Summary
本研究は、サンプル調製、測定、および結果の分析のためのH2020 ACEnanoプロジェクトの6パートナーの間で、紫外線可視分光(UV-Vis)を特徴とする金(Au)コロイド分散液用に開発された標準的な操作手順(SOP)を試験するために設計された、実験室間比較(ILC)のベンチマーク結果を提示する。
Abstract
ナノ材料(NMs)の物理化学的特性は、多くの場合、その小さなサイズ(ナノスケールでは少なくとも1次元、すなわち1〜100nm)、動的性質、および多様な特性のために、分析的な課題です。同時に、信頼性と再現性のある特性評価は、NM-BEARING製品の製造における安全性と品質を確保するために最も重要です。ナノスケール関連の特性を監視し、信頼性の高い測定を実現するために利用可能ないくつかの方法があり、その一例は紫外線可視分光法(UV-Vis)です。これは、NMサイズ、濃度、および凝集状態の非侵襲的かつ高速なリアルタイムスクリーニング評価を提供する、確立された、シンプルで安価な技術です。このような特徴は、特性評価方法の性能と再現性を評価することを目的とした検証済みの標準操作手順(SOP)の試験スキーム(PTS)を評価するための理想的な方法論である。本論文では、H2020プロジェクトの6つのパートナー研究所のPTSを、実験室間比較(ILC)を通じて評価した。異なるサイズ(5〜100 nmの範囲)の標準金(Au)コロイド懸濁液は、NMサイズ特性評価のための実装可能で堅牢なプロトコルを開発するために、異なる機関でUV-Visによって特徴付けられました。
Introduction
ナノマテリアル(NM)は、ナノスケール(1〜100nm)のユニークな特性により人気が高まっていますが、サイズ関連または量子効果(例えば、体積による比表面積の増加)、および異なる反応性、光学的、熱的、電気的、磁気特性などにより、バルク特性の特性とは異なります。.社会におけるNMsの応用は、ヘルスケア、食品産業、化粧品、塗料、塗料、エレクトロニクスなどの分野に幅広く関係しています3,4,5.金ナノ粒子(AuNPs)は、ナノテクノロジー(ヘルスケア、化粧品、電子アプリケーションなど)に広く適用されており、主にシンプルな製造、サイズ依存的な光学機能、表面官能化ポテンシャル、および物理化学的特性が多くの主要な用途に適しているためです6,7。
NMsの合成と特性評価における品質と再現性は、品質保証にとって非常に重要ですが、特にNMsの反応性、特にサイズ分布や形態などのNM特性が急速に変化する可能性のある複雑な環境において、ナノベースの製品の安全な製造のためにも非常に重要です。8,9.ナノスケール関連の特性を監視するために、数多くの方法が利用可能です。例えば、走査/透過型電子顕微鏡(SEM/TEM)は、NMsの光学的および組成情報の高解像度(サブナノメートルまで)を得るために使用される技術です。原子間力顕微鏡(AFM)は、垂直(z軸)次元でナノスケールの解像度を提供します。X線回折(XRD)は、NMsの原子構造に関する情報を提供します。これらの方法はすべて、乾燥サンプル(粉末)でのみ使用できます10,11.液体媒体中のNMsの特性評価に適した技術には、大きな分子、凝集体、粒子のサイズに基づいて分離できるフィールドフロー分画(FFF)が含まれます。ダイナミックライト散乱(DLS);ナノ粒子追跡解析(NTA)-ブラウン運動を用いた粒子のサイズ分布プロファイルを決定するために広く使用されている2つの方法と、単純な吸収測定によってサイズ、凝集状態、屈折率などのNM特性を評価できる紫外線可視分光度測定(UV-Vis)11,12,13.これらの技術はすべてNMの特性評価を可能にしますが、その性能は機器のセットアップ、機器関連の違い、サンプル調製のための複雑な方法論、およびユーザーの専門知識のレベルに依存します。さらに、ほとんどの技術では、NMサイズ、サンプルの完全性、または分散または凝集粒子間の分化のリアルタイムモニタリングが可能ではありません。6.UV-Vis分光法は、NMのサイズ、濃度、および凝集状態の非侵襲的かつ迅速なリアルタイム評価を提供する広く使用されている技術です。さらに、サンプル調製を最小限に抑えたシンプルで安価なプロセスで、この技術は多くの分野や市場の中で多数の研究所で広く使用されている不可欠なツールになります6,12,14.UV-Visは、液体サンプルを介して180〜1100nmの波長の電磁放射の透過率を測定することによって動作します。紫外線およびVISのスペクトル範囲は紫外線(170 nmから380 nm)、可視(380 nmから780 nm)、近赤外線(780 nmから3300 nm)の波長範囲をカバーする4,14.サンプルセルを通過する光の波長を測定します。試料に入る光の強さはIと呼ばれる0、そして反対側に出現する光の強さはIとして指定される114.ビール・ランバート法は、試料濃度C、サンプルの絶滅係数ε、および2つの強度の関数としてのA(吸光度)の関係を反映しています。14.吸収測定は、単一の波長または拡張スペクトル範囲を超えて収集することができます。測定された光透過率は、ビール・ランバート法の方程式に従って吸光度測定に変換されます。吸光度の標準式はA = ɛlcで、(A)は、特定の波長(ɛ)のサンプルが吸収する光量(吸光度/(g/dm)です。3) (l) は、光が溶液を通過する距離(cm)、(c)は単位体積あたりの濃度(g/dm)です。3).吸光度は、基準試料の強度の比として計算されます(I0)と未知のサンプル(I)、以下の式で説明する14:
UV-Visの簡易性は確立された測定の議定書のPTSを比較する理想的な技術6、12、15を作る。ILC または PTS の目的は、SOP15 を使用してメソッドのパフォーマンスと再現性を検証することです。これは、他のユーザーにナノ粒子懸濁液を迅速に特徴付けるための標準化されたアプローチを提供します。
ここで提示された方法の習熟度、一貫性、信頼性を評価するために、6つの研究所がHorizon 2020 ACEnanoプロジェクト(https://cordis.europa.eu/project/id/720952)のメンバーとしてILCに参加しました。ILCは、異なる粒径(5~100nm)の標準的なAuコロイド分散液のUV-Vis特性を持つ。SOPは、すべての関連する研究所に提供され、結果のAuNP中断の同一の調製、評価、および報告を行い、NM物理化学的特性評価、データ解釈、および産業および規制ニーズに対するベストプラクティスプロトコルの改善における実装可能で堅牢な階層化アプローチの開発に貢献しました8。
Protocol
1. AuNPサンプルの配信:
- 5,20,40,60,100 nmのサイズを持つ5mLのAuコロイド分散液のアリコートを用意し、50μg/mLサンプルの「未知のサイズ」を含む(使用するナノ材料の詳細については 、材料表 を参照)。
- ゲルパック付きの7 mLポリスチレン容器のサンプルを各参加ラボに送り、出荷中に適切な温度を維持します。サンプルは4°Cですぐに保管してください。
注: '不明なサイズ' サンプルは 80 nm のサイズを示す必要があります。この情報は、資料を配布するパートナーによって知られている必要がありますが、他のパートナーには開示されません。
2. 分光光度計のキャリブレーション:
- ランプが加熱されるように、UV-Vis分光計を少なくとも20分間オンにします。
注:使用する分光光度計のモデルとブランドについては、 材料表 をご参照ください。 - ソフトウェアで、モードウィンドウからスペクトラムスキャン オプションを選択すると、動作モードが表示されます。
- 計器|でパラメータ設定を調整する測定を進める前にソフトウェアの設定とパラメータ:測定モード|スペクトラムスキャン、データモード|ABS、開始波長680nm、380nmの終点波長、400 nm/分のスキャン速度、サンプリング間隔0.5、スリット幅1.5、パス長10。
- パラメータを設定した後、2つのキュベット(3 mL;ポリスチレン)に1 mLの超純水(UPW)(18.2 M·Ω·cm)を充填します。リファレンスセルホルダー(背面)とサンプルセルホルダー(フロント)にキュベットを配置して、ライトパスをカバーします(使用するキュベットの特定のブランドとモデルについては 、材料表 を参照)。
メモ:サンプルに関連しないノイズ効果やその他の環境効果をキャンセルするには、キュベットが正しく配置され、正しく整列されていることを確認してください。 - UV-Vis インストゥルメントカバーを閉じ、コマンドバーから「ブランク」を選択して、ブランクのキャリブレーションを続けます。ベースライン補正は、サンプルホルダに配置されたUPWの1 mLで満たされた2つのキュベットで参照を実行することによって行われます。他のパートナーが使用する代替プロトコルについては、補足情報 (SI) を参照してください。
3. サンプルの準備
- 5、20、40、60、100nmの各AuNPに対して500 μLのサブサンプルを取り、500 μLのUPWで希釈を準備します。
- 希釈した懸濁液を1 mLキュベットに入れる。全希釈比は1:1、最終濃度は25μg/mLである必要があります。
注: 希釈サンプルは、UV-Vis 測定の直前に準備する必要があります。
4. ナノ粒子分散の測定
- ブランクキャリブレーションが実行され、新しいサンプルが準備された後、サンプルセルホルダー(前面)のブランクキュベットの1つをAuNP分散サンプルに置き換えます。UPWの1 mLで満たされた他の参照キュベットは手つかずのままにしなければなりません。
注:サンプル間のクロスコンタミネーションを避けるために、異なるサンプル用の新しい使い捨てキュベットを使用してください。クオーツキュベットを使用する場合は、サンプル間の UPW でサンプルキュベットをすすいでください。 - コマンド バーから [メジャー/開始] オプションを選択し、希釈された各 AuNP 分散のスペクトル スキャンを実行します。未知のサイズのサンプルを含む、各AuNPサンプルに対して3つのスペクトルスキャンが実行されるはずです。
メモ:測定を実行する際は、空白のキュベットが参照セルホルダに残っていることを確認してください。
5. レポート結果
- スプレッドシート互換ファイルの各測定の生の実験データを抽出するには、[ ファイル]メニュー を選択し、[ レポートのエクスポート(*.csv)]をクリックします。
- UV-Vis の各測定値の最大吸収波長 (Absmax) とラムダ (λmax) に注意し、提供されたテンプレートに記録します。
注: あらかじめ設計されたテンプレートは、ワークブックで適切な計算式を設定することで、自動的に波長の平均標準偏差を計算するために ACEnano パートナーに提供されました。テンプレートの詳細とアクセスについては、 補足情報 (SI) を参照してください。 - ワークブックでは、既知のナノ粒子サイズ(nm)に対するλmax(y軸)の平均値を用いてキャリブレーション曲線をプロットします(5、20、40、60、および100nm)。たとえば、スプレッドシートで、コマンド バーの [データ] で [データ] を選択して、キャリブレーション カーブを作成|グラフ|の挿入散布図|近似曲線の|を追加する多項式曲線(パワー2)
- キャリブレーション曲線の多項式を含める: トレンドラインオプション|コマンド バーからチャート上に数式を表示 します(図 1)。
- 最後に、AuNPサンプルの未知のサイズを計算し、二次式の導出を用いて、未知のλmaxの平均値に合わせてキャリブレーション曲線から多項式を分離する(図1)。計算されたサイズをテンプレートに含めて、データの完全な要約を完成させ、一貫性、解釈、および結果の評価を迅速に行うことができます(SI を参照)。
図1:未知のサンプルのサイズを計算する検量線。 プロットは、キャリブレーションのプロットに使用される波長(λmax)とオーンのサイズを表します。プロットは、1つのパートナーからの1つのキャリブレーション曲線のみを示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
UV-Visは、Absmaxやλmax6,12などのNMsの特性を正確に分析できるため、ナノ粒子の特性評価に最も人気のある技術の1つです。本研究の結果は、6つの参加ラボ間のILCを通じたAuNP分散のUV-Vis特性を表しています。
図2:ラムダと吸光度の結果。 この図は、各研究所が異なるAuNPサイズについて報告した結果のプロットを示しています。 A) ラムダの最大結果。 B) 吸光度の最大結果。実験室5は、サンプル汚染のために100nmのデータを報告できなかった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
λmax波長の結果は、パートナー間で密接な再現性を示した(図2A)。これは、値間の差を評価するために使用された計算された範囲の場合で、AuNPサイズの大部分で1.00と2.40(λmax)の間の小さな違いを示しました(表1)。全体のλmax平均は、各AuNPサイズに対して各実験室の記録平均を使用して計算され、同様にほとんどのサイズの低標準偏差を表示した。100 nmのサイズは、パートナー間の変動範囲(4.66λmax)が高く表示され、他のAuNPサイズと比較して標準偏差(572±2.00 nm)が大きいため、唯一の免除でした(表1)。検査室5は、結果の再現性を損なう可能性のある汚染の問題のために、100 nmサイズの粒子に対して測定を行えないことを言及することが重要である。
これに対し、吸光度結果(Absmax)は、λmaxの結果と比較して、より散乱した範囲のデータ値(図2B)を示した。実験室間でのこれらの結果の明らかに高い変動にもかかわらず、分析はλmaxの結果と比較して、より低い標準偏差と予想外の変動範囲(0.11-0.21 Absmax)を持つ全体的な平均を表示しました(表1)。
| 価値 | オープン (nm) | |||||
| 5 | 20 | 40 | 60 | 100 | 不明 | |
| 範囲 λmax | 1.45 | 1.00 | 3.00 | 2.00 | 4.66 | 2.40 |
| 範囲オーマックス | 0.12 | 0.11 | 0.13 | 0.13 | 0.12 | 0.21 |
| 平均λmax | 517.7 ± 0.59 | 524.6 ± 0.45 | 527.8 ± 1.13 | 535.3 ± 0.74 | 572 ± 2.00 | 549.7 ± 0.85 |
| 平均オーマックス | 0.395 ± 0.048 | 0.497 ± 0.050 | 0.509 ± 0.057 | 0.689 ± 0.055 | 0.472 ± 0.051 | 0.661 ± 0.101 |
表1:ラムダと吸光度の計算範囲と平均値各 AuNP サイズの範囲と全体平均値と標準偏差が表示されます。各実験室のラムダと吸光度に関して報告された平均値(6回の測定)を用いて計算した結果は、実験室5によって報告されたサンプル汚染による値を計算するのに5つの測定値しか使用されなかった100nmのサイズを除いて計算した。
Zスコア値も計算され、全体の平均値からの個々の値の距離を記録しました。Zスコアの分析は、ILC結果の信頼度に関する情報を提供し、スコアは、多くの標準偏差で、データポイントが平均16からどれくらい離れているかを表示することによって、母集団分布に直接関連しているためである。結果では、ほとんどのラボはλmaxに対して0.01~1.93の正のZスコア値を示し、結果のほとんどが平均に近く、正規分布曲線を示しました。Absmaxの最高Zスコアは、実験室1によって報告された40nmサイズについて記録され、値は1.93、Absmax平均は530±0で、全体の平均は527.82±1.13と比較した(図3A)。λmaxの最大Zスコア値1.23は、報告されたλmaxが0.395±0.04の全体平均と比較して、5 nm AuNPサイズの0.454±0の報告されたλmaxと共に報告されました。その後、60 nm AuNP は Z スコア 1.18、λmax 平均は 0.689 ± 0.05 と比較して 0.754 ± 0 でした。残りのサイズでは、Z スコア値 -0.04 ~ -1.23 が表示されます (図 3B)。
図3:ラムダと吸光度Zスコア Zスコアは、各研究室が全体の平均に対して報告した結果を用いて計算した。 A) 計算ラムダの最大 Z スコア。 B) 計算された吸光度の最大Zスコア。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
未知のサンプルの結果は、ほとんどのパートナーが76-80 nmのサイズを計算したことを示しました。実験室1-4および6の平均は1.36nm±78.02として記録された。実験室5は109nmのより大きなサイズを報告し、全体の平均および標準偏差を12.70nm±83.18まで広げ、この値が外れ値であることを示唆した(図4A)。Zスコアは、すべての研究所で -0.25 ~ -0.56 の間に計算されました。唯一の例外は、実験室6によって報告された未知のサイズで、すべての測定値と比較して最高の正のZスコア(2.03)を表示しました(これは平均から離れた値と考えることができます)。(図4B)。
図4:不明なサンプルサイズとZスコア A) 提供された未知のサンプルについて、各実験室の報告されたサイズ。 B) 83.18 ± 12.70 nm の全体の平均に対する個々の結果の Z スコアを計算しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足情報(SI):このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
ナノスケール関連特性(例えば、分析超遠心化(AUC)、走査型電子顕微鏡/透過電子顕微鏡(SEM/TEM)、および動的光散乱(DLS)10,11)の特性評価にはいくつかの方法があります。しかし、これらの技術は、NMs12,13の特性評価における一次結果を得るためにUV-Visのシンプルさを欠いている。UV-Visは、設備の整っていない研究所でも一般的な機器であり、NMs6の特徴付けに最適なツールです。NMを特徴付ける際には、適用する技術の限界、長所、および弱点を考慮することが重要です。UV-Vis分光計では、光ビームがサンプルコンパートメントを通過し、吸収値を得ます。その結果、外部振動、外光、汚染物質、およびユーザの性能が測定および結果4,12に干渉する可能性があります。同様に、未知のサンプルのサイズを決定するためにキャリブレーションカーブをプロットする場合、不足している因子が測定値とユーザーの間の変動に寄与する可能性があるため、キャリブレーションの構築に必要なすべての測定値を登録することが重要です。
例えば、未知のサンプルの全体的なAbsmax平均の高い変動は、ビーム強度、位置、および機器自体の間の依存性のために実験室間の差にリンクされる可能性があります17,18。さらに、実験室5から100nmサイズの欠損データは、汚染問題のために、結果との間の高い差に寄与する可能性があり、欠落データが未知のAuNP懸濁液のサイズを計算するために使用される検量線とプロットされた多項式に影響を及ぼす可能性がある。確かに、多くの要因が実験室活動の一貫性の欠如に寄与し、研究者が時折他の研究室からの発見を再現できず、科学的進歩の遅れ、時間、お金、リソース19につながる可能性があるため、プロトコルと研究所の間の再現性は複雑になる可能性があります。特にサイズの物理化学的特性の特性評価に成功するには、すべての参加ラボによる実行が容易な方法が必要であり、SOPの作成、機器訓練、誤認または交差汚染サンプルの使用を回避するなど、体系的かつ概念的な複製に従うことによって、ほとんどに対処することができます。
同様に、コロイド懸濁液の質と安定性も考慮すべき重要な要因であり、その物理化学的性質の変化は異なる結果をもたらす可能性があるためである。したがって、より長い期間の安定性を確保するために、ナノ粒子懸濁液は4°Cの暗闇の中に保存されるべきである。 同様に、出荷プロセス中に、室温で長い期間が有意な集計20につながる可能性があるため、アリクォートされたサンプルは冷たく保たれるべきである。さらに、NM特性評価の障害を克服するためには、特にILC15を通じて能力、一貫性、信頼性を評価する際に、共同ラボ間の元のデータ、プロトコル、主要な研究資料へのアクセスを提供する必要があります。これらの要素を明確かつアクセス可能にすることは、あらゆる実験室や機器によるNM特性評価を成功させるために重要です。これらの側面を無視すると、再現性、正確さ、誤解を招く、または誤った結果が得られなくなる可能性があります15。UV-Vis分光法は、NM特性評価においてゴールドスタンダードであることが実証されていますが、無機化合物と有機化合物6,21の両方で、拡張されたダイナミックレンジのソリューションを定量的に決定できるため、他の多くの分野で活用することができます。
また、UV-Visは他のツールと簡単に組み合わせて、さまざまな属性を測定し、解析の品質を向上させることができます。これらの特徴に基づき、UV-Visは高濃度タンパク質溶液中のUV-Visスペクトルを測定することによりバイオ医薬品分野など多くの分野で広く使用されており、汚染物質とその製品関連不純物の類似性をリアルタイムで比較する環境制御において、廃水色決定及び許容レベル22の規制の一環としてプラントの産業排水処理プラントにおいて、23.確かに、技術が進歩し、より高度な機能と経験が分光光度測定で利用可能になるにつれて、この技術を用いて測定できるアプリケーションやパラメータのさらなる広がりが起こります22。例えば、現場のアプリケーションでは、オンラインUV-Visの分光法は、リアルタイムで、および様々なタイプの液体で多数のパラメータを監視するための貴重なツールであり、オンラインセンサーシステム22の間で例外的な特徴です。
ここで説明するILCは、H2020 ACEnanoプロジェクトに関わる6つの参加ラボの中でUV-Vis用に開発されたSOPのテストとして設計されました。結果の分析は、ILCが各参加者の研究室でNM特性評価のための内部方法の技術的な信頼を可能にする貴重な情報を提供することを実証しました。確立されたテンプレートのデータ収集は、結果の一貫性と迅速な解釈を確認し、未知のAuNPサンプルのサイズを推定するためのモデルを提供し、検量線内の十分な点が含まれていたときに結果間の再現性も示した。さらに、この結果は、NM特性評価におけるUV-Visの有効性と、ベストプラクティスプロトコルの作成の重要性を検証した。このようなアプローチは、さらに、認定規制当局や研究管理機関に関連する方法選択とデータ解釈に基づく再現可能なNM特性評価プロトコルを通じて、実施された手続きが立法枠組みの発展に貢献する機会を提供する。
Disclosures
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
Acknowledgments
ACQは、メキシコの国立科学技術評議会(CONACyT)が博士号を取得してくれたことに感謝したいと思います。すべての著者は、助成金契約の下で欧州連合ホライゾン2020プログラム(H2020)からの支持を認める no 720952, プロジェクトACEnano (呼び出し NMBP-26-2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorption Ultra-Micro-cuvette, 200 µL | Hellma | 105.201-QS | |
| Cary 5000 spectrophotometer (Spectrophotometer C) | Agilent | Cary 5000 | |
| Gold nanoparticles 5 nm | BBI solutions | EM.GC5 | |
| Gold nanoparticles 20 nm | BBI solutions | EM.GC20 | |
| Gold nanoparticles 40 nm | BBI solutions | EM.GC40 | |
| Gold nanoparticles 60 nm | BBI solutions | EM.GC60 | |
| Gold nanoparticles 80 nm | BBI solutions | EM.GC80 | |
| Gold nanoparticles 100 nm | BBI solutions | EM.GC100 | |
| Agilent / HP 8453 (Spectrophotometer E) | |||
| Jenway 6800 spectrophotometer (Spectrophotometer A) | Jenway | UV6800 | |
| Polystyrene cuvette, 1.5 mL, micro 10 mm pathlength | Sigma | 759015 | |
| Polystyrene cuvette, 3 mL (10 mm x 10 mm x 45 mm) | Sarstedt Inc | 67.742 | |
| Semi-micro quartz cuvette, 1mL (1 mm x 10 mm x 45 mm) | Agilent | 6610001 | |
| Ultrapure water (UPW) (18.2 MΩcm). | / | / | |
| UV-1800 spectrophotometer (Spectrophotometer B) | Shimadzu | UV1800 | |
| Varian Cary 50 spectrophotometer (Spectrophotometer D) | Agilent | Cary 50 |
References
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