lengte, stabiliteit en functionaliteit van de MS2-sRNA-constructie zorgvuldig te controleren, met name met behulp van noordelijke vlektesten met totaal RNA gewonnen uit culturen die zijn gekweekt onder omstandigheden die de endogene sRNA-productie en -functie activeren. Het ontegenzeggelijk kan het gebruik van een onjuiste/niet-functionele MS2-sRNA-constructie de gegenereerde resultaten drastisch beïnvloeden, wat het belang van de hierboven beschreven controles ondersteunt. Ten slotte wordt de MS2-sRNA altijd geproduceerd op een ΔsRNA-achtergrond om de verrijking van mRNA-doelen te maximaliseren. Bovendien kunnen experimenten worden uitgevoerd in gastheerstammen met specifieke mutaties in RNases (bijv. deletiemutanten of temperatuurgevoelige mutanten) om te voorkomen dat mRNA degradatie begaat door sRNA-afhankelijke rekrutering van RNases.
De experimentele validatie van kandidaten geïdentificeerd door MAPS is nog steeds vereist
Een punt dat in overweging moet worden genomen, is dat MAPS een lijst met putatieve RNA-doelen biedt. Sommige RNA's kunnen echter indirect worden verrijkt via interactie met een gedeeld mRNA-doel of een RNA-bindend eiwit. Bijgevolg moeten de onthulde kandidaten worden bevestigd door andere experimentele benaderingen. EMSA- en footprinting-experimenten worden vaak gebruikt om de directe binding van een sRNA aan putatieve RNA-doelen in vitro te visualiseren. Vervolgens helpen in vitro teenafdrukkende assays de impact van een sRNA op de vertaling van zijn mRNA-doel te monitoren. Ten slotte vullen noordelijke vlek- en/of genreportertesten (lacZ of gfp) deze experimentele validatie in vivo aan. Al deze benaderingen worden beschreven in Jagodnik et al. (2017)39.
In tegenstelling tot RIL-seq- en CLASH-technologieën biedt MAPS niet rechtstreeks informatie over de interactiesites. Niettemin wordt vaak een piek van in kaart gebrachte leesingen waargenomen in een beperkt gebied van de RNA-doelstelling (bijv. het 3'-uiteinde van glyW-cysT-leuZ operon21), waardoor de identificatie van de koppelingslocatie wordt vergemakkelijkt. Als alternatief kunnen verschillende voorspellingstools worden gebruikt om de putatieve bindingssite op het geïdentificeerde doel te voorspellen, zoals IntaRNA40.
MAPS onderzoekt het doel van een bepaald sRNA
MAPS technologie is geschikt voor de studie van sRNA targetome in Gram-negatieve bacteriën zoals E. coli en S. Typhimurium, maar ook nu met dit gemodificeerde protocol in Gram-positieve bacteriën zoals S. aureus. Kortom, MAPS biedt een momentopname van RNA:sRNA duplexen gevormd op een bepaald moment en in specifieke groeiomstandigheden. Helaas kan de lijst met mRNA-doelen onvolledig zijn. Een cognate mRNA-doelwit kan bijvoorbeeld worden gemist vanwege ongepaste experimentele omstandigheden, wat de bovengenoemde voorzorgsmaatregelen rechtvaardigt.
In vergelijking met andere veelgebruikte methoden zoals RIL-seq of CLASH, gebruikt MAPS een specifieke sRNA om alle interacterende RNA-doelen te co-zuiveren. Hier wordt sRNA:RNA-interactie niet verdund tussen andere RBP-geassocieerde duplexen, waardoor het targetoom theoretisch dieper kan worden gekarakteriseerd. Het lijkt er echter op dat RIL-seq/CLASH- en MAPS-methoden verschillende sets putatieve sRNA-doelen12,41aan het licht brachten , wat suggereert dat deze experimentele benaderingen complementair zijn. Deze discrepantie kan worden verklaard door variaties in groeiomstandigheden en/of bias die door elke methode worden gegenereerd.
Dienovereenkomstig moet het doel van het onderzoek de keuze van de methode beïnvloeden. Voor een globale analyse van sRNA-targetomes en wanneer een RBP betrokken is bij sRNA-gemedieerde regulering, moeten RIL-seq- en CLASH-methoden de voorkeur krijgen. Beide benaderingen bieden een overzicht van regelgevende netwerken die afhankelijk zijn van een bepaald RBP en leggen bijgevolg een breed scala aan sRNAs en bijbehorende doelstellingen bloot. Integendeel, voor de studie van een specifiek sRNA of wanneer er geen RBP bekend/betrokken is, is MAPS een geschikte optie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, en ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, aan PR). Het is ook gepubliceerd in het kader van de labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 en van ANR-17-EURE- 0023 (naar PR), als financiering van de staat beheerd door ANR als onderdeel van de investeringen voor het toekomstige programma. DL werd ondersteund door het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement nr. 753137-SaRNAReg. Het werk in E. Massé Lab is ondersteund door exploitatiesubsidies van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) en de National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I.
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N.
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R.
- Koontz, L.
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
