Summary
Мы описываем модифицированный метод на основе агара, предназначенный для количественной оценки противогрибкового воздействия растительных продуктов. С помощью этого протокола можно оценить как летучий, так и нестабильный вклад в противогрибковую активность. Кроме того, эффективность против грибов может быть измерена на ключевых стадиях развития в одной экспериментальной установке.
Abstract
Описанный протокол основан на методе передачи плагинов, который позволяет точно определить количество микроорганизмов и их стадии развития. Определенное количество спор распространяется на агар-пластину. Эта агарная пластина инкубируется в течение определенного периода, чтобы позволить грибам достичь ожидаемой стадии развития, за исключением спор, где инкубация не требуется. Агар пробки, покрытые спорами, гифа, или мицелий затем сняты и переданы на агар сми, содержащие противогрибковые соединения для тестирования либо размещены на расстоянии от грибов или в контакте. Этот метод применим для тестирования как жидких экстрактов, так и твердых образцов (порошков). Он особенно хорошо подходит для количественной оценки относительного вклада летучих и не летучих веществ в биологически активных смесях и для определения их воздействия, в частности на споры, раннюю гифе и мицелий.
Метод крайне актуален для характеристики противогрибковой активности продуктов биоконтроля, в частности продуктов растительного происхождения. Действительно, для обработки растений, результаты могут быть использованы для руководства выбор способа применения и установить триггерные пороги.
Introduction
Глобальные потери фруктов и овощей могут достигать до 50%производства 1 и в основном в результате распада продуктов питания, вызванного порчу грибов в поле или во времяпослеуборочного хранения 2,3, несмотря на обширную занятость синтетических фунгицидов ссередины двадцатого века 4. В настоящее время пересматривается вопрос об использовании этих веществ, поскольку оно представляет собой серьезную опасность для окружающей среды и здоровья. Как вредные последствия их использования появляются во всех экосистемах и доказательства потенциального воздействия на здоровьенакопилось 5,6, новые альтернативы старой профилактической стратегии разрабатываются для до- и после сбора урожаялечения 7,8,9. Поэтому задача, с которой мы сталкиваемся, дыдная. Новые фунгицидные стратегии должны, во-первых, поддерживать уровень эффективности продовольственной защиты от фитопатогенов и, соответственно, способствовать значительному снижению воздействия сельскохозяйственной практики на окружающую среду. Для выполнения этой амбициозной цели, стратегии, вдохновленные естественной защиты развивались в растениях в настоящее время предлагается, как более 1000 видов растений были выделены для их противомикробныхсвойств 8. Например, растения, которые разработали природные фунгициды для борьбы с фитопатогенами являются новым ресурсом в изучении разработки новых продуктов биоконтроля2. Эфирные масла являются флагманскими молекулами этого типа. Например, эфирное масло Origanum защищает томатные растения от серой плесени в теплицах 10 и Solidago canadensis L. и cassia эфирных масел было показано, чтобы сохранить пост-урожай клубники от повреждения серойплесени 11,12. Эти примеры иллюстрируют, что биоконтроль и, в частности, растительные продукты представляют собой решение, которое сочетает в себе биологическую эффективность и экологическую устойчивость.
Таким образом, растения являются важным ресурсом молекул, представляющих потенциальный интерес для растениеводства. Однако только горстка растительных продуктов были предложены для использования в качестве продуктов биоконтроля, хотя они, как правило, признаются безопасными, нефитотоксические и экологически чистые2. Некоторые трудности в транспозиции из лаборатории в поле наблюдались, такие как снижение эффективности после применения in vivo2,9. Таким образом, становится важным улучшить способность лабораторных тестов лучше прогнозировать эффективность поля. В этом контексте методы противогрибкового тестирования растительных продуктов необходимы как для оценки их противогрибковой эффективности, так и для определения их оптимальных условий для использования. В частности, продукты биоконтроля, как правило, менее эффективны, чем химические фунгициды, поэтому лучшее понимание их способа действия важно для предложения подходящих формулировок, определения способа применения в полях и определения того, какая стадия развития патогена уязвима для биопродукта кандидата.
Современные подходы к борьбе с антибактериальной и противогрибковой деятельностью включают методы диффузии, такие как диффузия агар-диска, разбавление, биоаутография и цитометрия потока13. Большинство из этих методов, и более конкретно, стандартное тестирование противогрибковой восприимчивости - агар-диск диффузии и разбавления анализы - хорошо приспособлены для оценки антимикробной активности растворимых соединений на бактериальных и грибковых спор в жидких суспензиях14. Однако эти методы, как правило, не подходят для тестирования твердых соединений, таких как сушеный растительный порошок или количественной противогрибковой активности во время роста мицелия, поскольку они требуют разбавления спор или споры, распространяющиеся на агарных пластинах и/или разбавления противогрибковых соединений13. В пищевой отравленный метод, агар пластин, содержащих противогрибковое вещество прививаются с 5-7 мм диаметр диска взяты из 7-дневной культуры грибов без рассмотрения точного количества начала мицелия. После инкубации противогрибковая активность определяется как процент радиационно-роста ингибирования17,18,19. При этом подходе мы можем оценить противогрибковую активность на мойцелиальный рост. В отличие от этого, метод разбавления агара выполняется для определения противогрибковой активности на спорах, непосредственно привитых на поверхности агарной пластины, содержащей противогрибковые соединения13,20,21. Эти два подхода дают дополнительные результаты по противогрибковой активности. Однако это два независимых метода, используемых параллельно, которые не обеспечивают точного параллельного сравнения относительной эффективности противогрибковых соединений на споры и мицелий17,20,22 как количество стартового грибкового материала отличается в двух подходах. Кроме того, противогрибковая активность растительного продукта часто является результатом сочетания противогрибковых молекул, синтезированных растениями, для борьбы с патогенными микроорганизмами. Эти молекулы включают белки, пептиды23,24, и метаболиты, имеющие широкое химическое разнообразие и принадлежащие к различным классам молекул, таких как полифенолы, терпены, алькалоиды25, глюкозинолаты8, и органосульфурные соединения26. Некоторые из этих молекул летучих или становятся летучими во время патогенной атаки27. Эти агенты чаще всего плохо водорастворимые и высокого давления пара соединений, которые должны быть восстановлены с помощью дистилляции воды в качестве эфирных масел, некоторые из которых антимикробной деятельности были хорошо установлены28. Анализы опосредованности паровой фазы были разработаны для измерения антимикробной активности летучих соединений после испарения и миграции через фазу пара29. Эти методы основаны на введении противогрибковых соединений на расстоянии от микробной культуры29,30,31,32,33. В обычно используемых пара фазы агара анализ, эфирные масла откладываются на бумажном диске и помещается в центре крышки чашки Петри на расстоянии от бактериальных или грибковых спор подвески, которая распространяется на агар среды. Диаметр зоны ингибирования роста измеряется так же, как и метод диффузии агар-диска20,24. Были разработаны другие подходы для количественного измерения противогрибковой восприимчивости эфирных масел к паровой фазе, полученной на основе метода разбавления бульона, из которого была рассчитана ингибирующая паровая фаза опосредованная противомикробная активность32, или полученных из агар-диск диффузии анализы31. Эти методы, как правило, специфичны для исследований паровой фазы активности и не подходят для анализа контактных ингибиции. Это исключает определение относительного вклада летучих и нестационатных веществ в противогрибковую активность сложной биоактивной смеси.
Количественный метод, который мы разработали, направлен на измерение противогрибкового эффекта сухого растительного порошка на контролируемые количества спор и выращенного мицелия, отложенного на поверхности агар-среды, чтобы воспроизвести воздушный рост фитопатогеновво время заражения растений 15, а также взаимосвязанной мицелиальнойсети 16. Этот подход является модифицированной экспериментальной установкой, основанной на методах разбавления агара и пищевых отравленных продуктов, что также позволяет в той же экспериментальной установке количественно оценить вклад как летучих, так и нестационарных противогрибковых метаболитов. В этом исследовании метод был схвеирован с активностью трех хорошо охарактеризованных противогрибковых препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка инойкулы
- До эксперимента, лежал 5 йл Триходерма spp. Споры SBT10-2018 хранятся при 4 градусах Цельсия на картофеле декстроза агар среды (PDA) и инкубировать в течение 4 дней при 30 градусов по Цельсию с регулярным воздействием света для содействия образованию конидии42 (Рисунок 1, панель А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Trichoderma spp. SBT10-2018 был изолирован от древесины и используется в качестве модели в этом исследовании для его быстрого роста и простоты восстановления спор. Этот штамм сохраняется нашей лабораторией. - Восстановление конидии(рисунок 1, панель A)
- Положите 3 мл 0,05% Tween-20 на мицелий Триходерма.
- Используйте грабли, чтобы освободить конидию от конидиопор; избегать нажатия на мицелий, чтобы предотвратить разрыв гифы.
- Быстро восстановите раствор с помощью микропипетта, чтобы избежать его поглощения агар-средой и переноса в трубку 15 мл.
- Подсчитайте общее количество спор с помощью гемоцитометра и подготовьйте раствор, содержащий 3 х10 6 спор/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен тщательно, чтобы предотвратить извлечение гифы. Затем подготовка спор проверяется под микроскопом. В конце концов, для штаммов, представляя высоко воздушный и пушистый мицелий, шаг фильтрации с использованием 40 КМ фильтра ситечко может быть добавлен для устранения остаточного фрагмента мицелия.
2. Подготовка грибковых пластин(рисунок 1, панель B)
- Депозит 100 йл 3 х10 6 спор / мл с микропипеттой на 9 см диаметром Петри блюдо, содержащее КПК среды для получения 4800 спор /см 2, соответствующие 925 спор / 5 мм диаметр-агар штепсельной вилки.
- Добавьте 10 г стеклянных бусин диаметром 2 мм со стерильным шпателем и выполните движения вперед и назад параллельно и перпендикулярно руке оператора, чтобы равномерно распределить споры на поверхности агара.
- Поверните пластину на 90 градусов и повторите вращающиеся движения (как в разделе 2.2); повторить эти шаги, пока пластина была полностью повернута.
- Используйте пластину немедленно, чтобы настроить эксперименты, требующие спор или инкубировать пластины при 30 градусов по Цельсию в течение 17 ч или 24 ч, когда ранние гифе или мицелий, соответственно, необходимы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения противогрибковой активности, измеренной после переноса мицелия и мицелия диска, используйте стерильные пинцеты и поместите стерильные 5 мм целлюлозные диски случайным образом на поверхность агар-пластины после распространения спор.
3. Препарат противогрибковых соединений
- Приготовление растительного продукта: приготовление чесночного порошка
- Очистите зубчики свежего чеснока и разрежьте гвоздику на 2-3 мм в ширину ломтиками скальпелем.
- Высушите ломтики в течение 2 дней при 40 градусах Цельсия.
- Измельчить ломтики в течение 3 х 15 секунд с помощью ножа мельницы, чтобы получить мелкий порошок.
- Храните чесночный порошок при 4 градусах Цельсия в трубках 50 мл перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку чеснок не автоклав (для предотвращения деградации чувствительных к температуре противогрибковых соединений) очистить мясорубку, скальпель, и воздух-сухой с 70% этанола перед использованием.
- Подготовка эфирного масла
- Подготовка 0,5%, 1%, 2,5%, 5% и 20% Thymus vulgaris эфирных растворов масла в 0,5% Tween-80.
- Хорошо перемешайте, чтобы сформировать эмульсию, прежде чем добавить ее в среду КПК (см. раздел 4.2).
- Препарат Карбендазим
- Взвешивание карбендазима для приготовления раствора этанола 200 мг/л (карбендазим плохо растворяется в воде).
- Храните раствор при комнатной температуре, прежде чем добавлять его в среду КПК (см. раздел 4.2).
ВНИМАНИЕ: Карбендазим представляет опасность для здоровья и окружающей среды. Носите перчатки и маску при обращении с этим продуктом. Храните его в проветриваемом помещении.
4. Анализ ингибирования контактов
- Приготовление агарных тарелок, содержащих чесночный порошок
- Подготовка и автоклав КПК среды.
- Взвесьте желаемое количество чесночного порошка в трубку 50 мл с помощью стерильного шпателя, чтобы получить концентрации обычно от 0,25 мг/мл до 16 мг/мл.
- Добавьте 10 мл КПК после проверки температуры среды на внутренней стороне запястья. Температура должна быть как можно ниже, чтобы предотвратить деградацию чувствительных молекул. В идеале эта температура должна быть 45 градусов по Цельсию.
- Гомогенизировать тщательно, повернув трубку вверх дном, чтобы равномерно распределить порошок в среде КПК. Быстро залить 10 мл в чашку Петри диаметром 5 см(рисунок 1, панель C).
- С чашкой Петри, помещенной при комнатной температуре, подождите, пока агар затвердеет.
- Приготовление агарных пластин, содержащих эфирное масло или карбендазим
- Ввеми 10 мл КПК в трубку 50 мл. Проверьте температуру, как для раздела 4.1.3.
- Добавьте 100 МКЛ различных растворов эфирного масла Thymus vulgaris в КПК, чтобы получить 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% и 0,2% растворов (см. раздел 3.2.1).
- Добавьте необходимый объем карбендазима из раствора 200 мг/л для получения растворов в диапазоне от 0,0625-2 мг/л (см. раздел 3.3.1).
- Гомогенизировать тщательно, повернув трубку вверх дном, быстро залить 10 мл в 5 см диаметром Петри блюдо(рисунок 1, панель C).
- С чашкой Петри, помещенной при комнатной температуре, подождите, пока агар затвердеет.
- Анализ ингибирования контакта(рисунок 1)
- С 5 мм диаметром стерильной трубки из нержавеющей стали, участок круг в центре Петри блюда, содержащие либо КПК или КПК, включая противогрибковые соединения. Утилизация агар-цилиндра с помощью стерильной зубочистки (панель C).
- С 5 мм диаметром стерильной трубки из нержавеющей стали, участок круги случайным образом в грибковые пластины из раздела 2. Участок между 15-20 кругами на тарелку (панель B).
- Аккуратно свяйте агар-цилиндры, покрытые спорами, ранними гифей или мицелием со стерильной зубочисткой и поместите пробки в пустое пространство чашек Петри, содержащих либо КПК, либо КПК, включая противогрибковые соединения (панель C).
- Инкубировать пластины, содержащие споры для 48 ч при 30 градусов по Цельсию, 31 ч для пластин, содержащих ранние гифе и, 24 ч для пластин, покрытых мицелием (панель C).
- Измерьте диаметр радиального роста и рассчитайте процент ингибирования грибкового роста над контролем с помощью формулы (панель D)
% ингибирование грибкового роста ( C - A/C)
где C является диаметр радиального роста в среде КПК и диаметр радиального роста в среде КПК, содержащей противогрибковые соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения противогрибковой активности, измеренной после переноса мицелия и переноса мицелия диска, с помощью стерильных пинцетов, перенесите один диск диаметром 5 мм, ранее депонированную на поверхность грибковых пластин (раздел 2 примечание) в центре чашек Петри, содержащих ЛИБО ИЛИ КПК, содержащих противогрибковые соединения, и поступить точно так же, как для передачи агар-плуга
5. Анализ ингибирования паровой фазы
- Приготовление агарных тарелок, содержащих чесночный порошок
- Продолжить, как в разделе 3.1.
- Приготовление агарной пластины, содержащей эфирное масло или карбендазим
- Продолжить, как в разделе 3.2 и 3.3.
- Приготовление грибковых тарелок
- Продолжить, как в разделе 2.
- Анализ противогрибкового ингибирования паровой фазы(рисунок 1)
- Налейте 10 мл PDA среды в крышку 5 см диаметром Петри блюда, содержащие либо 10 мл КПК среднего или 10 мл PDA среды, содержащей противогрибковые соединения в нижней части посуды. Подождите до полной затвердевания агара при комнатной температуре (панель C).
- Используйте центробечные трубки 50 мл в качестве инструмента калибровки для получения круга КПК в центре крышки; удалить КПК вокруг круга с помощью стерильного шпателя (панель C).
- Участок круг в центре среды КПК помещены в крышку с 5 мм диаметром стерильной трубки из нержавеющей стали. Откажитесь от агар-цилиндра стерильной зубочисткой (панель C).
- Форма пробки с 5 мм диаметром стерильной трубки из нержавеющей стали случайно в грибковые пластины, как в разделе 4.3.2 (панель B).
- Используя стерильную зубочистку, тщательно перенесите пробки, покрытые спорами, ранними гифейами или мицелием из грибковых пластин, в крышки анализных пластин (панель C).
- Инкубация при 30 градусах цельсия, как в разделе 4.3.4 (панель C).
- Измерьте диаметр радиального роста и рассчитайте процент ингибирования грибкового роста с помощью формулы в разделе 4.3.5 (панель D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы оценить способность количественного метода различать способ действия различных видов противогрибковых соединений, мы сравнили эффективность трех известных противогрибковых препаратов. Карбендазим является не летучих синтетических фунгицидов, который широко используется для контроля широкого спектра грибковых заболеваний врастениях 39,40. Эфирное масло Thymus vulgaris было в значительной степени описано за его антибактериальную и противогрибковую активность и используется в качестве натурального пищевого консерванта41. Чесночный порошок был выбран в качестве модели биопродукта растительного происхождения. Он традиционно используется в качестве природного средства с антимикробной деятельности, которые в значительной степени были отнесены к присутствию летучих соединений органосульфура, но и наличие нестабильных сапонинов ифенольных соединений 26, давая этой модели сложности, соответствующие в данном исследовании.
Этот количественный метод опирается на передачу агар пробки, содержащие контролируемое количество гриба на разных стадиях развития от спор до мицелия в то время как в пищевой отравленный метод, 5-дневный до 7-дневного мицелия передается из целлюлозыдисков 13. В анализе в качестве исходного грибкового материала использовались споры, ранние гифы (17 ч инкубации) и мицелий (24 ч инкубации). Использование передачи диска не может быть актуальным, как конидия или остаточный гифа остаются по крайней мере частично на агар среды после передачи диска, что впоследствии приводит к неточным измерения ингибирования роста, как показано на рисунке 2. Различные диаметры грибково-радиального роста наблюдались после переноса агарных участков, расположенных под целлюлозными дисками, за которыми последовала инкубация 24ч (рисунок 2,панели A, B и C), подчеркивая наличие остаточной грибковой гифы на агаре после передачи диска. Количественная оценка остаточного гифа была подтверждена измерением роста, что привело к изменчивости диаметра до 22%(рисунок 2, панель D). Влияние на ингибирование роста было затем оценено с использованием эфирного масла Thymus vulgaris в качестве противогрибкового соединения и по сравнению с ингибированием, полученным после переносаагар-плуга (рисунок 2, панель E). Ингибирование роста после передачи диска было выше, чем после переноса агар-штепсельной вилки для низких концентраций масла Тимуса, что привело к чрезмерной оценке ингибирующего эффекта, который может быть связан с неполной передачей грибкового материала и поддерживать подход, основанный на передаче агар-плуга.
Триходерма spp. SBT10-2018-рост ингибирование вызвано тремя противогрибковых соединений была затем оценена с помощью контакта и пара фазы ингибирования анализы для каждого грибкового этапа (Рисунок 3). Споры были тщательно распространены на агар пластин для получения 4800 спор / см2. Они были непосредственно переданы на агар пластин, содержащих противогрибковые соединения через агар-подключаемой экстракции с помощью 5 мм стерильной трубки из нержавеющей стали, что позволяет эксперимент, чтобы начать со спор. На двух других стадиях развития агаровые пластины, покрытые спорами, сначала инкубировались на 17 ч или 24 ч при 30 градусах Цельсия, прежде чем передать агарную вилку, чтобы обеспечить прорастание и раннее развитие гифы (17 ч) и мицелийного образования (24 ч)(рисунок 3, панель А). Для количественной оценки вклада активных летучих молекул в общую противогрибковую активность, анализ ингибирования контакта был адаптирован и споры, ранние гифе, и мицелий были помещены на расстоянии от противогрибковых соединений вылил в КПК среды, как для контакта ингибирования анализа. Trichoderma-радиальный рост был измерен в течение 48 часов и процент ингибирования был определен по сравнению с условиями контроля. Минимальная ингибирующая концентрация (ВПК) была определена как самая низкая концентрация противогрибковых соединений, предотвращая видимый рост после 48 ч инкубации при 30 градусах Цельсия.
Рисунок 3(панель B) показывает более высокую чувствительность спор к карбендазиму по сравнению с ранними сетями гифе и мицелия с 50%, 22% и 30% ингибированием роста соответственно при 0,25 мкг/мл карбендазиме, когда Триходерма и противогрибковые соединения были в контакте. В то же время на ранних удлинениях гиф и мицелии было получено значение МИЦ в 0,5 мкг/мл, в то время как на ранних гифах и мицелии было получено увеличение до 0,75 мкг/мл. В отличие от этого, карбендазим не имел противогрибкового воздействия на Триходерму, когда гриб был помещен на расстоянии от фунгицида в соответствии с низкой волатильностью этого вещества. Результаты, которые мы получили с использованием эфирного масла Thymus vulgaris (TEO) в качествепротивогрибкового соединения (рисунок 3, панель C) показали более высокую чувствительность спор к TEO по сравнению с ранними гифей и мицелием с 65% и приблизительно 50% ингибирование роста на 0,01% TEO соответственно. Полученные значения MIC были схожи по прорастанию спор и раннему удлинению гифы (0,025% TEO) и выше для роста мицелия (0,05% TEO). Как и ожидалось, эфирное масло Thymus vulgaris представляло идентичную противогрибковую активность независимо от расстояния, между грибком и маслом. Аналогичные значения MIC (0,025% TEO) были получены при прорастании спор и ранней удлинению гифы для анализа контактов и паровой фазы, хотя при более низком проценте наблюдалась более высокая чувствительность, когда споры TEO и Trichoderma были в контакте (60% ингибирование роста при контакте против 45% ингибирования роста на расстоянии). Удивительно, но значения MIC, полученные на мицелии, отличались в анализах ингибирования контактно-фазной фазы (0,05% против 0,1%) предполагая, что какая-то часть летучих молекул не активна против хорошо развитого мицелия. Наконец, при использовании чесночного порошка в качестве противогрибковогосоединения (рисунок 3, панель D), более высокая эффективность наблюдалась против прорастания спор (50% ингибирование роста при 0,25 мг/мл чесночного порошка и значения MIC 0,5 мг/мл) и раннего удлинения гифы (5 Ингибирование роста на уровне 0,25 мг/мл и значение ВПК 0,5 мг/мл), чем при росте мицелия (29% ингибирование роста при 0,5 мг/мл чесночного порошка и значении МИЦ 0,75 мг/мл). При сопоставлении контактных и паровых фаз результаты показали значительное снижение противогрибковой активности на расстоянии независимо от стадии развития гриба. Значения MIC переехали от 0,5 мг/мл до 1 мг/мл для прорастания спор, с 0,5 мг/мл до 2 мг/мл для раннего удлинения гифы и с 0,75 мг/мл до 4 мг/мл для роста мицелия(рисунок 3,панель D и рисунок 4 для репрезентативных изображений). Таким образом, эти результаты показывают, что чесночный порошок содержит смесь летучих и не летучих соединений, имеющих противогрибковые свойства.
В целом эти результаты показывают, что относительный вклад летучих и нестабильных веществ, содержащихся в продуктах растительного происхождения, может определяться на различных этапах грибкового роста по мере сопоставимости экспериментальных условий. Этот подход особенно хорошо подходит для сложных смесей противогрибковых соединений. Эфирное масло Thymus vulgaris представляет собой смесь летучих соединений и показывает аналогичную активность на расстоянии и в контакте для прорастания спор и раннего удлинения гифы, поддерживая сравнение этого пара-фазы и анализа контакт-ингибирования и подчеркивая, что миграция в паровую фазу не нарушается путем заливки в агар-среду. Результаты также подчеркивают, что чесночный порошок, используемый в качестве модели в данном исследовании, содержит нестациональные активные компоненты, которые вносят значительный вклад в общую противогрибковую активность и которые были забыты в пользу летучих тиосулфинатов, полученныхизалиума 27,28.
Рисунок 1: Синоптическая схема протокола для анализа контактной и паровой фазы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 2: Неточность, связанная с передачей грибковых с целлюлозного диска. А. Схема, представляющая передачу диска на агар-пластины, покрытые спорами, и перенос диска на поверхность на агар-пластинах, содержащих противогрибковые соединения B. Схема, представляющая агар-передачу областей под целлюлозными дисками с последующим инкубацией и остаточным измерением роста. К. Репрезентативная картина радиального роста остаточного мицелия после переноса участков под целлюлозные диски. Д. Измерение радиального роста остаточного мицелия. Е. Влияние эфирного масла Thymus vulgaris на рост мицелия, передаваемого из целлюлозного диска или агар-штепсельной вилки (N-2, означает ± SD), пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Рисунок 3: Сравнение противогрибковых действий с использованием паровой фазы и ингибирования контакта анализы на споры, ранние гифе, и мицелий. А. Репрезентативные фотографии спор триходермы, раннего гифа (рост 17 ч) и мицелия (24 ч роста). Триходерма ингибирование роста карбендазимом(B), эфирным маслом Thymus vulgaris (C)и чесночным порошком(D). (No2, среднее ± SD) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель фотографии чеснока противогрибковой активности на агар пластин в контакте- (A) или пара фазы (B) ингибирование анализы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь подход позволяет можно можно можно можно было бы можно можно было можно было можно можно было бы можно было можно можно было бы можно было можно получить для оценки противогрибковых свойств минимально обработанных растительных продуктов. В этом протоколе однородное распределение спор на поверхности агара достигается с помощью 2 мм стеклянных бусин. Этот шаг требует обработки навыков правильно распределить бисер и получить воспроизводимые результаты, в конечном счете, позволяя сравнение противогрибковых эффектов на разных стадиях грибкового роста. Мы обнаружили, что 5 мм стеклянные бусины или чрезмерное вращение при гомогенизации во время распространения может привести к переменной диаметр роста. Поэтому мы рекомендуем обучение освоению распределения спор перед экспериментами. Кроме того, при тестировании растительных порошков необходимо уделять внимание однородному рассеиванию продукта в агар-среду. Чтобы порошок не осевал в нижней части пластины, продукт необходимо смешать в агар-среду, когда температура расплавленной среды достигает 45 градусов по Цельсию (при комнатной температуре 24 градусов по Цельсию). Эта температура должна быть скорректирована в соответствии с местной комнатной температурой, чтобы избежать осадков.
Хотя метод, который мы описываем здесь, может дать ценную информацию, необходимо учитывать несколько недостатков. Этот метод позволяет проводить точные и побочные сравнения в одной экспериментальной установке за счет значительного количества времени подготовки, поскольку количество агар-тарелок, которые должны быть подготовлены, может быть значительным в зависимости от вопросов, на которые необходимо ответить. Кроме того, этот анализ является среднемасштабный анализ, предназначенный для 5 см Петри блюда. Таким образом, количество активных веществ, необходимых для проверки всех аспектов может быть существенным. Это означает, что редкие вещества могут быть не подходящими кандидатами для тестирования этого протокола. Масштабирование анализа можно рассматривать с помощью небольших чашек Петри и уменьшения размера пробок. Это может быть проверено с помощью протокола бенчмаркинга, описанного здесь с особым вниманием к извлечению агар-плуга, что может быть трудно. Точность измерений радиального роста может быть снижена в этом меньшем масштабе.
Современные методы подходят для измерения противогрибковой активности соединений в растворе и менее применимы к изучениюпорошков 13. Подход, который мы установили, хорошо приспособлен как для жидких, так и для твердых соединений, что позволяет можно было бы можно было бы можно можно было бы можно с оценкой противогрибковых свойств минимально обработанных растительных продуктов. Это сокращает время, необходимое для тестирования экстрактов, и уменьшает подводные камни, связанные с активными веществами, отображающие плохую слугородственность. Поскольку некоторые растительные продукты содержат активные молекулы, чувствительныек высокой температуре 43,это дает преимущество ограничения риска потери активности таких соединений. Этот подход был адаптирован из метода агар-диффузии ипищевой отравленный метод 15 , 16,17,18,19дополнительноразрешить прямое сравнение противогрибковых мероприятий на различных стадиях грибкового роста с использованием аналогичных экспериментальных условиях. Передача Агар-плуга позволяет точно контролировать количество микроорганизмов в пределах анализа. Это преимущество перед передачей диска, что приводит к чрезмерной оценке противогрибковых эффектов, связанных с неполной передачей спор или гифы. Наконец, в то время как пара фазы анализы, как правило, не применяются к контактнойингибирования анализы 27,28,29,30,31, метод, который мы предлагаем адреса относительный вклад летучих и не летучих агентов, содержащихся в сложных смесей, таких как растительные порошки или экстракты и в конечном итоге позволяет оценки противогрибковых мероприятий на различных стадиях грибкового роста.
Подход, который мы описываем здесь, может быть особенно актуальным для поддержки необходимости методов, которые оценивают противогрибковые свойства в продуктах растительного происхождения для биоконтроля. Используемый ими количественный метод позволяет операторам определять соответствующий вклад летучих и нестациональных соединений в противогрибковую активность сложной биоактивной смеси. Это дает ценную информацию, которая может направлять выбор способов применения для лечения и актуальность выполнения жидкой экстракции. Приложения, которые могут рассматриваться на расстоянии от целевого фитопатогена (например, включение биоконтроля продукта в упаковку) или могут нуждаться в прямом контакте для оптимизации эффективности продукта биоконтроля (небулизация на растения или погружение фруктов в раствор продукта биоконтроля). Это также позволяет сравнить противогрибковую эффективность на различных стадиях грибкового роста от прорастания спор до более поздней стадии роста мицелия, что приводит к определению рекомендаций по установлению пороговых значений контроля, необходимых для применения продуктов биоконтроля к сельскохозяйственным культурам. Действительно, определение эффективности веществ на различных грибковых стадиях может помочь классифицировать, могут ли вещества использоваться в качестве профилактического или лечебного лечения, и спланировать график лечения растений продуктами биоконтроля. Это необходимо для использования эффективности продуктов при использовании в полевых условиях или после сбора урожая.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
никакой
Acknowledgments
Мы очень благодарны Фрэнку Эйтсу за его драгоценный совет. Эта работа была поддержана Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
