Summary
Esta técnica permite la preparación rápida y sencilla de la sección de resina de tamaño de semilla entera para la observación y análisis de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de la semilla.
Abstract
La morfología, el tamaño y la cantidad de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en semillas determinan el peso y la calidad de las semillas. Son significativamente diferentes entre las diferentes regiones de semillas. Con el fin de ver claramente las morfologías de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, y analizar cuantitativamente sus parámetros morfológicos con precisión, se necesita la sección de tamaño de semilla completa. Aunque la sección de parafina de tamaño de semilla entera puede investigar la acumulación de materiales de almacenamiento en semillas, es muy difícil analizar cuantitativamente los parámetros morfológicos de las células y materiales de almacenamiento debido a la baja resolución de la sección gruesa. La sección de resina delgada tiene alta resolución, pero el método de seccionamiento rutinario de resina no es adecuado para preparar la sección de tamaño de semilla entera de semillas maduras con un gran volumen y alto contenido de almidón. En este estudio, presentamos un método de seccionamiento seco simple para preparar la sección de resina de tamaño de semilla completa. La técnica puede preparar las secciones transversales y longitudinales de tamaño integral de semillas en desarrollo, maduras, germinadas y cocidas incrustadas en resina LR White, incluso para semillas grandes con alto contenido de almidón. La sección de tamaño de semilla entera se puede teñir con brillo fluorescente 28, yodo y Coomassie azul brillante R250 para exhibir específicamente la morfología de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos claramente, respectivamente. La imagen obtenida también se puede analizar cuantitativamente para mostrar los parámetros morfológicos de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas.
Introduction
Las semillas vegetales contienen materiales de almacenamiento como almidón y proteínas y proporcionan energía y nutrición a las personas. La forma, el tamaño y la cantidad de los materiales celulares y de almacenamiento determinan el peso y la calidad de las semillas. Las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de semillas tienen morfologías significativamente diferentes, especialmente para algunos cultivos de cereales de alta amilasa con inhibición de la enzima ramificada de almidón IIb1,2,3. Por lo tanto, es muy importante investigar las morfologías de las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de semillas.
El seccionamiento de parafina es un buen método para preparar la sección de tamaño de semilla entera y puede exhibir la estructura tisular de la semilla y la acumulación de material de almacenamiento en diferentes regiones desemillas 4,5,6. Sin embargo, las secciones de parafina suelen tener un espesor de 6-8 m con baja resolución; por lo tanto, es muy difícil observar claramente y analizar cuantitativamente la morfología de los materiales celulares y de almacenamiento. Las secciones de resina suelen tener un espesor de 1-2 m y una alta resolución y son muy adecuadas para observar y analizar la morfología de los materiales celulares y de almacenamiento7. Sin embargo, el método de seccionamiento rutinario de resina tiene dificultades para preparar la sección de tamaño de semilla completa, especialmente para semillas con un gran volumen y alto contenido de almidón; por lo tanto, no hay manera de observar y analizar la morfología de las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de la semilla. La resina LR White es una resina acrílica y exhibe baja viscosidad y fuerte permeabilidad, lo que lleva a sus buenas aplicaciones en la preparación de la sección de resina de semillas, especialmente para granos maduros de cereales con gran volumen y alto contenido de almidón. Además, la muestra incrustada en resina LR White se puede teñir fácilmente con muchos tintes químicos para exhibir claramente la morfología de las células y materiales de almacenamiento bajo el microscopio ligero o fluorescente7. En nuestro artículo anterior, hemos reportado un método de seccionamiento seco para preparar las secciones de tamaño de semilla entera de granos de cereales maduros incrustados en resina LR White. El método también puede preparar la sección de tamaño de semilla entera del grano de cereales en desarrollo, germinado y cocido8. La sección obtenida de tamaño de semilla entera tiene muchas aplicaciones en la observación y análisis de micromorfología, especialmente para ver y analizar cuantitativamente las diferencias morfológicas de los materiales celulares y de almacenamiento en diferentes regiones desemillas 8,9.
Esta técnica es adecuada para los investigadores que desean observar la microestructura del tejido y la forma y el tamaño de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas utilizando microscopio de luz. Las imágenes de secciones de tamaño de semilla entera teñidas específicamente para exhibir células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos pueden ser analizadas por un software de análisis morfológico para medir cuantitativamente los parámetros morfológicos de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas. Con el fin de demostrar la aplicabilidad técnica y las aplicaciones de sección de tamaño integral, hemos investigado las semillas maduras de maíz y colza y los granos de arroz en desarrollo, germinados y cocidos en este estudio. El protocolo contiene cuatro procesos. Aquí, utilizamos el grano de maíz maduro, que es el más difícil en la preparación de las secciones de tamaño de semilla entera debido al gran volumen y alto contenido de almidón, como una muestra para exhibir los procesos paso a paso.
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Protocol
1. Preparación de semillas incrustadas en resina (Figura 1)
- Fijar seis granos maduros de maíz en 10 ml de glutaraldehído con fosfato del 2,5% (0,1 M, pH7,2) a 4 oC durante 48 h. Los investigadores pueden elegir otras mezclas fijativas, concentraciones fijativas, y condiciones de fijación de acuerdo con sus objetivos de investigación y tipos de tejido.
- Saque los granos y los corte longitudinal o transversalmente a 2-3 mm de espesor utilizando una hoja afilada de doble cara, y fijelos en 10 ml de glutaraldehído con búfer de fosfato (0,1 M, pH 7,2) de nuevo durante 48 h.
- Lave las muestras tres veces con 10 ml de tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7.2) durante 30 minutos cada vez.
- Deshidratar las muestras en grados crecientes de solución acuosa de etanol (10 ml) del 30% al 50%, 70%, 90% una vez y 100% tres veces durante 30 minutos cada vez.
- Infiltrar las muestras en grados de aumento de 10 ml de solución de resina LR White diluidas con etanol del 25% al 50%, 75% una vez y 100% dos veces a 4oC durante 12 horas cada vez.
- Prepare los pedestales para las muestras antes de incrustarlos. Añadir 0,25 ml de resina blanca 100% LR en un tubo centrífugo de 2 ml, y polimerizarlo a 60 oC durante 48 h.
- Añadir sucesivamente la resina blanca LR pura (0,5 ml) y la muestra infiltrada en el tubo de centrífuga con un pedestal. Enderezar las muestras con la aguja anatómica y polimerizarlas a 60oC en un horno durante 48 h.
2. Seccionamiento seco para la preparación de la sección de tamaño de semilla entera (Figura 1)
- Saque los granos incrustados del tubo de centrífuga y corte el exceso de resina alrededor de la muestra utilizando una cuchilla afilada.
- Sujete el bloque de resina en el soporte de muestra de ultramicrotoma (EM UC7), y recorte la resina superflua en la superficie de la muestra y alrededor de la muestra con una hoja.
- Pulir la superficie de la muestra finamente con un cuchillo de vidrio hasta que se pueda formar una sección completa.
- Coloque un pequeño gancho de cobre alrededor de 2 mm por encima del borde de la hoja antes de cortar y corte la muestra en una sección de 2 m. El papel del gancho es evitar el rizado hacia arriba de la sección.
- Coloque el gancho debajo de la sección para apoyarlo cuando la sección sea larga.
- Agregue 100 l de agua en un portaobjetos sin receta, y transfiera cuidadosamente la sección completa e ininterrumpida al agua con las pinzas.
- Con el fin de suavizar la sección arrugada, calentar y secar la muestra sobre la mesa aplanada a 50 oC durante la noche.
- Si la sección se desmorona o se desgarra, extienda el tiempo para cada infiltración de resina de la muestra de 12 h a 24 h o 48 h.
- Si la sección tiene algunas líneas paralelas al cuchillo, sujete firmemente el bloque de muestra. Si la sección tiene algunas líneas verticales al cuchillo, por favor use un cuchillo nuevo.
3. Tinción y observación de la sección
NOTA: Para observar la estructura tisular y morfología de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, manche las secciones con manchas específicas según el propósito de la investigación. Aquí, utilizamos el iluminador fluorescente 28, solución de yodo, y Coomassie azul brillante R250 para manchar las paredes celulares, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, respectivamente.
- Para observar la morfología de las células, manchar la sección con 40 ml de 0,1% (p/v) de aclarador fluorescente 28 solución acuosa en un frasco de tinción de vidrio compacto de 70 ml a 45 oC durante 10 min, y luego enjuáguelo con agua corriente durante 5 min. Observe y fotografíe la sección bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD.
- Para observar la morfología de los gránulos de almidón, manche la sección con 40 l de solución de yodo (0,07% (p/v) I2 y 0,14% (p/v) KI en 25% (v/v) glicerol) durante 1 min, y cubra la muestra que contiene solución de yodo con un cubreobjetos. Visuale y fotografíe la muestra bajo un microscopio de luz equipado con una cámara CCD.
- Para observar la morfología de los cuerpos proteicos, sumerja la sección con 40 ml de ácido acético al 10% (v/v) en un frasco de tinción de vidrio compacto de 70 ml durante 10 min a 45oC, y luego mancharlo en 40 mL de 1% (p/v) Coomassie brillante azul R250 en 25% (v/v) isopropanol y 10% (v/v) ácido acético durante 15 min a 45 oC. Lavar las secciones manchadas con agua corriente durante 5 min, y secar. Observe y fotografíe la sección bajo un microscopio de luz equipado con una cámara CCD.
4. Análisis cuantitativo de los parámetros morfológicos
- Procesar y analizar cuantitativamente las imágenes fotografiadas para el área, el eje largo/corto y la redondez de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas utilizando software de análisis de morfología (software Image-Pro Plus 6.0) siguiendo exactamente los procedimientos de Zhao et al.9.
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Representative Results
Método de seccionamiento en seco simple para obtener una sección de tamaño de semilla completa
Establecemos un método de seccionamiento seco simple para preparar una sección de semillas de tamaño de semilla entera incrustada en resina LR-blanca (Figura 1). El método puede preparar secciones transversales y longitudinales de tamaño de semilla entera con espesor de 2 m(Figura 2-5, Figura Complementaria 1-4). Por ejemplo, la semilla madura de la colza se puede secuescionar transversal y longitudinalmente (Figura 2). Para los cultivos de cereales, sus granos maduros están llenos de gránulos de almidón, lo que lleva a que sea muy difícil preparar la sección de tamaño de semilla entera. Utilizando la presente técnica, también se podrían preparar las secciones transversales y longitudinales de tamaño integral de maíz maduro con gran volumen(Figura 4, Figura Complementaria 1). Además, el núcleo en desarrollo (Figura Suplementaria 2), el núcleo germinado(Figura Complementaria 3) y el grano cocido (Figura Complementaria 4) del arroz se pueden investigar utilizando el método.
Aplicaciones de la sección de tamaño de semilla completa
Observación de la estructura tisular de la semilla
La sección de tamaño de semilla entera se puede utilizar para observar la estructura tisular de las semillas. Por ejemplo, el embrión de la colza consiste en radio, hipocotilo, plumule y dos cotiledones. Los cotiledones internos y externos están doblados por la mitad, envolviendo el hipocotilo y el radio y haciendo el embrión esférico (Figura 2A,C). Las secciones longitudinales y transversales de tamaño embrión entero teñidas con safranina mostraban claramente el radio, el hipocotilo, el cotiledón interior y el cotiledones exterior(Figura 2B,D). La sección longitudinal de tamaño embrión integral de la colza se prepara de forma más difícil que la sección transversal. Por lo tanto, las secciones transversales de los embriones se utilizan ampliamente para investigar la micromorfología de embriones en las referencias5,10.
Morfología y análisis de células en diferentes regiones de semillas
La sección de tamaño de semilla completa se puede utilizar para observar y analizar la morfología de las células en diferentes regiones de semillas. Por ejemplo, las secciones transversales de tamaño embrión integral de la colza se tiñeron con brillo fluorescente 28, y las paredes celulares se teñiron específicamente (Figura 3A). La micromorfología de las células en cualquier región del embrión podría mostrarse claramente con un aumento alto (Figura 3B,C). El radio consiste en epidermo, corteza y tejidos vasculares. Las células epidérmicas situadas en la capa más externa del radio eran rectangulares y radialmente dispuestas. Las células corticales del parénquima eran redondas en forma y de gran tamaño. Se observaron algunos espacios distintos entre las células corticales. Las celdas corticales estaban dispuestas en capas desde el interior hasta el exterior(Figura 3B). Las células epidérmicas del cotilledón eran cuadradas y tenían un pequeño volumen. No hubo diferencias significativas en la forma y el tamaño de las células epidérmicas entre las superficies externas e internas de los cotiledones internos y externos. Algunos cilindros vasculares se dispersaron en medio de los tejidos mesofífilos de los cotiledones internos y externos. Las células del parénquima de la mesofila eran significativamente más grandes que las células epidérmicas y las células del cilindro vascular en el cotiledón. Las células del parénquima de mesofila mostraron una disposición típica de empalizada en la región interna del cotiledón externo y la región externa del cotiledone interno (Figura 3C). Las células del parénquima tenían morfologías significativamente diferentes en diferentes regiones del embrión. Para revelar sus diferencias en la morfología, se eligieron las regiones 1, 2, 3, 4 y 5 en el radio tejido cortical, región interna del cotiledone interno, región exterior del cotilledón interno, región interna del cotiledón exterior y región exterior del cotilledón exterior, respectivamente (Figura 3B,C). Los parámetros morfológicos de las células del parénquima en las 5 regiones anteriores se analizaron cuantitativamente utilizando un software de análisismorfológico (Tabla complementaria 1). El área, la longitud larga del eje, la longitud corta del eje y la redondez de las células del parénquima mostraron algunas diferencias en las diferentes regiones de los embriones.
Las células del endospermo estaban llenas de almidón y proteína de almacenamiento. Usando la sección de resina de tamaño de semilla completa, es fácil observar y analizar las células en diferentes regiones de endospermo. Por ejemplo, la morfología de las células en cualquier región de endospermo de maíz podría verse claramente después de que las secciones transversales de tamaño de semilla entera se tiñen con un aclarador fluorescente 28. Los endospermas periféricos, medios y centrales del mismo núcleo mostraban formas y tamaños de células significativamente diferentes (Figura complementaria 1). Con el fin de analizar cuantitativamente los parámetros morfológicos de las células en diferentes regiones de endospermo, las imágenes de las regiones se analizaron utilizando software de análisis morfológico; los parámetros morfológicos de las células se presentan en la Tabla Suplementaria 2. Las células de endospermo en la región 1 tenían el área más pequeña entre cuatro regiones, las de la región 2 eran más grandes que las de la región 3, pero más pequeñas que las de la región 4.
Morfología y análisis de gránulos de almidón en diferentes regiones de semillas
Las semillas maduras de la mayoría de los recursos vegetales, especialmente para los cultivos de cereales, contienen un alto contenido de almidón. La morfología del gránulo y el tamaño del almidón tienen efectos importantes en las propiedades del almidón y juegan un papel en la calidad de la semilla. La sección de resina de la semilla se puede teñir con solución de yodo para exhibir la morfología de gránulos de almidón en diferentes regiones de semilla. Por ejemplo, las secciones transversales y longitudinales de tamaño de semilla entera del maíz se prepararon con éxito. Las secciones teñidas con yodo mostraban la morfología del almidón (Figura 4). Con el fin de mostrar la morfología del gránulo de almidón en diferentes regiones de endospermo, las cuatro regiones y nueve regiones fueron elegidas en las secciones transversales y longitudinales de tamaño de semilla entera, respectivamente (Figura 4). Los gránulos de almidón en diferentes regiones mostraron una morfología, tamaño y cantidad significativamente diferentes en las células de endospermo. Para la sección transversal, la región 1 tenía gránulos de almidón esférico, la región 2 tenía gránulos poligonales y gránulos de almidón en ambas regiones 3 y 4 eran esféricos. Para la sección longitudinal, los gránulos de almidón con forma poligonal en las regiones 1, 4, 5 y 8 eran más grandes que los de forma esférica en las regiones 3, 7 y 9, y se observaron algunos gránulos compuestos de almidón en las regiones 2 y 6.
El análisis cuantitativo de los parámetros morfológicos de gránulos de almidón en cuatro regiones de sección transversal se mostró en la Tabla Suplementaria 3. Los gránulos de almidón de la región 1 tenían el tamaño más pequeño, los de la región 2 tenían el tamaño más grande y los de la región 3 eran más grandes que en la región 4.
Micromorfología y análisis de cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas
La sección de tamaño de semilla entera con proteína de alto almacenamiento se puede utilizar para anverso y analizar la morfología de los cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas. Por ejemplo, la sección transversal del embrión de la colza se tiñeba con Coomassie azul brillante R250, y la proteína de almacenamiento se tiñeba de azul (Figura 5). La distribución espacial de la proteína de almacenamiento en el embrión podría observarse claramente en la baja ampliación(Figura 5A). La proteína de almacenamiento está presente en los cuerpos proteicos. Con un alto aumento, el cuerpo proteico exhibió una matriz heterogénea con algunos gránulos negros y alguna estructura transparente no manchada(Figura 5B). Los cuerpos proteicos de las semillas tienen tres tipos: el primer tipo consiste en una matriz proteica homogénea y no tiene inclusiones, el segundo tipo contiene cristales globulares, y el tercer tipo contiene cristales globulares y pseudocristales11. Los cristales globulares en el cuerpo proteico se componen de fititato y otras sales inorgánicas, que no están manchadas. Estos cristales globulares son negros debido a que la luz no puede pasar a través de ellos bajo el microscopio. Además, el cristal esférico es frágil y difícil de penetrar por el fijador y el agente de incrustación. Al hacer la sección, los cristales esféricos a veces estallan, resultando en una cavidad transparente dentro del cuerpo de la proteína11. El cuerpo proteico del embrión de colza contenía cristales esferoidales según su micromorfología (Figura 5B). Con el fin de investigar la distribución espacial de los cuerpos proteicos en el embrión, se eligieron cinco regiones en la sección de tamaño embrión entero para representar el tejido cortical radiocle, la región interna del cotiledone interno, la región exterior del cotilledón interno, la región interna del cotilledón exterior y la región exterior del cotilledón exterior (Figura 5A,C-G). Los cuerpos proteicos en todas las regiones del embrión eran esféricos, elipsoidales e irregulares de forma (Figura 5C-G).
El análisis cuantitativo de los cuerpos proteicos en la primera y segunda células de parénquima laicas cercanas a la epidermis en las cinco regiones antes elegidas se presenta en la Tabla Suplementaria 4. El área del cuerpo proteico tenía una ligera diferencia entre las cinco regiones elegidas. La redondez del cuerpo proteico fue significativamente menor en la región externa del cotilledón externo que en las otras cuatro regiones, lo que indica que el cuerpo proteico en el cotiledón externo estaba cerca de la esfera. El número y el índice de área del cuerpo proteico en las células fueron significativamente más altos en la célula del parénquima radicular que en la célula del parénquima cotiledonen(Tabla complementaria 4).
Figura 1: Preparación de la sección de semifina de resina de tamaño de semilla entera utilizando el método de seccionamiento seco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estructura tisular del embrión en semillas maduras de la variedad huashuang 5 de colza. (A) Morfología del embrión. (B) Estructura tisular de sección longitudinal de tamaño embrión entero. (C) Morfología de la sección transversal de tamaño embrión entero. (D) Estructura tisular de sección transversal de tamaño embrión entero. Las secciones estaban manchadas con safranina. H, hipocotilo; IC, cotilledón interior; OC, cotiledone exterior; R, radio. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Morfología de células en embrión de la variedad huashuang 5 de colza. (A) Sección transversal de tamaño embrión integral teñida con aclarador fluorescente 28. (B) Amplificación de la región B en (A), mostrando la morfología celular y la estructura tisular del radio. (C) Amplificación de la región C en (A), mostrando la morfología celular y la estructura tisular del cotiledón interior y exterior. Barra de escala a 500 m para (A) y 100 m para (B,C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología de gránulos de almidón en grano maduro de la variedad de maíz Zheng 58. Las secciones transversales (A) y longitudinales (B) de tamaño integral se tiñeron con solución de yodo, y sus amplificaciones regionales exhiben la morfología de gránulos de almidón en diferentes regiones de endospermo. Barra de escala de 1 mm para sección de tamaño de semilla entera y 20 m para amplificaciones regionales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Morfología de cuerpos proteicos en embrión de la variedad de colza Huashuang 5. (A) Sección transversal de tamaño embrión integral teñida con Coomassie azul brillante R250. (B) Amplificación de los cuerpos proteicos, mostrando su microestructura. (C-G) Amplificación de la región C-G en (A), mostrando la morfología del cuerpo proteico en radicle (C), región interna del cotiledón interior (D), región exterior del cotiledone interno (E), región interna del cotiledón exterior (F), región exterior del cotiledone interno (G). Barra de escala a 500 m para (A), 5 m para (B) y 50 m para (C-G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: Morfología de células en núcleo maduro de la variedad de maíz Zheng 58. La sección transversal de tamaño de semilla entera fue teñida con brillo fluorescente 28, y sus amplificaciones regionales (1-4) exhiben la morfología de células de endospermo en diferentes regiones de endospermo. Barra de escala de 1 mm para sección de tamaño de semilla entera y 100 m para amplificaciones regionales. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplementario Figura 2: Morfología del desarrollo del grano de la variedad de arroz 9311. Las secciones transversales de tamaño integral en diferentes días después de la floración (DAF) fueron contrarresten con safranina O y solución de yodo. Barra de escala de 0,5 mm. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Morfología del grano germinado de la variedad de arroz Te-qing. La sección longitudinal de tamaño de semilla entera a los 8 días después de la imbibición fue contrarrescrita con ácido-Schiff periódico y azul toluidina azul O, y sus amplificaciones regionales exhiben los cambios morfológicos del endospermo en diferentes regiones de semilla. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Suplementario Figura 4: La morfología del grano cocido de la variedad de arroz Te-qing. La sección transversal de tamaño de semilla entera fue teñida con solución de yodo, y sus amplificaciones de la región externa, media e interior exhiben los cambios morfológicos de gránulos de almidón en semillas durante el proceso de cocción durante 0, 10, 20 y 30 min. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 1: Parámetros morfológicos de las células en diferentes regiones de la colza embryoa Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla.
a Los datos son ± desviaciones estándar (n - 3), y los valores en la misma columna con letras diferentes son significativamente diferentes (p < 0.05).
b Las regiones se muestran en la Figura 3B,C.
c LAL: longitud del eje largo; SAL: longitud del eje corto; Redondez: (perímetro 2)/(4×π×área).
Tabla complementaria 2: Parámetros morfológicos de células en diferentes regiones de maíz endosperma Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.
a Los datos son ± desviaciones estándar (n a 3). Los valores de la misma columna con letras diferentes son significativamente diferentes(p < 0.05).
b Las regiones se muestran en la sección transversal del grano de maíz en la Figura Complementaria 1.
c LAL: longitud del eje largo; SAL: longitud del eje corto; Redondez: (perímetro 2)/(4×π×área).
Tabla complementaria 3: Parámetros morfológicos de gránulos de almidón en diferentes regiones de endospermo de maíza Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.
a Los datos son ± desviaciones estándar (n a 3). Los valores de la misma columna con letras diferentes son significativamente diferentes(p < 0.05).
b Las regiones se muestran en la sección transversal del grano de maíz en la Figura 4A.
c LAL: longitud del eje largo; SAL: longitud del eje corto; Redondez: (perímetro 2)/(4×π×área).
Tabla complementaria 4: Parámetros morfológicos de cuerpos proteicos en diferentes regiones de la colza embryoa Por favor haga clic aquí para descargar esta tabla.
a Los datos son ± desviaciones estándar (n - 3), y los valores en la misma columna con letras diferentes son significativamente diferentes (p < 0.05).
b Las regiones se muestran en la Figura 5.
c Redondez: (perímetro 2)/(4×π×área); El índice de área es la relación de área de proteína cuerpo a célula.
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Discussion
Las semillas son el recurso renovable más importante para alimentos, forraje y materia prima industrial, y son ricas en materiales de almacenamiento como el almidón y las proteínas. La morfología y cantidad de células y el contenido y configuración de los materiales de almacenamiento afectan al peso y la calidad de las semillas7,12. Aunque la estareología y la tecnología de análisis de imágenes pueden medir el tamaño y la cantidad de células en una región de tejido, carecen en muchos laboratorios. Las secciones de parafina y resina proporcionan una imagen bidimensional (2D), lo que no conduce a ningún modo en el análisis del tamaño y la cantidad real de células. Sin embargo, las celdas se cortan aleatoriamente en sus planos, el tamaño medio de muchas celdas (más de 100) de al menos tres secciones diferentes de la región del tejido pueden reflejar los parámetros de morfología 2D (longitud, anchura y área) de las celdas, y la relación del área de región elegida para el área de celda media puede reflejar la cantidad de celdas. Por lo tanto, es muy importante para la visualización in situ y el análisis de la morfología de las células y materiales de almacenamiento en diferentes regiones de semilla. La sección de parafina es la más adecuada para preparar la sección de tamaño de semilla entera, especialmente para semillas de gran tamaño7. Sin embargo, las células están llenas de materiales de almacenamiento con desarrollo de semillas, lo que lleva a que sea muy difícil obtener la buena sección de tamaño de semilla entera de semillas de desarrollo tardío y semillas maduras. Además, la sección de parafina es demasiado gruesa para exhibir la morfología claramente, y sólo es adecuada para investigar la estructura tisular de la semilla7.
La sección de resina es delgada, y puede exhibir la morfología de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos claramente7. Sin embargo, la resina de rutina no es adecuada para la sección de tamaño de semilla entera. La técnica presentada aquí representa un enfoque rápido, sencillo y agudo hacia la preparación de secciones transversales y longitudinales de tamaño de semillas maduras incrustadas en resina para ver la morfología de células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas utilizando microscopía de luz (Figura 2-5,Figura Suplementaria 1). Además, la técnica también puede preparar la sección de semillas en desarrollo, germinadas y cocidas para investigar in situ los cambios morfológicos de los cuerpos celulares, de almidón y proteínas en diferentes regiones de semillas.
Otra ventaja distinta que proporciona esta técnica es la aplicación de secciones de tamaño de semilla completa. En la nueva era de fenómica y metabolómica, es importante medir cuantitativamente los parámetros morfológicos de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas. La nueva técnica, junto con el software de análisis morfológico, permite al investigador analizar cuantitativamente los parámetros morfológicos de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones de semillas(Tabla Suplementaria 1-4).
Aunque el actual método de seccionamiento seco puede preparar con éxito la sección de resina de tamaño de semilla completa, tiene algunas limitaciones y deficiencias. Para la sección de parafina, la parafina se puede quitar fácilmente de la sección; pero para la sección de resina, la resina no se puede eliminar de la sección, lo que conduce a la muestra de la planta incrustada en resina. Por lo tanto, en comparación con la sección de parafina, la actual sección de resina de tamaño de semilla entera no es adecuada para llevar a cabo la histoquímica y la inmunohistoquímica. Además, el método de seccionamiento rutinario de resina puede cortar muestras en secciones lisas de 0,5-2 m debido al bloque de muestra con un volumen pequeño. Sin embargo, el actual método de seccionamiento seco es difícil de preparar las secciones lisas con un espesor inferior a 2 m, especialmente para semillas maduras con gran volumen y alto contenido de almidón.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La financiación fue proporcionada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32071927), el Proyecto de Talento de la Universidad de Yangzhou y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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