Summary
Vi beskriver en modifisert agarbasert metode designet for å kvantifisere de antifungale effektene av planteavledede produkter. Både flyktige og ikke-flyktige bidrag til antifungal aktivitet kan vurderes gjennom denne protokollen. I tillegg kan effekt mot sopp måles ved viktige utviklingsstadier i et enkelt eksperimentelt oppsett.
Abstract
Protokollen som er beskrevet er basert på en plug-transfer-teknikk som tillater nøyaktig bestemmelse av mikroorganismemengder og deres utviklingsstadier. Et bestemt antall sporer er spredt på en agarplate. Denne agarplaten inkuberes i en definert periode slik at soppene kan nå det forventede utviklingsstadiet, bortsett fra sporer der inkubasjon ikke er nødvendig. Agarplugger dekket av sporer, hyphae eller mycelium blir deretter trukket tilbake og overført til agarmedier som inneholder den antifungale forbindelsen som skal testes enten plassert i avstand fra soppene eller i kontakt. Denne metoden gjelder for å teste både væskeekstrakter og faste prøver (pulver). Det er spesielt godt egnet for å kvantifisere de relative bidragene fra flyktige og ikke-flyktige midler i bioaktive blandinger og for å bestemme deres effekter, spesielt på sporer, tidlig hyphae og mycelium.
Metoden er svært relevant for karakterisering av antifungal aktivitet av biokontrollprodukter, spesielt planteavledede produkter. Faktisk, for plantebehandling, kan resultatene brukes til å veilede valg av applikasjonsmåte og for å etablere utløserterskler.
Introduction
Globale tap av frukt og grønnsaker kan nå opptil 50% av produksjonen1 og resultere hovedsakelig av matråte forårsaket av soppsvinn i felt eller under lagring etter høsting2,3, til tross for den omfattende sysselsettingen av syntetiske soppdrepende midler siden midten av det tjuende århundre4. Bruken av disse stoffene blir revurdert siden det representerer alvorlige miljø- og helsefarer. Ettersom de skadelige konsekvensene av deres bruk vises gjennom økosystemer og bevis på potensielle helsepåvirkninger har akkumulert5,6, utvikles nye alternativer til gamle profylaktiske strategier for pre- og post-harvest behandlinger7,8,9. Derfor er utfordringen vi står overfor todelt. Nye soppdrepende strategier må for det første opprettholde nivåene av effekt av matbeskyttelse mot fytopatomer og samtidig bidra til å dramatisk redusere miljøavtrykket i landbrukspraksis. For å oppfylle dette ambisiøse målet foreslås strategier inspirert av det naturlige forsvaret utviklet i planter, da mer enn 1000 plantearter har blitt fremhevet for sine antimikrobielle egenskaper8. For eksempel er planter som har utviklet naturlige soppdrepende midler for å bekjempe fytopatoogener en ny ressurs for å utforske utviklingen av nye biokontrollprodukter2. Eteriske oljer er flaggskipmolekyler av denne typen. For eksempel beskytter Origanum essensiell olje tomatplanter mot grå mugg i drivhusene 10 og Solidago canadensis L. og cassia essensielle oljer har vist seg å bevare posthøstet jordbær fra grå muggskade11,12. Disse eksemplene illustrerer at biokontroll og spesielt planteavledede produkter representerer en løsning som kombinerer biologisk effekt og miljømessig bærekraft.
Dermed er planter en viktig ressurs for molekyler av potensiell interesse for avlingsbeskyttelsesindustrien. Imidlertid er det bare foreslått en håndfull planteprodukter som skal brukes som biokontrollprodukter, selv om de generelt er anerkjent som trygge, ikke-fytotoksiske og miljøvennlige2. Noen vanskeligheter i transposisjonen fra laboratoriet til feltet har blitt observert, for eksempel effekten avtar når den er påført in vivo2,9. Dermed blir det viktig å forbedre evnen til laboratorietester for bedre å forutsi felteffektivitet. I denne sammenhengen er antifungale testmetoder for planteavledede produkter nødvendig både for å evaluere deres antifungale effekt og for å definere deres optimale bruksbetingelser. Spesielt er biokontrollprodukter generelt mindre effektive enn kjemiske soppdrepende midler, så en bedre forståelse av deres virkningsmåte er viktig for å foreslå egnede formuleringer, for å identifisere anvendelsesmodus i felt, og for å definere hvilket utviklingsstadium av patogenet som er sårbart for kandidatens bioprodukt.
Aktuelle tilnærminger til antibakterielle og antifungale aktiviteter inkluderer diffusjonsmetoder som agar-disk diffusjon, fortynning, bioautografi og strømningscytometri13. De fleste av disse teknikkene, og mer spesifikt, standard antifungal følsomhetstesting - agar-disk diffusjon og fortynningsanalyser - er godt tilpasset for evaluering av antimikrobiell aktivitet av løselige forbindelser på bakterielle og soppsporer i flytende suspensjoner.14. Imidlertid er disse metodene generelt ikke egnet for testing av faste forbindelser som tørket plantepulver eller for å kvantifisere antifungal aktivitet under myceliumvekst, da de krever sporefortynning eller sporespredning på agarplater og / eller fortynning av antifungale forbindelser.13. I den matforgiftede metoden er agarplater som inneholder antifungalmiddelet inokulert med en 5-7 mm diameter disk samplet fra en 7-dagers gammel soppkultur uten å vurdere den nøyaktige mengden startende mycelium. Etter inkubasjon bestemmes den antifungale aktiviteten som en prosentandel av radial vekstinhibering17,18,19. Med denne tilnærmingen kan vi evaluere antifungal aktivitet på mycelial vekst. Til sammenligning utføres agarfortynningsmetoden for å bestemme antifungal aktivitet på sporer som er direkte inokulert på overflaten av agarplaten som inneholder de antifungale forbindelsene.13,20,21. Disse to tilnærmingene gir komplementære resultater på antifungal aktivitet. Dette er imidlertid to uavhengige teknikker som brukes parallelt som ikke gir nøyaktig sammenligning side om side av den relative effekten av antifungale forbindelser på sporer og mycelium.17,20,22 ettersom mengden startsvampmateriale er forskjellig i de to tilnærmingene. Videre er den antifungale aktiviteten til et planteavledet produkt ofte et resultat av kombinasjonen av antifungale molekyler syntetisert av planter for å møte patogener. Disse molekylene omfatter proteiner, peptider23,24, og metabolitter som har et bredt kjemisk mangfold og tilhører ulike klasser av molekyler som polyfenoler, terpener, alcaloïds25, glukosinolater8, og organosulfurforbindelser26. Noen av disse molekylene er flyktige eller blir flyktige under patogenangrep27. Disse midlene er oftest dårlig vannløselige og høye damptrykkforbindelser som må utvinnes gjennom vanndestillasjon som essensielle oljer, hvorav noen av deres antimikrobielle aktiviteter er godt etablert.28. Dampfasemediert følsomhetsanalyser er utviklet for å måle den antimikrobielle aktiviteten til flyktige forbindelser etter fordampning og migrasjon via dampfasen29. Disse metodene er basert på innføring av antifungale forbindelser i avstand fra den mikrobielle kulturen.29,30,31,32,33. I den ofte brukte dampfase-agaranalysen blir essensielle oljer avsatt på en papirdisk og plassert i midten av dekselet på Petri-parabolen i avstand fra bakteriell eller soppsporfjæring, som er spredt på agarmedium. Diameteren på sonen for vekstinhibering måles deretter på samme måte som for agar-disk diffusjonsmetoden20,24. Andre tilnærminger er utviklet for å gi kvantitativ måling av dampfase antifungal følsomhet av essensielle oljer, avledet fra buljong-fortynningsmetoden hvorfra en hemmende dampfasemediert antimikrobiell aktivitet ble beregnet fra32, eller avledet fra agar-disk diffusjonsanalyser31. Disse metodene er generelt spesifikke for dampfaseaktivitetsstudier og ikke egnet for kontaktinhiberingsanalyser. Dette utelukker bestemmelse av det relative bidraget av flyktige og ikke-flyktige midler til antifungal aktivitet av en kompleks bioaktiv blanding.
Den kvantitative metoden vi har utviklet tar sikte på å måle den antifungale effekten av tørket plantepulver på kontrollerte mengder sporer og dyrket mycelium avsatt på overflaten av et agarmedium for å reprodusere luftveksten av fytopatogene under infeksjon av planter15 samt et sammenkoblet mycelialnettverk16. Tilnærmingen er et modifisert eksperimentelt oppsett basert på agarfortynning og matforgiftede metoder som også tillater, i samme eksperimentelle oppsett, side-ved-side kvantifisering av bidraget fra både flyktige og ikke-flyktige antifungale metabolitter. I denne studien har metoden blitt benchmarked mot aktiviteten til tre godt karakteriserte antifungale preparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Inocula forberedelse
- Før eksperimentet lå 5 μL trichoderma spp. SBT10-2018-sporer lagret ved 4 °C på potetdekstrose agarmedium (PDA) og inkuberes i 4 dager ved 30 °C med regelmessig lyseksponering for å fremme conidiaformasjon42 (figur 1, panel A).
MERK: Trichoderma spp. SBT10-2018 er isolert fra tre og brukes som modell i denne studien for rask vekst og enkel spore utvinning. Denne stammen er bevart av vårt laboratorium. - Gjenopprette conidia (Figur 1, panel A)
- Legg 3 ml 0,05% Tween-20 på Trichoderma mycelium.
- Bruk en rake for å frigjøre conidia fra conidiophores; unngå å trykke ned på myceliet for å forhindre at hyphae blir revet bort.
- Gjenopprett løsningen raskt med en mikropipette for å unngå at den absorberes av agarmediet og overføres til et 15 ml rør.
- Tell totalt antall sporer ved hjelp av et hemocytometer og lag en løsning som inneholder 3 x 106 sporer / ml.
MERK: Dette trinnet må utføres nøye for å forhindre at hyphae blir trukket ut. Sporepreparatet kontrolleres deretter under mikroskop. Til slutt, for stammer som presenterer svært antenne og fluffy mycelium, kan et trinn med filtrering ved hjelp av 40 μM silfilter legges til for å eliminere gjenværende myceliumfragment.
2. Klargjøring av soppplater (Figur 1, panel B)
- Deponer 100 μL 3 x10 6 sporer/ml med en mikropipette på en Petri-tallerken med 9 cm diameter som inneholder PDA-medium for å oppnå 4800 sporer/cm2 tilsvarende 925 sporer/5 mm diameter-agarplugg.
- Tilsett 10 g glassperler med 2 mm diameter med en steril spatel og utfør fremre og bakoverbevegelser parallelt og vinkelrett på operatørens arm for jevnt å fordele sporene på overflaten av agaren.
- Roter platen med 90° og gjenta de roterende bevegelsene (som i avsnitt 2.2); gjenta disse trinnene til platen er rotert helt.
- Bruk platen umiddelbart til å sette opp eksperimenter som krever sporer eller inkubere platene ved henholdsvis 30 °C i 17 timer eller 24 timer når det er behov for tidlig hyphae eller mycelium.
MERK: For å sammenligne antifungal aktivitet målt etter mycelium plug-transfer og mycelium disk-overføring, bruk sterile pinsett og plasser sterile 5 mm celluloseskiver tilfeldig på overflaten av agarplaten etter sporspredning.
3. Antifungale forbindelser forberedelse
- Planteavledede produktpreparater: hvitløk-pulverpreparat
- Skrell nellikene av fersk hvitløk og kutt nellikene i 2-3 mm brede skiver ved hjelp av et skalpellblad.
- Lufttørk skivene i 2 dager ved 40 °C.
- Grind skivene i 3 x 15 sekunder ved hjelp av en knivmølle for å få et fint pulver.
- Oppbevar hvitløkspulveret ved 4 °C i 50 ml rør før bruk.
MERK: Siden hvitløk ikke autoklaveres (for å forhindre nedbrytning av temperaturfølsomme antifungale forbindelser) rengjør slipemaskinen, skalpellen og lufttørkeren med 70% etanol før bruk.
- Eterisk oljepreparat
- Forbered 0,5%, 1%, 2,5%, 5% og 20% Thymus vulgaris essensielle oljeløsninger i 0,5% Tween-80.
- Bland godt for å danne en emulsjon før du legger den til i PDA-mediet (se pkt. 4.2).
- Carbendazim forberedelse
- Vei karbendazim for å forberede en 200 mg / L etanoloppløsning (karbendazim er dårlig oppløselig i vann).
- Oppbevar oppløsningen ved romtemperatur før du legger den i PDA-mediet (se pkt. 4.2).
FORSIKTIG: Carbendazim utgjør en helse- og miljøfare. Bruk hansker og maske når du håndterer dette produktet. Oppbevar den på et ventilert sted.
4. Kontakt-hemming analyse
- Tilberedning av agarplater som inneholder hvitløkspulver
- Klargjør og autoklaver PDA-medium.
- Vei ønsket hvitløkspulvermengde inn i et 50 ml rør ved hjelp av en steril spatel, for å oppnå konsentrasjoner som vanligvis spenner fra 0,25 mg / ml til 16 mg / ml.
- Tilsett 10 ml PDA etter å ha kontrollert temperaturen på mediet på innsiden av håndleddet. Temperaturen må være så lav som mulig for å forhindre nedbrytning av følsomme molekyler. Ideelt sett bør denne temperaturen være 45 °C .
- Homogeniser forsiktig ved å snu røret opp ned for jevnt å fordele pulveret i PDA-mediet. Hell raskt 10 ml i en Petri-tallerken med 5 cm diameter (Figur 1, panel C).
- Med Petri-retten plassert ved romtemperatur, vent til agaren størkner.
- Tilberedning av agarplater som inneholder essensiell olje eller karbendazim
- Introduser 10 ml PDA i et 50 ml rør. Kontroller temperaturen som for pkt. 4.1.3.
- Tilsett 100 μL av de forskjellige løsningene til Thymus vulgaris essensiell olje i PDA for å oppnå 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% og 0,2% løsninger (se pkt. 3.2.1).
- Tilsett det nødvendige volumet av karbendazim fra 200 mg/l-oppløsningen for å få løsninger fra 0,0625-2 mg/l (se pkt. 3.3.1).
- Homogeniser forsiktig ved å snu røret opp ned, hell raskt 10 ml i en Petri-tallerken med 5 cm diameter (figur 1, panel C).
- Med Petri-retten plassert ved romtemperatur, vent til agaren størkner.
- Kontaktinhiberingsanalyse (figur 1)
- Med et 5 mm diameter sterilt rør i rustfritt stål, plott en sirkel i midten av Petri-retter som inneholder enten PDA eller PDA, inkludert antifungale forbindelser. Kast agarsylinderen med en steril tannpirker (panel C).
- Med et 5 mm diameter sterilt rør i rustfritt stål, plotter du tilfeldig inn i soppplatene fra seksjon 2. Tegn mellom 15-20 sirkler per plate (panel B).
- Trekk forsiktig ut agarsylindrene dekket av sporer, tidlig hyphae eller mycelium med en steril tannpirker og legg pluggene i det tomme rommet av Petri-retter som inneholder enten PDA eller PDA, inkludert antifungale forbindelser (panel C).
- Inkuber platene som inneholder sporer i 48 timer ved 30 °C, 31 timer for platene som inneholder tidlig hyphae og 24 timer for platene dekket med mycelium (panel C).
- Mål diameteren på radial vekst og beregn prosentandelen av soppveksthemming over kontroll ved hjelp av formelen (panel D)
% soppvekstinhibering = (C - A/C)* 100
der C er diameteren av radial vekst i PDA-medium og A diameteren av radial vekst i PDA-medium som inneholder antifungale forbindelser.
MERK: For å sammenligne antifungal aktivitet målt etter myceliumpluggoverføring og myceliumdiskoverføring, ved hjelp av sterile pinsett, overfør en disk med 5 mm diameter som tidligere ble avsatt på overflaten av soppplatene (avsnitt 2-notat) i midten av Petri-retter som inneholder enten PDA eller PDA som inneholder antifungale forbindelser og fortsetter akkurat som for agarpluggoverføring
5. Dampfase inhiberingsanalyse
- Tilberedning av agarplater som inneholder hvitløkspulver
- Fortsett som i avsnitt 3.1.
- Tilberedning av agarplate som inneholder essensiell olje eller karbendazim
- Fortsett som i pkt. 3.2 og 3.3.
- Tilberedning av soppplater
- Fortsett som i avsnitt 2.
- Antifungal inhiberingsanalyse for dampfase (figur 1)
- Hell 10 ml PDA medium i lokket på Petri-rettene med 5 cm diameter som inneholder enten 10 ml PDA-medium eller 10 ml PDA-medium som inneholder antifungale forbindelser i bunnen av oppvasken. Vent til fullstendig størkning av agaren ved romtemperatur (panel C).
- Bruk et 50 ml sentrifugalrør som kalibreringsverktøy for å få en sirkel av PDA i midten av lokket; PDA-en rundt sirkelen med en steril slikkepott (panel C).
- Plott en sirkel i midten av PDA-mediet plassert i lokket med et 5 mm diameter sterilt rør i rustfritt stål. Kast agarsylinderen med en steril tannpirker (panel C).
- Form plugger med et 5 mm diameter sterilt rør i rustfritt stål tilfeldig inn i soppplatene som i avsnitt 4.3.2 (panel B).
- Bruk en steril tannpirker, overfør forsiktig pluggene som er dekket enten med sporer, tidlig hyphae eller mycelium fra soppplater til lokkene på analyseplater (panel C).
- Inkuber ved 30 °C som i pkt. 4.3.4 (panel C).
- Mål diameteren på radial vekst og beregn prosentandelen av soppveksthemming ved hjelp av formelen i pkt. 4.3.5 (panel D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å evaluere den kvantitative metodens evne til å diskriminere virkningsmåten til forskjellige typer antifungale forbindelser, sammenlignet vi effekten av tre kjente antifungale midler. Carbendazim er et ikke-flyktig syntetisk soppdrepende som har blitt mye brukt til å kontrollere et bredt spekter av soppsykdommer i planter39,40. Thymus vulgaris essensiell olje har i stor grad blitt beskrevet for sin antibakterielle og antifungale aktivitet og brukes som naturlig mat konserveringsmiddel41. Hvitløkspulver er valgt som modell av et planteavledet bioprodukt. Det har tradisjonelt blitt brukt som et naturlig middel med antimikrobielle aktiviteter som i stor grad har blitt tilskrevet tilstedeværelsen av flyktige organosulfurforbindelser, men også til tilstedeværelsen av ikke-flyktige saponiner og fenolforbindelser26, noe som gir denne modellen en kompleksitet som er relevant i denne studien.
Denne kvantitative metoden er avhengig av overføring av agarplugger som inneholder kontrollerte mengder sopp på forskjellige utviklingsstadier fra sporer til mycelium, mens i matforgiftet metode overføres 5-dagers til 7-dagers gammelt mycelium fra celluloseskiver13. I analysen ble sporer, tidlig hyphae (17 h inkubasjon) og mycelium (24 h inkubasjon) brukt som start soppmateriale. Bruk av diskoverføring er kanskje ikke relevant, da conidia eller resthyphae forblir minst delvis på agarmediet etter diskoverføring, noe som senere fører til unøyaktig måling av veksthemming som illustrert i figur 2. Ulike diametre av sopp-radial vekst har blitt observert etter overføring av agar områder som ligger under cellulose disker etterfulgt av 24 h inkubasjon (Figur 2, paneler A, B og C) fremhever tilstedeværelsen av gjenværende sopp hyphae på agar etter diskoverføring. Kvantifiseringen av resthyphae er bekreftet ved måling av vekst som fører til variasjon i opptil 22 % diameter (figur 2, panel D). Effekten på veksthemming ble deretter evaluert ved hjelp av Thymus vulgaris essensiell olje som antifungal forbindelse og sammenlignet med hemmingen oppnådd etter agar-plug transfer (Figur 2, panel E). Veksthemming etter diskoverføring var høyere enn etter agarpluggoverføring for lave Thymus-oljekonsentrasjoner, noe som førte til en overestimering av den hemmende effekten, noe som kan skyldes ufullstendig overføring av soppmateriale og støtter tilnærmingen basert på agarpluggoverføring.
Trichoderma spp. SBT10-2018-veksthemming utløst av de tre antifungale forbindelsene ble deretter evaluert ved hjelp av kontakt- og dampfasehemmingsanalysene for hvert soppstadium (figur 3). Sporer ble forsiktig spredt på agarplater for å oppnå 4800 sporer / cm2. De ble direkte overført til agarplater som inneholder antifungale forbindelser gjennom agarpluggutvinning ved hjelp av et 5 mm sterilt rør i rustfritt stål, slik at eksperimentet kan starte fra sporene. For de to andre utviklingsstadiene ble agarplater dekket med sporer først inkubert i 17 timer eller 24 timer ved 30 °C før de overførte agarpluggen for å tillate spiring og tidlig utvikling av hyphae (17 t) og myceliumdannelse (24 h) (Figur 3, panel A). For å kvantifisere bidraget fra aktive flyktige molekyler til den generelle antifungale aktiviteten, har kontakthemmingsanalysen blitt tilpasset og sporer, tidlig hyphae og mycelium ble plassert i avstand fra de antifungale forbindelsene som helles i PDA-medium som for kontakthemmingsanalysen. Trichoderma-radialvekst ble målt over 48 timer, og prosentandelen hemming er bestemt ved sammenligning med kontrollforhold. Den minimum-hemmende konsentrasjonen (MIC) er definert som den laveste konsentrasjonen av antifungale forbindelser som forhindrer synlig vekst etter 48 timers inkubasjon ved 30 °C.
Figur 3(panel B) viser høyere sporefølsomhet overfor karbendazim sammenlignet med tidlige hyphae- og myceliumnettverk med henholdsvis 50 %, 22 % og 30 % veksthemming ved henholdsvis 0,25 μg/ml karbendazim når Trichoderma og antifungale forbindelser var i kontakt. Samtidig er en MIC-verdi på 0,5 μg/ml estimert på sporespredning, mens en økning til 0,75 μg/ml er oppnådd ved tidlig hyphaeforlengelse og mycelium. Til sammenligning hadde carbendazim ingen antifungal effekt på Trichoderma da soppen ble plassert i avstand fra fungicidet i samsvar med den lave volatiliteten til dette stoffet. Resultatene vi oppnådde ved hjelp av Thymus vulgaris essensielle olje (TEO) som antifungal forbindelse (Figur 3, panel C) har vist en høyere sporefølsomhet overfor TEO i forhold til tidlig hyphae og mycelium med henholdsvis 65% og ca. 50% veksthemming ved henholdsvis 0,01% TEO. De oppnådde MIC-verdiene var like for sporespredning og tidlig hyphae-forlengelse (0,025 % TEO) og høyere for myceliumvekst (0,05 % TEO). Som forventet presenterte Thymus vulgaris essensiell olje identisk antifungal aktivitet uavhengig av avstanden beTween soppen og oljen. Lignende MIC-verdier (0,025 % TEO) ble oppnådd på sporespredning og tidlig hyphae-forlengelse for kontakt- og dampfaseanalyser, men med den nedre prosentandelen er det observert en høyere følsomhet når TEO- og trichoderma-sporer var i kontakt (60 % vekstinhibering i kontakt versus 45 % veksthemming ved avstand). Overraskende nok var MIC-verdier oppnådd på myceliet forskjellige i kontakt- og dampfasehemmingsanalysene (0,05% versus 0,1%) antyder at en del av de flyktige molekylene ikke er aktive mot et velutviklet mycelium. Til slutt, Ved bruk av hvitløkspulver som antifungal forbindelse (figur 3, panel D), ble det observert en høyere effekt mot sporespredning (50 % vekstinhibering ved 0,25 mg/ml hvitløkspulver og MIC-verdi på 0,5 mg/ml) og tidlig hyfaseforlengelse (5 ni% veksthemming ved 0,25 mg /ml og MIC-verdi på 0,5 mg/ml) enn for myceliumvekst (29 % vekstinhibering ved 0,5 mg/ml hvitløkspulver og MIC-verdi på 0,75 mg/ml). Når kontakt- og dampfaseanalyser ble sammenlignet, har resultatene vist en betydelig nedgang i antifungal aktivitet i avstand uavhengig av utviklingsstadiet av soppen. MIC-verdiene beveget seg fra 0,5 mg/ml til 1 mg/ml for sporespredning, fra 0,5 mg/ml til 2 mg/ml for tidlig hyphae-forlengelse, og fra 0,75 mg/ml til 4 mg/ml for myceliumvekst (figur 3, panel D og figur 4 for representative bilder). Så, disse resultatene tyder på at hvitløk pulver inneholder en blanding av både flyktige og ikke-flyktige forbindelser som har antifungale egenskaper.
Til sammen viser disse resultatene at det relative bidraget fra flyktige og ikke-flyktige midler som finnes i planteavledede produkter, kan bestemmes på forskjellige soppvekststadier ettersom de eksperimentelle forholdene er sammenlignbare. Denne tilnærmingen er da spesielt godt egnet for komplekse blandinger av antifungale forbindelser. Thymus vulgaris essensiell olje er en blanding av flyktige forbindelser og viser en lignende aktivitet på avstand og i kontakt for spore spiring og tidlig hyphae forlengelse, som støtter sammenligningen av denne dampfase- og kontakthemmingsanalysen og fremhever at migrasjon til dampfasen ikke svekkes ved å helles i agarmediet. Resultatene understreker også at hvitløkspulver som brukes som modell i denne studien inneholder ikke-flyktige aktive komponenter som har et betydelig bidrag i den generelle antifungale aktiviteten og som har blitt neglisjert til fordel for flyktige tiosulfinater avledet fra allium27,28.
Figur 1: Synoptisk oppsett av protokollen for kontakt- og dampfaseanalyser Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Unøyaktighet forbundet med soppoverføring fra celluloseskive. A. Skjema som representerer diskoverføring på agarplater dekket av sporer og diskoverføring på overflaten på agarplater som inneholder antifungale forbindelser B. Skjema som representerer agaroverføring av områder under celluloseskiver etterfulgt av inkubasjon og restvekstmåling. C. Representativt bilde av radial vekst av gjenværende mycelium etter overføring av områder under celluloseskiver. D. Radial vekstmåling av gjenværende mycelium. E. Effekt av Thymus vulgaris essensiell olje på veksten av mycelium overført fra cellulose disk eller agar-plug (N = 2, bety ± SD) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av antifungale aktiviteter ved hjelp av dampfase- og kontaktinhiberingsanalyser på sporer, tidlig hyphae og mycelium. A. Representative bilder av Trichoderma sporer, tidlig hyphae (17 h vekst), og mycelium (24 h vekst). Trichoderma vekst hemming av carbendazim (B), Thymus vulgaris essensiell olje (C) og hvitløk pulver (D). (N=2, gjennomsnitt ± SD) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av hvitløk antifungal aktivitet på agarplater i kontakt- (A) eller dampfase (B) hemmingsanalyserKlikk her for å se en større versjon av dennefiguren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilnærmingen som presenteres her tillater evaluering av antifungale egenskaper til minimalt bearbeidede planteavledede produkter. I denne protokollen oppnås homogen fordeling av sporer på agaroverflaten ved hjelp av 2 mm glassperler. Dette trinnet krever håndtering av ferdigheter for å distribuere perlene riktig og for å oppnå reproduserbare resultater, og til slutt tillate sammenligning av antifungale effekter på forskjellige stadier av soppvekst. Vi fant ut at 5 mm glassperler eller overdreven rotasjon mens homogenisering under spredning kan forårsake variabel vekstdiameter. Derfor anbefaler vi trening for å mestre sporefordeling før eksperimentering. I tillegg, når plantepulver må testes, må det tas hensyn til homogen spredning av produktet i agarmediet. For å forhindre at pulveret setter seg på bunnen av platen, må produktet blandes inn i agarmedium når temperaturen på det smeltede mediet når 45 °C (når romtemperaturen er 24 °C). Denne temperaturen må justeres i henhold til den lokale romtemperaturen for å unngå sedimentering.
Selv om metoden vi beskriver her kan gi verdifull innsikt, må noen ulemper vurderes. Denne metoden gjør det mulig å lage nøyaktige sammenligninger side ved side i et enkelt eksperimentelt oppsett på bekostning av en betydelig mengde forberedelsestid, da antall agarplater som skal utarbeides, kan være betydelig avhengig av spørsmålene som må besvares. I tillegg er denne analysen en mellomskala analyse designet for 5 cm Petri-retter. Derfor kan mengden aktive stoffer som kreves for å teste alle aspektene være betydelig. Det betyr at sjeldne stoffer kanskje ikke er egnede testkandidater for denne protokollen. En nedskalering av analysen kan vurderes ved å bruke mindre Petri-retter og redusere størrelsen på pluggene. Dette kan testes ved hjelp av benchmarking protokollen beskrevet her med spesiell oppmerksomhet til agar-plug utvinning, noe som kan være vanskelig. Nøyaktigheten av radialvekstmålinger kan reduseres i den mindre skalaen.
Nåværende metoder er egnet for å måle antifungal aktivitet av forbindelser i løsning og mindre anvendelig for å studere pulver13. Tilnærmingen vi har etablert er godt tilpasset både flytende og faste forbindelser, noe som gjør det mulig å evaluere antifungale egenskaper til minimalt bearbeidede planteavledede produkter. Dette reduserer tiden det tar å teste ekstrakter og reduserer fallgruver relatert til aktive stoffer som viser dårlig løselighet. Siden noen planteavledede produkter inneholder aktive molekyler som er følsomme for høy temperatur43, tilbyr dette fordelen med å begrense risikoen for tap av aktivitet av slike forbindelser. Denne tilnærmingen er tilpasset fra agar-diffusjonsmetoden og matforgiftet metode15,16,17,18,19 for i tillegg å tillate direkte sammenligning av antifungale aktiviteter på forskjellige soppvekststadier ved hjelp av lignende eksperimentelle innstillinger. Agar-plug transfer gir nøyaktig kontroll over mengdene mikroorganismer i analysen. Dette er en fordel i forhold til diskoverføring, noe som fører til overestimering av antifungale effekter forbundet med ufullstendig overføring av sporer eller hyphae. Til slutt, mens dampfaseanalyser generelt ikke brukes på kontakthemmingsanalyser27,28,29,30,31, adresserer metoden vi foreslår de relative bidragene til flyktige og ikke-flyktige midler som finnes i komplekse blandinger som plantepulver eller ekstrakter, og til slutt tillater evaluering av antifungale aktiviteter på forskjellige soppvekststadier.
Tilnærmingen vi beskriver her kan være spesielt relevant for å støtte behovet for metoder som evaluerer antifungale egenskaper i planteavledede produkter for biokontroll. Den kvantitative metoden vi foreslår gjør det mulig for operatører å bestemme de respektive bidragene fra flyktige og ikke-flyktige forbindelser til den antifungale aktiviteten til en kompleks bioaktiv blanding. Dette gir verdifull informasjon som kan lede valget av anvendelsesmåter for behandlingen og relevansen av å utføre væskeutvinning. Applikasjoner som kan betraktes på avstand fra det målrettede fytopatogenet (for eksempel inkludering av biokontrollproduktet i en emballasje) eller kan trenge direkte kontakt for å optimalisere effekten av biokontrollproduktet (forstøvning på planter eller dyppe frukt i en løsning av biokontrollprodukt). Det tillater også sammenligning av antifungal effekt på forskjellige soppvekststadier fra spore spiring til senere stadium myceliumvekst, noe som fører til definisjonen av anbefalinger for å etablere kontrollterskler som kreves for å bruke biokontrollprodukter på avlinger. Faktisk kan det å definere effekten av stoffene på ulike soppstadier bidra til å kategorisere om stoffer kan brukes som forebyggende eller kurative behandlinger og planlegge tidsplanen for plantebehandlinger med biokontrollprodukter. Dette er viktig for å utnytte effekten av produktene når de brukes i felt eller etter høsting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Vi er veldig takknemlige til Frank Yates for hans dyrebare råd. Dette arbeidet ble støttet av Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
- FAO. Global food losses and food waste - Extent, causes and prevention. FAO. , Rome. (2011).
- da Cruz Cabral, L., Fernández Pinto, V., Patriarca, A. Application of plant compounds to control fungal spoilage and mycotoxin production in foods. International Journal of Food Microbiology. 166 (1), 1-14 (2013).
- Romanazzi, G., Smilanick, J. L., Feliziani, E., Droby, S. Postharvest biology and technology integrated management of postharvest gray mold on fruit crops. Postharvest Biology and Technology. 113, (2016).
- Morton, V., Staub, T.
- Brandhorst, T. T., Klein, B. S. Uncertainty surrounding the mechanism and safety of the post- harvest fungicide Fludioxonil. Food and Chemical Toxicology. 123, 561-565 (2019).
- Bénit, P., et al. Evolutionarily conserved susceptibility of the mitochondrial respiratory chain to SDHI pesticides and its consequence on the impact of SDHIs on human cultured cells. PLoS ONE. 14 (11), 1-20 (2019).
- Usall, J., Torres, R., Teixidó, N. Biological control of postharvest diseases on fruit: a suitable alternative. Current Opinion in Food Science. 11, 51-55 (2016).
- Tripathi, P., Dubey, N. K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology. 32 (3), 235-245 (2004).
- Abbey, J. A., et al. Biofungicides as alternative to synthetic fungicide control of grey mould (Botrytis cinerea)-prospects and challenges. Biocontrol Science and Technology. 29 (3), 241-262 (2019).
- Soylu, E. M., Kurt, Ş, Soylu, S. In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. International Journal of Food Microbiology. 143 (3), 183-189 (2010).
- Liu, S., Shao, X., Wei, Y., Li, Y., Xu, F., Wang, H. Solidago canadensis L. essential oil vapor effectively inhibits botrytis cinerea growth and preserves postharvest quality of strawberry as a food model system. Frontiers in Microbiology. 7, 0-9 (2016).
- El-Mogy, M. M., Alsanius, B. W. Cassia oil for controlling plant and human pathogens on fresh strawberries. Food Control. 28 (1), 157-162 (2012).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- Arikan, S. Current status of antifungal susceptibility testing methods. Medical Mycology. 45 (7), 569-587 (2007).
- Girmay, Z., Gorems, W., Birhanu, G., Zewdie, S. Growth and yield performance of Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm (oyster mushroom) on different substrates. AMB Express. 6 (1), 87 (2016).
- Fischer, M. S., Glass, N. L. Communicate and fuse: how filamentous fungi establish and maintain an interconnected mycelial network. Frontiers in Microbiology. 10, 1-20 (2019).
- Mohana, D. C., Raveesha, K. A. Anti-fungal evaluation of some plant extracts against some plant pathogenic field and storage fungi. Journal of Agricultural Technology. 4 (1), 119-137 (2007).
- Balamurugan, S. In vitro activity of aurantifolia plant extracts against phytopathogenic fungi phaseolina. International Letters of Natural Sciences. 13, 70-74 (2014).
- Ameziane, N., et al. Antifungal activity of Moroccan plants against citrus fruit pathogens. Agronomy for sustainable development. 27 (3), 273-277 (2007).
- Rizi, K., Murdan, S., Danquah, C. A., Faull, J., Bhakta, S. Development of a rapid, reliable and quantitative method - "SPOTi" for testing antifungal efficacy. Journal of Microbiological Methods. 117, 36-40 (2015).
- Imhof, A., Balajee, S. A., Marr, K., Marr, K. New methods to assess susceptibilities of Aspergillus isolates to caspofungin. Microbiology. 41 (12), 5683-5688 (2003).
- Goussous, S. J., Abu el-Samen, F. M., Tahhan, R. A. Antifungal activity of several medicinal plants extracts against the early blight pathogen (Alternaria solani). Archives of Phytopathology and Plant Protection. 43 (17), 1745-1757 (2010).
- Ng, T. B. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25 (7), 1215-1222 (2004).
- Hu, Z., Zhang, H., Shi, K. Plant peptides in plant defense responses. Plant Signaling and Behavior. 13 (8), (2018).
- Iriti, M., Faoro, F. Chemical diversity and defence metabolism: How plants cope with pathogens and ozone pollution. International Journal of Molecular Sciences. 10 (8), 3371-3399 (2009).
- Lanzotti, V., Bonanomi, G., Scala, F. What makes Allium species effective against pathogenic microbes. Phytochemistry Reviews. 12 (4), 751-772 (2013).
- Kyung, K. H.
- Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in microbiology. 3, 12 (2012).
- Bueno, J. Models of evaluation of antimicrobial activity of essential oils in vapour phase: a promising use in healthcare decontamination. Natural Volatiles & Essential Oils. 2 (2), 16-29 (2015).
- Doi, N. M., Sae-Eaw, A., Suppakul, P., Chompreeda, P. Assessment of synergistic effects on antimicrobial activity in vapour- and liquidphase of cinnamon and oregano essential oils against Staphylococcus aureus. International Food Research Journal. 26 (2), 459-467 (2019).
- Amat, S., Baines, D., Alexander, T. W. A vapour phase assay for evaluating the antimicrobial activities of essential oils against bovine respiratory bacterial pathogens. Letters in Applied Microbiology. 65 (6), 489-495 (2017).
- Feyaerts, A. F., et al. Essential oils and their components are a class of antifungals with potent vapour-phase-mediated anti-Candida activity. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Wang, T. H., Hsia, S. M., Wu, C. H., Ko, S. Y., Chen, M. Y., Shih, Y. H., Shieh, T. M., Chuang, L. C. Evaluation of the antibacterial potential of liquid and vapor phase phenolic essential oil compounds against oral microorganisms. PLoS ONE. 11 (9), 1-17 (2016).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Leadbeater, A. Recent developments and challenges in chemical disease control. Plant Protection Science. 51 (4), 163-169 (2015).
- Jin, C., Zeng, Z., Fu, Z., Jin, Y. Oral imazalil exposure induces gut microbiota dysbiosis and colonic inflammation in mice. Chemosphere. 160, 349-358 (2016).
- Kumar, R., Ghatak, A., Balodi, R., Bhagat, A. P. Decay mechanism of postharvest pathogens and their management using non-chemical and biological approaches. Journal of Postharvest Technology. 6 (1), 1-11 (2018).
- Talibi, I., Boubaker, H., Boudyach, E. H., Ait Ben Aoumar, A. Alternative methods for the control of postharvest citrus diseases. Journal of Applied Microbiology. 117 (1), 1-17 (2014).
- Arya, R., Sharma, R., Malhotra, M., Kumar, V., Sharma, A. K. Biodegradation Aspects of Carbendazim and Sulfosulfuron: Trends, Scope and Relevance. Current Medicinal Chemistry. 22 (9), 1147-1155 (2015).
- European Food Safety Authority. Conclusion on the peer review of the pesticide risk assessment of the active substance carbendazim. EFSA Journal. 8 (5), 1-76 (2010).
- Sakkas, H., Papadopoulou, C. Antimicrobial activity of basil, oregano, and thyme essential oils. Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (3), 429-438 (2017).
- Steyaert, J. M., Weld, R. J., Mendoza-Mendoza, A., Stewart, A. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma. Microbiology. 156, Reading, England. Pt 10 2887-2900 (2010).
- Leontiev, R., Hohaus, N., Jacob, C., Gruhlke, M. C. H., Slusarenko, A. J. A Comparison of the antibacterial and antifungal activities of thiosulfinate analogues of allicin. Scientific Reports. 8 (1), 1-19 (2018).
- Scorzoni, L., et al. The use of standard methodology for determination of antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (3), 391-397 (2007).
