Summary
Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en monteren van Caenorhabditis elegans-embryo's , het registreren van de ontwikkeling onder een 4D-microscoop en het traceren van de cellijn.
Abstract
4D-microscopie is een waardevol hulpmiddel voor het ontrafelen van het embryonale ontwikkelingsproces bij verschillende dieren. In de afgelopen decennia is Caenorhabditis elegans naar voren gekomen als een van de beste modellen voor het bestuderen van ontwikkeling. Vanuit optisch oogpunt maken de grootte en het transparante lichaam deze nematode een ideaal monster voor DIC (Differential Interference Contrast of Nomarski) microscopie. Dit artikel illustreert een protocol voor het kweken van C. elegans-nematoden , het voorbereiden en monteren van hun embryo's, het uitvoeren van 4D-microscopie en het traceren van cellijn. De methode is gebaseerd op multifocale time-lapse records van Nomarski-beelden en analyse met specifieke software. Deze techniek onthult embryonale ontwikkelingsdynamiek op cellulair niveau. Elk embryonaal defect in mutanten, zoals problemen in spindeloriëntatie, celmigratie, apoptose of celbestemmingsspecificatie, kan efficiënt worden gedetecteerd en gescoord. Vrijwel elke cel van het embryo kan worden gevolgd tot het moment dat het embryo begint te bewegen. Het traceren van de volledige cellijn van een C. elegans-embryo door 4D DIC-microscopie is bewerkelijk, maar het gebruik van specifieke software vergemakkelijkt deze taak aanzienlijk. Bovendien is deze techniek eenvoudig te implementeren in het lab. 4D-microscopie is een veelzijdig hulpmiddel en opent de mogelijkheid om een ongeëvenaarde analyse van de embryonale ontwikkeling uit te voeren.
Introduction
4D-microscopie is een multifocaal time-lapse-registratiesysteem waarmee onderzoekers de celdynamiek van een biologisch monster zowel ruimtelijk als in de loop van de tijd kunnen registreren en kwantificeren. Celculturen, gisten of levende weefsels kunnen worden onderworpen aan 4D-analyse, maar deze techniek is vooral geschikt voor het analyseren van de ontwikkeling van levende embryo's. De resolutie van deze analyse bereikt het niveau van elke afzonderlijke cel van het embryo. Elke celdeling kan worden gedetecteerd en celbewegingen kunnen in de loop van de tijd worden getraceerd. Celbestemmingen worden beoordeeld op basis van de positie en vorm die cellen krijgen. Het gebruik van Nomarski-optica verbetert het contrast van niet-gekleurde transparante monsters met behulp van orthogonaal gepolariseerde lichtstralen die interfereren in het brandpuntsvlak. De resulterende beelden zien er driedimensionaal uit, aan één kant verlicht.
Andere methoden gebaseerd op het gebruik van confocale microscopie en GFP transgene dieren voor automatische detectie van kernen en het genereren van cellijnen zijn ontwikkeld 1,2. Het voordeel van die systemen is duidelijk: de software overschrijft ruimschoots de noodzaak om elke kern gedurende een bepaalde periode handmatig te markeren (hoewel enige handmatige supervisie vereist is in de late stadia). Cellulaire processen met veranderingen in celvorm of membraandynamica, zoals die optreden tijdens celdifferentiatie, migratie, apoptose of lijkoverspoeling, blijven echter verborgen als een zwarte achtergrond in de fluorescerend gelabelde kernafbeeldingen.
Daarentegen toont 4D Nomarski-microscopie (ook wel DIC-microscopie, Differential Interference Contrast-microscopie) zowel kern- als celvormveranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling van wilde of gemuteerde dieren. Dit maakt het traceren van de afstamming mogelijk met behulp van standaard microscopen, waarbij alleen doorgelaten licht wordt gebruikt. Er is geen algemene noodzaak om transgene dieren te gebruiken, behalve om specifieke expressiepatronen te vertonen, in welk geval fluorescerende scans kunnen worden geïntercaleerd. Daarom zou dit de optimale aanpak kunnen zijn voor veel laboratoria die werken aan dynamische celprocessen zoals embryogenese of apoptose die kunnen worden benadrukt onder DIC-microscopie 3,4,5,6,7.
Verschillende flexibele en gebruiksvriendelijke programma's zijn beschikbaar voor het vastleggen van microscopische beelden en het reconstrueren van cellijnen, 3D-modellen, celmigratiepaden, enz. in het opgenomen monster. In een standaardexperiment worden beelden verkregen in een reeks brandpuntsvlakken, op een constante afstand, waarvan het aantal afhankelijk is van de dikte van het monster. De temporele resolutie van de analyse kan worden geoptimaliseerd door de scanfrequentie te verhogen. Er is vrijwel geen limiet voor de duur van de opname anders dan de opslagcapaciteit van de computer. Voor een C. elegans embryo-ontwikkelingsanalyse verkrijgen we bijvoorbeeld routinematig beelden op 30 brandpuntsvlakken (elk 1 micron-stap), elke 30 seconden gedurende 12 uur.
Deze systemen zijn toegepast op de analyse van verschillende dierlijke embryo's zoals Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andere aaltjesembryo's12,13, beerdiertjes14,15 en zelfs vroege muizenembryo's16. De enige vereiste is het hebben van een transparant embryo dat zich kan ontwikkelen op het glaaspreparaat onder de microscoop.
Samenvattend is DIC-gebaseerde 4D-microscopie vooral nuttig voor 1) het analyseren van de embryonale ontwikkeling van kleine, transparante dieren: het traceren van cellijn, celmigratiepaden, het genereren van 3D-modellen, enz.; 2) het definiëren van genexpressiepatronen; 3) het bestuderen van celkweekdynamiek, van gist tot menselijke cellen; 4) het analyseren van weefseldynamica of embryofragmenten; 5) kwantificering van de kinetiek van celdood en lijkoverspoeling; en 6) het uitvoeren van vergelijkende fylogenieanalyse op basis van embryonale ontwikkelingskenmerken. Als er interesse is in een van deze onderwerpen (of soortgelijke onderwerpen), kan 4D-microscopie worden gebruikt.
Protocol
1. Kweek C. elegans op petrischaaltjes
- Bereid NGM-platen en zaai ze in met E. coli OP50 als voedselbron (figuur 1). Kweek en onderhoud C. elegans zoals beschreven17. Bewaar gezaaide platen bij 4 °C gedurende maximaal één maand.
- Stel de platen in op de gewenste temperatuur voordat u de wormen toevoegt.
- Om de wormen over te brengen, verwijdert u een stuk agar van een oud bord en plaatst u het op een nieuw bord.
- U kunt ook enkele dieren vangen met een steriele wormenplukker (een 1-inch stuk 32-gauge platinadraad met een afgeplatte punt, gemonteerd op de punt van een Pasteur-pipet) en ze op de nieuwe plaat plaatsen.
- Laat de wormen groeien op de gewenste temperatuur.
- Kweek C. elegans wormen bij 20 °C, de standaardtemperatuur. Om de ontwikkeling van thermogevoelige mutanten te analyseren, voert u echter een nachtelijke incubatie uit, meestal bij 25 °C. Pas de duur en temperatuur van deze incubatie indien nodig aan, afhankelijk van de specifieke mutant.
2. Bereid de 4D-microscopie-opname voor voordat u de embryo's monteert (figuur 2)
- Stel de microscoop en temperatuurregelaars in voordat u het embryo voorbereidt. C. elegans embryo's delen zeer snel. Wees voorbereid om onmiddellijk na het monteren van de embryo's te beginnen met opnemen.
- Stel de opnametemperatuur in op 15 °C, 20 °C of 25 °C.
- Noteer de embryo's routinematig bij 25 °C. Neem thermogevoelige mutanten op bij de beperkende temperatuur om hun fenotypen te tonen. Noteer een WT-controle (indien uitgevoerd in een ander preparaat) bij dezelfde temperatuur als de mutanten.
OPMERKING: WT-embryo's ontwikkelen zich sneller bij 25 °C en langzamer bij 15 °C zonder extra verschillen in cellijn. Plaats microscopen in een ruimte met temperatuurregeling. Extra controle door de glijbaan te koelen of te verwarmen is zeer wenselijk. Dit kan worden bereikt door water op een bepaalde temperatuur te laten circuleren door een metalen ring rond het microscoopobjectief en de condensor. Het doel en het preparaat staan in direct contact via de dompelolie en de temperatuuroverdracht is efficiënt. Dit systeem maakt een nauwkeurige regeling van de registratietemperatuur mogelijk en voor het uitvoeren van temperatuurverschuivingen tijdens de ontwikkeling van het embryo.
- Noteer de embryo's routinematig bij 25 °C. Neem thermogevoelige mutanten op bij de beperkende temperatuur om hun fenotypen te tonen. Noteer een WT-controle (indien uitgevoerd in een ander preparaat) bij dezelfde temperatuur als de mutanten.
- Definieer de recordparameters in de microscopiesoftware.
- Voor een standaard C. elegans-opname (zonder fluorescerende scans), selecteert u:
z-stacks van 30 brandpuntsvlakken, op een afstand van elk 1 micron.
Intervallen van 30 seconden tussen het begin van elke z-stack.
1500 z-stacks (12,5 uur record).
OPMERKING: Zowel commerciële als open source microscoopbesturingsprogramma's kunnen worden gebruikt om deze workflow voor het vastleggen van afbeeldingen te definiëren. Nu is de microscoop klaar om op te nemen.
- Voor een standaard C. elegans-opname (zonder fluorescerende scans), selecteert u:
3. Bereid en monteer de embryo's
- Bereid een dunne, homogene agar pad voor als de eerste stap in het verkrijgen van een mooi beeld (figuur 3).
- Bereid 50 ml van een 4,5% agar-oplossing in gedeïoniseerd water. Verwarm tot kokend in de magnetron en giet 0,5 – 1 ml in glazen buisjes van 3 ml.
- Sluit de buizen zorgvuldig af met wasfolie om uitdroging te voorkomen. Verzegelde agarbuizen kunnen tot twee maanden bij kamertemperatuur worden bewaard.
- Op de labbank, heb een warmteblok bij 80 °C met:
een reageerbuis van pure vaseline (gesmolten), met een fijn verfkwast erin.
een reageerbuis met gedestilleerd water met een Pasteurpipet.
OPMERKING: Dit zorgt ervoor dat alle benodigde materialen heet zijn en dat de agar niet stolt tijdens het maken van de pad. - Verwijder de wasfilm van de bovenkant van een van de agarbuizen en verwarm deze voorzichtig boven een alcoholbrander om de agar te smelten. Wees voorzichtig, want hete agar die uit de glazen buis wordt verdreven, kan brandwonden veroorzaken.
- Zodra de agar is gesmolten, plaatst u de buis in het warmteblok om de agar in vloeibare vorm te houden.
- U kunt de agarbuizen 1 uur voor het experiment in het warmteblok plaatsen om ze te smelten zonder een brander te gebruiken. De gesmolten agar moet na één dag worden weggegooid.
- Plaats een microscoopglaasje (Dia A) tussen twee anderen op een stuk plastic.
- Neem een andere dia (Dia B) en houd deze met je vingers in één hand.
- Plaats met de andere hand een kleine druppel gesmolten agar in het midden van dia A met behulp van de warme Pasteur-pipet.
- Druk onmiddellijk op dia B op de agardruppel om een zeer dun kussen te maken tussen dia A en B. Houd deze dia's aan elkaar vastgeklemd tot stap 3.2.3.
- Monteer de embryo's.
- Verzamel 5-10 gravid hermafrodieten met de plukker en plaats ze in een horlogemakerglas gevuld met water.
- Gebruik een scalpel om de hermafrodietnematoden open te snijden en vroege eieren (1-4 cellen) uit de baarmoeder te halen, onder de stereomicroscoop.
- Neem de dia uit stap 3.1.10 en schuif dia B voorzichtig af om de agar-pad op dia A bloot te leggen.
- Plaats een vroeg ei in het midden van de agar pad door te pipetteren met een capillaire buis.
- U kunt ook een druppel met een set embryo's op het agarpad pipetten en vervolgens zoeken naar embryo's in een vroeg stadium. Voer deze stap uit onder de stereomicroscoop.
- Verplaats het ei indien nodig door het met een wimper aan het uiteinde van een tandenstoker te duwen.
- Verwijder overtollig water met de capillaire pipet.
OPMERKING: Een capillaire pipet kan eenvoudig worden bereid door een Pasteur-pipet boven een alcoholbrander te verwarmen en deze aan beide uiteinden te trekken. - Bedek de bereiding voorzichtig met een coverslip. Om luchtbellen te voorkomen, plaatst u een rand van de dekplaat op de dia en schuift u voorzichtig een scalpel langs de aangrenzende rand om de deksellip langzaam en schuin op het preparaat te draperen.
- Gebruik een pipet om 3/4 van de ruimte rond de agar pad met water te vullen. Laat 1/4 van de ruimte met lucht.
- Sluit de coverslip af met vaseline om uitdroging tijdens lange opnameperioden te voorkomen.
- Gebruik de fijne borstel om een dun laagje gesmolten vaseline rond de rand van de deklip uit te breiden.
OPMERKING: Nu is de voorbereiding klaar voor opname.
4. Pas de DIC aan en start de 4D-microscopie-opname
- Plaats de dia op het microscooppodium. Richt het embryo met behulp van het lage vergrotingsobjectief (5x of 10x).
- Ga naar de doelstelling 100x onderdompeling.
- Pas de optische componenten van de microscoop aan om een Nomarski-beeld te krijgen.
- Stel de condensor scherp.
- Open het diafragma van de condensor volledig en sluit het veldmembraan (dit zorgt voor een hoger numeriek diafragma en dus een grotere resolutie).
- Controleer of beide polarisatoren op de microscoop zijn georiënteerd om de maximale lichtuitsterving te veroorzaken.
- Draai het Wollaston-prisma om een mooi driedimensionaal beeld van het embryo te krijgen, aan één kant verlicht. Draai het prisma in de andere richting om het effect te krijgen dat het embryo aan de andere kant wordt verlicht.
OPMERKING: Deze stappen kunnen worden uitgevoerd op een testmonster vóór de opname, zodat alleen fijnafstelling vereist is op het monster dat wordt geanalyseerd.
- Start de opname van de afbeelding in de microscoop.
5. Analyseer de 4D-film (Figuur 4).
OPMERKING: Zodra de opname is voltooid, gebruikt u software voor het traceren van cellijn om de cellijn te reconstrueren en te analyseren.
Cell lineage tracing software is een krachtig hulpmiddel voor het uitvoeren van gedetailleerde analyses van embryonale ontwikkeling of dynamiek in celculturen of weefselfragmenten. Het programma extraheert en kwantificeert verschillende datasets over de cellulaire dynamiek van het monster, waaronder het genereren van de volledige cellijn van elke geregistreerde cel, inclusief celdelingen, celcycluslengte, migratie of apoptose, evenals de kinetiek ervan. Bovendien kan celdifferentiatie worden gescoord door de morfologische veranderingen van de cel of door expressie van specifieke markers. Kortom, het softwarescherm geeft twee vensters weer: in het linkervenster kan de 4D-film vooruit en achteruit of op en neer worden afgespeeld naar het bovenste of onderste niveau, zodat elke cel tijdens de opname in tijd en ruimte kan worden gevolgd. Op de rechter weduwe wordt de cellijn gegenereerd. Klikken op een celkern in de 4D-film genereert een punt in het afstammingsvenster dat de informatie over de celnaam, het lot en de ruimtelijke coördinaten opslaat. De cellijn van een specifieke cel wordt gegenereerd door de 4D-film vooruit te spelen en periodiek op de kern te klikken om de mitose van die specifieke cel in de loop van de tijd te markeren. Herhaling van dit proces voor elk van de geregistreerde cellen genereert de volledige cellijn van het embryo of monster. De opgeslagen informatie voor ruimtelijke coördinaten van elke cel wordt later gebruikt om 3D-embryomodellen en celmigratiepaden te reconstrueren.
- Open de software voor het traceren van afstamming en maak een nieuw project door naar het menu van de bovenste balk te gaan en het volgende te selecteren:
Bestand | Nieuw project. - Selecteer de cellijnsjabloon afhankelijk van de opnametemperatuur: DB08 voor opname bij 25 °C, DB10 voor opname bij 20 °C en DB12 voor opname bij 15 °C.
- Stel de opnameparameters in het opkomende venster in: scantelling (meestal 1500), tijd tussen scans (30 seconden), niveautelling (30) en afstand tussen niveaus (1 micron).
- Selecteer het afbeeldingsbestand en de indeling.
- Selecteer de afbeeldingsmap waarin de afbeeldingen zijn opgeslagen.
- Kies of afbeeldingen moeten worden opgeslagen als afzonderlijke afbeeldingen (één afbeelding per niveau en tijd) of als z-stacks met meerdere afbeeldingen.
- Bepaal de bestandsnaam en de afbeeldingsindeling. Routinematig worden afzonderlijke afbeeldingen opgeslagen onder de volgende namen:
X0000L00C1 (voor scan 0, niveau 0, kanaal 1)
X0000L01C1 (voor scan 0, niveau 1, kanaal 1)
X0000L02C1 (voor scan 0, niveau 2, kanaal 1)
...
X0001L00C1 (voor scan 1, niveau 0, kanaal 1)
X0001L01C1 (voor scan 1, niveau 1, kanaal 1)
...
X0300L04C1 (voor scan 300, niveau 4, kanaal 1)
...
OPMERKING: Als u de afbeeldingen in een gecomprimeerd formaat opslaat, bespaart u ruimte op uw harde schijf.
- Definieer de lichtkanalen: 1 voor DIC-optica, 2 voor GFP, 3 voor RFP, enz. Voeg die toe die werden gebruikt in de 4D-opname. Klik op "kanaalverwerking ingeschakeld" om ze te detecteren.
- Begin met het traceren van de cellijn van het embryo. Het scherm bevat nu twee belangrijke vensters: het videovenster en het cellijnvenster.
- Selecteer in het afstammingsvenster een afstammingstak en gebruik de muis om op de celkern te klikken die overeenkomt met deze cel in het videovenster.
- Volg de cel ruimtelijk en in de loop van de tijd door de 4D-film vooruit, achteruit of omhoog of omlaag te spelen, een niveau omhoog of omlaag, met behulp van de cursortoetsen.
- Klik periodiek op de celkern. Dit genereert een punt in de afstammingstak en registreert de ruimtelijke coördinaten van de cel op dit moment. Hierdoor vordert de cellijn en zijn 3D-reconstructies van het embryo mogelijk.
- Markeer mitose door op de return-toets te klikken. Selecteer vervolgens een van de dochtercellen en volg deze zoals voorheen.
- Herhaal het proces (stappen 5.6.1 tot en met 5.6.4) voor de rest van de embryonale cellen om de volledige cellijn te traceren of om specifieke cellen van belang te volgen, zoals cellen die apoptose ondergaan.
- Vergelijk de gemuteerde afstamming met de stereotiepe WT C. elegans cellijn.
Representative Results
Om de embryonale ontwikkeling van een C. elegans-mutant voor het gen gsr-1 te karakteriseren, dat codeert voor het enzym glutathionreductase, vereist om gereduceerd glutathion (GSH) te regenereren en betrokken is bij het handhaven van redoxhomeostase in de nematode, voerden we 4D-microscopie uit van een gsr-1 (tm3574) deletiemutant die een functieverliesallel is dat een vroege embryonale arrestatie fenotype18 veroorzaakt. Zowel WT als gebalanceerde gsr-1 (tm3574) mutant C. elegans nematoden werden gekweekt op NGM-platen gezaaid met E. coli OP50 als voedselbron17. gsr-1 (tm3574) wormen werden twee generaties lang als heterozygoot gekweekt bij 20 °C en vervolgens werden scheidende homozygote wormen (die dankzij de maternale belasting tot volwassenheid kunnen opgroeien) verschoven naar 25 °C voor een nachtelijke incubatie voorafgaand aan embryo-analyse. Wormplaten werden geïncubeerd in kartonnen dozen om condensatie te voorkomen (figuur 1). Gravid nematoden werden opengesneden om jonge embryo's te extraheren.
Om de embryonale ontwikkeling van de mutant te vergelijken met de stereotiepe WT onder identieke omstandigheden, werden een WT (als controle) en een gsr-1 (tm3574) embryo op hetzelfde preparaat naast elkaar geplaatst. De 4D-microscopieworkflow werd uitgevoerd op een standaard gemotoriseerde rechtopstaande microscoop uitgerust met DIC-optica. De geselecteerde opnameparameters op het microscoopcontroleprogramma waren: z-stacks van 30 brandpuntsvlakken op 1 micron afstand elk, intervallen van 30 seconden tussen het begin van elke z-stack en 1500 z-stacks (12,5 uur opname). De opnametemperatuur werd aangepast naar 25 °C (zowel in de ruimte als op het microscoopstadium) (figuur 2).
Nadat de opname was voltooid, werd het beeldbestand geopend en werd de cellijn gereconstrueerd met behulp van afstammingstraceringssoftware door op celkernen in het videovenster te klikken (figuur 4). De getraceerde gsr-1 (tm3574) gemuteerde embryonale cellijn werd vergeleken met de C. elegans WT-afstamming op de achtergrond. Een belangrijk resultaat was de detectie van een progressieve vertraging van de celcyclus tijdens de embryonale ontwikkeling. Als gevolg hiervan werden gemuteerde embryo's in tussenstadia gearresteerd, terwijl WT-embryo's vorderden en uiteindelijk als larven uitkwamen.
Voorbereiding en directe observatie van embryo's onder de microscoop of immunostaining met antilichamen tegen late embryonale markers zou de aanwezigheid van een hoog percentage jonge embryo's in de mutant kunnen onthullen in vergelijking met de WT. Embryo-arrestatie zou dan kunnen worden afgeleid als de meest plausibele verklaring. Direct bewijs en exacte kwantificering van de celcyclusvertraging kunnen echter alleen elegant en gemakkelijk worden aangetoond en gekwantificeerd door middel van een 4D-microscopie-experiment. Andere belangrijke kenmerken van embryonale ontwikkeling zoals celdifferentiatie of apoptose (figuur 5) kunnen ook op een dynamische manier worden gevisualiseerd met behulp van 4D-microscopie die een gedetailleerde analyse biedt van meerdere aspecten van ontwikkeling in een enkel experiment.
Figuur 1: C. elegans-nematoden die onder laboratoriumomstandigheden groeien. Nematoden worden gekweekt op E. coli-gezaaide NGM-platen, opgeslagen in kartonnen dozen en geïncubeerd bij 15 °C, 20 °C of 25 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Screenshot van 4D-microscopie-opnamesoftware. Voorbeeld van twee verschillende microscoopbesturingssoftwareprogramma's (A en B). Deze programma's creëren workflows om de microscoop en het vastleggen van beelden tijdens 4D-microscopie-opname te regelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Seriefoto's van het preparaat en de montage van het C. elegans-embryo . A. Voorbereide agarbuizen. B-C. Voorbereiding van de agar pad. D. Glijbaan gedeeltelijk gevuld met water. E. De glijbaan afdichten met vaseline. F. Laatste voorbereiding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Seriële schermafbeeldingen van cellijntraceringssoftware. Het programma maakt reconstructie mogelijk van de embryonale cellijn van een celcyclusvertragingsmutant (links) en een WT (rechts) C. elegans-embryo . Een. Een vroege stap in de ontwikkeling. B-C. De ontwikkeling van beide embryo's vordert in de loop van de tijd. D. WT embryo ontwikkelt zich goed en begint verlenging terwijl de mutant arresteert. In alle gevallen geeft het programma het videovenster en het afstammingsvenster weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Linzen refractiele vorm van apoptotische cellen in een C. elegans WT embryo. Het lot van cellen, gedefinieerd door morfologische kenmerken, kan worden beoordeeld door 4D-microscopie. De afbeelding toont een C. elegans embryo in het bonenstadium . Levende cellen vertonen glad gevormde kernen omgeven door een korrelig cytoplasma. Daarentegen condenseren apoptotische cellen (gele pijlen) en nemen ze een linzenachtige, refractiele vorm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Een van de grootste uitdagingen in de moderne biologie is het begrijpen van de ontwikkeling van meercellige organismen. C. elegans is naar voren gekomen als een van de meest geschikte modellen voor het bestuderen van de fijne coördinatie tussen celproliferatie en celdifferentiatie in het zich ontwikkelende embryo. Vanuit optisch oogpunt maken het transparante lichaam en het kleine formaat deze nematode een ideaal monster voor DIC-microscopie. Andere organismen met vergelijkbare kenmerken zijn ook onderworpen aan 4D-microscopieanalyse 11,12,13,14,15,16.
Voor die ontwikkelingsstudies biedt geninactivatie door voorwaartse of omgekeerde genetica een aanwijzing voor zijn betrokkenheid bij embryogenese. Zodra is bewezen dat een gen een rol speelt in de ontwikkeling, is de volgende stap het definiëren van de exacte rol in het opstellen van het juiste lichaamsplan. Immunostaining is de gekozen aanpak voor de meeste modellen. Deze techniek verheldert problemen in celdifferentiatie of expressie van specifieke markers. Een belangrijke beperking van deze benadering is echter dat het alleen een statisch beeld geeft van de expressie van een enkele of meer markers op een vast punt in ontwikkeling. Een dynamisch beeld van deze markers gedurende de ontwikkeling kan alleen worden verkregen door verschillende embryo's op verschillende tijdstippen te kleuren. Bovendien is cellijnreconstructie niet mogelijk in dergelijke vaste monsters.
4D-microscopie is een aanvullende benadering voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling. Deze techniek onthult ontwikkelingsdynamiek op celniveau. Elk defect in het embryo, zoals problemen in spindeloriëntatie, celmigratie, apoptose, specificatie van het lot van cellen, enz., Zal verschijnen in een 4D-film die vooruit en achteruit kan worden gevisualiseerd, gekwantificeerd en gescoord door de onderzoeker. Met behulp van deze techniek kan vrijwel elke cel in het embryo worden gevolgd tot het moment dat het embryo begint te bewegen. Embryo's die worden onderworpen aan 4D-microscopie met alleen zichtbaar licht en Nomarski-optica lopen geen fotoschade op. Fluorescerende scans kunnen ook worden geïntercaleerd in de opname om te detecteren wanneer en waar een gen tot expressie wordt gebracht. Embryo's die aanzienlijke fotoschade lijden, worden geïdentificeerd door de celcyclusverlenging die sterke UV-bestraling veroorzaakt in vergelijking met een standaard WT-afstammingsembryo. In dat geval kan fotoschade worden verminderd door de intensiteit van de UV-lamp te verlagen en de gevoeligheid of belichtingstijd van de camera te verhogen. Morfologische kenmerken en moleculaire markers kunnen helpen de embryonale ontwikkeling van elke mutant te verduidelijken.
Het opzetten van een 4D-microscopiesysteem is eenvoudig te implementeren in het laboratorium en maakt, na enige oefening, een ongeëvenaarde analyse van celdynamica en afstammingstracering van celculturen en levende transparante monsters mogelijk op een resolutieniveau van elke cel in het microscoopveld. Cellijntracering op DIC-beelden wordt nog steeds met de hand verwerkt. Het is tijdrovend en hoewel de software afstammingsfouten detecteert, zoals verschillende afstammingstakken die dezelfde cel markeren, zijn fouten mogelijk. Hoewel automatische detectie van GFP-gelabelde cellen goed ontwikkeld is2, is aanvullende afstammingstraceringssoftware op basis van ongemarkeerde cellen en zichtbare lichtbeelden zich nog in een vroeg stadium en niet echt nuttig voor een volledige embryo-analyse. Zonder enige twijfel zal de toepassing van beeldherkenningssystemen op het gebied van zichtbaar lichtmicroscopie een grote vooruitgang op dit gebied teweegbrengen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de steun erkennen van de Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) en het Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda wordt gefinancierd door een fellowship van de AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caenorhabditis elegans (N2) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | N2 | WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Caenorhabditis elegans (VZ454) | GCG (Caenorhabditis Genetics Center) | VZ454 | gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/ |
| Cell Lineage Tracing software | SIMI | Simi BioCell | This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html |
| Microscope camera | Hamamatsu | Orca-R2 | Miscroscope camera for both transmitted and UV light |
| Microscope control software | Caenotec | Time to Live | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 Börßum, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de |
| Microscope control software | Micro-manager | Micro-manager | This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/ |
| Motorized microscope | Leica | Leica DM6000 | Motorized upright microscope to perform 4D microscopy |
| Standard equipment in a Molecular Biology lab. | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZ16FA | Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos. |
References
- Hardin, J. Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).
- Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).
- Nieto, C., et al. ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans. Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).
- Cabello, J., et al. PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans. Cell Death & Disease. 5, 1120 (2014).
- Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).
- Sáenz-Narciso, B., Gómez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated. Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).
- Zheleva, A. Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development. PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software. Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).
- Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).
- Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila. Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).
- Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata). Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).
- Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina. Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).
- Hejnol, A., Schnabel, R. The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations. Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).
- Hejnol, A., Schnabel, R. What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development. Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).
- Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions. Development. 135 (5), 953-962 (2008).
- WormBook. , Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
- Mora-Lorca, J. A. Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development. Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).
