Summary
Cette technique permet la préparation rapide et simple de la section de résine de la taille d’une graine entière pour l’observation et l’analyse des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de la graine.
Abstract
La morphologie, la taille et la quantité des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans les graines déterminent le poids et la qualité des semences. Ils sont sensiblement différents d’une région à l’autre. Afin de visualiser clairement les morphologies des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques, et d’analyser quantitativement leurs paramètres de morphologie avec précision, la section de la taille d’une graine entière est nécessaire. Bien que la section de paraffine de la taille d’une graine entière puisse étudier l’accumulation de matériaux de stockage dans les graines, il est très difficile d’analyser quantitativement les paramètres de morphologie des cellules et des matériaux de stockage en raison de la faible résolution de la section épaisse. La section résine mince a une haute résolution, mais la méthode de sectionation de résine de routine n’est pas appropriée pour préparer la section entière de graines de la taille d’une graine avec un grand volume et une teneur élevée en amidon. Dans cette étude, nous présentons une méthode simple de sectionation sèche pour préparer la section de résine de la taille d’une graine entière. La technique peut préparer les sections transversales et longitudinales de la taille d’une graine entière de graines en développement, matures, germées et cuites intégrées dans la résine blanche LR, même pour les grosses graines à haute teneur en amidon. La section de la taille d’une graine entière peut être tachée d’un égayer fluorescent 28, d’iode et de Coomassie bleu brillant R250 pour exposer spécifiquement la morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques clairement, respectivement. L’image obtenue peut également être analysée quantitativement pour montrer les paramètres de morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de semences.
Introduction
Les graines végétales contiennent des matériaux de stockage tels que l’amidon et les protéines et fournissent de l’énergie et de la nutrition aux gens. La forme, la taille et la quantité de cellules et de matériaux de stockage déterminent le poids et la qualité des semences. Les cellules et les matériaux de stockage dans différentes régions de semences ont des morphologies significativement différentes, en particulier pour certaines cultures céréalières à haute teneur en amylose avec inhibition de l’amidon ramissant enzyme IIb1,2,3. Par conséquent, il est très important d’étudier les morphologies des cellules et des matériaux de stockage dans différentes régions de semences.
La paraffine est une bonne méthode pour préparer la section de la taille d’une graine entière et peut présenter la structure tissulaire des graines et l’accumulation de matériel de stockage dans différentes régionsde semences 4,5,6. Cependant, les sections de paraffine ont habituellement 6-8 μm d’épaisseur avec la basse résolution ; il est donc très difficile d’observer clairement et d’analyser quantitativement la morphologie des cellules et des matériaux de stockage. Les sections de résine ont habituellement 1-2 épaisseur de μm et haute résolution et sont très appropriées pour observer et analyser la morphologie des matériaux de cellule et destockage 7. Toutefois, la méthode de sectionation de résine de routine a de la difficulté à préparer la section de la taille d’une graine entière, en particulier pour les graines à fort volume et à forte teneur en amidon; ainsi, il n’existe aucun moyen d’observer et d’analyser la morphologie des cellules et des matériaux de stockage dans différentes régions de la graine. La résine blanche LR est une résine acrylique qui présente une faible viscosité et une forte perméabilité, ce qui conduit à ses bonnes applications dans la préparation de la section résine des graines, en particulier pour les grains matures céréaliers à fort volume et à forte teneur en amidon. En outre, l’échantillon incorporé dans la résine blanche LR peut être taché facilement avec de nombreux colorants chimiques pour montrer clairement la morphologie des cellules et des matériaux de stockage sous la lumière ou le microscope fluorescent7. Dans notre article précédent, nous avons signalé une méthode de sectionation sèche pour la préparation des sections entières de la taille d’une graine de grains de céréales matures incorporés dans la résine blanche LR. La méthode peut également préparer la section entière de la taille d’une graine de noyau de céréales en développement, germé et cuit8. La section obtenue de la taille d’une graine entière a de nombreuses applications dans l’observation et l’analyse de la micromorphologie, en particulier pour observer clairement et analyser quantitativement les différences de morphologie des cellules et des matériaux de stockage dans différentes régionsde semences 8,9.
Cette technique convient aux chercheurs qui veulent observer la microstructure des tissus et la forme et la taille des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de semences à l’aide d’un microscope léger. Les images de sections entières de la taille d’une graine tachées spécifiquement pour l’exposition de cellules, de granules d’amidon et de corps protéiques peuvent être analysées par un logiciel d’analyse morphologique pour mesurer quantitativement les paramètres de morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de semences. Afin de démontrer l’applicabilité technique et les applications de sections de la taille d’une graine entière, nous avons étudié les graines matures de maïs et de colza oléaté et les grains de riz en développement, germés et cuits dans cette étude. Le protocole contient quatre processus. Ici, nous utilisons le noyau de maïs mature, qui est le plus difficile à préparer les sections de la taille d’une graine entière en raison du grand volume et de la teneur élevée en amidon, comme échantillon pour exposer les processus étape par étape.
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Protocol
1. Préparation de semences encastrées dans la résine (figure 1)
- Fixer six grains matures de maïs dans 10 mL de glutaraldehyde phosphaté à 2,5 % (0,1 M, pH7,2) à 4 °C pendant 48 h. Les chercheurs peuvent choisir d’autres mélanges fixatifs, concentrations fixatives et conditions de fixation en fonction de leurs objectifs de recherche et de leurs types de tissus.
- Sortez les grains et coupez-les longitudilement ou transversalement à l’épaisseur de 2-3 mm à l’aide d’une lame à double face tranchante, et fixez-les en 10 mL de glutaraldehyde phosphaté à 2,5 % (0,1 M, pH 7,2) à nouveau pendant 48 h.
- Lavez les échantillons trois fois avec 10 mL de tampon de phosphate de 0,1 M (pH 7,2) pendant 30 min à chaque fois.
- Déshydrater les échantillons dans des catégories croissantes de solution aqueuse à l’éthanol (10 mL) de 30% à 50%, 70%, 90% une fois, et 100% trois fois pendant 30 min à chaque fois.
- Infiltrer les échantillons dans 10 mL de plus en plus de qualités de solution de résine blanche LR diluée avec de l’éthanol de 25% à 50%, 75% une fois, et 100% deux fois à 4 °C pendant 12 h à chaque fois.
- Préparer les piédestaux pour les échantillons avant de les intégrer. Ajouter 0,25 mL de résine blanche 100 % LR dans un tube de centrifugeuse de 2 mL et le polymériser à 60 °C pendant 48 h.
- Ajouter successivement la résine blanche LR pure (0,5 mL) et l’échantillon infiltré dans le tube de centrifugeuse avec un piédestal. Redressez les échantillons avec l’aiguille anatomique et polymérisez-les à 60 °C au four pendant 48 h.
2. Sections sèches pour la préparation d’une section entière de la taille d’une graine( Figure 1)
- Sortez les grains incorporés du tube de centrifugeuse et découpez l’excès de résine autour de l’échantillon à l’aide d’une lame tranchante.
- Serrez le bloc de résine dans le porte-échantillon de l’ultramicrotome (EM UC7) et coupez la résine superflue à la surface de l’échantillon et autour de l’échantillon à l’l’amiable.
- Polir finement la surface de l’échantillon à l’aide d’un couteau en verre jusqu’à ce qu’une section complète puisse être formée.
- Placez un petit crochet en cuivre à environ 2 mm au-dessus du bord de la lame avant de couper et coupez l’échantillon en une section de 2 μm. Le rôle du crochet est d’éviter le curling vers le haut de la section.
- Placez le crochet sous la section pour le soutenir lorsque la section devient longue.
- Ajouter 100 μL d’eau sur une toboggan non traitée et transférer délicatement la section complète et ininterrompue à l’eau avec les pinces à épiler.
- Afin de lisser la section ridée, chauffer et sécher l’échantillon sur la table aplatissante à 50 °C pendant la nuit.
- Si la section s’effrite ou déchire, prolonger le temps pour chaque infiltration de résine de l’échantillon de 12 h à 24 h ou 48 h.
- Si la section a quelques lignes parallèles au couteau, pincez le bloc d’échantillon étroitement. Si la section a quelques lignes verticales au couteau, s’il vous plaît utiliser un nouveau couteau.
3. Coloration et observation de la section
REMARQUE : Afin d’observer la structure tissulaire et la morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques, tacher les sections avec des taches spécifiques selon le but de la recherche. Ici, nous utilisons l’éclaircisseur fluorescent 28, solution d’iode, et Coomassie bleu brillant R250 pour tacher les parois cellulaires, granules d’amidon, et les corps protéiques, respectivement.
- Pour observer la morphologie des cellules, tacher la section avec 40 mL de 0,1 % (w/v) d’éclaircisseur fluorescent 28 solution aqueuse dans un bocal compact de coloration en verre de 70 mL à 45 °C pendant 10 min, puis rincer à l’eau courante pendant 5 min. Observez et photographiez la section au microscope à fluorescence équipé d’une caméra CCD.
- Pour observer la morphologie des granules d’amidon, tacher la section avec 40 μL de solution iodée (0,07% (w/v) I2 et 0,14% (w/v) KI en 25% (v/v) glycérol) pendant 1 min, et couvrir l’échantillon contenant une solution d’iode avec un coverslip. Visualisez et photographiez l’échantillon au microscope léger équipé d’une caméra CCD.
- Pour observer la morphologie des corps protéiques, immerger la section avec 40 mL d’acide acétique de 10% (v/v) dans un bocal compact de coloration en verre de 70 mL pendant 10 min à 45 °C, puis le tacher en 40 mL de 1% (w/v) Coomassie bleu brillant R250 en 25% (v/v) isopropanol et 10% (v/v) acide acétique pendant 15 min à 45 °C. Laver les sections tachées avec de l’eau courante pendant 5 min et les sécher. Observez et photographiez la section au microscope léger équipé d’une caméra CCD.
4. Analyse quantitative des paramètres de morphologie
- Traiter et analyser quantitativement les images photographiées pour la zone, l’axe long/court et la rondeur des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de semences à l’aide d’un logiciel d’analyse morphologique (logiciel Image-Pro Plus 6.0) suivant exactement les procédures de Zhao et coll.9.
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Representative Results
Méthode simple de sectionment sec pour l’obtention d’une section entière de la taille d’une graine
Nous établissons une méthode simple de sectionation sèche pour la préparation d’une section entière de graines de la taille d’une graine intégrée dans la résine blanche LR (figure 1). La méthode peut préparer des sections transversales et longitudinales de la taille d’une graine entière d’une épaisseur de 2 μm(figure 2-5,figure supplémentaire 1-4). Par exemple, les graines matures de colza oléagineux peuvent être sectionnées de façon transversale et longitudiine (figure 2). Pour les cultures céréalières, leurs grains matures sont pleins de granules d’amidon, ce qui fait qu’il est très difficile de préparer la section de la taille d’une graine entière. En utilisant la technique actuelle, les sections transversales et longitudinales de la taille d’une graine entière de maïs mature à grand volume pourraient également être préparées (figure 4, figure supplémentaire 1). En outre, le noyau en développement(figure supplémentaire 2),le noyau germé(figure supplémentaire 3)et le noyau cuit(figure supplémentaire 4)du riz peuvent être étudiés à l’aide de cette méthode.
Applications de la section de la taille d’une graine entière
Observation de la structure tissulaire des semences
La section entière de la taille d’une graine peut être utilisée pour observer la structure tissulaire des graines. Par exemple, l’embryon de colza oléaillé se compose de radicle, d’hypocotyl, de plumule et de deux cotylédons. Les cotyléons intérieurs et externes sont pliés en deux, enveloppant l’hypocotyle et le radicle et rendant l’embryon sphérique (Figure 2A, C). Les sections longitudinales et transversales de la taille d’embryons entiers tachées de safranin présentaient clairement le radicle, l’hypocotyl, le cotylédon intérieur et le cotylédon externe (figure 2B,D). La section longitudinale du colza oléagineur de la taille d’un embryon entier est préparée plus difficilement que la section transversale. Par conséquent, les sections transversales des embryons sont largement utilisées pour étudier la micromorphologie des embryons dans les références5,10.
Morphologie et analyse des cellules dans différentes régions de semences
La section de la taille d’une graine entière peut être utilisée pour observer et analyser la morphologie des cellules dans différentes régions de semences. Par exemple, les sections transversales de colza oléagineuse de la taille d’embryons entiers ont été tachées d’un égayer fluorescent 28, et les parois cellulaires ont été tachées spécifiquement (figure 3A). La micromorphologie des cellules dans n’importe quelle région de l’embryon pourrait être clairement affichée à grossissement élevé (figure 3B,C). Le radicle se compose de l’épiderme, du cortex et des tissus vasculaires. Les cellules épidermiques situées dans la couche la plus externe du radicle étaient rectangulaires et radialement disposées. Les cellules corticales de parenchyme étaient rondes dans la forme et grandes dans la taille. Quelques espaces distincts ont été observés entre les cellules corticales. Les cellules corticales ont été disposées en couches de l’intérieur vers l’extérieur( figure 3B). Les cellules épidermiques de cotyledon étaient carrées et avaient un petit volume. Il n’y avait aucune différence significative dans la forme et la taille des cellules épidermiques entre les surfaces externes et intérieures des cotylédons intérieurs et externes. Certains cylindres vasculaires ont été dispersés au milieu des tissus mésophylles des cotylédons intérieurs et externes. Les cellules de parenchyme de mésophylle étaient sensiblement plus grandes que les cellules épidermiques et les cellules vasculaires de cylindre dans le cotyledon. Les cellules de parenchyme de mésophylle ont montré un arrangement typique de palissading dans la région intérieure du cotyledon externe et la région extérieure du cotyledon intérieur (figure 3C). Les cellules de parenchyme ont eu des morphologies sensiblement différentes dans différentes régions de l’embryon. Afin de révéler leurs différences dans la morphologie, les régions 1, 2, 3, 4 et 5 ont été choisies dans le tissu cortical radicle, la région intérieure du cotylédon intérieur, la région extérieure du cotylédon intérieur, la région intérieure du cotylédon externe, et la région externe du cotylédon externe, respectivement (figure 3B, C). Les paramètres de morphologie des cellules parenchyma dans les 5 régions ci-dessus ont été analysés quantitativement à l’aide d’un logiciel d’analyse morphologique(tableau supplémentaire 1). La zone, la longueur de long axe, la longueur courte d’axe, et la rondeur des cellules de parenchyme ont montré quelques différences dans différentes régions des embryons.
Les cellules de l’endosperme étaient pleines d’amidon et de protéines de stockage. En utilisant la section résine de la taille d’une graine entière, il est facile d’observer et d’analyser les cellules dans différentes régions de l’endosperme. Par exemple, la morphologie des cellules dans n’importe quelle région de l’endosperme de maïs a pu être vue clairement après que les sections transversales de la taille d’une graine entière aient été tachées d’un éclaircisseur fluorescent 28. Les endospermes périphériques, moyens et centraux dans le même noyau présentaient des formes et des tailles significativement différentes de cellules(figure supplémentaire 1). Afin d’analyser quantitativement les paramètres de morphologie des cellules dans différentes régions de l’endosperme, les images des régions ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse morphologique; les paramètres de morphologie des cellules sont présentés dans le tableau supplémentaire 2. Les cellules endosperme de la région 1 avaient la plus petite superficie parmi quatre régions, celles de la région 2 étaient plus grandes que celles de la région 3, mais plus petites que celles de la région 4.
Morphologie et analyse des granules d’amidon dans différentes régions de semences
Les graines matures provenant de la plupart des ressources végétales, en particulier pour les cultures céréalières, contiennent une teneur élevée en amidon. La morphologie granulée et la taille de l’amidon ont des effets importants sur les propriétés de l’amidon et jouent un rôle dans la qualité des graines. La section résine des graines peut être tachée de solution d’iode pour montrer la morphologie des granules d’amidon dans différentes régions de graines. Par exemple, les sections transversales et longitudinales de la taille d’une graine entière de maïs ont été préparées avec succès. Les sections tachées d’iode présentaient la morphologie de l’amidon( figure 4). Afin de montrer la morphologie du granule d’amidon dans différentes régions de l’endosperme, les quatre régions et neuf régions ont été choisies dans les sections transversales et longitudinales de la taille d’une graine entière, respectivement (figure 4). Les granules d’amidon dans différentes régions ont montré la morphologie, la taille et la quantité sensiblement différentes dans les cellules d’endosperme. Pour la section transversale, la région 1 a eu des granules sphériques d’amidon, la région 2 a eu des granules polygonaux, et les granules d’amidon dans les deux régions 3 et 4 étaient sphériques. Pour la section longitudinale, les granules d’amidon avec la forme polygonale dans les régions 1, 4, 5, et 8 étaient plus grands que ceux avec la forme sphérique dans les régions 3, 7, et 9, et quelques granules composés d’amidon ont été observés dans les régions 2 et 6.
L’analyse quantitative des paramètres morphologiques des granules d’amidon dans quatre régions de la section transversale a été montrée dans le tableau supplémentaire 3. Les granules d’amidon de la région 1 avaient la plus petite taille, ceux de la région 2 avaient la plus grande taille et ceux de la région 3 étaient plus grands que dans la région 4.
Micromorphologie et analyse des corps protéiques dans différentes régions de semences
La section de la taille d’une graine entière à haute teneur en protéines de stockage peut être utilisée pour averser et analyser la morphologie des corps protéiques dans différentes régions de semences. Par exemple, la section transversale de l’embryon de colza oléaginé a été tachée de R250 bleu brillant Coomassie, et la protéine de stockage était tachée de bleu (Figure 5). La distribution spatiale des protéines de stockage dans l’embryon pourrait être clairement observée au faible grossissement (figure 5A). Les protéines de stockage sont présentes dans les corps protéiques. Au grossissement élevé, le corps protéique présentait une matrice hétérogène avec quelques granules noirs et une structure transparente non tachée (figure 5B). Les corps protéiques des semences ont trois types : le premier type se compose d’une matrice de protéines homogène et n’a pas d’inclusions, le second type contient des cristaux globulaires, et le troisième type contient des cristaux globulaires et des pseudocrystals11. Les cristaux globulaires du corps protéique sont composés de phytate et d’autres sels inorganiques, qui ne sont pas tachés. Ces cristaux globulaires sont noirs parce que la lumière ne peut pas passer à travers eux au microscope. En outre, le cristal sphérique est fragile et difficile à pénétrer par le fixatif et l’agent d’intégration. Lors de la fabrication de la section, les cristaux sphériques éclatent parfois, résultant en une cavité transparente à l’intérieur du corps protéique11. Le corps protéique de l’embryon de colza oléissé contenait des cristaux sphéroïdaux selon sa micromorphologie (Figure 5B). Afin d’étudier la distribution spatiale des corps protéiques dans l’embryon, cinq régions de la section entière de la taille d’un embryon ont été choisies pour représenter le tissu cortical radicle, la région interne du cotylédon intérieur, la région externe du cotylédon intérieur, la région intérieure du cotylédon externe et la région externe du cotylédon externe(figure 5A,C-G). Les corps protéiques de toutes les régions embryonnaires étaient de forme sphérique, ellipsoidale et irrégulière(figure 5C-G).
L’analyse quantitative des corps protéiques dans les première et deuxième cellules laïques de parenchyme proches de l’épiderme dans les cinq régions choisies ci-dessus sont présentées dans le tableau supplémentaire 4. La zone du corps protéique avait une légère différence entre les cinq régions choisies. La rondeur du corps protéique était significativement plus faible dans la région externe du cotylédon externe que dans les quatre autres régions, indiquant que le corps protéique dans le cotylédon externe était proche de la sphère. Le nombre et l’indice de secteur du corps protéique dans la cellule étaient sensiblement plus élevés dans la cellule radicle de parenchyme que dans la cellule de parenchyme de cotyledon(tableau supplémentaire 4).
Figure 1 :Préparation de la section de séminine de résine de la taille d’une graine entière selon la méthode de sectionnement sec. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 :Structure tissulaire de l’embryon dans les graines matures de la variété de colza oléaillé Huashuang 5. (A) Morphologie de l’embryon. (B) Structure tissulaire de la section longitudinale de la taille d’un embryon entier. (C) Morphologie de la section transversale de la taille d’un embryon entier. (D) Structure tissulaire de la section transversale de la taille d’un embryon entier. Les sections étaient tachées de safranin. H, hypocotyle; IC, cotyledon intérieur; OC, cotyledon externe; R, radicle. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Morphologie des cellules dans l’embryon de la variété de colza oléaillé Huashuang 5. (A) Section transversale de la taille d’embryons entiers teintée d’un égayer fluorescent 28. (B) Amplification de la région B dans (A), montrant la morphologie cellulaire et la structure tissulaire du radicle. (C) Amplification de la région C dans (A), montrant la morphologie cellulaire et la structure tissulaire du cotylédon intérieur et externe. Barre d’échelle = 500 μm pour (A) et 100 μm pour (B,C). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 :Morphologie des granules d’amidon dans le noyau mature de la variété de maïs Zheng 58. Les sections transversales (A) et longitudinales(B)de la taille d’une graine entière ont été tachées de solution d’iode, et leurs amplifications régionales présentent la morphologie des granules d’amidon dans différentes régions de l’endosperme. Barre d’échelle = 1 mm pour la section de la taille d’une graine entière et 20 μm pour les amplifications régionales. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 :Morphologie des corps protéiques dans l’embryon de la variété de colza oléaillé Huashuang 5. (A) Section transversale de la taille d’un embryon entier teintée de R250 bleu brillant Coomassie. (B) Amplification des corps protéiques, montrant leur microstructure. (C-G) Amplification de la région C-G dans (A), montrant la morphologie du corps protéique en radicle (C), la région intérieure du cotylédonintérieur( D ), région externe de cotyledon intérieur (E), région intérieure du cotyledon externe (F), région externe du cotyledon intérieur (G). Barre d’échelle = 500 μm pour (A), 5 μm pour (B) et 50 μm pour (C-G). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Supplément Figure 1: Morphologie des cellules dans le noyau mature de la variété de maïs Zheng 58. La section transversale de la taille d’une graine entière a été tachée d’un égayer fluorescent 28, et ses amplifications régionales (1-4) présentent la morphologie des cellules endosperm dans différentes régions de l’endosperme. Barre d’échelle = 1 mm pour la section de la taille d’une graine entière et 100 μm pour les amplifications régionales. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Supplément Figure 2: Morphologie du noyau en développement de la variété de riz 9311. Les sections transversales de la taille d’une graine entière à différents jours après la floraison (DAF) ont été contre-tachées de safranine O et de solution d’iode. Barre d’échelle = 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Morphologie du noyau germé de la variété de riz Te-qing. La section longitudinale de la taille d’une graine entière à 8 jours après l’imbibition a été contre-tachée d’acide périodique- Schiff et toluidine bleu O, et ses amplifications régionales présentent les changements morphologiques de l’endosperme dans différentes régions de semences. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Supplément Figure 4: La morphologie du noyau cuit de la variété de riz Te-qing. La section transversale de la taille d’une graine entière a été tachée de solution d’iode, et ses amplifications externes, moyennes et intérieures de la région présentent les changements morphologiques des granules d’amidon dans les graines pendant le processus de cuisson pendant 0, 10, 20 et 30 min. Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Paramètres de morphologie des cellules dans différentes régions de l’embryon de colza oléaniqueun S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
a Les données sont des ± écarts types(n = 3), et les valeurs dans la même colonne avec des lettres différentes sont significativement différentes(p < 0,05).
b Les régions sont indiquées dans la figure 3B,C.
c LAL : longueur d’axe longue ; SAL: longueur d’axe courte; Rondeur: (périmètre 2)/(4×π×area).
Tableau supplémentaire 2 : Paramètres de morphologie des cellules dans différentes régions de l’endosperme de maïsun S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
a Les données sont ± écarts types(n = 3). Les valeurs de la même colonne avec des lettres différentes sont significativementdifférentes (p < 0,05).
b Les régions sont indiquées dans la section transversale du grain de maïs dans la figure supplémentaire 1.
c LAL : longueur d’axe longue ; SAL: longueur d’axe courte; Rondeur: (périmètre 2)/(4×π×area).
Tableau supplémentaire 3 : Paramètres de morphologie des granules d’amidon dans différentes régions de l’endosperme demaïs un S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
a Les données sont ± écarts types(n = 3). Les valeurs de la même colonne avec des lettres différentes sont significativementdifférentes (p < 0,05).
b Les régions sont indiquées dans la section transversale du grain de maïs à la figure 4A.
c LAL : longueur d’axe longue ; SAL: longueur d’axe courte; Rondeur: (périmètre 2)/(4×π×area).
Tableau supplémentaire 4 : Paramètres de morphologie des corps protéiques dans différentes régions de l’embryon de colza oléaniqueun S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce tableau.
a Les données sont des ± écarts types(n = 3), et les valeurs dans la même colonne avec des lettres différentes sont significativement différentes(p < 0,05).
b Les régions sont indiquées dans la figure 5.
c Rondeur: (périmètre 2)/(4×π×area); L’indice de zone est le rapport de secteur du corps de protéine à la cellule.
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Discussion
Les semences sont la ressource renouvelable la plus importante pour la nourriture, le fourrage et les matières premières industrielles, et sont riches en matériaux de stockage tels que l’amidon et les protéines. La morphologie et la quantité des cellules ainsi que le contenu et la configuration des matériaux de stockage affectent le poids et laqualité des graines 7,12. Bien que la technologie de stéréologie et d’analyse d’image puisse mesurer la taille et la quantité des cellules dans une région tissulaire, elles font défaut dans de nombreux laboratoires. Les sections de paraffine et de résine donnent une image bidimensionnelle (2D), ne menant à aucun moyen d’analyser la taille et la quantité véritables des cellules. Cependant, les cellules sont coupées au hasard à leurs plans, la taille moyenne de nombreuses cellules (plus de 100) à partir d’au moins trois sections différentes de la région tissulaire peut refléter les paramètres de morphologie 2D (longueur, largeur et zone) des cellules, et le rapport de la région choisie à la zone cellulaire moyenne peut refléter la quantité de cellules. Par conséquent, il est très important pour la visualisation in situ et l’analyse de la morphologie des cellules et des matériaux de stockage dans différentes régions de semences. La section paraffine est la plus appropriée pour préparer la section de la taille d’une graine entière, en particulier pour les graines de grande taille7. Cependant, les cellules sont pleines de matériaux de stockage avec le développement des semences, ce qui conduit à ce qu’il est très difficile d’obtenir la bonne section de la taille d’une graine entière à partir de graines en développement tardif et les graines matures. En outre, la section de paraffine est trop épaisse pour montrer clairement la morphologie, et est seulement appropriée pour étudier la structure tissulaire de la graine7.
La section résine est mince, et peut montrer la morphologie des cellules, des granules d’amidon, et des corps de protéine clairement7. Cependant, la résine de routine ne convient pas à la section de la taille d’une graine entière. La technique présentée ici représente une approche rapide, simple et vive vers la préparation de sections transversales et longitudinales de graines entières de graines matures intégrées dans la résine pour visualiser la morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de semences à l’aide d’une microscopie légère(figure 2-5,figuresupplémentaire 1). En outre, la technique peut également préparer la section des graines en développement, germées et cuites pour étudier in situ les changements morphologiques des corps cellulaires, amidon et protéines dans différentes régions de semences.
Un autre avantage distinct que cette technique procure est l’application de sections entières de la taille d’une graine. Dans la nouvelle ère de la phénomique et de la métabolomique, il est important de mesurer quantitativement les paramètres de morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de graines. La nouvelle technique, en conjonction avec le logiciel d’analyse morphologique, permet au chercheur d’analyser quantitativement les paramètres de morphologie des cellules, des granules d’amidon et des corps protéiques dans différentes régions de semences(tableau supplémentaire 1-4).
Bien que la méthode actuelle de sectionation sèche puisse préparer avec succès la section de résine de la taille d’une graine entière, elle présente certaines limites et lacunes. Pour la section paraffine, la paraffine peut être enlevée facilement de la section; mais pour la section résine, la résine ne peut pas être retirée de la section, ce qui conduit à l’échantillon de plante incorporé dans la résine. Par conséquent, par rapport à la section paraffine, la section actuelle de résine de la taille d’une graine entière n’est pas appropriée pour effectuer l’histochimie et l’immunohistochimie. En outre, la méthode de sectionnement de résine de routine peut couper des échantillons en sections lisses de 0,5-2 μm en raison du bloc d’échantillon avec un petit volume. Mais la méthode actuelle de sectionation sèche est difficile à préparer les sections lisses avec une épaisseur inférieure à 2 μm, en particulier pour les graines matures avec un grand volume et une teneur élevée en amidon.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le financement a été fourni par la National Natural Science Foundation of China (32071927), le Talent Project de l’Université de Yangzhou et le Programme académique prioritaire de développement des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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- He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
- Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
- Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
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- Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
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- Lott, J. N. A.
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