Summary
Denna artikel syftar till att presentera ett protokoll om hur man bygger ett punktvariationsfluorescens korrelationsspektroskopi (svFCS) mikroskop för att mäta molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler.
Abstract
Dynamiska biologiska processer i levande celler, inklusive de som är associerade med plasmamembranorganisation, förekommer på olika rumsliga och tidsmässiga skalor, allt från nanometer till mikrometer respektive mikrosekunder till minuter. Ett så brett spektrum av biologiska processer utmanar konventionella mikroskopimetoder. Här beskriver vi proceduren för att implementera spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi (svFCS) mätningar med hjälp av ett klassiskt fluorescensmikroskop som har anpassats. Protokollet innehåller en specifik prestandakontroll av svFCS-installationen och riktlinjerna för molekylära diffusionsmätningar av svFCS på plasmamembranet i levande celler under fysiologiska förhållanden. Dessutom tillhandahåller vi ett förfarande för att störa plasmamembranflottanodomäner genom kolesteroloxidasbehandling och visar hur dessa förändringar i plasmamembranets laterala organisation kan avslöjas genom svFCS-analys. Sammanfattningsvis kan denna fluorescensbaserade metod ge oöverträffade detaljer om plasmamembranets laterala organisation med lämplig rumslig och tidsmässig upplösning.
Introduction
Komplexiteten i plasmamembranorganisation
Den nuvarande förståelsen av cellmembranorganisation måste ta hänsyn till flera aspekter1. För det första varierar en komplex lipidkomposition inte bara mellan celltyper utan också inom en enda cell (membranorganeller / plasmamembran). Dessutom är associerade eller inneboende membranproteiner mestadels organiserade i dynamiska multimera komplex, med stora domäner som sträcker sig utanför membranet, vilket står för ett betydligt större område än för transmembrandomänerna ensam. Dessutom uppvisar membranassocierade proteiner specifika lipidbindande eller lipid-interagerande kapaciteter som spelar roller för att reglera proteinfunktionen. Dessa beror direkt på den lokala sammansättningen och tillgängligheten av lipiderna2.
Slutligen observeras en signifikant nivå av asymmetri mellan två membranbroschyrer på grund av den inneboende asymmetriska strukturen hos membranproteiner och fördelningen av lipider. Faktum är att en lipidmetabolisk balans mellan syntes och hydrolys, i kombination med lipidflip-flop mellan broschyrerna, genererar en sådan asymmetrisk fördelning. Eftersom all transport över dubbelskiktet begränsas av den fria energi som krävs för att flytta polarhuvudgruppen genom membranens hydrofoba inre, assisteras den vanligtvis av selektiva transportörer. För varje celltyp tenderar asymmetrin att bibehållas ordentligt. Sammantaget bidrar dessa faktorer till lateral inhomogenitet eller uppdelning av plasmamembranet 3,4.
Vi berikar denna representation av plasmamembranet genom att ta hänsyn till den inneboende molekylära diffusionen inom och över dubbelskiktet, vilket bidrar till den dynamiska laterala heterogeniteten på en skala från tiondelar till hundratals nanometer och mikrosekunder till sekunder. Till exempel bidrar lipidberoende membrannanodomäner-de så kallade lipidflottorna, definierade som kolesterol och sfingolipidrika signalplattformar-till uppdelningen av plasmamembranet 5,6. Den nuvarande synen på membranorganisation är dock inte begränsad till lipidflottor ensam. Membrannanodomäner är mer komplexa och heterogena i sammansättning, ursprung och funktion. Ändå måste deras närvaro vid plasmamembranet samordnas tätt, och dynamiska interaktioner mellan proteiner och lipider verkar vara viktiga i den rumsliga fördelningen och kemiska modifieringen av membrannanodomäner 1,3,7,8.
SvFCS-principen och dess tillämpning för att undersöka plasmamembranets organisation
Även om stora framsteg har gjorts i analysen av membrandomäner, främst genom biofysiska tekniker, måste determinanterna som dikterar den lokala organisationen av plasmamembranet förfinas med lämplig rumslig och tidsmässig upplösning. Determinanter baserade på spårning av enskilda molekyler ger utmärkt rumslig precision och möjliggör karakterisering av olika rörelsesätt 9,10,11,12, men har en begränsad tidsupplösning med klassiska låga kamerabildhastigheter och kräver mer experimentell ansträngning för att spela in ett betydande antal banor. Alternativt kan diffusionskoefficienten för membrankomponenter utvärderas genom fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP)13 eller fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)14. Den senare har fått mer uppmärksamhet, främst på grund av dess höga känslighet och selektivitet, mikroskopiska detektionsvolym, låga invasivitet och breda dynamiska omfång15.
Den konceptuella grunden för FCS introducerades av Magde och kollegor för cirka 50 år sedanför 16,17. Den är baserad på registrering av fluktuationen av fluorescensemission med en hög tidsupplösning (från μs till s)18. I sin moderna version utförs mätningar i levande celler av en liten konfokal excitationsvolym (~ 0,3 femtoliter) placerad inom ett område av intresse (t.ex. vid plasmamembranet); fluorescenssignalen som genereras genom att diffundera fluorescerande molekyler som går in och ut ur observationsvolymen samlas in med mycket hög tidsupplösning (dvs. ankomsttiden för varje foton till detektorn). Därefter beräknas signalen för att generera autokorrelationsfunktionen (ACF), från vilken den genomsnittliga tiden td (diffusionstid) för vilken en molekyl stannar inom fokalvolymen extraheras, tillsammans med det genomsnittliga antalet partiklar, (N), närvarande i observationsvolymen, vilket är omvänt proportionellt mot ACF: s amplitud. Denna sista parameter kan vara användbar information om molekylkoncentrationen inom observationsvolymen.
Sedan dess har ett växande antal FCS-modaliteter implementerats tack vare snabbt utvecklande instrumentering i biofotonik, vilket möjliggör beskrivning av dynamiska fenomen som förekommer i levande system. Ändå skulle en molekylär art uppleva en mer överlappande fördelning av diffusionskoefficientvärdena, vilket vanligtvis återspeglas av en avvikande diffusionskarakteristik, där molekyler diffunderar med ett olinjärt förhållande i tid19 och svårigheter att identifiera den biologiska betydelsen av denna avvikande subdiffusion. Tidigare har denna svårighet övervunnits något genom att registrera den molekylära diffusionen av FRAP från områden av olika storlekar, snarare än från bara ett område, vilket ger ytterligare rumslig information. Detta möjliggjorde till exempel konceptualisering av membranmikrodomäner 20,21,22.
En översättning av denna strategi till FCS-mätningar (dvs. den så kallade punktvariationen Fluorescenskorrelationsspektroskopi (svFCS)) fastställdes genom att variera storleken på observationsvolymen, vilket gjorde att fluktuationen i fluorescens kunde registreras på olika rumsliga skalor23. Således tillhandahåller svFCS-metoden indirekt rumslig information som möjliggör identifiering och bestämning av molekylära diffusionslägen och typ av membranpartitionering (isolerad kontra angränsande domäner24) av studerade molekyler. Genom att plotta diffusionstiden td som en funktion av de olika rumsliga skalorna definierade av midjevärdet (ω), vilket motsvarar detektionsstrålens radiestorlek i detta fall23,25, kan man karakterisera diffusionslagen för en given molekyl i ett givet fysiologiskt tillstånd. SvFCS är därför en perfekt analog till enpartikelspårning i tidsdomänen26. Under den brownska diffusionsbegränsningen bör man förvänta sig ett strikt linjärt förhållande mellan diffusionstiden td och midjan ω (figur 1)23,25. Ursprunget till diffusionslagens avvikelse från detta schema kan hänföras till icke-exklusiva skäl, såsom cytoskelettnät, molekylär trängsel, dynamisk partitionering i nanodomäner eller någon kombination av dessa och andra effekter (figur 1), och måste testas experimentellt25.
Här tillhandahåller vi alla nödvändiga kontrollpunkter för daglig användning av ett skräddarsytt svFCS optiskt system byggt från grunden, vilket kompletterar våra tidigare protokollgranskningar27,28 på det experimentella tillvägagångssättet. Vidare, som ett bevis på konceptet, ger vi riktlinjer för kalibrering av installationen, beredning av celler, datainsamling och analys för upprättandet av svFCS diffusionslag (DL) för Thy1-GFP, ett plasmamembran glykosylfosfatidylinositolförankrat protein, som är känt för att vara lokaliserat i lipid-flottnanodomäner 29. Slutligen visar vi hur den partiella destabiliseringen av lipid-raft nanodomäner genom kolesteroloxidasbehandling påverkar diffusionsegenskaperna hos Thy1-GFP. Dessutom finns en detaljerad beskrivning av att bygga en svFCS-installation från grunden i kompletterande material.
Protocol
1. Ställa in specifikation för montering av en skräddarsydd svFCS-installation
OBS: Enkelheten i den föreslagna svFCS-installationen möjliggör enkel installation, drift och underhåll till en låg kostnad samtidigt som effektiviteten i fotonåtervinningen säkerställs. Mer information finns i Kompletterande material.
- Experimentrum och säkerhet
- Installera systemet i ett rum som är stabiliserat vid cirka 21 °C.
- Undvik direkt luftflöde på det passiva (eller aktiva) optiska bordet och följ lasersäkerhetsreglerna för optisk inriktning.
- Hårdvara och mjukvara
OBS: Kompletterande material beskriver installationsstegen som visas i figur 2.- Skriv huvudförvärvs- och kontrollprogramvaran i LabVIEW med hjälp av en tillståndsmaskin och händelsestrukturarkitektur där ett multifunktionsförvärvskort driver de flesta styrenheterna.
OBS: Korrelatorn, lasern och effektmätaren styrs eller övervakas av sin egen programvara. - Anpassa installationsprocedurerna för hårdvara och programvara enligt den använda hårdvaran.
- Skriv huvudförvärvs- och kontrollprogramvaran i LabVIEW med hjälp av en tillståndsmaskin och händelsestrukturarkitektur där ett multifunktionsförvärvskort driver de flesta styrenheterna.
- Optisk inställning
OBS: Figur 3 illustrerar de optiska bänkmodulerna som används i följande avsnitt för att kontrollera kvaliteten på de optiska inriktningarna. Alla specifikationer för optiska element listas i materialförteckningen. Proceduren för att bygga installationen är mycket detaljerad i kompletterande material. Detta system består av en kontinuerlig våglaser, ett motoriserat inverterat mikroskop utrustat med ett nedsänkningsvattenmål, en lavinfotodioddetektor kopplad till en enda fotonräkningsmodul och en hårdvarukorrelator. En inkubationskammare i mikroskop med vibrationsfria värmare har utformats speciellt för att kontrollera temperaturen för experiment på levande celler. Enligt konvention motsvarar XY-axeln den optiska banans vinkelräta plan och Z-axeln motsvarar den optiska banan.
2. Daglig kontrollpunkt innan du kör experimentet
- Kontrollera excitationsvägen (bild 3,
& 
).- Öppna alla irismembran.
- Mät lasereffekten med effektmätaren och håll den första irisen helt öppen.
- Vrid halvvågsplattan (HWP) för att hitta maximal effekt.
- Kontrollera inriktningen med iriserna om lasereffekten är lägre än vanligt och flytta L1 och M1 växelvis, om det behövs.
- Notera effektvärdet i experimentlaboratoriets anteckningsbok.
- Kontrollera identifieringsvägen (bild 3,
& 
).- Placera vattnet, ett täckglas och en droppe av en 2 nM rhodamin 6G (Rh6G) lösning på målet.
- Om fluorescenssignalen (antal nummer på APD, inspelad med LabVIEW-programvaran) är lägre än vanligt, gör om Rh6G-lösningen, kontrollera positioneringen och täckglasets nummer på objektivlinsen eller eliminera eventuella bubblor.
- Om fluorescenssignalen fortfarande är lägre än vanligt, placera effektmätaren inuti den optiska vägen för att blockera strålen.
- Stäng av APD (nedan hänvisar APD till APD och den enda fotonräkningsmodulen).
- Ta bort provet.
- Rengör och byt ut objektivlinsen mot ett reflekterande mål.
- Kontrollera laserstrålen på det reflekterande målet genom att ta bort effektmätaren från ljusbanan. Se till att målets stråle är centrerad och att bakreflektionen når den första irisen på linjen (figur 3).
- Om inte, justera mittpositioneringen med M2 eller bakreflektionen med den dikroiska spegeln.
- Om mikroskopkopplingen är korrekt, tryck tillbaka objektivlinsen, tillsätt en droppe vatten, en täckglas och en droppe av en mer koncentrerad Rh6G-lösning (dvs. 200 nM) och ställ in en lägre lasereffekt än för de klassiska mätningarna (få μW).
- Slå på APD och optimera APD och pinhålsjustering, växelvis, med sina respektive XYZ-justeringsskruvar medan du övervakar intensitetssignalen (LabVIEW-programvara).
- Byt täckglas och tillsätt en lägre koncentration av Rh6G (2 nM). Flytta pinhålet längs Z-axeln för att hitta en position där det molekylära ljusstyrkan ökar och midjan är minimal.
- Stäng iris tills signalen faller ner: laserstrålens storlek når målets bakre bländarstorlek (dvs. den minimala midjestorleken, se Kompletterande material).
- Starta korrelatorprogramvaran och registrera data (se avsnitt 7 för dataregistrering).
- Kontrollera ACF, som ska visa en låg mängd brus, ge en liten midjestorlek och en hög räkningshastighet per molekyl per sekund (se avsnitt 7 för dataanalys och utvärdering av midjestorlek).
& 
).
& 
).3. Allmänna överväganden för registrering och analys av svFCS-data
- Registrera och analysera fluorescensdata enligt detta allmänna schema (se avsnitt 7, 8 och 9): (1) fluorescensinspelning och ACF-generering (korrelatorprogramvara), (2) oväntad kassering av data, ett genomsnitt av kvarhållna data, anpassning till lämplig modell (med hemlagad Igor Pro-programvara), (3) diffusionslagsplott (hemlagad MATLAB-programvara 1) och (4) valfri jämförelse av diffusionslag (hemlagad MATLAB-programvara 2). De olika programmen är tillgängliga på begäran.
OBS: Hårdvarukorrelatorn har en minsta samplingstid på 12,5 ns (dvs. en samplingsfrekvens på 80 MHz). Det ger en tidsupplösning som är minst 1 000 lägre än den typiska uppehållstiden för fritt diffunderande liten molekyl i lösning och 106 mindre än diffusionstiden för membranproteiner inom en konfokal observationsvolym.
4. Cellodling och transfektion
- Frö Cos7-cellerna i 8-brunnskammare täckglas med # 1.0 borosilikatglasbotten vid en densitet av 10 000 celler / brunn med komplett Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 5% fetalt bovint serum, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 U / ml) och L-glutamin (1 mM).
- Odla cellerna vid 37 °C i en fuktad atmosfär innehållande 5 %CO2 i 24 timmar.
- Avlägsna mediet, tillsätt 300 μl av det färska hela odlingsmediet per brunn och förinkubera cellerna i 30 minuter vid 37 °C.
- Späd 0,5 μg av plasmid-DNA som kodar för Thy-1-protein smält med eGFP25 i 50 μL serumfri DMEM. Vortex kort att blanda.
- Späd 1,5 μl av DNA-transfektionsreagenset i 50 μL serumfri DMEM och blanda lösningen väl.
- Tillsätt det utspädda transfektionsreagenset direkt i den beredda DNA-lösningen och blanda föreningarna omedelbart.
- Inkubera den beredda blandningen i 10 till 15 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 μL av de kombinerade DNA/transfektionsreagenskomplexen droppvis på mediet i varje brunn och homogenisera genom att försiktigt virvla plattan.
- Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2 i 3 timmar.
- Efter inkubationen ersätter du mediet som innehåller DNA/transfektionsreagenskomplex med 400 μl färsk komplett DMEM och odlar cellerna i 16 timmar före svFCS-experimentet.
5. Beredning av celler för svFCS-mätningar
- Ta bort odlingsmediet.
- Tvätta cellerna försiktigt två till tre gånger med serumfri Hanks balanserade saltlösningsbuffert (HBSS) innehållande Ca2+ och Mg2+ kompletterat med 10 mM (4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES).
- Behåll cellerna i HBSS/HEPES-bufferten vid alla svFCS-förvärv.
6. Farmakologisk behandling
- Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna två till tre gånger med serumfritt HBSS kompletterat med 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES).
- Inkubera cellerna med 1 U/ml kolesteroloxidaslösning (COase) i HBSS/HEPES-buffert i 1 timme vid 37 °C.
- Ta bort lösningen och behåll cellerna i närvaro av 0,1 U/ml COase i HBSS/HEPES-buffert medan du utför svFCS-mätningarna.
7. Kalibrering av spotstorlek
- Förvarda mikroskopkammaren vid 37 °C.
- Förbered en standard 2 nM-lösning av Rh6G genom seriell utspädning.
- Släpp 200 μl 2 nM Rh6G-lösning på ett glasöverdrag placerat på vattendjupningsmålet.
- Starta all hårdvara och programvara.
- Mät och justera laserstrålens effekt på 488 nm till 300 μW. Beroende på ljusstyrkan och fotostabiliteten hos den fluorescerande sonden som används, anpassa denna effekt enligt (1) fluorescensintensiteten (på LabVIEW-programvaran), som ska vara stabil, (2) ACF-formen (på korrelatorprogramvaran), som ska ha en konstant form över tiden, och (3) de passande parametrarna som ger en liten midjestorlek och en hög räkningshastighet per molekyl (fotoner per molekyl per sekund, vanligtvis några tiotals till hundratals fotoner per molekyl per sekund).
OBS: Amplituden för ACF (kallad G (0)) är omvänt proportionell mot molekylens antal (dvs. koncentrationen av den fluorescerande sonden). För midjestorlekskalibreringen är detta en kandidatparameter för god kvalitetskontroll. Därför bör G(0) vara liknande för samma koncentration från dag till dag eftersom den kopplar midjestorlek och koncentration. För cellmätningar, eftersom FCS är mer exakt för låg koncentration, bör G (0) vara hög för korrekt extraktion av parameterpassning. - Ställ in svFCS-belysnings-/detektionsmikroskopporten med LabVIEW-programvaran.
- Slå på APD: n.
- Stäng iris tills signalen sjunker ner för att få minimal midjestorlek, eller stäng den för större midjestorlek.
- Registrera flera ACF:er med vald varaktighet (nämligen en körning) för att förbättra den statistiska reproducerbarheten, vanligtvis 10 körningar som varar i 20 sekunder vardera med korrelatorprogramvaran.
- Stäng av APD.
- Använd Igor Pro-programvaran för att kontrollera och kassera körningarna med starka fluktuationer på grund av molekylära aggregat. Utför det här steget manuellt – det ska vara användaroberoende efter att användarna har tränats.
- Passa genomsnittet av de behållna ACF: erna med en 3D-diffusionsmodell.
- Extrahera från anpassningsparametrarna den genomsnittliga diffusionstiden
och spara den i en ".txt" -fil (filformatet dikteras av Igor Pro-programvaran). - Kontrollera räkningshastigheten per molekyl per sekund (en bra prestandaindikator) genom att dividera den genomsnittliga intensiteten (extraherad från fluorescensspåret) med antalet molekyler (extraherade från ACF).
OBS: Se till att detta värde är högt och stabilt från dag till dag för samma anskaffningsparametrar. - Genom att känna till diffusionskoefficienten för Rh6G i vattenlösning vid 37 °C (D) och (se 7.13) beräknar du den experimentella midjestorleken ω enligt:
. - Tillämpa proceduren för varje ändring av midjestorleken som krävs för att plotta FCS-diffusionslagen och före någon ny experimentell serie av svFCS-datainsamling.
och spara den i en ".txt" -fil (filformatet dikteras av Igor Pro-programvaran).
.8. svFCS-datainsamlingar på celler
- Mät och justera stråleffekten på 488 nm mellan 2 och 4 μW. Beroende på ljusstyrkan och fotostabiliteten hos den fluorescerande sonden som används, anpassa denna effekt för att möjliggöra en hög räkningshastighet per molekyl (vanligtvis flera tusen fotoner per molekyl per sekund), samtidigt som fotoblekningen hålls låg (dvs. ett stabilt intensitetsspår på LabVIEW-programvaran).
- Balansera proverna i 10 minuter vid 37 °C innan mätningarna påbörjas.
- Ställ in epi-fluorescensbelysningsmikroskopet med LabVIEW-programvaran.
- Välj en cell med lämplig fluorescerande sondplats och (låg) fluorescenssignalintensitet.
OBS: Ju lägre fluorescensen är, desto bättre är FCS-mätningarna (se steg 8.1). - Ställ in svFCS-belysnings-/detektionsmikroskopporten med LabVIEW-programvaran.
- Slå på APD: n.
- Utför en xy-skanning av den valda cellen med LabVIEW-programvaran.
- Utför en z-skanning och lokalisera konfokalpunkten vid maximal fluorescensintensitet genom att välja plasmamembranet högst upp och starta datainsamlingen. För att maximera separationen mellan de två membranen, utför företrädesvis skanningen i cellens kärnområde.
- Spela in en serie med 20 körningar som varar i 5 s, var och en med korrelatorprogramvaran.
OBS: Se till att varaktigheten för varje körning är tillräckligt lång för att få ACF med reducerat brus. Långa förvärv är mottagliga för fotoblekning eller oväntade väsentliga variationer (t.ex. aggregat). Anpassa antalet körningar, deras varaktighet och antalet serier till proverna, men se till att de förblir konstanta inom samma bulk av experiment för reproducerbarhet. - Stäng av APD.
- Kassera oväntade körningar med Igor Pro-programvaran.
- Passa den genomsnittliga ACF med en 2-arters 2D-diffusionsmodell. Anpassa denna modell till typen av diffusionsbeteende hos målmolekylen.
- Spara anpassningsparametrarna i föregående fil (se steg 7.13).
- Utför 10 till 15 serier av inspelningar på minst 10 olika celler och återskapa steg 8.3 till 8.13. Kontrollera att den enda erhållna filen innehåller information om midjestorlek och anpassningsparametrar för de 10–15 inspelningarna.
- För att upprätta en enda diffusionslag, analysera minst fyra midjestorlekar som varierar mellan 200 och 400 nm. Detta intervall definieras av den diffraktionsoptiska gränsen, men är objektiv- (numerisk bländare) och laser (våglängd) beroende.
OBS: Eftersom midjestorlekskalibreringen inte är absolut och har en viss grad av osäkerhet, byggdes en dedikerad MATLAB-programvara28 som står för x- och y-felet (nämligen ω2 och td) för att passa diffusionslagen. - Starta MATLAB-programvaran 1 och välj en mapp som innehåller alla ".txt" -filer som motsvarar minst fyra experiment i midjestorlek.
- Plot <td> kontra <ω2>, nämligen diffusionslagen. Två huvudparametrar kan extraheras: y-axelns skärningspunkt (t0) och den effektiva diffusionskoefficienten (Deff, omvänt proportionell mot lutningen).
9. Diffusionslagar för olika experimentella tillståndsjämförelser
OBS: Återge vid behov avsnitten 7 och 8 för olika försöksbetingelser. En dedikerad programvara (MATLAB-programvara 2) utvecklades för att avgöra om dessa diffusionslagar är likartade eller inte enligt t0 - och Deff-värdena 28. Den testar två hypoteser: de två värdena är olika, eller de två värdena är inte olika vid ett tröskelvärde som är inställt över en sannolikhet för falskt larm (PFA). Ett godtyckligt PFA-värde på 5% (T = 3,8) anses vara den övre gränsen för betydelse mellan två parametrar (t0 eller Deff), vilket indikerar att det bara finns 5% chans att de två värdena är identiska.
- Skapa en ".xls" -fil som innehåller de karakteristiska diffusionslagvärdena för varje villkor för att jämföra (dvs. en fil som innehåller t0, t0-felet , Deff och Deff-felet för de icke-behandlade (NT) och behandlade (COase) förhållandena som en tabell).
- Starta MATLAB-programvaran 2.
- Välj filen ".xls".
- Analysera det genererade färgkodade 2D-diagrammet, där de statistiska testerna t0 och Deff ska plottas på x- respektive y-axlarna (figur 4). Ju högre T är desto större är skillnaden mellan de jämförda värdena.
10. Mätningar av kolesterolkoncentration
- Cellbehandling och lys
- Frö Cos7-cellerna i tre exemplar i 6-brunnsplattor vid 4 × 105 celler / brunn och inkubera i 2 ml komplett DMEM vid 37 ° C med 5% CO2 över natten så att cellerna kan fästa vid plattan.
- Ta bort odlingsmediet och tvätta cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 1 ml HBSS/HEPES-buffert som innehåller (eller inte, för kontroller) 1 U/ml coase och inkubera i 1 timme vid 37 °C med 5 %CO2.
- Byt ut mediet mot 1 ml HBSS/HEPES innehållande 0,1 U/ml Coase och inkubera i 1 timme vid 37 °C med 5 %CO2.
- Ta bort lösningen och skörda cellerna.
- Tvätta cellerna tre gånger med PBS och centrifugera vid 400 × g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Lysa cellerna med radioimmunoprecipitationsanalysbuffert (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM etylendiamintetraättiksyra, 2% glycerol, proteas och fosfatashämmare cocktail) i 30 min på is.
- Centrifugera lysaterna vid 10000 × g i 10 min vid 4 °C och samla upp supernatanten.
- Kvantifiera den totala proteinkoncentrationen för varje prov genom modifierad Bradfords proteinanalys med hjälp av arbetslösningen enligt tillverkarens rekommendationer.
- Mätning av kolesterolkoncentration
- För att bestämma total cellulär kolesterolnivå enzymatiskt, använd lämpligt kit (t.ex. Amplex Red Kolesterol Assay Kit) enligt tillverkarens rekommendationer.
- Blanda provet som innehåller 5 μg protein för varje reaktion med Amplex Red reagens/pepparrotsperoxidas/kolesteroloxidas/kolesterolesteras arbetslösning och inkubera i 30 minuter vid 37 °C i mörker.
- Mät fluorescensen med excitation på 520 nm och detektera emissionen vid 560–590 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
- Subtrahera bakgrunden från det slutliga värdet och bestäm kolesterolkoncentrationen med hjälp av en standardkurva.
- Beräkna det slutliga kolesterolinnehållet i ng kolesterol per μg protein.
Representative Results
Vi genererade en DL för Thy1-GFP uttryckt i Cos-7-celler (figur 4, svarta rutor). Diffusionslagen har ett positivt t0-värde (19,47 ms ± 2 ms), vilket indikerar att Thy1-GFP är begränsad i nanodomänstrukturer i plasmamembranet. Kolesteroloxidasbehandlingen av cellerna som uttrycker Thy1-GFP resulterade i förskjutningen av DL t0-värdet till 7,36 ± 1,34 ms (figur 4, grå rutor). Denna observation bekräftar att arten av Thy1-GFP-inneslutning beror på kolesterolhalten och är associerad med lipidflottenanodomäner. Dessa två diffusionslagar har visat sig vara olika enligt det statistiska test som beskrivs ovan (se steg 9.1.3) när det gäller t0 - och Deff-värden . Dessutom bedömde vi koncentrationen av totalt cellulärt kolesterol i icke-behandlade Cos-7-celler jämfört med cellerna behandlade med COase. En liten, men signifikant, minskning av det totala kolesterolinnehållet observeras vid COase-behandling (figur 5). Eftersom detta enzym endast verkar på kolesterolpoolen som är tillgänglig vid plasmamembranets yttre bipacksedel, antar vi att den observerade minskningen av kolesterol endast är associerad med plasmamembranet och resulterar i destabilisering av lipidflottenanodomäner.
Figur 1: Simulerade fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) diffusionslagar fastställda av spot-variation FCS för olika former av membranorganisation. (Övre paneler) Schematisk representation av membranorganisation - (A) fri diffusion, (B) maskbarriärer och (C) fälla / domänbegränsningar - med banan ritad för en enda molekyl (röd). Blå cirklar betecknar skärningspunkten mellan membranet och laserstrålen i midjan ω. (Nedre paneler) FCS diffusionslagar representerade genom att plotta diffusionstiden td som en funktion av den kvadrerade radien ω2. Diffusionslagsprojektion (grön streckad linje) avlyssnar tidsaxeln vid (A) origo (t0 = 0) vid fri diffusion; (B) i negativ axel (t0 < 0) när det finns maskbarriärer, eller (C) i positiv axel (t0 > 0) när det finns fällor och domäner (lipidflottor). D är den laterala diffusionskoefficienten för brownsk rörelse; Deff, den effektiva diffusionskoefficienten; Dmikro, den mikroskopiska diffusionskoefficienten inuti maskfällorna; Din, diffusionskoefficienten inom domäner; Dut, diffusionskoefficienten utanför domäner; L, storleken på sidan av en fyrkantig domän; och rD, radien för en cirkulär domän. Denna figur har modifierats från He och Marguet6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Schematisk vy över svFCS-maskinvarukontroll. Datorn styr alla enheter genom olika kommunikationsprotokoll: seriell (mikroskop, extern slutare), USB (XYZ piezoelektriskt steg, korrelator) och PCI (förvärvskort). DAQ: datainsamlingskort, APD: lavinfotodiod, SPCM: enkelfotonräkningsmodul, DO: digital utgång. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk vy över excitations- och emissionsoptiska banor i svFCS-installationen. SVFCS-installationen innehåller fyra moduler: (1) utgången från en fiberad 488 nm laser kollimeras, (2) en kombination av en halvvågsplatta och polariserande stråldelare ställer in den optiska effekten, (3) laserstrålen fokuserad på provet efter att ha färdats genom ett rörlinsfritt motoriserat mikroskop, och (4) fluorescensen detekteras genom en konfokalliknande detektionsväg på en lavinfotodiod kopplad till en enda fotonräkningsmodul, som levererar en signal till en hårdvarukorrelator. Enkelhet ger systemet dess känslighet, robusthet och användarvänlighet (kommenteras allmänt i kompletterande material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: SvFCS-diffusionslagarna som genereras från diffusionsanalys av Thy1-GFP uttryckt i Cos-7. svFCS diffusionslagar för Cos-7-celler utan behandling (NT, svarta rutor) och efter kolesteroloxidasbehandling (COase, grå cirklar). Insatsen i diagrammet representerar statistisk testning av en signifikant skillnad mellan de två presenterade svFCS-diffusionslagarna (enligt Mailfert et al.28). Testvärdet (T) bör ligga över tröskelvärdet som är inställt på 3,8 när båda diffusionslagarna är olika. Ju högre det är desto större är skillnaden mellan diffusionslagarna. Värdet på T är färgkodat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförelse av totalt kolesterolinnehåll i Cos-7-celler. Cos-7-celler var antingen icke-behandlade (NT) eller behandlades med 1 U/ml kolesteroloxidas (COase) i 1 timme. Data representerar ett exempel på ett experiment i tre exemplar. Ett tvåsidigt, oparat t-test användes för att bedöma den statistiska skillnaden (α = 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell över material: Listan över optiska element som krävs för svFCS-installationen.
Kompletterande material: Det här dokumentet beskriver byggandet av en svFCS-installation från grunden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Här har vi beskrivit implementeringen av svFCS-modulen på ett standardfluorescerande mikroskop, ett kraftfullt experimentellt tillvägagångssätt för att dechiffrera dynamiken i plasmamembranorganisationen i levande celler tack vare FCS-diffusionslagsanalysen. Konceptuellt bygger svFCS på en enkel princip: korrelationsmätningar av fluorescens i tidsdomänen samtidigt som storleken på belysningsområdet23 varierar. Denna strategi har varit avgörande för att härleda nanoskopisk information från mikroskopiska mätningar, vilket hjälper till att dechiffrera de viktigaste fysikalisk-kemiska elementen som bidrar till plasmamembranorganisationen i steady state25 och fysiologiska processer 30,31,32,33. Sammantaget visar dessa svFCS-analyser entydigt förekomsten av lipidberoende nanodomäner i olika celltyper och deras direkta implikation vid inställning av olika signalhändelser.
Inom denna ram finns det några optiska aspekter som måste beaktas när du bygger svFCS-installationen för att optimera fotonbudgeten och minimera optiska avvikelser. Därför rekommenderar vi att du använder ett mikroskop från vilket rörlinsen kan tas bort när svFCS-mätningen utförs. Dessutom spelar en enda iris en nyckelroll i svFCS-installationen: den ändrar strålstorleken vid målets bakre bländare och varierar därmed direkt den effektiva midjestorleken (dvs. den effektiva excitationsvolymen). Stråldiametern ska passa den objektiva bakre pupillen för att få den minsta midjestorleken34. Det här alternativet, som hjälper till att ställa in midjestorleken, säkerställer optimering av fotonbudgeten och är lätt att implementera. Slutligen används ett minimalt antal optiska delar längs ljusvägen; ju mindre komplext systemet är, desto färre fotoner som går förlorade. Alla dessa alternativ förbättrar robustheten hos svFCS-experiment avsevärt.
När det gäller själva protokollet måste några kritiska steg övervägas. Det viktigaste är en lämplig inriktning av de optiska banorna som är avgörande för framgångsrika svFCS-mätningar (protokoll, avsnitt 2). Detta är lätt att kontrollera genom att analysera fluorescenssignalen från en 2 nM Rh6G-lösning, som bör vara ~ 200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alla iris bör öppnas och ACF: erna bör ha en viktig amplitud (vanligtvis G0 ~ 1.5–2.0). En annan kritisk punkt gäller cellerna och deras förberedelser för svFCS-analys (protokoll, avsnitt 4–8). Deras densitet måste anpassas så att isolerade celler som ska observeras är tillgängliga för analys. Icke-vidhäftande celler måste immobiliseras på ett kammare täckt glas med hjälp av poly-L-lysinlösning. Fluorescenssignalen från cellmärkning bör inte vara för stark, annars kommer det att resultera i mycket platta ACF: er som är svåra att passa, och passformsparametrarna belastas med ett viktigt fel. Dessutom gör ickehomogen märkning och fluorescensaggregat i celler svFCS-mätningarna extremt svåra att tolka. Slutligen påverkar kolesteroloxidasbehandling cellviabiliteten, och svFCS-analysen bör inte överstiga en timme efter behandlingen. Det är också bättre att registrera fluorescensfluktuationerna från det övre plasmamembranet eftersom det inte är fäst vid stödet, och det finns ingen risk för hindrad diffusion av molekyler på grund av de fysiska interaktionerna med stödet.
Det har gjorts tillräckligt med framsteg inom svFCS-tekniken för dess användning i olika tillvägagångssätt på grund av mångfalden av metoder för att justera detektionsvolymen, vilket gör det möjligt att studera olika biologiska processer i levande celler. Ett alternativ till att justera storleken på excitationsvolymen är att använda en variabel strålutvidgare35. Det är också möjligt att helt enkelt modulera storleken på belysningsområdet genom att spela in den fluorescerande signalen från plasmamembranets avlyssning längs z-riktningen36. Detta kan göras på ett standardkonfokalmikroskop för vilket ett teoretiskt ramverk har utvecklats för att härleda diffusionslagen37,38.
Även om svFCS-metoden erbjuder spatio-temporal upplösning, vilket är nödvändigt för karakterisering av plasmamembranets inhomogena laterala organisation, utesluter inte de geometriska inneslutningssätten varandra. En avvikelse på t0 i den ena eller den andra riktningen avslöjar uteslutande ett dominerande inneslutningssätt25. Dessutom är en annan viktig begränsning av den nuvarande svFCS-metoden resultatet av den klassiska optiska diffraktionsgränsen (~ 200 nm). Detta är utan tvekan större än domänerna som begränsar molekylerna i cellplasmamembranet. Därför härleds analysen av inneslutningen från t0-värdet , extrapolerat från diffusionslagen.
Denna nackdel har övervunnits genom att implementera alternativa metoder. Inledningsvis erbjöd användning av metallfilmer borrade med nanoaperturer möjligheten att belysa ett mycket litet membranområde (dvs. under den optiska diffraktionsgränsen för enstaka nanometriska bländare med radier som varierar mellan 75 och 250 nm)39. Övergångsregimen som förutspåddes från den teoretiska diffusionslagen för isolerad domänorganisation rapporterades således, och den möjliggjorde en förfining av den karakteristiska storleken på de nanometriska membranheterogeniteterna och en kvantitativ uppskattning av ytan som upptas av lipidberoende nanodomäner39. Alternativt har nanometrisk belysning också utvecklats med hjälp av optisk mikroskopi för närfältsskanning40 eller plana optiska nanoantenner41. På senare tid har kombinationen av stimulerad utsläppsutarmning (STED) och FCS gett ett kraftfullt och känsligt verktyg för att dokumentera diffusionslagen med mycket hög rumslig upplösning. Denna STED-FCS ger tillgång till molekylära diffusionsegenskaper på nanoskala som inträffar inom en kort tidsperiod, vilket möjliggör studier av den dynamiska organisationen av lipidprober vid plasmamembranet42,43. Den ofullständiga undertryckandet av fluorescens i STED-processen utmanar dock analysen av de automatiska korrelationskurvorna i FCS.
En ny anpassningsmodell har utvecklats för att övervinna denna svårighet, vilket förbättrar noggrannheten i diffusionstiderna och genomsnittliga molekylnummermätningar44. Slutligen, för långsam molekylär diffusion vid plasmamembranet, kan svFCS-principen tillämpas på data som registrerats med bildkorrelationsspektroskopi45. Nyligen har det visats att kombinationen av atomkraftsmikroskopi (AFM) med avbildning av total intern reflektion-FCS (ITIR-FCS) bidrar till förfining av mekanismens natur som hindrar molekylär diffusion vid plasmamembranet, särskilt nära perkolationströskelmembrankonfigurationen på grund av en hög densitet av nanodomäner46.
Sammanfattningsvis har upprättandet av diffusionslag av svFCS gett experimentella bevis för att dra slutsatsen om lokal heterogenitet skapad av dynamiska kollektiva lipider och membranproteiners föreningar. Som anges av Wohland och medarbetare46, "FCS diffusionslagsanalys är fortfarande ett värdefullt verktyg för att härleda strukturella och organisatoriska funktioner under upplösningsgränsen från dynamisk information". Ändå behöver vi utveckla nya modeller för att förfina tolkningen av diffusionslagen som ska möjliggöra en bättre förståelse av dynamiken i de molekylära händelser som inträffar vid plasmamembranet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
SB, SM och DM stöddes av institutionell finansiering från CNRS, Inserm och Aix-Marseille University och programbidrag från den franska nationella forskningsbyrån (ANR-17-CE15-0032-01 och ANR-18-CE15-0021-02) och den franska "Investissement d'Avenir" (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW erkänner "BioTechNan", ett program för tvärvetenskapliga miljödoktorander KNOW inom bioteknik och nanoteknik. EB erkänner det ekonomiska stödet från Polens nationella vetenskapscenter (NCN) under projekt nr 2016/21/D/NZ1/00285, liksom den franska regeringen och Frankrikes ambassad i Polen. MŁ erkänner det ekonomiska stödet från det polska utvecklingsministeriet (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) och National Center for Research and Development (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT erkänner ekonomiskt stöd från National Science Center of Poland (NCN) under projekt nr 2016/21/B/NZ3/00343 och från Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aligment tool | Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings | Thorlabs | SPW602 |
| Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) | Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode | Excelitas | SPCM-AQRH-15 |
| BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m | RS Components | 742-4315 | |
| Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 | RS Components | 885-8172 | |
| Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz | RS Components | 546-4948 | |
| Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V | RS Components | 768-5500 | |
| Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C | RS Components | 452-8394 | |
| Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter | RS Components | 792-4079 | |
| Fluorescence filtering | 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm | AHF filter | F47-539 |
| Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm | AHF filter | F43-088 | |
| 496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 | AHF filter | F37-496 | |
| Hardware correlator | 80 MHz Digital Correlator | Correlator.com | Flex02-12D |
| Laser | LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW | Lasos | BLD-XT 488100 |
| Laser safety | High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll | Thorlabs | T743-2.0 |
| Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets | Thorlabs | MC-5 | |
| Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission | Thorlabs | LG3B | |
| Microscope | Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters |
Carl Zeiss | |
| C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR |
Carl Zeiss | 421767-9971-711 | |
| Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-345 | |
| Middle ring W0.8 - W0.8 H "5" | Carl Zeiss | 000000-1698-347 | |
| Optical path | D25.4mm Mirror, Protected Silver | Thorlabs | PF10-03-P01 |
| D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-060-A | |
| D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat | Thorlabs | AC254-035-A | |
| 25 µm mounted pinhole | Thorlabs | P25S I | |
| 25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm | Thorlabs | WPH10M-488 (HWP) | |
| 20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm | Thorlabs | PBS201 | |
| Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID | Thorlabs | RSP1/M | |
| 52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount | Thorlabs | KM100B/M | |
| Adjustable Prism Clamp | Thorlabs | PM3/M | |
| Beam block - active area 19 mm x 38 mm | Thorlabs | LB1/M | |
| Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture | Thorlabs | ID25/M | |
| Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount | Thorlabs | KM100CL | |
| 1" Optic Holder, M4 Tap | Thorlabs | MFF101/M | |
| 1" Stackable Lens Tube | Thorlabs | SM1L03 | |
| Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ | Thorlabs | SM1L05 | |
| Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" | Thorlabs | SM1L20 | |
| Small Optical Rails 600mm, metric | Thorlabs | RLA600/M | |
| Small Optical Rails 75mm, metric | Thorlabs | RLA075/M | |
| Small Optical Rails 150mm, metric | Thorlabs | RLA150/M | |
| Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" | Thorlabs | RC1 | |
| Rail Carrier, Perpendicular Dovetail | Thorlabs | RC3 | |
| High Precision Translating Lens Mount for 1 inch | Thorlabs | LM1XY/M | |
| ½ " (12mm) Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12/M | |
| Rail Clamps | Thorlabs | CL6 | |
| Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) | Thorlabs | PT3/M | |
| Black Rubberized Fabric | Thorlabs | BK5 | |
| Ball Driver kit/ 6 tools | Thorlabs | BD-KIT/M | |
| Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads | Thorlabs | AP6M4M | |
| Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack | Thorlabs | BA1S/M-P5 | |
| Lens Mount for 25.4mm optic | Thorlabs | LMR1/M | |
| SM1 FC/APC Adapter | Thorlabs | SM1FCA | |
| Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics | Thorlabs | KM100 | |
| Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW | Thorlabs | S120C | |
| 12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=50 mm, 5 Pack |
Thorlabs | PH50/M-P5 | |
| Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm | Thorlabs | PH20/M | |
| 12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR50/M-P5 | |
| 12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole, 5 Pack |
Thorlabs | TR75/M-P5 | |
| USB Power and Energy Meter Interface | Thorlabs | PM100USB | |
| 12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR30/M | |
| 12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud, M6-Tapped Hole |
Thorlabs | TR20/M | |
| 750 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L750/M | |
| 350 mm long Structural Rail (detection box) | Thorlabs | XE25L350/M | |
| Quick Corner Cube for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25W3 | |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | Thorlabs | XE25A90 | |
| Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets | Thorlabs | TB5 | |
| Hinge for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25H | |
| Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures | Thorlabs | XE25LS | |
| M4 Cap Screw Kit | Thorlabs | HW-KIT1/M | |
| M6 Cap Screw Kit and Hardware kit | Thorlabs | HW-KIT2/M | |
| Table Clamp, L-Shape, 5 Pack | Thorlabs | CL5-P5 | |
| SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 - Ø12 mm) | Thorlabs | SM1D12D | |
| Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | |
| Honeycomb Optical Table Top, Standa | Standa | 1HB10-15-12 | |
| Optical Table support, Standa | Standa | 1TS05-12-06-AR | |
| Sample nano-positionning | Precision XYZ Nanopositioning | Physik Instrumente | PI P527-3.CD |
| Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors, |
Physik Instrumente | PI E727-3.CD | |
| Temperature chamber | Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK | Digital Pixel | |
| Dual Channel Microprocessor Temperature Controller | Digital Pixel | DP_MTC_2000_DUO | |
| Two Vibration Free Heater Modules | Digital Pixel | DP_150_VF | |
| PT100 Temperature Sensor | Digital Pixel | DP_P100_TS | |
| Biological Reagents and Materials | |||
| Cell culture and transfection | Cos7 cells | ATCC® | CRL-1651™ |
| 8- well Lab-Tek chambers | Thermo Fisher Scientific | 155411PK | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| PBS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| PenStrep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PolyJet Transfection Reagent | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| Cholesterol content measurement | Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | A12216 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 87786 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78420 | |
| ROTI Nanoquant Working Solution | Roth | K880 | |
| GloMax Discover Microplate Reader | Promega | GM3000 | |
| svFCS measurements | HBSS buffer | Thermo Fisher Scientific | 14025092 |
| Hepes buffer | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Cholesterol oxidase | Sigma-Aldrich | C8868 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 83697-1G |
References
- Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
- Newton, A. C. Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase C as a paradigm. The Biochemical Journal. 370, Pt 2 361-371 (2003).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. The EMBO Journal. 25 (15), 3446-3457 (2006).
- Edidin, M. The state of lipid rafts: From model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. , (2003).
- Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. , (2010).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annual Reviews of Physical Chemistry. 62, 417-436 (2011).
- Rossy, J., Ma, Y., Gaus, K. The organisation of the cell membrane: Do proteins rule lipids. Current Opinion in Chemical Biology. 20 (1), 54-59 (2014).
- Nicolson, G. L. The Fluid - Mosaic Model of Membrane Structure: Still relevant to understanding the structure, function and dynamics of biological membranes after more than 40 years. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (6), 1451-1466 (2014).
- Fujiwara, T., Ritchie, K., Murakoshi, H., Jacobson, K., Kusumi, A. Phospholipids undergo hop diffusion in compartmentalized cell membrane. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 1071-1081 (2002).
- Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34, 351-378 (2005).
- Destainville, N., Salomé, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), 17-19 (2006).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schütz, G. J. Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophysical Journal. 92 (10), 3719-3728 (2007).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophysical Journal. , (1976).
- Petrášek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2008).
- Elson, E. L. 40 Years of FCS: How it all began. Methods in Enzymology. , (2013).
- Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. , (1974).
- Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. , (1974).
- Schwille, P., Haupts, U., Maiti, S., Webb, W. W. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical Journal. , (1999).
- Bouchaud, J. P., Georges, A. Anomalous diffusion in disordered media: Statistical mechanisms, models and physical applications. Physics Reports. , (1990).
- Yechiel, E., Edidin, M. Micrometer-scale domains in fibroblast plasma membranes. Journal of Cell Biology. 105 (2), 755-760 (1987).
- Salomé, L., Cazeils, J. L., Lopez, A., Tocanne, J. F. Characterization of membrane domains by FRAP experiments at variable observation areas. European Biophysics Journal. 27 (4), 391-402 (1998).
- Niv, H., Gutman, O., Kloog, Y., Henis, Y. I. Activated K-Ras and H-Ras display different interactions with saturable nonraft sites at the surface of live cells. The Journal of Cell Biology. 157 (5), 865-872 (2002).
- Wawrezinieck, L., Rigneault, H., Marguet, D., Lenne, P. F. Fluorescence correlation spectroscopy diffusion laws to probe the submicron cell membrane organization. Biophysical Journal. 89 (6), 4029-4042 (2005).
- Saxton, M. J.
- Lenne, P. F., et al. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork. EMBO Journal. 25 (14), 3245-3256 (2006).
- Ruprecht, V., et al. Cortical contractility triggers a stochastic switch to fast amoeboid cell motility. Cell. , (2015).
- Billaudeau, C., et al. Probing the plasma membrane organization in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 519, 277-302 (2013).
- Mailfert, S., Hamon, Y., Bertaux, N., He, H. T., Marguet, D. A user's guide for characterizing plasma membrane subdomains in living cells by spot variation fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Cell Biology. 139, 1-22 (2017).
- Rege, T. A., Hagood, J. S. Thy-1, a versatile modulator of signaling affecting cellular adhesion, proliferation, survival, and cytokine/growth factor responses. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. , (2006).
- Cahuzac, N., et al. Fas ligand is localized to membrane rafts, where it displays increased cell death-inducing activity. Blood. , (2006).
- Guia, S., et al. Confinement of activating receptors at the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Science Signaling. 4 (167), 21 (2011).
- Blouin, C. M., et al. Glycosylation-dependent IFN-γR partitioning in lipid and actin nanodomains is critical for JAK activation. Cell. 166 (4), 920-934 (2016).
- Chouaki-Benmansour, N., et al. Phosphoinositides regulate the TCR/CD3 complex membrane dynamics and activation. Scientific Reports. , (2018).
- Wawrezinieck, L., Lenne, P. F., Marguet, D., Rigneault, H. Fluorescence correlation spectroscopy to determine diffusion laws: application to live cell membranes. Biophotonics Micro- and Nano-Imaging. , (2004).
- Masuda, A., Ushida, K., Okamoto, T. New fluorescence correlation spectroscopy enabling direct observation of spatiotemporal dependence of diffusion constants as an evidence of anomalous transport in extracellular matrices. Biophysical Journal. , (2005).
- Humpolíčková, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal. , (2006).
- Benda, A., et al. How to determine diffusion coefficients in planar phospholipid systems by confocal fluorescence correlation spectroscopy. Langmuir. , (2003).
- Ganguly, S., Chattopadhyay, A. Cholesterol depletion mimics the effect of cytoskeletal destabilization on membrane dynamics of the serotonin1A receptor: A zFCS study. Biophysical Journal. , (2010).
- Wenger, J., et al. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization. Biophysical Journal. 92 (3), 913-919 (2007).
- Manzo, C., Van Zanten, T. S., Garcia-Parajo, M. F. Nanoscale fluorescence correlation spectroscopy on intact living cell membranes with NSOM probes. Biophysical Journal. , (2011).
- Regmi, R., et al. Planar optical nanoantennas resolve cholesterol-dependent nanoscale heterogeneities in the plasma membrane of living cells. Nano Letters. , (2017).
- Mueller, V., et al. FCS in STED microscopy: Studying the nanoscale of lipid membrane dynamics. Methods in Enzymology. , (2013).
- Sezgin, E., et al. Measuring nanoscale diffusion dynamics in cellular membranes with super-resolution STED-FCS. Nature Protocols. , (2019).
- Wang, R., et al. A straightforward STED-background corrected fitting model for unbiased STED-FCS analyses. Methods. , (2018).
- Veerapathiran, S., Wohland, T. The imaging FCS diffusion law in the presence of multiple diffusive modes. Methods. , (2018).
- Gupta, A., Phang, I. Y., Wohland, T. To hop or not to hop: exceptions in the FCS diffusion law. Biophysical Journal. , (2020).
