Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Published: October 13, 2020 doi: 10.3791/61799
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, 2Mass Spectrometry Facility, University of Guelph

Summary

Denne protokol dækker en detaljeret analyse af peptidoglycansammensætning ved hjælp af væskekromatografi, massespektrometri kombineret med avanceret funktionsekstraktion og bioinformatisk analysesoftware.

Abstract

Peptidoglycan er en vigtig bestanddel af bakterielle cellevægge og et fælles cellulært mål for antimikrobielle stoffer. Selvom aspekter af peptidoglycanstrukturen er ret bevaret på tværs af alle bakterier, er der også betydelig variation mellem grampositive / negative og mellem arter. Derudover er der adskillige kendte variationer, modifikationer eller tilpasninger af peptidoglycanen, der kan forekomme inden for en bakterieart som reaktion på vækstfase og / eller miljømæssige stimuli. Disse variationer producerer en meget dynamisk struktur, der vides at deltage i mange cellulære funktioner, herunder vækst / deling, antibiotikaresistens og undgåelse af værtsforsvar. For at forstå variationen inden for peptidoglycan skal den overordnede struktur opdeles i dets konstitutive dele (kendt som muropeptider) og vurderes for den samlede cellulære sammensætning. Peptidoglycomics bruger avanceret massespektrometri kombineret med kraftig bioinformatisk dataanalyse til at undersøge peptidoglycansammensætning i detaljer. Følgende protokol beskriver oprensning af peptidoglycan fra bakteriekulturer, erhvervelse af muropeptidintensitetsdata gennem et væskekromatograf-massespektrometer og differentiel analyse af peptidoglycansammensætning ved anvendelse af bioinformatik.

Introduction

Peptidoglycan (PG) er et definerende kendetegn ved bakterier, der tjener til at opretholde cellemorfologi, samtidig med at det giver strukturel støtte til proteiner og andre cellulære komponenter 1,2. Rygraden i PG består af alternerende β-1,4-bundet N-acetyl muraminsyre (MurNAc) og N-acetylglucosamin (GlcNAc)1,2. Hver MurNAc besidder et kort peptid bundet ved ᴅ-lactylresten, der kan tværbindes til tilstødende disaccharidbundne peptider (figur 1A, B). Denne tværbinding producerer en maskelignende struktur, der omfatter hele cellen og ofte omtales som en sakculus (figur 1C). Under PG-syntese genereres forstadier i cytoplasmaet og transporteres over den cytoplasmatiske membran af flippaser. Forstadier inkorporeres efterfølgende i den modne PG ved transglycosylase og transpeptidaseenzymer, som producerer henholdsvisglycosid- og peptidbindingerne3. Men når de er samlet, er der adskillige enzymer produceret af bakterierne, der ændrer og / eller nedbryder PG for at udføre en række cellulære processer, herunder vækst og deling. Derudover har forskellige modifikationer af PG vist sig at give tilpasninger, der er specifikke for stammen, vækstbetingelserne og miljøbelastningen, som har været impliceret i cellesignalering, antimikrobiel resistens og værtsimmununddragelse4. Som eksempler er en almindelig modifikation tilføjelsen af en C6-acetylgruppe på MurNAc, der giver resistens ved at begrænse adgangen til glycan-β-1,4-bindingerne til værtsproducerede lysozymenzymer, der nedbryder PG 4,5,6. I enterokokker giver substitution af peptidsidekædens terminale ᴅ-Ala med ᴅ-Lac en større resistens over for det antimikrobielle vancomycin 7,8.

Den generelle procedure for PG-isolering og -oprensning har været relativt uændret, siden den blev beskrevet i 1960'erne9. Bakteriemembraner opløses gennem varmebehandling med SDS efterfulgt af enzymatisk fjernelse af bundne proteiner, glycolipider og resterende DNA. Den rensede intakte sacculus kan efterfølgende fordøjes i de enkelte komponenter ved hydrolyse af β-1,4-forbindelsen mellem GlcNAc og MurNAc. Denne fordøjelse producerer GlcNAc-MurNAc-disaccharider med eventuelle strukturelle ændringer og / eller tværbindinger intakte og kaldes muropeptider (figur 1B).

Sammensætningsanalyse af PG blev oprindeligt udført gennem højtryksvæskekromatografisk separation (HPLC) for at rense hvert muropeptid efterfulgt af manuel identifikation af muropeptider10,11. Dette er siden blevet erstattet af væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS), som øger detektionsfølsomheden og reducerer den manuelle arbejdsbyrde ved rensning af hvert enkelt muropeptid. Den tidskrævende og komplekse karakter af den manuelle identifikation af muropeptider er imidlertid forblevet en begrænsende faktor, hvilket reducerer antallet af udførte undersøgelser. I de senere år med fremkomsten af "omiske" teknologier er automatiseret LC-MS-funktionsekstraktion blevet et kraftfuldt værktøj, der muliggør hurtig detektion og identifikation af individuelle forbindelser i komplekse prøver fra meget store datasæt. Når funktionerne er identificeret, sammenligner bioinformatisk software statistisk variationen mellem prøver ved hjælp af differentiel analyse, der isolerer selv minimale forskelle mellem det komplekse datasæt og viser dem grafisk for brugeren. Anvendelsen af software til funktionsekstraktion til analyse af PG-sammensætning er kun lige begyndt at blive udforsket 12,13,14 og koblet til bioinformatisk analyse 12. I modsætning til proteomisk analyse, der drager fordel af de let tilgængelige proteindatabaser, der forudsiger peptidfragmentering, hvilket muliggør fuldautomatisk identifikation, findes der i øjeblikket ikke noget fragmenteringsbibliotek for peptidoglycomics. Imidlertid kan funktionsekstraktion kombineres med kendte og forudsagte strukturelle databaser for at forudsige muropeptididentifikation12. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til brug af LC-MS-baseret funktionsekstraktion kombineret med et muropeptidbibliotek til automatiseret identifikation og bioinformatisk differentialanalyse af PG-sammensætning (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Peptidoglycan prøve forberedelse

  1. Vækst af bakteriekulturer
    BEMÆRK: Væksten af bakteriekulturerne vil variere afhængigt af bakteriearterne og de vækstbetingelser, der undersøges. De eksperimentelle parametre, der skal testes, definerer vækstbetingelserne.
    1. Dyrk bakteriekulturer under vækstbetingelser, der kræves til bakteriestammen og eksperimentelt design. Dyrk bakterier som tredobbelte kulturer (biologiske replikater), dvs. tre separate kolonier pr. stamme eller væksttilstand.
      BEMÆRK: Vækstbetingelser og vækstfase vides at have signifikant effekt på PG-sammensætning 1,2,10. Der skal udvises stor omhu for at opretholde konsistens mellem kulturer og replikater for at sikre, at sammensætningsændringer skyldes de eksperimentelle parametre og ikke eksperimentelle fejl.
    2. Kulturen afkøles hurtigt til 4 °C, opsamles ved centrifugering (11.000 x g, 10 min, 4 °C) og cellepillen fryses ved -20 °C. Cellepillen vaskes med forkølet 4 °C, 20 mM natriumphosphat pH 6,5 før frysning. Produktionen af den frosne cellepellet bør ske så hurtigt og så konsekvent mellem prøverne som muligt for at begrænse aktiviteten af enzymer, der kan ændre og/eller nedbryde PG under indsamlingsprocessen. Prøverne kan behandles direkte gennem ekstraktionsprocessen (punkt 1.2) uden frysning. Sørg dog for, at alle prøver behandles på samme måde.
      BEMÆRK: For at sikre tilstrækkeligt produkt til senere trin anvendes en vådcellepille af betydelig størrelse. Dette producerer en tilstrækkelig stor sakculipille, som let visualiseres og vedligeholdes under de gentagne vasketrin (punkt 1.2.5 og 1.2.14) uden væsentligt tab af produkt. Afhængigt af bakterie og vækstbetingelser vil dette udbytte sandsynligvis variere. For den gramnegative bakterie Pseudomonas aeruginosa, PAO1, producerede 4 L af en 0,5 OD 600-kultur en 3-4 g cellepille og var tilstrækkelig til at producere ~10 mg renset sacculi (afsnit 1.2.17)12. Dette er et stort overskud af sacculi, end der kræves for LC-MS (afsnit 2); Det vil dog hjælpe med målenøjagtighed (afsnit 1.2.17) og normalisering (afsnit 1.3).
  2. Ekstraktion af peptidoglycan sacculi
    BEMÆRK: Protokollen for ekstraktion af PG er tilpasset fra ref.9,11,15. Denne protokol vil ekstrahere PG fra individuelle bakterieceller som en hel sacculi, fri for andre cellulære komponenter. Protokollen kan bruges med enten gramnegative eller grampositive bakterier. For grampositive celler kan det dog være nødvendigt at justere den tykkere PG-struktur og fjerne cellevægsassocierede polymerer; såsom teichoic syrer.
    1. Resuspender frosne cellepellets ved ca. 1:10 af det oprindelige dyrkningsvolumen på 20 mM natriumphosphat pH 6,5. Udfør dette trin ved 4 °C (kan være 1–8 mg vådcellepelletvægt pr. ml buffer11,12).
      BEMÆRK: For at opretholde acetyleringstilstanden for PG kræves en pH-værdi på 6,5 eller lavere15,16.
    2. Tilsæt cellesuspension dråbevis til kogning 8% natriumdodecylsulfat (SDS) 20 mM natriumphosphat pH 6,5 for et endeligt volumen på 1: 1 (dvs. slutkoncentration er 4% SDS), omrør forsigtigt i en rundbundet kolbe udstyret med en vandkølet kondensator. (Figur 2, trin 2)
    3. Oprethold en mild kogning i 30 min til 3 timer under omrøring for at sikre fuldstændig membrandissociation. Sørg for, at den resulterende blanding er helt klar uden resterende celleklumper eller viskositet. Længere kogning foretrækkes for at garantere fuldstændig dissociation.
    4. Lad det afkøle til stuetemperatur. Prøven kan efterlades ved stuetemperatur natten over.
      BEMÆRK: Når SDS er til stede, skal prøverne opbevares ved stuetemperatur for at holde SDS i opløsningen.
    5. Sacculi opsamles som pellet gennem ultracentrifugering ved 70.000 x g i 40 minutter (eller den tid, det tager at sedimentere sacculi fuldstændigt) ved 25 °C.
    6. Gentagen vask af sacculi ved successiv ultracentrifugering (afsnit 1.2.5) og suspension i ~50 ml stuetemperatur 20 mM natriumphosphat pH 6,5, indtil vaskebufferen har en SDS-koncentration ~0,001%. Typisk er 5 til 7 vaske tilstrækkelige.
      BEMÆRK: For at teste koncentrationen af det resterende SDS i vaskebufferen skal du bruge det kolorimetriske farvestof, Pletter-alle17.
    7. Resuspender sacculi i 5-10 ml stuetemperatur 20 mM natriumphosphat pH 6,5.
    8. Sonikere prøven kort (~ 40%, 50 W, 20 kHz, 20 s) ved stuetemperatur for at sprede klumper.
      BEMÆRK: Udvidet sonikering vil mekanisk forårsage klipning af PG-strukturen18.
    9. Prøven suppleres med 50 μg/ml hver amylase, DNase og RNase, 10 mM magnesiumsulfat, og fordøjes ved 37 °C i 1 time med omrøring eller nutation.
      BEMÆRK: Amylasefordøjelse fjerner eventuelt resterende glykogen fanget i sakkuli11.
    10. Der tilsættes 100 μg/ml pronase og fordøjes ved 37 °C natten over med omrystning eller nutation og ~0,02% natriumazid.
      BEMÆRK: Pronase fordøjelse fjerner de tilsatte enzymer (fra punkt 1.2.9) og fjerner lipoproteiner, der er kovalent bundet til PG.
      FORSIGTIG: Natriumazid er meget giftigt og kræver korrekt brug / bortskaffelsesmetoder.
    11. Ultracentrifuge ved 70.000 x g i 40 minutter (eller den tid, det tager at sedimentere sacculi fuldstændigt) ved 25 °C for at fjerne natriumazid.
    12. Resuspender pellet i 25 ml 2% SDS 20 mM natriumphosphat pH 6,5.
    13. Der koges i 1 time i en dampkoger eller en rundbundet kolbe med vandkølet kondensator (punkt 1.2.2).
      BEMÆRK: Det andet SDS-kogetrin fjerner alle de resterende proteiner og forurenende stoffer fra sakkulien.
    14. Sacculi-vasken (punkt 1.2.6) gentages med ~50 ml stuetemperatur dobbeltdestilleret vand (ddH2O), indtil SDS-koncentrationen er ~0,001%.
    15. Pellet resuspenderes i en tilstrækkelig mængde ddH2O til at opslæmme sacculi, samt beholderen vaskes (f.eks. 25 ml) og fryses natten over ved -80 °C. Volumenet kan variere, da prøven frysetørres i næste trin, selvom mindre volumener kræver mindre tid til at frysetørre.
    16. Den næste dag frysefryses suspensionen og opbevares ved stuetemperatur.
    17. Mængden af frysetørret sakkuli måles på en analysevægt.
    18. Fortynd sacculi i ddH2O til 10 mg / ml og kort sonikere for at bryde klumper op før yderligere analyse.
  3. Kvantificering af renset peptidoglycan
    1. Mængden af renset sakkuli kvantificeres fra punkt 1.2.18 for at sikre, at massespecifikationsdata udlignes under differentialanalyse (afsnit 3.2). Følg den detaljerede metode, der er beskrevet i reference15.
      BEMÆRK: Renset sacculi (punkt 1.2.18) opdeles i individuelle sukker- og aminosyrekomponenter ved syrehydrolyse. Individuelle komponenter adskilles og kvantificeres ved anionbytningskromatografi ved hjælp af pulserende amperometrisk detektion. I betragtning af strukturen af PG (figur 1) er individuelle muropeptider sammensat af en enkelt MurNAc og en enkelt GlcNAc-rest. Derfor repræsenterer kvantificering af koncentrationen af begge rester mængden af muropeptider 1: 1 i prøven. MurNAc foretrækkes på grund af den rene topadskillelse fra andre PG-komponenter under kromatografi16.

2. Dataindsamling af massespektrometri

  1. Fremstilling af muropeptider til massespektrometri
    1. Der tilsættes 800 μg renset sacculi med 100 μg/ml mutanolysin, 100 mM ammoniumacetat pH 5,5 og 50 mM magnesiumchlorid i en 100 μL reaktion.
    2. Afgass ved 37 °C natten over.
    3. Der tilsættes 1:1 volumen 0,5 M boratbuffer pH 9,0 og suppleres med ~10 mg/ml natriumborhydrid (NaBH4).
      BEMÆRK: Mutarotation af cykliske sukkerarter mellem α og β anomere former vil forårsage flere topformationer under væskekromatografiadskillelsen af muropeptiderne. Behandlingen med NaBH4 eliminerer omdannelse mellem de to former ved at reducere MurNAc til muramitol11. Behandlingen reducerer ikke 1,6-anhydro MurNAc eller 1,4-bundne sukkerrester.
      FORSIGTIG: Reaktionen af NaBH4 producerer små mængder hydrogengas. NaBH4-reaktionen vil skabe bobler, og mikrofugerør skal holdes åbne for at tillade gas at slippe ud.
    4. Inkuber prøven ved stuetemperatur i ~20-30 min.
    5. Der centrifugeres kortvarigt for at sætte prøven i mikrofugerøret og fjerne bobler.
    6. pH justeres til <4,0 ved hjælp af 1:5 fosforsyre, tilsat i trin på 5 μL. Test pH ved hjælp af lakmus pH-teststrimler.
    7. Der centrifugeres ved ~17.000 x g i 1 min for at sedimentere eventuelt resterende uopløseligt materiale.
    8. Filtrer ved hjælp af 0,2 μm mikrocentrifugefiltre.
    9. Prøverne centrifugeres i 10 minutter ved 30.000 x g før injektion i LC-MS for at sikre, at eventuelle partikler ikke injiceres i MS.
  2. Opsætning af LC-MS
    1. Fastgør en overfladisk porøs partikelsøjle C18 (100 mm x 2,1 mm, porestørrelse <3 μm) til et QTOF-massespektrometer (Quadrupole-Time of Flight) med en minimal detekteringsnøjagtighed på fire decimaler.
    2. Udfør væskekromatografiseparation af muropeptider
      BEMÆRK: Hvert biologisk triplicat (punkt 1.1.1) skal køres gennem LC-MS (punkt 2.2.2 til 2.2.3) tre gange (teknisk triplicat). Derfor vil hver testet tilstand have i alt ni LC-MS-datafiler. Dataindsamling blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelig software (se Materialetabel). Anskaffelsessoftware bør dog vælges ud fra MS-maskineriet. Følgende repræsenterer en vejledning til opsætning af MS med parametre, der er specifikke for at køre denne protokol. For en detaljeret beskrivelse henvises til producentens manual.
      1. Til kromatografisk separation fremstilles følgende opløsningsmidler: 0,1% myresyre (A) og acetonitril med 0,1% myresyre (B).
      2. Opret en metode til kromatografisk adskillelse ved hjælp af følgende parametre.
      3. Indstil flowhastigheden til 0,4 ml/min.
      4. Konditioner kolonnen i 10 minutter ved 2 % B (~24 kolonnevolumener).
      5. Ved hjælp af en autosampler injiceres 10 μL prøve fra punkt 2.1.9.
        BEMÆRK: Kør en indledende prøve gennem LC-MS-protokollen, før du begynder dataindsamlingen. Denne kørsel bruges ikke til data, men til at øge retentionstidens reproducerbarhed for alle efterfølgende kørsler. Reproducerbarheden af retentionstiden er nødvendig under spektralbehandling (punkt 3.1) for nøjagtig identifikation og gruppering af masse-til-ladningsforhold (m/z) toppe.
      6. Adskil muropeptider ved hjælp af 2% B i 5 minutter (~ 12 kolonnevolumener), øg det derefter til 15% B over 13 minutter (~ 30 kolonnevolumener), øg det yderligere til 50% B over 10 minutter (~ 24 kolonnevolumener) og øg det til sidst til 98% B over 2 minutter (~ 5 kolonnevolumener).
        BEMÆRK: Kassér (send til spilde) de første 2 minutter og de sidste 5 minutter af gradienten.
      7. Afslut med en søjlevask ved 98% B i 6 min (~14 kolonnevolumener) og 20 min (~47 kolonnevolumener) genligevægt.
    3. Udfør massespektrometridetektion af muropeptider
      1. Masseaksen kalibreres i positiv tilstand ved hjælp af en indstillingsblanding i acetonitril, der indeholder LC-MS-referencemassestandarder i henhold til MS-producentens anvisninger.
        BEMÆRK: MS indstilles før begyndelsen af de kromatografiske kørsler (punkt 2.2.2.1).
      2. Konfigurer en metode til MS-dataindsamling ved hjælp af følgende parametre.
        BEMÆRK: MS- og MS/MS-data indsamles (punkt 2.2.3.2 til 2.2.3.6) samtidig med den kromatografiske separation af muropeptiderne (punkt 2.2.2.4 og 2.2.2.5). Både kromatografiske parametre og MS-parametre (punkt 2.2.2.2 og 2.2.3.2) er en enkelt metode, der tilføjes under opsætningen af en arbejdsliste til kørsel af flere prøver i rækkefølge.
      3. Elektrospraykapillarspændingen indstilles til 4,0 kV og tørregastemperaturen til 350 °C med en strømningshastighed på 13 L/min.
        BEMÆRK: Nitrogen (renhed >99%) bør anvendes som forstøvnings-, tørre- og kollisionsgas under al massespektrometridataindsamling.
      4. Indstil forstøvertrykket til 40 psi og indstil fragmentoren til 150 V.
      5. Indstil dyse-, skimmer- og oktavol RF-spændingerne til henholdsvis 1000 V, 65 V og 750 V.
      6. Indstil scanningsområdet til 300-2.000 m/z i positiv ion-tilstand på 4 GHz (udvidet dynamisk område).
      7. Indstil dataindsamling ved hjælp af dataafhængig MS/MS-indsamling med en MS- og MS/MS-scanningshastighed på 1 spektre/sekund. Vælg fem forløbermasse pr. cyklus i rækkefølgen enkeltvis, dobbelt og tredobbelt ladet.
      8. Indstil MS/MS-fragmenteringskollisionsenergierne til 15, 20 og 30 eV.

3. Differentiel analyse af muropeptidoverflod

  1. LC-MS kromatogram spektral behandling
    BEMÆRK: Rekursiv funktionsekstraktion blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelig software (se materialetabel). Anden software til ekstraktion af funktioner kan bruges. Anden software kan dog kræve yderligere manuel databehandling for at opnå den meget robuste rekursive ekstraktion. Forskellige software bruger terminologifunktionen, enheden og forbindelsen næsten om hverandre. For PG-analyse henviser alle til identifikationen af LC-MS-ionkromatogrammet, der er repræsentativt for et individuelt muropeptid (f.eks. Figur 3). Under spektralbehandling (afsnit 3.1) repræsenterer en funktion de mange m / z-toppe , der omfatter de mange mulige ionarter af et enkelt muropeptid, der er grupperet sammen under en enkelt sammensat etiket.
    1. Start et nyt projekt under Fil.
    2. Tilføj LC-MS QTOF-datafilerne, og tildel individuelle datafiler til en eksperimentel tilstand / gruppe, f.eks. to forskellige vækstbetingelser.
    3. Kør databehandlingsguiden Batch rekursiv funktionsekstraktion (små molekyler / peptider), og indstil databehandlingsfiltrene til at matche parametrene for LC-MS-betingelserne og instrumenteringen for nøjagtigt at identificere, gruppere og verificere m / z-toppe , der repræsenterer individuelle muropeptider. Fra kromatogrammet undersøges retentionstidsforskydningen og variationen af m/z af kendte lignende toppe for at indstille indledende filterparametre.
      BEMÆRK: Rekursiv funktionsekstraktion bruger en indledende ikke-målrettet algoritme til ekstraktion af molekylære funktioner til at identificere og justere kromatogramfunktioner (m / z-toppe ) på tværs af alle datafilerne. Når de er oprettet, bruges disse funktioner til at revurdere de originale datafiler (rekursive) med en målrettet algoritme til ekstraktion af molekylære funktioner for at forbedre pålideligheden og nøjagtigheden af de identificerede funktioner. Det er bedst at indstille den indledende ikke-målrettede ekstraktion med et smalt detektionsvindue og bruge bredere detektionsparametre til den rekursive ekstraktion til at identificere toppe i alle datafiler, der muligvis mangler i den indledende udtrækning. Det kan tage timer at køre den rekursive funktionsudtrækning afhængigt af antallet af prøver, dataenes kompleksitet og den tilstedeværende computerhardware
    4. Gennemse resultaterne af udtrækning af funktioner. Hvis et betydeligt antal funktioner ikke kunne justeres i en gruppe, skal du justere de rekursive filtreringsparametre for at udvide/begrænse registreringsvinduet efter behov. For at opnå dette skal du inspicere kromatogrammet og isotopprofilen for hver ekstraheret funktion for at sikre, at funktionsdetektering blev udført på samme måde på tværs af alle datafiler. For hver identificeret funktion i en datafil skal du også undersøge scoren, eventuelle advarsler, og om funktionen bestod de valgte filterparametre.
      BEMÆRK: Sørg for, at registreringsvinduer er smalle nok til, at forskellige funktioner ikke fejlagtigt grupperes sammen. Dette bemærkes ofte ved forskellige isotopprofiler mellem datafiler eller betydelige m / z / retentionstidsvariationer. Omvendt, hvis der er flere funktioner med lignende m/z og retentionstider, er det muligt, at filterparametrene var for strenge, hvilket resulterede i, at en MS-top blev opdelt i to funktioner. Kør derfor funktionsudtrækning (afsnit 3.1.3) igen med justerede filterparametre for opbevaringstid for at muliggøre bedre gruppering af disse funktioner. Visualisering af toppene med den laveste forekomst angiver, om de anvendte filtre (punkt 3.1.3) nøjagtigt identificerede toppe over baggrundsstøj. Hvis toppene med den laveste forekomst ligner baggrunden, skal du køre funktionsudtrækningen igen med nye baggrundsfilterparametre.
    5. Eksporter data som en sammensat udvekslingsfil (.cef) (et format, der er kompatibelt med det statistiske softwareprogram) eller en kolonnesepareret fil (.csv), der indeholder masse, retentionstid og overflod for hver funktion for hver prøve.
  2. Differentiel analyse af spektrale egenskaber
    BEMÆRK: Differentialanalyse blev udført ved hjælp af kommercielt tilgængelig software (se materialetabel). Anden bioinformatisk software kan bruges.
    1. Åbn programmet, og start et nyt projekt, når du bliver bedt om det.
    2. Følg vejledningen til dataimport og dataanalyse. Under dataimport skal du uploade de udpakkede filer (afsnit 3.1). Under dataanalyse skal du vælge signifikans og foldeændring til differentiel analyse og vælge at baseline data til medianintensiteten på tværs af alle datafilerne. Indstil ikke datafiltre (hvis dette blev gjort i det forrige spektrebehandlingstrin (afsnit 3.1)), da anvendelse af filtre igen ville ophæve den robuste rekursive funktionsekstraktion. I lighed med funktionsudtrækning skal differentialanalyse imidlertid justeres baseret på masse (m/z) og retentionstid på grund af drift i LC-MS-dataindsamlingen. Brug de parametre, der er bestemt i funktionsudtrækning (afsnit 3.1).
      BEMÆRK: Normaliser mellem datafiler ved hjælp af muropeptidkvantificeringen (afsnit 1.3) for at sikre, at variationer skyldes eksperimentelle parametre og ikke på grund af variationer i sakkulirensning (afsnit 1.2). Brug indstillingen ekstern skalering til at justere hver datafil for forskelle i MurNAc-prøvekoncentration.
    3. Når analysen er afsluttet, skal du undersøge de resulterende grafiske og statistiske analyser for at identificere muropeptider, der viser en signifikant tæthedsændring mellem de testede eksperimentelle forhold.
    4. Under projektnavigatoren skal du højreklikke på de forskellige analyser og vælge en eksportindstilling for at gemme funktionsdetaljer som en kolonnesepareret (.csv) datafil, der indeholder m/z, retentionstid, rå og normaliserede intensitetsværdier, p-værdi, FDR og foldændringer for hver funktion. Flere analyser skal gemmes for at få alle relevante data.
    5. Eksporter en anden .csv-fil, der kun indeholder de muropeptider, der har overgået de statistiske analyser, herunder p-værdi <0,05 og foldændring >2.
  3. Annotering af muropeptididentitet til spektrale træk
    BEMÆRK: Hver identificeret funktion skal tildeles en forudsagt muropeptidstruktur baseret på m / z , og denne annotation bekræftes ved at undersøge MS / MS-fragmenteringen. Efter bekræftelse af annotationerne kan det være nødvendigt at udføre og forfine differentialanalysen (afsnit 3.2).
    1. I differentialanalysesoftwaren skal du vælge ID-browser under resultatfortolkning. Tilføj et bibliotek med forventede muropeptidstrukturer, og vælg lignende parametre som tidligere anvendt (afsnit 3.1.3). Dette vil producere en forudsagt muropeptidannotation for hver identificeret funktion. Et bibliotek af muropeptidstrukturer kan fremstilles ved hjælp af m / z til forudsagte muropeptidstrukturer og MS-databasesoftware (se materialetabel). Imidlertid kan et bibliotek med m / z på > 6.000 mulige muropeptider findes i reference12.
    2. Vælg den forudsagte muropeptidannotation baseret på den matchende score og den biologiske relevans af det forudsagte muropeptid, dvs. vælg det mest sandsynlige muropeptid, der skal være til stede i den biologiske prøve.
    3. Bekræft manuelt den forudsagte muropeptidannotation ved at sammenligne m/z-toppene for MS/MS-kromatogrammet med det forudsagte m/z for alle mulige fragmenteringer af en kendt muropeptidstruktur (f.eks. figur 4).
      1. Se MS- og MS/MS-data ved hjælp af et kromatogramvisningsprogram (se materialetabellen, figur 4).
      2. Tegn den forudsagte muropeptidstruktur ved hjælp af en molekylær editor (kemisk strukturtegningsprogram) (se materialetabel, figur 4, grå indsats). Brug massefragmenteringsværktøjet til at vise m/z for MS-fragmenter, når hver binding brydes enten individuelt eller i kombination.
        BEMÆRK: Afhængigt af den fragmenteringsenergi, der anvendes til MS / MS, kan fragmentering ske ved enhver binding i muropeptidstrukturen. Nogle bindinger er dog lettere/hyppigere fragmenteret ved lavere energiniveauer. For eksempel forekommer fragmentering i peptidsidekæden oftest ved amidbindingen mellem aminosyrer. Under vurderingen af fragmenteringen er det vigtigt at bemærke, at GlcNAc-rester meget let fragmenteres fra muropeptidet. Derfor bør fragmentering af den kendte muropeptidstruktur vurderes med og uden GlcNAc. På grund af in-source-fragmenteringen af GlcNAc kan flere funktioner ekstraheret i spektralbehandling (afsnit 3.1) repræsentere en enkelt muropeptidstruktur. Hvis de findes, skal disse funktioner slås sammen, og differentialanalysen revurderes.
      3. Alle mulige fragmenteringer af den bestemte muropeptidstruktur (punkt 3.3.3.2) sammenlignes med MS/MS-kromatogrammet (punkt 3.3.3.1). For at bekræfte muropeptidannotationen skal m/z-toppene af flere fragmenter findes i MS/MS-kromatogrammet med et meget minimalt m/z-justeringsvindue (figur 4).
      4. For at belyse muropeptididentitet i tilfælde af tvetydig MS/MS-fragmentering gentages punkt 2.2.2 til 2.2.3 med prøver (punkt 2.1.9) for yderligere MS/MS-dataindsamling, der omfatter en liste over foretrukne prækursorer m/z og retentionstid med yderligere MS / MS-fragmenteringskollisionsenergier.
    4. For co-eluerende enheder, der blev annoteret som det samme muropeptid, skal du køre differentialanalysen (afsnit 3.2.2) igen og flette de ekstraherede funktioner.
  4. Vurdering af globale ændringer i muropeptidmodifikationer
    1. Rediger .csv-filen (afsnit 3.2.4) af de statistisk signifikante muropeptider med høj foldændring for at inkludere en enkelt kolonne for hver muropeptidmodifikation. Udfyld denne kolonne med en betegnelse for hvert kommenteret muropeptid (afsnit 3.3) (f.eks. acetyleret versus de-N-acetyleret GlcNAc eller MurNAc).
    2. Upload den ændrede .csv fil til Perseus22,23. Importer de normaliserede intensitetsværdier til importboksen Hoved, og importer ændringsbetegnelsen til feltet Kategorisk import.
    3. Under Anmærk rækker skal du klikke på Kategorisk anmærk rækker og tilføje datafiler til hver eksperimentel parameter.
    4. Under test skal du klikke på to prøveprøver for at udføre en elevs t-test (p-værdi < 0,05, FDR < 0,05, s0 = 1).
    5. Klik på 1D for at udføre 1D-annotation22,23. En 1D-annotation FDR < 0,05 indikerer en signifikant tæthedsændring for muropeptidmodifikationen mellem de testede eksperimentelle parametre. Indstilling af tærskelværdien (s0) = 1 viser 1D-annotationens FDR-score for alle muropeptiderne.
    6. Inden for en grafsoftware (se materialetabel) skal du oprette et varmekort over tæthedsfoldændringen for hver muropeptidmodifikation og vise 1D-annotationsscoren for at demonstrere signifikans (figur 5B). Foldændringen af hver muropeptidmodifikation kan produceres i Microsoft Excel ved hjælp af råintensiteterne af alle individuelle muropeptider, der indeholder modifikationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Øget detekteringsfølsomhed af MS-maskiner kombineret med højtydende peakgenkendelsessoftware har forbedret evnen til at isolere, overvåge og analysere stofsammensætninger af komplekse prøver i meget små detaljer. Ved hjælp af disse teknologiske fremskridt er nylige undersøgelser af peptidoglycansammensætning begyndt at bruge automatiserede LC-MS-funktionsekstraktionsteknikker 12,13,14,24 over ældre HPLC-baserede metoder 11,25,26,27,28,29,30,31 . Selvom der er adskillige generiske softwarepakker til ekstraktion af funktioner tilgængelige, er kommerciel software, der bruger rekursiv funktionsekstraktion, hurtig og meget robust ved automatisk at identificere og kombinere alle ladninger, isotoper og adduktversioner af hvert muropeptid, der findes i LC-MS-datasættet (figur 3). Derudover bruges indledende retentionstider, m/z og isotopmønstre for ekstraherede funktioner til at revurdere (rekursive) datasættet for at sikre nøjagtig identifikation af hver funktion i alle datafiler. Derfor hjælper den rekursive algoritme med at validere og øge tilliden til topidentifikation. De fleste generiske funktionsekstraktionsprogrammer grupperer ikke ladninger / isotoper osv. og vil kræve dette som et ekstra manuelt trin. Derudover vil generiske programmer være mindre robuste, da funktioner udtrækkes separat i hver datafil og ikke som et helt datasæt, som er en del af den rekursive algoritme.

Den peptidoglykæmiske protokol, der præsenteres her, blev for nylig brugt til at undersøge sammensætningsændringerne af PG mellem to fysiologiske vækstbetingelser, nemlig fritsvømmende planktonisk og stationær fælles biofilm12. Ved hjælp af en meget følsom QTOF MS kombineret med ekstraktion af den rekursive funktion blev 160 forskellige muropeptider genkendt og sporet. Dette repræsenterede otte gange antallet af muropeptider identificeret i denne organisme tidligere 29,32 og mere end det dobbelte af muropeptiderne identificeret ved hjælp af andre metoder i andre organismer10,14,24.

Tilknytning af hver m / z-top ekstraheret fra MS-dataene med et bestemt muropeptid lettes ved krydshenvisning med en database med kendte og forudsagte muropeptidstrukturer. Fragmenterings-MS/MS-kromatogrammet (figur 4) for hver ekstraheret egenskab sammenlignes med fragmenteringsprofilen (figur 4, grå indsats) for det muropeptid, der foreslås ved hjælp af databasen.

Peptidoglykæmiske data kan ses på en række forskellige måder afhængigt af den eksperimentelle opsætning og de spørgsmål, der stilles. En sådan grafisk analyse kan omfatte analyse af hovedkomponenter (PCA), scatterplots, vulkanplots, varmekort og hierarkisk klyngeanalyse. For eksempel fremhæver vulkanplotter muropeptider, der viser en statistisk signifikant høj størrelse af tæthedsændring mellem de testede betingelser (figur 5A). Disse udvalgte muropeptider, som repræsenterer signifikante tæthedsændringer mellem de testede betingelser, kan undersøges yderligere for muropeptidmodifikationer. Disse modifikationer kan omfatte tilstedeværelsen af aminosyresubstitutioner, acetyleringsændringer eller tilstedeværelsen af amidaseaktivitet. Når de undersøges sammen, kan flere muropeptider med samme modifikation undersøges for en tendens mod en eksperimentel tilstand (figur 5A - fremhævede punkter grønne) og hele gruppen vurderes for signifikans (figur 5B). Sporing af en muropeptidmodifikation på denne måde kan indikere en bestemt enzymatisk aktivitet, der påvirkes af den eksperimentelle parameter. Derudover kan afvigende værdier fra denne tendens indikere enzymatisk aktivitet med en særlig specificitet eller biologisk funktion (figur 5A - fremhævede punkter orange).

Figure 1
Figur 1: Eksempel på en typisk gramnegativ peptidoglycanstruktur. (A) I gramnegative bakterier er peptidoglycan placeret i periplasmaet mellem de indre og ydre membraner. (B) Et enkelt muropeptid består af en β-1,4-bundet N-acetylglucosamin (GlcNAc) (blå) og en N-acetyl muraminsyre (MurNAc) (lilla) med en vedlagt peptidsidekæde (orange). Peptidsidekæden kan tværbindes til sidekæden af tilstødende muropeptid, der producerer den modne mesh-lignende peptidoglycan (A). Oprensning involverer isolering af peptidoglycan fra hele cellen som en sakculus, hvor alt andet cellulært materiale er blevet fjernet væk. C) Transmissionselektronmikrografi af en peptidoglycansakkuli. Til sammenligning kan grampositiv PG bestå af et større udvalg af variationer i struktur og er en del af grampositiv taksonomisk klassifikation33. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Peptidoglycomics workflow. Forberedelse af prøve. Trin 1, vokse og pellet bakterieceller (afsnit 1.1). Trin 2, rens peptidoglycan sacculi med 4% SDS kog (afsnit 1.2). Dataindsamling. Trin 3, enzymatisk fordøjelse af sacculi til fremstilling af muropeptider ved brud på β-1,4-bindingen mellem N-acetylglucosamin (GlcNAc) og N-acetylmuraminsyre (MurNAc) i peptidoglycanrygraden (afsnit 2.1). Trin 4, analyse af muropeptidintensitet gennem LC-MS / MS (afsnit 2.2). Dataanalyse. Trin 5, rekursiv funktionsekstraktion identificerer og indsamler alle ladninger, addukter og isotoper forbundet med et enkelt muropeptid (afsnit 3.1). Trin 6, identifikation af muropeptider ved at sammenligne forventet fragmentering med MS/MS-kromatogrammer (pkt. 3.3). Trin 7, bioinformatisk differentialanalyse (afsnit 3.2), der sammenligner peptidoglycansammensætningsændringer mellem forskellige eksperimentelle parametre. Trin 8, undersøg den globale ændring i muropeptidmodifikationer inden for de forskellige eksperimentelle parametre ved hjælp af 1D-annotation (afsnit 3.4). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på ekstraktion af rekursive funktioner. For et muropeptid, der repræsenterer en peptidsidekæde af alanin (A), iso-ᴅ-glutamat (E), meso-diaminopimelsyre (m), alanin (A) tværbundet til AE m A i den tilstødende muropeptidsidekæde (1864,8 m / z). Inkluderet i den ekstraherede funktion for 1864,8 m / z er ladninger (+1, +2 og +3), addukter (fx natrium og kalium), tab af GlcNAc (1 eller 2 GlcNAc) og flere isotoptoppe for hver variation (fx zoomet indsats). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Muropeptidfragmentering og identifikation. Til annotation gives hver m / z-top (funktion) ekstraheret fra MS-kromatogrammet en foreslået muropeptidstruktur baseret på lighed med et muropeptidbibliotek. For at bekræfte denne foreslåede struktur genereres forudsagte MS / MS-fragmenter ved hjælp af et kemisk tegneprogram (grå indsats). Denne forudsagte fragmentering sammenlignes med MS/MS-kromatogrammet. Når forudsagte fragmenter (grå indsats) matcher MS / MS-kromatogrammet, bekræftes den foreslåede muropeptidstruktur. Tallet er ændret i forhold til reference12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Differentiel analyse af peptidoglycansammensætning. (A) Vulkanplot af foldændringen og statistisk betydning af ændringer i muropeptidintensitet mellem peptidoglycan renset fra P. aeruginosa dyrket som enten fritsvømmende planktonkultur eller stationær biofilmkultur. Alle muropeptider, der har en modifikation, der repræsenterede en ændring i det typiske aminosyrearrangement inden for peptidsidekæden, fremhæves. Aminosyresubstituerede muropeptider, der viste en tendens til nedsat overflod i biofilmafledt peptidoglycan, fremhæves med grønt. Aminosyresubstituerede muropeptider, der var outliers til denne tendens og viste øget overflod i biofilmafledt peptidoglycan, fremhæves i orange. (B) Varmekort over den globale foldændring i overflod af alle de aminosyresubstituerede muropeptider med øget overflod (orange) og nedsat overflod (grøn) i biofilm. Disse muropeptider blev omgrupperet og vurderet for, om aminosyresubstitution forekom på monomerer, tværbundne dimerer, eller om den fjerde (AE m+), femte (AEmA+) eller begge aminosyrer (AEm++) blev substitueret. Signifikansen af hver gruppe muropeptider blev vurderet ved 1D-annotation med FDR < 0,05 for signifikans, og den tilhørende 1D-score vises. 1D-annotation kan kun udføres på mere end 2 muropeptider (f.eks. AEm ++ substitution blev kun fundet på to muropeptider). Derfor skal signifikans i dette tilfælde undersøges for de enkelte muropeptider og ikke på gruppen. Tallet er ændret i forhold til reference12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en metode til oprensning af peptidoglycan fra bakteriekulturer, proces til LC-MS-detektion og analyse af sammensætning ved hjælp af bioinformatiske teknikker. Her fokuserer vi på gramnegative bakterier, og der kræves nogle mindre ændringer for at muliggøre analyse af grampositive bakterier.

Fremstillingen af muropeptider har været stort set den samme, siden den først blev produceret i 1960'erne 9,11,15. Efter rensning fordøjes sacculi (pkt. 1.2.18) til individuelle muropeptider under anvendelse af muramidaseenzymet mutanolysin fra Streptomyces globisporus. Mutanolysin fordøjer PG-strukturen ved at bryde den β-1,4-glycosidbinding, der frigiver individuelle muropeptider bestående af et GlcNAc-MurNAc-disaccharid med vedlagt peptidsidekæde og inkluderer eventuelle modifikationer eller tværbindinger (figur 1).

En begrænsning af tidligere metoder, der blev brugt til at studere PG-sammensætning, har været den tidskrævende manuelle identifikation af muropeptider. På grund af kompleksiteten og vanskeligheden er addukter, ladninger og/eller isotoper måske eller måske ikke medtaget i analysen. Derudover begrænsede de fleste undersøgelser analysen til de mest rigelige, og dermed lettest at rense, muropeptider. På grund af metodens komplicerede karakter er der derfor udført relativt få detaljerede PG-sammensætningsanalyser på højt niveau. Analyserne af "omic"-typen har anvendt nylige teknologiske forbedringer til produktion og statistisk analyse af relativt store og komplekse LC-MS-datasæt til overblik på højt niveau over biologiske systemer. Anvendelsen af peptidoglycomics vil muliggøre analyse af PG-sammensætning i meget fine detaljer.

Inden for peptidoglycomics reducerer rekursiv funktionsekstraktion manuel arbejdsbyrde og øger nøjagtigheden ved at undersøge alle datafiler på én gang. En rekursiv funktionsekstraktionsalgoritme bruges til at identificere, justere og gruppere unikke spektrale træk (m / z-toppe) på tværs af flere LC-MS-kromatografiske datafiler, hvilket gør identifikation af muropeptid m / z-toppe automatiseret. Denne algoritme bruger isotopisk mønstermatchning, der tager de mange potentielle isotoper, ionaddukter og ladningstilstande og kondenserer de mange m / z-toppe til sin repræsentative enkeltforbindelse (eller funktion), som i dette tilfælde ville repræsentere et enkelt muropeptid (figur 3). Verifikation af spektralfunktionsgruppen opnås ved at sammenligne retentionstid, m / z og isotopisk mønstermatchning inden for hver kromatografisk datafil for at sikre robust ekstraktion af funktionen i hele datasættet. Generiske algoritmer til at finde funktioner inkluderer muligvis ikke isotopmatchning eller justerer, grupperer eller verificerer m / z-toppe på tværs af flere prøver og kræver yderligere manuel databehandling for at udføre denne funktionsekstraktion.

Når funktioner er identificeret, håndterer bioinformatiske differentialanalysealgoritmer det meget store datasæt som helhed, hvilket giver mulighed for nyttige sammenligninger og fortolkninger fra de komplekse data. Brug af disse bioinformatiske grafiske analyser er en effektiv måde at visualisere og fortolke store datasæt for at undersøge tendenser, der kan indikere biologiske processer. Det var først for nylig, at disse kraftfulde grafiske analyser blev brugt til at undersøge peptidoglycan i meget fine detaljer12. Differentialanalyse (afsnit 3.2) vurderer ændringerne i overflod af individuelle muropeptider mellem forskellige eksperimentelle betingelser. Inden for rammerne af hele bakterieceller kan aktiviteten af PG-modificerende enzymer imidlertid resultere i flere forskellige muropeptidstrukturer afhængigt af specificiteten af den katalytiske aktivitet (dvs. tilsætningen af en acetylgruppe på disaccharidet kan være med eller uden en modifikation af peptidsidekæden). Derfor vil vurdering af de globale tæthedsændringer af en bestemt modifikation på tværs af alle individuelle annoterede muropeptider give indsigt i den enzymatiske aktivitet, der virker på PG (figur 5) Derfor bruges differentiel analyse til at undersøge overflodsændringer af individuelle muropeptider; der henviser til, at 1D-annotation undersøger overflodsændringer af en bestemt PG-ændring. Kobling af differentialanalyse med 1D-annotation gør det muligt at vurdere PG-sammensætning både på et individuelt muropeptidniveau og også som en indikator for den samlede PG-enzymatiske aktivitet.

Under differentialanalyse er det vigtigt at bemærke, at PG består af nogle få meget rigelige muropeptider og adskillige muropeptider med lav overflod12. Derfor er baselining meget vigtig for at fjerne enhver bias fra muropeptiderne med høj overflod under de senere trin i analysen. På grund af de udførte flere t-tests skal der også anvendes en statistisk korrektion for at reducere falske positive. Standarden er ofte Benjamini-Hochberg falsk opdagelsesrate (FDR)19. Andre korrektioner såsom den mere konservative Bonferroni familiemæssige fejlprocent (FWER)20,21 er mulige.

Inden for bioinformatisk software tildeles m / z-toppen , der er identificeret i funktionsekstraktion, også en forudsagt struktur. Andre analyser af "omisk" type (f.eks. proteomiske) drager fordel af tilgængeligheden af store sammensatte databaser, som giver mulighed for identifikation af forbindelser gennem prædiktiv fragmenteringsspektrematchning. I øjeblikket findes der ikke noget muropeptid forudsagt fragmenteringsbibliotek, og bekræftelsen af muropeptididentifikation forbliver et manuelt trin. Efterhånden som peptidoglykæmiske fragmenteringsdatabaser udvikles og bliver offentligt tilgængelige, vil dette manuelle identifikationstrin imidlertid blive mere automatiseret og tilgængeligt ved at fjerne eller stærkt reducere afsnit 3.3.3 og 3.3.4.

I Escherichia coli består PG af ~ 3,5 x 106 muropeptider pr.Celle 34. Inden for detektionsgrænserne for QTOF MS kan selv de laveste rigelige muropeptider stadig repræsentere hundredvis af kopier af et enkelt muropeptid i en celle12. Derfor kan forståelse af ændringerne i selv de laveste rigelige muropeptider give nyttig indsigt i den biologiske aktivitet af PG-målrettede enzymer i cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jennifer Geddes-McAlister og Dr. Anthony Clarke for deres bidrag til at forfine denne protokol. Dette arbejde blev støttet af driftstilskud fra CIHR tildelt C.M.K (PJT 156111) og en NSERC Alexander Graham Bell CGS D tildelt EMA Figurer blev oprettet den BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
C18 reverse phase column - AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask - 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator - micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix - HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, É, Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie - International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Tags

Retraktion udgave 164 peptidoglycan muropeptider massespektrometri funktionsekstraktion differentialanalyse bioinformatik peptidoglykomik
Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, E. M., Greenwood, N. A.,… More

Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter