Summary
이 프로토콜의 목표는 관형 전기 스캐폴드에서 인간 대식세포와 근섬유세포의 동적 공동 배양을 실행하여 재료 중심 조직 재생을 조사하는 것이며, 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게 하는 생체 반응기를 사용하는 것입니다.
Abstract
신체에서 직접 재생을 유도하는 재생을 유도하는 재생 가능한 생체 재료의 사용은 번역 관점에서 매력적인 전략입니다. 이러한 물질은 이식 시 염증 반응을 유도하며, 이는 물질의 후속 흡수와 새로운 조직의 재생의 원동력이다. 이 전략, 또한 시투 조직 공학에서 로 알려진, 조직 설계 혈관 이식 등 심장 혈관 교체를 얻기 위해 추구. 염증 및 재생 공정 은 스캐폴드 (즉, 스트레치 및 전단 응력)에 대한 국소 생체 역학 적 단서에 의해 결정됩니다. 여기서는 관 비계에서 스트레치및 전단 응력을 분리할 수 있는 맞춤형 생물 반응기의 사용을 자세히 설명합니다. 이를 통해 인간 대식세포와 근섬유아세포아제를 이용한 역동적인 공동배양 실험에 기초하여 입증되는 잘 조절된 기계적 하중의 영향으로 관 비계의 염증및 재생 능력의 체계적이고 표준화된 평가를 가능하게 한다. 바이오 반응기의 구성 및 설정, 비계 및 세포 파종의 준비, 스트레치 및 전단 흐름의 적용 및 유지 보수, 분석을 위한 샘플 수확 등 이 접근법의 주요 실용적인 단계는 자세히 설명합니다.
Introduction
심혈관 조직 공학(TE)은 현재 사용되는 영구 심혈관 보철물(예를 들어, 혈관 이식, 심장 판막 교체)에 대한 대체 치료 옵션으로 추구되고 있으며, 이는 환자의 큰 코호트에 대해 최적이 아니다1,2,3,4. 많은 수요가 응용 프로그램은 조직 엔지니어링 혈관 이식편 (TEVGs)5,6 및 심장 판막 (TEHV)7,8을포함한다. 대부분의 경우, 심장 혈관 TE 방법론은 새로운 조직이 형성될 수 있는 유익한 발판역할을 하는 개역 가능한 생체 재료(천연 또는 합성)를 사용합니다. 새로운 조직의 형성은 체외에서 완전히 설계될 수 있으며, 세포와 함께 스캐폴드를 시드하고 이식 전에 생체 반응기에서 배양하여(체외TE)9,10,11,또는 직접 앉아서 합성 스캐폴드가 체내에서 직접 새로운 조직의 형성을 유도하기 위해 사전 배양없이 이식된다( 12) 1,12. 시험관 내 및 시투 심혈관 TE 접근법의 경우 성공적인 기능성 재생은 이식된 구조에 대한 숙주 면역 반응과 적절한 생체 기계적 적재모두에 크게 의존합니다.
심혈관 TE용 생체역학적 하중의 중요성은15. 심혈관 임플란트의 경우, 스캐폴드를 채우는 세포는 혈역학적 환경의 결과로 발생하는 순환 스트레칭및 전단 응력에 노출됩니다. 수많은 연구는 콜라겐16,17,18,19,글리코소미노글리산 (GAGs)20,및 엘라스틴(21,22)및 다양한 세포 유형에 의해 매트릭스 성분의 형성에 (순환) 스트레칭의 자극 효과를보고했다. 예를 들어, 황 외는 혈관생물반응기(23)를이용하여 체외 TEVG에서 콜라겐 및 엘라스틴의 증착 및 조직을 상승시키는 양축 스트레칭을 입증했다. 강조는 일반적으로 지배적 인 부하로 스트레칭에 놓여 있지만, 이러한 연구는 종종 샘플이 전단 흐름에 노출되는 흐름 중심의 생물 반응기를 사용합니다. 3D의 조직 형성과 염증에 대한 전단 응력의 고립 된 영향에 대해서는 상대적으로 거의 알려져 없지만 일부 데이터를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Hinderer 외. 및 Eoh 외. 전단 흐름, 3D 스캐폴드 미세 구조 이외에, 체외 모델시스템(24,25)에서인체 혈관 평활근 세포에 의한 성숙한 엘라스틴형성에 중요했다. 전부, 이 사실 인정은 심장 혈관 TE를 위한 순환 스트레칭 및 전단 긴장 둘 다의 관련성을 보여줍니다.
TE 임플란트의 성공 또는 실패에 대한 또 다른 중요한 결정요인은 이식된접목(26)에대한 호스트의 면역 반응이다. 이는 실제로 세포 유입 및 내인성 조직 형성 및 리모델링27의후속 과정을 킥스타트하기 위해 스캐폴드에 대한 급성 염증 반응에 의존하는 시투 TE 전략에서 물질 중심의 물질 중심의 물질 중심을 위해 특히 중요하다. 대식세포는 기능성 조직 재생의 중요한 시노레이터이며, 이는 다중 연구28,29,30에의해 나타났다. 상처 치유와 유사하게, 조직의 재생은 섬유아세포와 근섬유세포 와 같은 대식세포와 조직 생성 세포 사이의 파라크리노 신호에 의해 지배된다31,32,33. 새로운 조직 증착을 조정하는 것 외에도, 대식세포는이물질(34,35)의활성 재흡수에 관여한다. 이와 같이, 생체물질에 대한 체외 대식세포반응은임플란트(36,37,38)의생체 내 성공을 위한 예측 파라미터로서 확인되었다.
이식된 스캐폴드에 대한 대식대식 반응은 재료 조성 및미세구조(35,39,40)와같은 스캐폴드 설계 기능에 의존한다. 스캐폴드 특성 외에도 비계에 대한 대식대식 반응과 근섬유아세포와의 교차토크도 혈역학적 하중의 영향을 받았습니다. 예를 들어, 순환 스트레치는 대식세포 표현형41,42,43,44 및 사이토카인의 분비(43,44,45,46in 3D 일렉트로스펀 스캐폴드)의 중요한 변조기로 나타났다. 대식세포와 혈관 평활근 세포의 공동 배양 시스템을 사용하여, Battiston 등. 대식세포의 존재는 엘라스틴과 GAGs의 증가 수준으로 이어졌고 순환 스트레치 (1.07-1.10)의 적당한 수준이 콜라겐 I와 엘라스틴47의증착을 자극했다는 것을 입증했습니다. 전작에서는 전단 응력이 3D 전두엽 비계48,49로단백세포 모집을 위한 중요한 결정제이며, 전단 응력과 순환 스트레치 모두 인간 단세포와 중간엽 기질세포(50)사이의 파라크리온 신호에 영향을 미친다는 것을 입증하였다. Fahy 등은 전단 흐름이 인간단핵구(51)에의한 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 것을 입증했다.
종합하면, 위의 증거는 혈역학 적재에 대한 적절한 이해와 제어가 심혈관 TE에 매우 중요하며 이를 달성하기 위해 염증 반응을 고려하는 것이 중요하다는 것을 보여줍니다. 수많은 생물 반응기는 이전에 시험관 내52,53,54,55, 56,57,57,58 또는 전 생체59,60,61 심혈관 조직의 문화를 위해 이전에 기술되었다. 그러나 이러한 모든 시스템은 가능한 한 생리적 혈역학 적재 조건을 모방하도록 설계되었습니다. 이것은 시험관 내에서 심장 혈관 조직을 만들거나 전 생체 문화를 유지하기위한 목적으로 매우 가치가 있지만, 이러한 시스템은 개별 단서의 개별 효과에 체계적인 연구를 허용하지 않습니다. 이는 이러한 생물 반응기에서 순환 스트레칭과 전단 응력의 적용이 본질적으로 연결되는 동일한 가압 흐름에 의해 구동되므로. 정확한 멀티큐 기계식 조작을 허용하는 마이크로시스템은 2D 기판62 또는 3D 하이드로겔 설정63,64에대해 설명되어 왔지만, 이러한 설정은 탄성액 3D 생물재료 스캐폴드의 통합을 허용하지 않는다.
여기에서, 우리는 유일하게 전단 응력과 순환 스트레칭의 분리를 가능하게하고 기계적으로 그들의 개별및 결합된 효력을 조사하는 것을 돕는 관 생물 반응기 시스템의 응용을 제시합니다. 이 시스템은 조직 설계 혈관 이식의 광범위한 테스트를 허용 (예를 들어, 합성 또는 자연 기원, 다른 마이크로 아키텍처, 다양한 다공성). 전단 응력과 스트레치의 적용을 효과적으로 분리하기 위해, 생체 반응기에서 사용하는 주요 개념은 (1) 뚜렷한 펌프 시스템을 사용하여 전단 응력 및 스트레치 제어의 분리와 (2) 스캐폴드의 자극을 계산 구동 치수로 '내부 아웃'방식으로 분리하는 것이다. 흐름은 유동 펌프의 사용을 통해 관 비계의 외부 표면에 적용되는 반면, 스캐폴드의 일주 스트레칭은 별도의 스트레인 펌프를 사용하여 스캐폴드가 장착되는 실리콘 튜브를 확장하여 유도된다. 구성을 포함하는 실리콘 튜브및 유리 튜브의 치수는 스캐폴드(흐름에 의한) 및 외주 스트레치(튜브 팽창로 인한)의 전단 응력이 서로 크게 영향을 미치지 않도록 하기 위해 전산 유체 역학 시뮬레이션을 사용하여 신중하게 선택및 검증된다. 이 내부 아웃 디자인은 몇 가지 실용적인 근거가 있습니다. 발광 유체 압력(생리적 적재와 유사)에 의해 스트레치가 적용되는 경우, 본질적으로 샘플 설계가 누출되지 않습니다. 또한, 시료를 스트레칭하는 데 필요한 압력은 시료 강성에 의해 완전히 결정되며, 이는 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내에서 다를 수 있어 스트레치를 제어하기가 어려워집니다. 이 생물 반응기는 실리콘 튜브 주위에 조직 설계 이식편을 장착하고 접목의 외벽에 벽 전단 응력 (WSS) 응용 프로그램을 허용하고 내부에서 접목을 가압합니다. 이러한 방식으로, 시간이 지남에 따라 샘플과 샘플 내의 동일한 하중 조건을 보장할 수 있으며, 또한, 다공성 혈관비계(19)에공통적으로 도공되는 바와 같이 시료가 새는 것을 허용한다. 이 내부 아웃 생물 반응기는 특히 전통적인 혈관 생물 반응기 설치가 더 적합한 시험관 내의 토착 혈관의 엔지니어링보다는 전단 및 / 또는 스트레치의 효과에 대한 체계적인 연구를 위한 것입니다. 생물 반응기 설계 도면에대한 그림 1A-B를 참조하고, 생체 반응기의 주요 구성 요소 뒤에 기능적 설명 및 근거에 대한 해당 표 1을 참조하십시오.
생물 반응기의 사용은 우리가 시상 심혈 관 조직19,43,44에대한 반사 전기 스프폴드에서 염증과 조직 형성에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개인 및 결합 된 영향을 조사하는 우리 그룹에 의해 최근 연구의 시리즈에 기초하여 입증된다. 이를 위해, 우리는 인간 대식세포와 근섬유아세포를 모노 또는 공동 배양에서 사용하여 시투 재생 폭포의 다양한 단계를 시뮬레이션했습니다. 우리는 인간 대식세포에 의한 사이토카인 분비액이 이러한 비계에서 인간 근섬유세포에 의해 매트릭스 증착 및 조직에 영향을 미치는 순환 스트레치 및 전단 응력 모두에 의해 뚜렷하게 영향을 받는것을 입증했으며, 파라크리노 신호 및 직접 접촉19,43,44를통해. 특히, 이러한 연구는 전단 스트레스와 스트레칭의 결합 된 응용 프로그램의 경우, 조직 형성과 염증에 미치는 영향은 두 부하 중 하나에 의해 지배된다는 것을 밝혔다, 또는 두 부하의 시너지 효과가있다. 이러한 연구 결과는 TE 공정에서 기계적 환경의 기여를 더 잘 이해하기 위해 두 부하를 분리하는 관련성을 보여줍니다. 이러한 이해는 관련 혈역학 적재 기조에서 스캐폴드 설계 파라미터를 체계적으로 최적화하기 위해 적용될 수 있습니다. 또한, 이러한 잘 조절된 환경에서 의 기계형 데이터는 최근 TEVGs65 또는 TEHV66에대해 보고된 바와 같이, 시투 조직 리모델링 과정을 예측하기 위해 개발되고 있는 수치 모델에 대한 입력으로 작용할 수 있으며, 예측 능력을 더욱 향상시킨다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명된 연구에서, 관상 동맥 바이패스 수술 후 사페누스 정맥으로부터 분리된 말초 혈액 버피 코트와 인간 근섬유아세포로부터 분리된 1차 인간 대식세포가44개사용되었다. 버피 코트는 산퀸 연구 기관 의료 윤리위원회의 승인을 받은 서면 동의를 제공한 건강하고 익명화된 자원봉사자들로부터 얻어졌습니다. 인간의 베나 사페나 세포의 사용 (HVSC) 네덜란드에서 의료 사회 연맹 (FMWV)에 의해 개발 된 "인간의 조직의 코드 적절한 이차 사용"에 따라했다.
1. 생물 반응기를 설정하기 전에 일반적인 준비 및 필요한 조치
참고: 각각의 격리 및 배양 프로토콜에 대한 자세한 내용은 이전 작업19,43,44를참조하십시오. 프로토콜의 모든 계산은 8개의 혈역학적으로 로드된 스캐폴드와 2개의 정적 컨트롤(n=10)에 시드된 단핵구 및 근섬유아세포로 공동 배양 실험을 위한 예로 주어집니다.
- 세포 격리 및 세포 배양을 시작합니다. 단핵구및 근섬유아세포의 공동 배양 시료에 대한 파종 밀도(2:1의 파종 비율 포함)는 각각 30× 106 단낭/cm3 및 15 × 106 근섬유세포/cm3이다.
참고: 전기스펀 재료는 다공성(>90%)이 높습니다. 접목당 필요한 셀 수를 추정하기 위해 스캐폴드의 부피는 중공 실린더의 부피수와 함께 계산됩니다: π*(두께)2*길이 ≈ 0.04cm3. 접목당 세포의 총 양은 1.2 × 106 단세포와 0.6 × 106 근섬유 세포입니다. 10개의 견본을 위해, 적어도 12 × 106 단핵구 및 6 × 106 근섬유세포가 요구됩니다; 가능한 파이펫 팅 오류를 고려하여 최대 ~10~15% 더 많은 셀로 시작합니다. - 생물 반응기를 포함하는 실험에 사용될 세포 배양 배지를 탈가스.
- RPMI-1640:aDMEM(1:1)으로 구성된 공동 배양배지를 10% 태아소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.5% L-글루타민으로 보충한다.
- 배지를 디가스에 필터 캡을 사용하여 세포 배양 플라스크에 인큐베이터에 하룻밤 사이에 놓습니다.
- 필터 캡을 밀폐 캡으로 교체하고 4°C에 보관합니다.
- 사용하기 직전에 배지에 0.25 mg/mL L-아스코르브산 2-인산 (비타민 C)을 추가하십시오.
참고: 계산의 경우 유량 배양 챔버당 필요한 중간 량은 50mL입니다. 일주일에 세 번 매체를 새로 고칩니다. 25 mL 오래된 매체는 25 mL 신선한 매체로 대체됩니다. 10개의 샘플; 파종 후 총 500mL의 신선한 배지가 필요하며, 후속 배지 변화에 대해 총 250mL의 신선한 배지가 사용된다. 항상 중간 신선한 준비, 특히, 비타민 C는 매체를 변경 하기 직전에 추가 해야 합니다.
- 반 하프텐 외19 (도 1G-I)에의해 설명된 바와 같이 등위 영양 전기 스펀 비계 (3mm 발광 직경, 200 μm 벽 두께)를 준비합니다. 간단히 말해서, 관형 폴리카폴톤 비보험자(PCL-BU) 스캐폴드는 15%(w/w) 클로로폼 폴리머 용액에서 전기방사에 의해 생성됩니다. 폴리머 용액은 실온에서 전기선및 30% 상대 습도, 40 μL/min의 유량, 회전 원통형 표적(Ø 3mm, 500rpm)으로부터 16cm 거리, 그리고 전자방사 노즐에 16kV의 도포 전압 및 대상에 -1kV이다.
참고: PCL-BU 이식편이 이러한 실험에 사용되었지만, 다양한 엘라소메릭 조직 설계 이식편을 이 생물 반응기(예: 다른 합성 또는 자연 기원, 다른 미세 아키텍처, 다른 다발성)에 장착할 수 있습니다.- 맨드렐에서 전기스펀 비계를 제거합니다.
- 중앙에 맨드렐을 '잡고'튜브의 벽에 닿지 않도록 15mL 튜브의 캡에 작은 구멍을 만듭니다.
- 만드렐을 팔콘 튜브에 전기스펀 비계로 놓고 탈이온화된 물로 채웁니다.
- -20°C에서 튜브 O/N을 동결합니다.
- 튜브를 실온(RT)에 놓고 몇 분 후에 만드렐을 꺼내 얼음에 전기 스펀 이식편을 남깁니다.
- 얼음이 완전히 해동하고, 해동된 물에서 전기분 튜브를 제거하고, 몇 시간 동안 수직으로 말리도록 '중단'하십시오. 비계가 자신의 무게로 '붕괴'되지 않도록 하십시오.
- 진공 O/N 하에서 마른 비계.
- 스캐닝 전자 현미경 검사법(SEM)을 사용하여 전자스펀 이식체의 작은 샘플을 이미지하여 미세 구조(예: 섬유 형태학, 섬유 직경)를 평가합니다. 실시예 연구에서 이식편은 등위섬유 배향과 섬유 직경 5μm(도1H-I)을갖는다.
- 맨드렐에서 전기스펀 비계를 제거합니다.
- 실험을 시작하기 하루 전에 인큐베이터에 탈이온화된 물로 채워진 유압 저장소를 배치합니다. 흰색 루어 캡으로 유량 배양 챔버의 8개 연결을 모두 닫습니다. 압축 공기 시스템에 연결하고 압력 센서를 삽입합니다. 테플론 벨로우의 작은 확장을 허용하려면 스트레인 펌프(5.6단계 참조) O/N을 실행합니다.
참고: 제조업체의 프로토콜에 따라 필요한 모든 재료 및 장비가 청소 및/또는 자동 확장되었는지 확인하십시오(재료 테이블,자동 분석이 허용되는 주석/설명 열 참조), 제조업체의 프로토콜 또는 7.3-7.6 단계에 설명된 대로. - 프로토콜의 나머지 부분에 대한 멸균 작업 조건을 확인합니다.
- 멸균 라미나르 유량 캐비닛에서 2-5.3단계(시스템 설정), 6.3단계(중간 변화), 단계 7.1-7.2(혈관 구조 수확)를 수행한다.
- 닫은 페트리 접시에 후속 단계에 직접 필요하지 않은 재료를 배치하여 모든 것을 가능한 한 깨끗하게 유지하십시오.
- 70%에탄올로 종이 조직을 담그고 생물반응기 성분과 라미나르 유량 캐비닛의 표면을 닦아 서 정기적으로 깨끗하거나 건조한 물질 표면을 닦아냅니다.
2. 바이오 반응기 설정
참고: 라미나르 플로우 캐비닛에서 2단계를 수행합니다.
- 전기 스캐폴드를 길이 약 25mm의 튜브로 자르고 사용하기 전에 문서화합니다(예: 길이에 대한 사진, 초기 질량의 균형이 있는 무게).
- 전자스펀 비계를 오염 제거합니다.
- 자외선(UV) 광원을 향한 하나의 개구부와 함께, 잘 플레이트 또는 페트리 접시에 기울어진 전기스펀 비계를 놓아 UV 광(253.7 nm)이 스캐폴드 내부를 비춥니다.
- 전자스펀 비계를 UV 광에 5분 동안 노출합니다.
- 모든 비계를 돌리고 다른 개구부를 위해 UV 조명을 반복합니다.
참고: 이 단계 후에는 필요할 때만 전기스펀 스캐폴드를 만드세요. 항상 깨끗한 핀셋이나 깨끗한 장갑을 사용하십시오. - 70%에 보관되는 유량 배양챔버의 유리튜브를 가져 가서 유리튜브를 초순수물로 씻고, 건조하고, 닫혀 있는 큰 페트리 접시에 놓습니다.
참고: 다음 단계, 특히 단계 2.3-2.5는 두 명의 실험자가 이상적으로 수행됩니다.
- 실리콘 튜브에 전기 스캐폴드를 장착합니다.
- 튜브의 한쪽을 통해 다른 쪽을 통해 봉합사를 복용하여 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 5-0 prolene 봉합사를 부착하고, 튜브의 단면을 가로 질러 두 개의 반대 팽팽한 봉합사를 남깁니다. 매듭의 궤적에서 튜브를 압축하는 동안 튜브의 양쪽에 작은 매듭을 만들고 양쪽 매듭에 와이어의 약 10cm를 둡니다. 두 개의 10cm 좌측 와이어의 끝에 세 번째 매듭을 만듭니다.
- 봉합사 바늘과 모든 무료 실을 잘라 내고 전자스펀 스캐폴드의 내부를 손상시킬 수 있습니다. 실리콘 튜브의 가장자리를 삼각형 모양으로 잘라 서 전자스펀 스캐폴드를 통해 실리콘 튜브를 당기는 데 도움을 주세요.
- 전자스펀 스캐폴드를 30% 에탄올에 담그고(이는 여분의 오염 제거 단계역할을 하며 실리콘 튜브 위로 전기스펀 스캐폴드를 미끄러지게 하는 데 도움이 됩니다)를 자유 10cm 와이어 위에 전기스펀 스캐폴드를 놓습니다. 실험자 A는 실리콘 튜브와 10cm 봉합사의 매듭을 부드럽게 당기면 실리콘 튜브를 펴고, 실험자 B는 매끄러운 내부 팁으로 핀셋을 사용하여 실리콘 튜브 위에 전기 스캐폴드를 부드럽게 밀어 내어 비계의 손상을 방지합니다.
- 실리콘 튜브의 스트레치를 천천히 풀어주면서 핀셋으로 전자스펀 스캐폴드를 부드럽게 합니다. 초순수수에 실리콘 튜브에 전기스펀 스캐폴드를 두 번 찍어 보세요.
참고 : 전기 스캐폴드의 일부 주름이 발생할 수 있습니다. 이 주름은 2.5.3 단계에서 압력 도관에 스캐폴드를 고정하기 전에 적용 된 사전 스트레치 중에 사라집니다. - 다른 전기스펀 스캐폴드에 대해 2.3.2 및 2.3.3 단계를 반복합니다. 실리콘 튜브의 길이에 따라 여러 개의 전기 스캐폴드를 동일한 실리콘 튜브에 장착할 수 있습니다.
- 모든 전기 스펀 비계가 실리콘 튜브에 장착되면, 스캐폴드 주위에 실리콘 튜브를 잘라, 모두 동일한 길이 (5.5cm)로; 한쪽은, 전기스펀 스캐폴드의 끝에 가깝고, 다른 쪽에서는 ~ 2~3cm의 무료 실리콘 튜브를 남깁니다.
- 튜브의 한쪽을 통해 다른 쪽을 통해 봉합사를 복용하여 실리콘 튜브의 한쪽 끝에 5-0 prolene 봉합사를 부착하고, 튜브의 단면을 가로 질러 두 개의 반대 팽팽한 봉합사를 남깁니다. 매듭의 궤적에서 튜브를 압축하는 동안 튜브의 양쪽에 작은 매듭을 만들고 양쪽 매듭에 와이어의 약 10cm를 둡니다. 두 개의 10cm 좌측 와이어의 끝에 세 번째 매듭을 만듭니다.
- 유량 배양 챔버의 바닥 구획을 구성한다(도1A-B).
- 유동 콘센트가 들어 있는 하부 구획의 상부를 가져 와서 수컷 Luer 플러그로 유량 콘센트를 닫습니다.
- 압력 도관을 바닥 구획을 통해 구멍으로 밀어 내고, 누설을 방지하기 위해 압력 도관의 하부 끝에 실리콘 O 링을 배치합니다. 압력 도관을 확보하기 위해 하단 구획의 하부를 아래쪽 구획의 상부에 나사로 고정합니다. 압력 도관의 하부 새겨진 홈이 아래쪽 구획의 어댑터 부싱 가장자리에서 약 3-5mm 위인지 확인하십시오. 이것은 나중에 봉합사 와이어의 단단한 매듭을 '잡고'실리콘 튜브 위에 전기 스캐폴드를 고정합니다.
참고: 압력 도관이 상하로 쉽게 기동될 수 있는 경우, 바닥 구획이 잘 고정되지 않음을 나타냅니다. 반복 단계 2.4.2 이후 단계에서 누출을 방지하기 위해(그림 2D).
- 압력 도관에 전기 스캐폴드로 실리콘 튜브를 고정합니다.
- 압력 도관 위로 전기 스캐폴드로 실리콘 튜브를 당깁니다.
- 압력 도관에 새겨진 홈의 위치에 있는 전기스펀 스캐폴드의 하부 끝에 봉합사 와이어로 매듭을 만든다. 전자스펀 접목으로 실리콘 튜브를 단단히 고정하기 위해 반대쪽에서 두 번째 매듭을 만듭니다.
주의: 이것은 중요한 단계입니다. 유압 저수지에서 유량 배양 챔버로물의 누수를 방지하기 위해 매듭이 압력 도관의 새겨진 홈에 정확히 '떨어집니다'되어 있는지 확인하십시오. 확실하지 않은 경우, 홈의 예상 위치 위 또는 아래에 있는 여러 위치에서 봉합사 와이어를 조여 최종 매듭이 정확히 새겨진홈(그림 2A)에있는지 확인하십시오. - 실리콘 튜브의 상부 끝에 가위 클램프를 놓고 실리콘 튜브를 위쪽으로 펴십시오 (이것은 첫 번째 매듭을 직접 테스트할 것이며, 압력 도관 위로 전기 스캐폴드로 실리콘 튜브를 이동할 수 있다면 충분히 잘 조여지지 않았습니다). 당김력으로 실리콘 튜빙이 미리 뻗어 있습니다. 실리콘 튜브가 다른 샘플 간에 일관되도록 하려면 눈금자를 가위 클램프에 부착합니다. 눈금자의 아래쪽 끝이 스캐폴드의 하부 끝에 도달할 때까지 가위 클램프를 위쪽으로 당깁니다.
참고: 두 가지 이유로 각 시료의 사전 스트레칭을 거의 동일(~5%)으로 유지하는 것이 중요합니다: (1) 실리콘 튜브가 미리 늘어나면 가압시 시료의 길이에 따라 더 균일한 팽창이 초래됩니다. (2) 사전 스트레치가 실리콘의 기계적 특성에 영향을 미치므로 샘플 간의 동일한 스트레치 조건을 보장하기 위해 모든 샘플에서 동일해야합니다. - 전기스펀 스캐폴드를 부드럽게 당겨 서 전하 계골 비계의 주름을 제거합니다. 다시 말하지만, 압력 도관에 상부 새겨진 홈의 위치에 스캐폴드의 상단에 봉합사 와이어와 함께 양쪽에 두 개의 매듭을.
- 가위 클램프를 풀어, 칼로 실리콘 튜브의 과잉을 잘라, 나사 스레드의 20-30 %를 떠나 실리콘 튜브로 덮여, 코 콘이 나사 스레드에 장착 될 때 누출을 방지하기 위해.
참고: 모든 동적 샘플에 대해 2.4 및 2.5 단계를 반복합니다. - 정적 제어 샘플의 경우 구멍없이 압력 도관에 실리콘 튜브에 장착 된 전기 스캐폴드를 고정하십시오. 이러한 도관은 파종(4단계)까지 15mL 튜브에 별도로 보관할 수 있으며 유량 배양 챔버 구획에 장착할 필요가 없다.
- 10 분 동안 UV 빛에 노출하여 전기 스캐폴드로 부분적으로 구성된 유량 배양 챔버를 오염 제거합니다. 전기스펀 스캐폴드로 유량 배양 챔버를 다른 쪽으로 돌리고 UV 광 노출을 10분 동안 반복합니다.
- 압력 도관의 나사 실에 코 콘을 동적 샘플에 구멍이 있는 나사로 나사로 연결합니다.
- 실리콘 튜브의 상단 끝이 코 콘에 맞아 서 나중에 누출을 방지하십시오. 실리콘 튜브가 너무 많으면 칼로 튜브를 과도하게 잘라냅니다.
- 부분적으로 구성된 유량 배양 챔버를 큰 페트리 접시에 놓고 코 콘을 UV 광원으로 가리킵니다. UV 조명을 5분 동안 적용하십시오.
- 유량 배양챔버의 유리튜브 및 상부 구획을 갖춘 유량 배양 챔버의 완전한 시공(도1A-B).
- 30% 에탄올에 실리콘 튜브및 전기스펀 스캐폴드로 압력 도관을 찍어 전하계, 초순수수에 두 번 담그고 있다.
- 압력 도관 위에 유리 튜브를 놓고 바닥 구획에 부드럽게 밀어 부드럽게 고정합니다.
- 유동 입구를 포함하는 상단 구획을 가지고 실리콘 O-링, 플로우 스트레이트너 및 어댑터 부싱을 올바른 순서로 놓고(그림 1A-B),유리 튜브의 열린 끝에 놓고 부드럽게 고정하십시오.
- 상단 구획의 유동 입구에 흰색 루어 캡을 나사로 고정합니다.
- 하단 구획의 유동 출구에서 수컷 루어 플러그를 제거하고 에탄올에 젖은 종이 조직으로 주변 표면을 청소하십시오.
- 유동 콘센트에 10mL의 초순수물이 있는 주사기를 놓고 상단 구획에 흰색 루어 캡을 열고 실내에 초순수물로 챔버를 채웁니다. 흰색 루어 캡을 다시 닫고 주사기를 제거하고 에탄올로 다시 청소하고 남성 루어 플러그로 유동 콘센트를 닫습니다.
참고: 모든 흐름 배양 챔버에 대해 2.6-2.8 단계를 반복합니다. - 정적 컨트롤의 경우 15mL 튜브에 구멍없이 압력 도관에 장착된 샘플을 보유하는 10mL의 초순수물을 추가합니다.
- 모든 유량 배양 챔버를 인큐베이터에 배치합니다. 초순수수를 배양배지로 1일 전에 세포파종조2.8.5 및 2.8.6단계(유량 출구에 직접 배치된 에탄올에 담근 종이 조직으로 '오래된' 초순수수를 수거해야 한다).
[프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다]
3. 유량 펌프 설정 준비
참고: 라미나르 플로우 캐비닛에서 3단계를 수행합니다.
- 모든 펌프 설정 재료를 수집하고 사용을 준비하십시오.
참고: 실험자는 유체 장치의 밸브를 통해 펌프, 유체 단위 및 중간 튜브를 설정하는 자세한 설명을 위해 제조업체의 프로토콜을 참조합니다.- 펌프를 200mbar 용량으로 설정합니다.
- 60mL 저수지에 대한 저수지 홀더를 유체 단위로 나사로 만듭니다.
- 에탄올에 담근 종이 티슈로 재사용 가능한 고무 공기 필터를 청소하고 공기 필터가 건조하게 유지되도록 하십시오.
- 60mL 저수지를 저수지 홀더에 넣고 유체 장치의 밸브를 통해 표준 중간 튜브를 배치합니다. 중간 튜브를 더 큰 내부 직경과 여성 Luer 잠금 커플러를 동봉된 루프에 연결합니다.
- 중간 튜브를 저수지 바로 아래에 호스 클립으로 고정합니다.
- 저수지는 60mL 저수지당 25mL의 배양 배지로 채웁니다. 호스 클립을 해제하고 매체가 튜브에 들어가도록 합니다.
- 중간 저수지를 고무 공기 필터로 닫고 4단계까지 인큐베이터에 유량 펌프 설정을 배치합니다.
4. 세포 운반대로 피브린을 사용하여 세포 파종
참고: 라미나르 플로우 캐비닛에서 4단계를 수행합니다.
- 세포 파종 단계를 위해 피브린 젤을 준비합니다. 자세한 내용은 Mol 외.67 피브린 젤의 경우, 피브리노겐 용액은 10 mg/mL(단백질 스톡의 순도에 대한 올바른) 최종 농도를 가져야 하며, 혈전 용액은 10 U/mL의 최종 농도를 가져야 한다.
- 붉은 뚜껑이있는 플라스틱 용기에 ~ 50 mg (10 샘플에 충분)하기 전에 FIbrinogen을 RT로 해동하십시오.
- 세포 배양 배지를 추가하여 피브리노겐 용액을 준비하십시오 (10 mg /mL의 농도에서 단백질 육수의 순도에 적합). 잘 섞고 필터를 사용하여 0.2 μm 주사기 필터를 멸균 15mL 튜브로 살균합니다. 여과된 피브리노겐 용액을 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 미리 피브리노겐 용액을 너무 오래 준비하지 말고, 그렇지 않으면 피브리노겐이 자발적으로 응고할 수 있습니다. - 해동 혈 전 하 고 혈 전 배양 배지에서 혈전 용액 (10 U/mL의 농도)을 만들고 얼음에 놓습니다. 샘플당 20 μL 혈소판 + 세포 용액을 준비합니다. n=10 샘플의 경우 200 μL이 필요합니다. 따라서 250 μL 트롬빈 솔루션을 준비하여 가능한 파이펫 팅 오류를 고려하십시오.
- 배양 플라스크에서 세포를 수집하고 계산합니다. 원하는 비율 및 양(1.2 × 106 단낭 및 0.6 × 106 스캐폴드당 근섬유세포)로 세포를 혼합한다. 파이펫팅 오류에 대해 수정할 수 있는 n+1 샘플에 충분한 셀이 있는지 확인합니다. RT에서 10 분 동안 350 × g의 원심 분리기는 상체를 제거합니다.
- 중단된 세포와 혈전을 혼합합니다.
- 각 샘플에 대해, 트롬빈 용액의 20 μL을 사용합니다. n=10 샘플의 경우 셀 펠릿에 200 μL 트롬빈을 넣고 섞습니다. 세포 현탁액(셀 +트롬빈)의 부피를 측정하고, 모든 10개의 스캐폴드(예를 들어, 트롬빈+ 세포 현탁액이 260μL의 부피를 가지고 있는 경우) 각 전기스펀 샘플은 260 μL/10 샘플 = 26 μL/10 샘플 = 26 μL+셀 서스펜션을 받게 됩니다.
- 스캐폴드의 파종은 두 단계로 수행됨에 따라 각 스캐폴드에 대해 셀 서스펜션의 절반을 보유하는 2개의 1.5mL 마이크로퍼지 튜브를 준비합니다(이전 단계의 예 계산: 13μL+셀 서스펜션으로 2개의 튜브를 준비). 얼음 위에 놓습니다.
참고: 다음 단계, 특히 단계 4.4는 두 명의 실험자가 이상적으로 수행됩니다.
- 미리 젖은 전동 전기 스캐폴드를 진공으로 말리면 세포 파종에 대비하십시오.
- 유리 파스퇴르 파이프를 라미나르 플로우 캐비닛의 진공 시스템에 연결하고 빈 50mL 튜브에 배치하여 멸균 임시 보관을 합니다.
- 인큐베이터에서 유량 배양 챔버를 가지고, 흐름 출구에서 남성 루어 플러그를 제거하고, 흰색 루어 캡을 열고 흐름 출구 앞에 에탄올 에러 티슈를 배치 한 후 매체를 제거합니다.
- 상단 수납공간과 유리튜브를 벗고 멸균 페트리 접시에 넣고 임시 보관하십시오.
- 진공 파스퇴르 파이펫을 전기스펀 스캐폴드에 놓고 가능한 한 많은 매체를 제거합니다.
주의: 전기스펀 스캐폴드를 매우 부드럽게 진공 건조시하십시오. 스캐폴드 위에 앞뒤로 선형 모션 대신 진공 파이프를 여러 위치에 배치합니다. 더 나은 제어를 위해 파스퇴르의 파이프 위에 진공 튜브를 고정합니다. - 혈전 + 세포 현탁액과 1:1 비율로 피브리노겐 용액을 혼합합니다(예를 들어, 13μL의 혈전 + 세포 현탁액)을 혼합합니다. 피브린이 마이크로푸지 튜브가 아닌 스캐폴드에서 중합체되도록 하려면 피브리노겐을 파이프하고, 트롬빈 + 세포 현탁액의 '추가 볼륨'에 대한 파이프 휠을 돌리고, 세포 현탁액이 있는 미세분리관에서 한 번 위아래로 피펫을 섞는다.
- 직접 균질적으로 전기 스캐폴드의 전체 길이에 용액을 드립. 실험자 A는 피브린 혼합물을 떨어 뜨리고, 실험자 B는 압력 도관에 장착된 전기스펀 스캐폴드가 장착된 바닥 구획을 보유하는 것이 좋습니다.
- 세포가 있는 피브린이 전하 계측비에 떨어뜨린 후, 실험자 B는 서서히 스캐폴드를 좌우로 움직여 세포를 비계 위로 고르게 나눕니다.
- 반복 단계 4.4.5 - 4.4.7 전기 스캐폴드의 반대편에.
- 유리 튜브를 조심스럽게 배치하여 유동 배양 챔버를 다시 마운트 (유리 튜브의 내부에 피브린 집착 및 응고 방지), 유량 배양 챔버의 상단 구획을 다시 밀어. 직접 인큐베이터내의 유량 배양 챔버에 임의의 매체 또는 인산염 완충식식염수(PBS)없이 시드 구조를 배치한다.
- 모든 동적 샘플에 대해 4.4.1-4.4.9 단계를 반복합니다. 구멍없이 압력 도관에 장착 된 정적 샘플의 경우 4.4.1-4.4.8 단계에 따라 시드하고 나중에 15 mL 튜브에 배치하십시오.
- 피브린은 인큐베이터에서 60 분 동안 중합하게하십시오.
[프로토콜은 30~60분 동안 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.]
- 중합 후, 유량 배양 챔버(동적 샘플) 또는 15mL 튜브(정적 샘플)를 배지로 채운다.
5. 실험을 시작하기 전에 생물 반응기 및 유량 펌프 시스템의 결합
참고: 라미나르 플로우 캐비닛에서 5.1-5.3 단계를 수행합니다.
- 플로우 배양 챔버와 유체 단위를 채우고 중간 저수지와 라미나르 흐름 캐비닛 내부에 연결된 중간 튜브를 운반하는 트레이를 가져 가라.
- 순환 스트레치와 결합 된 혈역학 부하(도 1E)로로드된 실험 군을 위한 생물 반응기 베이스에 유량 배양 챔버를 배치합니다.
- 유량 배양 챔버를 거꾸로 기울이고, 얇은 튜브를 가진 주사기를 사용하여 초순수수로 압력 도관을 채우고(이 실험에서 10cm 길이, 0.15mm 내경 와이어가 바늘에 부착된 모든 유형일 수 있음).
- 압력 도관 내부에 얇은 튜브를 놓고 압력 도관은 주사기에서 물을 서서히 밀어 내어 초순수수로 채워지지만, 압력 도관 내부에서 동시에 와이어를 꺼내 압력 도관 내부에 기포가 없는지 확인합니다.
- 생물 반응기 기지에 8개의 나사 나사 나사 중 하나에 유량 배양 챔버를 놓습니다. 생체 반응기 베이스와 흰색 루어 커넥터 사이에 실리콘 O 링을 배치하여 누출 가능성을 방지하고 하단 구획에서 흰색 Luer 커넥터를 조입니다.
- 주기적으로 늘어난 모든 샘플에 대해 5.2.2 및 5.2.3 단계를 반복합니다.
- 정적 제어를 제외한 모든 실험 그룹에 대한 유량 배양 챔버를 유량 펌프 시스템에 연결합니다.
- 중간 튜브에 호스 클립을 놓습니다. 유량 배양 챔버의 상단 구획의 유동 입구를 덮는 흰색 루어 캡을 제거합니다. 중간 튜브의 여성 Luer 커플러를 제거하고, 상단 구획의 흐름 입구와 한쪽의 중간 튜브를 연결하고, 중간 튜브의 다른 쪽은 아래 칸의 흐름 콘센트와 연결합니다.
- 모든 흐름 배양 챔버에 대해 5.3.1 단계를 반복합니다. 이 시점에서, 생물 반응기 및 유량 배양 챔버는 매체로 채워지고 유량 시스템에 연결됩니다.
- 정적 제어 샘플의 경우 가위 클램프를 사용하여 필터 캡을 사용하여 샘플샘플을 셀 배양 플라스크에 수직으로 배치합니다. 세포 배양 플라스크를 배지로 채우고 인큐베이터에 배치하십시오.
- 라미나르 플로우 캐비닛에서 인큐베이터로 전체 설정을 전송하고 유체 장치를 기압 튜브 및 전기 케이블에 연결합니다.
- 소프트웨어를 시작하고 유량 펌프를 초기화합니다. 샘플의 중간 흐름을 하나씩 시작합니다.
- 유체 장치의 밸브가 클릭하고 있는지 확인합니다.
- 중간 튜브에서 호스 클램프를 제거합니다.
- 100mbar와 10s 스위칭 시간으로 유량 펌프를 시작합니다.
- 유동 방향을 주의 깊게 확인하여 누출 또는 기포가 발생할 수 있는지 확인합니다. 모든 포동된 기포는 유량 배양 챔버를 거꾸로 돌려 제거할 수 있습니다.
참고: 중간 저수지의 중간 수준이 균형을 이루고, 유량 배양 챔버의 시스템 및 기포로 공기 흡입을 방지하고, 저수지가 건조하게 달리는 것을 허용하지 않도록하십시오(도 2C). - 모든 유체 단위에 대해 5.5단계를 하나씩 반복합니다.
- 스트레인 펌프를 초기화합니다.
- 공압 실린더의 공기 흡입구를 통해 공압 작동 펌프를 압축 공기에 연결합니다. 공기 아웃을위한 파란색 튜브와 낮은 공기 콘센트를 연결(그림 1F).
- 오픈 LabVIEW 소프트웨어를 실행, LabVIEW 스크립트 및 압축 공기 압력 응용 시스템, 반 켈 외.68에의해 설명 된 바와 같이, 변위와 주파수를 입력 (0.2 Hz의 저주파로 시작). 테플론 벨로우가 가장 낮은 수준에 있을 때 펌프를 일시 중지합니다.
- 압력 센서를 압력 센서 입구에 유압 저장소에 배치합니다.
- 펌프 설정을 원하는 설정으로 변경합니다(1.5 Pa의 경우 150mbar, 10s 스위칭 시간을 사용).
- 스트레인 펌프를 시작하고 선호하는 설정(예: 0.5Hz, 1.05 스트레치)을 적용합니다.
6. 며칠 동안 실험을 실행; 문화 및 중간 교체 시 전단 및 스트레치 모니터링
- 스캐폴드 벽에서 WSS를 계산합니다.
- 격일 흐름 크기를 기록합니다(자세한 내용은 유량 펌프 제조업체의 설명서 참조). 요컨대, 10s용 유체 단위 저장소의 스위칭 사이에 중간 저수지에서 액체 수준(mL)의 변화를 관찰한다. 최소 5개의 측정을 수행하고, 평균 값을 계산하고, 6을 곱하여 mL/min의 유량 Q를 얻습니다.
- 흐름은 환상 채널을 통해 포수유 흐름에 의해 설명된다. 배양 배지를 뉴턴 유체로 가정하면 스캐폴드 벽, r1,방정식 1에서 WSS를 계산합니다.
(1)
여기서 WSS는스캐폴드벽(r1;here r1 = 1.7mm)에서 발생하며, 유리 튜브 r2의 적용된 압력 p 및 내부 반경에 의해 결정된다(here r2 = 2.3 mm). 축 방향의 압력 그라데이션은 유동 입구와 유동 출구 간에 균일한 것으로 가정되며 수학식2(도 1J)에의해 주어집니다.
(2)
μ 동적 점도(여기서 중간 점도는 상수로 가정되었다, μ = 0.7 × 10-3 Pa+s 37°C) 및 Q 적용 유량.
- 격일로 비계에 적용되는 스트레치를 모니터링합니다.
- 비계와 배경 사이의 대비를 높이기 위해 흐름 배양 챔버 뒤에 어두운 배경을 배치합니다. 스캐폴드를 가리키며 LED 조명 램프를 배치하여 비계의 시각화를 돕습니다.
- 고속 카메라로 6s(즉, 스트레치 사이클 3개)에 30Hz의 주파수에서 스캐폴드의 타임랩스 사진을 찍어보세요.
참고: 카메라가 허용하는 경우 녹화 빈도가 낮을 수 있습니다. 그러나 최소한으로 필요한 주파수는 결정되지 않았습니다. - 이미지에서 스캐폴드의 최소 및 최대 직경을 수동으로 결정합니다.
- 일렉트로스펀 스캐폴드의 최소 및 최대 외경을 계산하여 방정식 3에 따라 최대 스트레치를 계산합니다.
(3)
여기서 일주 스트레치(λθ)는스캐폴드, d1,및 초기 직경, d0의외경 사이의 비에 의해 주어진다.
- 중간 증발에 대 한 수정 하 고 일주일에 세 번 매체를 새로 고침.
- 흐름 시스템과 스트레인 펌프의 케이블을 중지하고 분리합니다.
- 중간 튜브에 호스 클립을 놓습니다.
- 중간 저장소의 볼륨 표시표시를 기반으로 증발된 배지 양을 결정합니다.
- 생물 반응기와 유체 단위를 라미나르 플로우 캐비닛으로 트레이를 옮겨.
- 중간 저수지의 고무 공기 필터를 제거; 자동 초순수수를 추가하여 증발된 양의 매체를 보정합니다. 중간 저수지를 다시 닫고 펌프에 다시 연결하여 매체를 초순수 물과 혼합합니다.
- 6.3.1-6.3.5 단계를 반복합니다. 고무 공기 필터를 다시 제거하고, 배양 배지의 25mL을 꺼내, RT에서 5 분 동안 300 × g에서 아래로 회전.
- 1.5mL 상체를 수집하고 분비 프로파일 분석을 위해 -30 °C에 저장하십시오 (효소 연결 면역 소르벤트 분석 (ELISA)로 분석하십시오).
- 조건부배지(43)로상체를 사용하여 파라크리노 신호 연구에 대한 상체의 원하는 부피를 수집한다.
- 중간 저수지에 25mL의 신선한 매체를 추가합니다.
- 중간 저수지에 고무 공기 필터를 다시 놓습니다.
- 전체 설정을 인큐베이터에 다시 배치합니다. 모든 케이블과 에어 튜브를 펌프 및 스트레인 펌프에 연결합니다. 호스 클립을 해제하고 단계를 반복5.4-5.8.
- 펌프에 연결된 건조 병에 실리카 건조 구슬이 촉촉한 (흰색 외관)인지 확인하고 필요한 경우 드라이 실리카 구슬로 교체하십시오 (주황색 모양).
(1)
(2)
(3)7. 실험, 샘플 수집 및 장비 청소 및 저장 종료
- 실험의 마지막 날에는 6.3.1-6.3.5 단계에 설명된 바와 같이 중간 증발을 보정하고 샘플을 하나씩 수확한다.
- 샘플을 하나씩 수확하려면 유동 펌프와 스트레인 펌프를 여러 번 일시 중지해야 합니다. 중간 튜브에 호스 클립을 놓습니다. 유동 펌프와 스트레인 펌프를 일시적으로 중지합니다. 생물 반응기 기지에서 하나의 유량 배양 챔버를 분리; 생물 반응기 베이스의 흰색 루어 캡으로 교체하십시오. 플로우 배양 챔버와 유체 단위를 라미나르 플로우 캐비닛으로 가져 가라. 유량 펌프와 스트레인 펌프를 다시 시작하여 수확할 때까지 다른 시료에 혈역학 부하를 가합니다.
- ELISA를 통해 파라크리인 사이토카인 생산 분석을 위해 중간 저장소에서 배지를 수집합니다.
- 흐름 단위를 분리하고 튜브 구조를 수확합니다. 원하는 절단 방식에 따라 섹션. 상기 구조의 일부는 추가 분석전까지 4°C(3.7% 포름알데히드및 PBS에서 3x 5분 세척 후) 또는 -30°C(액체 질소에서 스냅 동결 후)에 보관할 수 있다.
- 생물 반응기 및 펌프 구성 요소를 청소하십시오. 또한, 항목당 권장 되는 청소 방법은 재료의 표에언급 됩니다.
- 고무 공기 필터를 70% 에탄올로 청소하십시오. 내부 필터를 촉촉하게하지 않도록 주의하십시오!
- 중간 튜브, 중간 저수지, 유리 튜브, 수컷 루어 플러그 및 여성 루어 잠금 장치, 화이트 루어 캡, 압력 도관, 코 콘, 실리콘 O 링, 어댑터 부싱, 유동 스트레이트너 (펌프, 유체 단위, 고무 공기 필터, 생물 반응기 기지를 제외) 및 흐르는 수돗물에 헹구십시오.
- O/N을 0.1% 산화물에 도데딜술파테 나트륨에 놓습니다.
참고: 부품이 녹을 수 있기 때문에 초순수를 사용하지 마십시오. - 수돗물과 식기 세척 비누로 헹구습니다.
- 탈이온물에 담그고, 70% 에탄올이 두 번, 그 다음에 는 탈이온화된 물에 담급드시면 됩니다.
- 모든 재료를 종이 조직에 따로 놓고 건조시키십시오. 압력 공기를 사용하여 튜브를 건조시다.
- 70% 에탄올에 담근 종이 티슈로 모든 비자동 분해성 물질을 청소하십시오. 여기에는 고무 공기 필터(공기 필터가 건조해야 한다는 것을 명심하십시오)와 생물 반응기 베이스(테플론 벨로우 및 공압 실린더)가 포함됩니다.
- 유체 챔버의 구성 요소(실리콘 O-링 포함), 중간 튜브, 중간 저수지(고무 공기 필터 제외), 수컷 루어 플러그 및 여성 루어 커플러, 흰색 루어 캡, 호스 클립 및 표준 장비(예: 핀셋, 클램핑 가위)의 구성 요소를 자동 클랩
- 다음 실험 중에 편리하게 사용하기 위해 별도의 구성 요소를 하나의 완전한 유체 챔버에 자동 식 상자에 결합합니다.
- 유압 저수지에서 물을 제거합니다. 70% 에탄올로 청소하고, 그 다음에는 탈온화된 물로 청소합니다. 건조하게 하십시오. 탈이온된 물과 수조 보존 소독제로 리필하십시오.
- 흐름 배양 챔버용 유리튜브를 70% 에탄올에 보관한다.
- 촉촉한 실리카 건조 구슬(흰색 모양)을 오븐 O/N에 120°C로 넣고 건조(주황색 외관)에 보관하고, 밀폐된 플라스크에 보관합니다.
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Representative Results
이 생물 반응기는 혈관 조직 성장에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개별적이고 결합 된 효과를 연구하고 3D 생체 물질 스캐폴드에서 리모델링하기 위해 개발되었다. 생물 반응기의 설계는 다양한 적재 조건하에서 최대 8개의 혈관 구조를 배양할 수 있게한다(도 1A). 혈관 구조는 둘레 스트레치와 WSS가 독립적으로 제어될 수 있는 유량 배양챔버(도 1B)에위치한다. 유동 배양 챔버의 상부 구획은 비교적 짧은 정착 길이(도1C)에서흐름을 안정화하기 위해 유동 스트레이트너를 보유한다. 유동 스트레이트너의 직접 하류, 코 콘은 환상 채널(도 1D)를통해 균등하게 흐름을 분배한다. 프로토콜의 모든 단계가 올바른 방식으로 수행될 때, 유동 배양 챔버내의 혈관 비계는 스캐폴드와 유리 벽 사이의 환상 채널을 통해 연속단방향 흐름을 실시할 수 있으며 공압펌프(도 1E-F)에의해 둘레로 뻗어 있다. 스캐폴드가 장착되기 전에, 전기스펀 튜브는 25mm튜브(도 1G)로절단되어야 하며, 마이크로아키텍처(도1H-I)를분석하기 위해 SEM으로 검사할 수 있다. 이 예에서 PCL-BU 이식편은 다른 엘라스트로메티 조직 설계 접목(천연 또는 합성 기원, 다른 미세 아키텍처 또는 다공성)으로 대체될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 내부 아웃 설계는 반드시 누출이 필요하지 않기 때문에 고다공성 이식편을 테스트 할 수 있습니다. 유량 배양 챔버의 회로도 이미지는 WSS(방정식 1), 압력 그라데이션(수학2), 및 둘레 스트레치(도1J)를설명하기 위해 방정식에 사용되는 파라미터의 물리적 해석을 나타낸다.
프로토콜의 중요한 단계를 잘못 실행하면 몇 가지 시나리오가 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 유압 저수지로부터의 누설은 잘못 장착된 매듭의 결과로 발생할 수 있으며, 압력 도관으로부터 유압 유체가 누출되어 실리콘 튜브를 통과하고 유량 배양챔버(도 2A)로진입하는 구멍이 있는 것으로 이어질 수 있다. 나사 실과 생물반응기 염기 사이의 연결에서 유압 유체의 누설은 실리콘 링이 잘 배치되지 않았거나 테플론 벨로우가 실험 1일 전에 O/N을 약간 팽창시킬 수 없을 때 발생할 수있다(도 2B). 더욱이, 매체가 탈가스가 없거나 중간 저수지의 중간 수준이 잘 균형이 맞지 않고 1개의 중간 저수지가 건조해지면 공기가 시스템에 빨려 들어갈 경우 WSS 소풍을 방해하는 유량 배양실(도2C)에서기포가 발생할 수 있어 세포 생존력과 후속 조직 성장을 저해한다. 마지막으로, 하단 구획의 실리콘 O-링이 올바르게 배치되지 않으면, 배지 유출은 유량 배양챔버(도 2D)아래에서 관찰될 수 있다.
이러한 생물반응기 설정이 개별 및 결합 된 혈역학 부하의 적용을 허용하므로, 다중 혈역학적 로드 된 실험 그룹은 하나의 실험(도 3A)에포함 될 수있다. 이전에는 다양한 혈역학 적재(즉, 2개의 전단 응력 정권 및 2개의 스트레치 정권)를 다양한 가능한 시스템설정(그림 3B)을적용하여 검증하였다. 스트레치(그림3C)와WSS(도 3D)가장기 배양 기간 동안 모니터링되었을 때, 이러한 것들이 최대 20일 동안 비교적 일정한 수준으로 유지될 수 있음을 검증하였다.
생물 반응기는 특히 혈역학적 로딩이 내부 혈관 TE 컨텍스트에서 성장과 리모델링에 미치는 영향을 연구하는 데 적합합니다. 시투 TE의 단계는 자연 상처 치유 반응의 단계를 반영하기 위해 가설이됩니다(도 4A). 여기에 설명된 바와 같이, 인간 사페누스 정맥에서 유래된 단핵유래 대식세포 및 근섬유아세포의 공동 배양은 증식 단계의 체외 모방으로 확립되었다. 파종 후 3일 후, 면역형광 염색은 스캐폴드(도4B)를통해 두 세포 유형의 균질분포를 보였다. 20일 간의 공동 배양 후, 순환 스트레칭만으로도 더 많고 두꺼운 콜라겐 타입 I 섬유의 증착이 발생했으며, 혈역학적 하중을 결합한 그룹에서는 이러한 순환 스트레칭 효과가 전단 응력에 의해 과장되어 면역형 염기침착(그림 4C)에의해 상시된 콜라겐 타입 I 증착이 적었다. 현장에서 조직 재생에 성공하려면 조직 생산과 스캐폴드 흡수 사이의 단단한 균형이 필요합니다. 조직 형성 외에도 생물 반응기는 세포 중심의 스캐폴드 재흡수를 유도할 수 있습니다. 예를 들어, 전기접편에서 8일 동안 대식세포의 단일 배양을 배양할 때, 섬유 침식 및 섬유 분열은 모든 혈역학 적재 정권에서 관찰되었으며, 정극군에서 가장 뚜렷한 재흡수와 전단 응력 군에서 가장 뚜렷한 재흡수(도4D). 이러한 결과는 서로 다른 혈역학 적재 정권이 성장과 리모델링 모두에 미치는 영향을 보여줍니다. 이러한 인사이트는 Situ TEVG에서 새로 개발된 설계 매개 변수를 최적화하는 데 유용합니다.
조직 재생 과정의 또 다른 중요한 결정요인은 프로-및 항염증성 사이토카인의 존재이다. 생물 반응기는 폐쇄 루프 시스템이기 때문에 시스템의 세포는 분비 된 요인의 파라크리인 자극에 지속적으로 노출될 것입니다. 세포사포동성 분비 프로파일은 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)-유래 대식세포 및 사페누스 정맥으로부터의 인간 근섬유아세포의 동적으로 적재된 공동 배양의 배지에서 초기 및 후기 단계에서 분석되었다(그림5A). 이러한 대표적인 결과는 공동 배양 설정에서 사이토카인 분비 프로파일에 대한 순환 스트레칭과 전단 스트레스의 영향을 보여줍니다. 흥미롭게도, 두 부하의 결합된 효과는 두 부하 중 하나의 지배를 보였다 (예를 들어, 인터류빈-6 (IL-6) 및 단핵 화학 요법 단백질-1 (MCP-1)) 또는 두 부하의 시너지 효과 (예를 들어, IL-10)의 시너지 효과 (예를 들어, IL-10). 이 시험관 내 테스트 플랫폼을 사용하여 수집 된 이러한 통찰력은 시투 조직 재생에서 대식세포 중심의 근거를 기반으로 하는 Situ TEVGs의 개발을위한 귀중한 정보를 제공합니다.
대식세포와 근섬유세포의 공동 배양 실험은 기계적 환경과 그로 인한 로딩 의존성 염증 환경이 근섬유아세포의 표현형을 조절하는 것으로 나타났다. 혈역학 적재 후, 근섬유 세포 마커의 유전자 발현은 심섬유 아세포에 대식세포의 직접 및 파라크린 신호의 개인 및 결합 된 충격에 명확한 차이를 보였다(도 6A). 더욱이, 수축 마커 알파 평원 근육 작용의 유전자 발현 패턴은 단백질 합성과 상관관계가있다(도 6B). 더욱이, 순환 스트레치 자극 콜라주누스와 탄성 매트릭스 유전자 발현 및 감쇠 매트릭스 메탈로프로테나제 1/조직 억제제 매트릭스 메탈로프로테나제 1-중재 콜라겐 리모델링, 반면 전단 응력의 안정화 효과는 공동 배양(도6C)에서관찰되었다. 이러한 장기 공동 배양 실험은 이러한 생체 반응기를 통해 조직 설계 혈관 이식에 있는 다양한 혈역학 적재 요법에서 후기 단계 조직 리모델링단계(도 4A)를연구할 가능성을 보여준다. TEVG가 실리콘 튜브에 "내부 아웃"으로 장착됨에 따라 원형 스트레치 및 WSS를 더 긴 배양 기간 동안 적용할 수 있습니다.
그림 1: 생물 반응기의 설계 및 개요. (A)바이오 반응기 기저및(B)의시공도는 모든 부품이 표시된 유체 배양챔버의 전도(단계 2.4-2.8)를나타냈다. 유동 배양 챔버의 상단 구획은 흐름 스트레이트너를 보유하고 있습니다. (C)구형 무딘 코 콘은 유동 스트레이트너 후 배치되어 환상 채널을 통해 흐름을 분배한다(분홍색으로 표시된 흐름 방향). (D)이러한 구성 요소는 함께 유동 방향을 제어하고 안내합니다. 개별적으로 언급된 부품에 대한 기능적인 설명은 표 1을 참조하십시오. (E)완전한 생물반응기 설정(단계 5.2) 및(F)유량 배양 챔버 및 공압 실린더(Step 5.6.1)의클로즈업 뷰의 사진. (G)종착하기 전에 전기스펀 PCL-BU 스캐폴드의 총 출현(눈금자 진드기 1mm). 관형 전기 전자-BU 스캐폴드의 스캐닝 전자 현미경 이미지는 3mm 내경과 5 μm 평균 섬유 직경의 다른 배율, 스케일바(H)100 μm 및(I) 10 μm(1.3단계)이다. (J)관형 전전기 스캐폴드로 구성된 배양챔버의 회로도 이미지, 외부 반경(r1)이 내반경(r2)의 유리 튜브를 중심으로 한다. 흐름(Q)입구및 콘센트는 벽 전단 응력(t)을 적용하기 위한 채널높이 h와 함께 환상 고리에 연결됩니다. 압력/스트레치(P) 입구는 내부(6.1단계)에서장착된 전기스펀 스캐폴드에 일주 스트레치(λ(t)를 적용하기 위한 실리콘 장착 스캐폴드에 연결된다. 약어: 폴리카폴락톤 비보험자 (PCL-BU). 패널 C, D 및 G-J는 반 하프텐 외19에서적응되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 바이오 반응기 부품 | 기능 설명 |
| 스트레치 어플리케이션 | |
| 공압 실린더 | 테플론 벨로우를 액추에이트. |
| 테플론 벨로 | 유압 저장소를 로드합니다. |
| 유압 저수지 | 최대 8개의 유량 배양 챔버와 연결할 수 있으며, 데미워터로 채워져 있으며, 실리콘 장착 구조에 압력을 가한다. |
| 나사 나사 | 유량 배양 챔버와 유압 저수지 사이의 연결. 실리콘 장착 구조에 대한 압력 입구입니다. |
| 화이트 루어 커넥터 | 유압 저수지/생물 반응기 베이스의 8개의 나사 나사 나사 중 하나에 단단히 고정된 유량 배양 챔버를 나사로 고정하는 데 사용됩니다. |
| 작은 구멍이 있는 압력 도관 | 유압 저수지의 물과 직접 연결됩니다. 유압 저장소가 가압되면 압력 도관이 실리콘 튜브(압력 도관에 장착된)사이의 공간을 물로 채우고 실리콘 튜브를 바깥쪽으로 밀어 내면에서 실리콘 장착 이식편에 둘레 스트레칭이 발생합니다. |
| 실리콘 튜빙 | 압력 도관에 전기 스펀 접목을 장착합니다. 실리콘 튜빙은 내부에서 일주적으로 뻗어 있습니다. |
| 플로우 어플리케이션 | |
| 플로우 펌프 시스템 | 유량 배양 챔버의 흐름을 제어하는 데 사용됩니다. (우리의 예: ibidi 펌프 시스템이 사용됩니다.) |
| 플로우 입구와 콘센트가 있는 상단 및 하단 컴파트먼트 | 흐름 배양 챔버를 흐름 루프에 연결합니다. |
| 유리 튜브 | 중앙에 가압 된 비계를 포함하고 비계의 관류를 허용합니다. |
| 플로우 스트레이트너 | 비교적 짧은 침전 길이로 흐름을 안정화합니다. |
| 코 콘 | 흐름을 균등하게 분배합니다. |
| 어댑터 부싱 | 유리 튜브를 수정합니다. |
| 실리콘 O 링 | 매체의 누출을 방지합니다. |
표 1: 생물 반응기 주요 특징에 대한 기능적 설명은 도 1A-D의 표시된 부품과 일치합니다.
그림 2: 프로토콜에서 중요한 단계를 부정확하게 실행한 결과입니다. 중요한 단계가 올바른 방식으로 수행되지 않을 때 생물 반응기 설정에서 관찰 할 수있는 일부 발생의 사진. (A)매듭이 충분히 단단하지 않거나 정확히 새겨진 홈(화살표로 표시됨)에 놓이지 않으면 유량 배양챔버로 유압 유체가 약간 누출될 수있다(2.5단계). (B)테플론 벨로우가 실험 1일 전에 O/N을 팽창시킬 수 없거나 실리콘 링이 잘 배치되지 않은 경우, 스크류 실과 바이오 반응기 염기 사이의 연결에서 유압 액체로부터 유압 액체 누출이 발생할 수 있다(화살표로 표시) (단계 1.4 및 5.2.3). (C)유량 배양 챔버(화살표로 표시)의 기포가 방해된 전단 응력 패턴을 초래한다. 항상 배양 배지를 탈취하고 중간 저수지의 중간 수준이 균형을 이루어 한 저수지가 건조하고 공기가 유량 챔버 시스템(1.2 단계 및 5.5.4)으로빨려 들어가는 것을 방지하도록 균형을 유지하십시오. (D)바닥 구획의 실리콘 링이 올바르게 배치되지 않으면 배지의 유출이 관찰될 수 있다(화살표로 표시) (단계 2.4.2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 전단 응력 과 스트레치 제어. 생물 반응기는 스트레치 및 전단의 독립적이고 결합된 적용을허용하므로(A)다중 실험 군은 하나의 실험에 포함될 수 있다. (B)4개의 별개의 시스템 설정(색상표시)에서 테스트된 특정 시점에서 최대 스트늘브 및 전단 응력의 변형의 예. 검은색 사각형은 각 설정에 대한 측정의 표준 편차를 ± 의미합니다. 점선은 4개의 뚜렷한 하중 조건을나타내기 위해 스트레스트(수평선)와 전단 응력(수직선)의 평균으로 계산된다. (C)순환 의 외주 스트레칭 및 20 일의 실험 과정을 통해 결합 된 그룹으로 뻗어, 고속 카메라의 시간 경과로 모니터링 되는 비계 구조물의 외부 직경 측정에 기초하여 (단계 6.2). (D)주사기(6.1단계)의 변화하는 중간 수준에 기초하여 실험 과정에서 전단 응력 및 결합된 그룹에서 모니터링된 벽 전단 응력을 모니터링한다. 패널 A, C, D는 반 하프텐과 위싱 등44에서적응되었다; 패널 B는 반 하프텐 외19에서적응되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 현장에서 혈관 조직 공학, 세포 분포, 조직 생산 및 비계 저하의 개념. (A)호스트의 기능적 부위에서 스캐폴드 구동 조직 재생의 가설 단계를 묘사한 회로도 일러스트레이션. 표시된 결과는 대식세포와 조직 생성 세포가 비계 물질을 식민지화한 증식 단계에 초점을 맞춘 실험에서 파생됩니다. (B)3일째에 인간 사페누스정맥(빨강)과PBMC 유래 대식세포(녹색) 분포로부터의 심오섬유아세포(green)가 3일째에 전하스펀 스캐폴드(grey)의 바깥쪽으로 분포한다. 스케일 바 200 μm.(C)콜라겐 타입I(녹색),콜라겐 타입III(빨간색),및 DAPI(흰색)에 얼룩진20일째에 공동 배양 구조의 단면. 배율 막대 100 μm, *는 흐름 측에 대응하는 컨스트럭터의 바깥쪽을 나타냅니다. (D)대식세포 분해를 나타내는 8일간의 세포외식 이식의 SEM 이미지; 스케일 바 20 μm. 약어: 인간 사페누성 정맥 세포 (HVSC); 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC); 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌 (DAPI); 전자 현미경 검사 (SEM)를 스캔합니다. 패널 A는 위싱과 보니토 등에서적응되었다. 패널 B와 C는 반 하프텐과 위싱 외44에서적응했다; 및 패널 D는 위싱 외43에서적응되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 3일 20일 동안 혈역학적으로 하역된 공동배양 구조의 염증환경. 수페누스 정맥에서 인간 PBMC 유래 대식세포및 인간 근섬유 세포의 공동 배양. (A)멀티플렉스 ELISA를 통해 상부로 측정된 총 사이토카인 분비물의 열지도. (B)20일째에 사이토카인을 선택하기 위한 박스플롯, 총 DNA 함량으로 정상화. P 값은 던의 다중 비교 테스트와 크루스칼- 월리스 테스트를 사용하여 계산되었다; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** 약어: 금속단백질효소(TIMP), 매트릭스 메탈로프로테나아제(MMP), 인터류신(IL), 단세포 화학운동단백질 1(MCP-1), 성장인자 베타 1(T) 변형 GF-β1), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 정적(ST), 순환 스트레치(CS), 전단 응력(SS). 패널 A와 B는 반 하프텐과 위싱 외44에서적응했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 20일째에 혈관 구조의 혈역학 적재에 대응하여 매트릭스 성장 및 리모델링의 근섬유세포 표현형 및 마커의 변화. (A)근섬유세포 특이적 표현마커의 상대적인 유전자 발현. (B)αSMA(녹색)및 DAPI(파란색),스케일 바 100 μm에 대해 염색 된 단면. (C)콜라주 매트릭스, 탄성 매트릭스, 프로테오글리칸 및 리모델링 유전자와 관련된 유전자의 상대적 발현. P 값은 던의 다중 비교 테스트와 크루스칼- 월리스 테스트를 사용하여 계산되었다; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. 약어: S100 칼슘 결합 단백질 A4 (S100A4), 알파-부드러운 근육 액틴 (αSMA 또는 ACTA2), 칼포닌 1 (CNN1), 스무 델린 (SMTN), 바이멘틴 (VIM), 콜라겐 I (COL1A1), 엘라스틴 (COL1A1), 엘라스틴 (COL1A1), 엘라스틴 (COL1A1), 엘라스틴 (ELN), versican (VCAN), 매트릭스 메탈로프로테나제 (MMP), 금속 로프로테나제 (TIMP), 정적 (ST), 순환 스트레칭 (CS), 전단 응력 (SS), 4′, 6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI)의 조직 억제제. # 감지 한계 또는 그 이하에서 측정. 패널 A, B, C는 반 하프텐과 위싱 등44에서적응되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 S1: 단백질 발현 근섬유아세포-및 대식세포-단일 배양은 개별 및 결합된 혈역학 하중을 실시합니다. (A)근섬유아세포의 대표적인 공초점 영상, 액틴섬유(녹색),핵(빨간색),및 스캐폴드(blue)로 10일 동안 배양된 것으로, 장전된 시료에서 명확한 액틴 섬유 방향을 나타내며, 우선액섬유 방향이 없는 정적 샘플과 비교할 때 관찰될 수 있다. 스케일 바 50 μm.(b)콜라겐(녹색)및 핵 /스캐폴드(흰색)에대해 염색 된 동일한 근섬유 세포 단배의 공초점 이미지. 스케일 바 50 μm.(C)8일간 정적 및 동적으로 배양된 THP1 유래 대식세포의 단백질 분비 프로파일의 박스플롯은 IL-6, TNF-α, MCP-1(프로 염증) 및 IL-10의 사이토카인 분비 수준을 기준으로 계산된 M1/M2 비율로, IL-10 및 IL-1-1-염증성 MMP-1-1-염증성(10-1)을 기준으로 합니다. MCP-1 그래프의 점은 통계적 이상값을 나타냅니다. (D)8일째에 상대 단백질 분비 수준의 ELISA 데이터는 프로 염증성, 항염증, 성장 및 리모델링 단백질의 평균 분비에 비해 8일째에 정적 및 동적으로 배양된 대식세포(단백질 수준은 그룹당 평균 DNA 함량에 대해 수정되었다). 점과 그늘진 영역은 각각50번째와25일~75번째 백분위수임을 나타냅니다. 약어: 단핵구 화학요법 단백질 1 (MCP-1), 인터류빈 (IL), 변형 성장 인자 베타 (TGF-β), 매트릭스 메탈로 플라테라제 (MMP), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 결합 조직 성장 인자 (CTGF), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α), 효소 연결 면역제 (ELISA)<; ** p < 0.01, *** p < 0.001. 패널 A와 B는 반 하프텐 외19에서적응되었다. 패널 C와 D는 위싱 외43에서적응되었다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 명세서에 기재된 생물반응기는 관내 반사성 스캐폴드에서 염증 및 조직 재생에 대한 전단 스트레스 및 순환 스트레칭의 개별 및 결합된 효과의 기여도를 체계적으로 평가할 수 있다. 또한 이 방법을 사용하면 대표적인 결과 섹션에서 예시된 바와 같이 혈관 구조에서 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 이러한 결과는 TEVG 구조의 성장과 리모델링 모두에 다양한 혈역학 적재 체제(즉, 전단및 스트레치의 다양한 조합)의 독특한 영향을 보여줍니다. 이 시험관 내 플랫폼을 통해 수집된 이러한 통찰력은 Situ TEVG에서 새로 개발된 스캐폴드 설계 파라미터의 최적화를 지원합니다. 적절한 실험 워크플로우를 보장하기 위해서는 중요한 단계와 이 프로토콜의 한계를 이해하는 것이 중요합니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 샘플에 스트레치 적용과 관련이 있습니다. 스트레치 어플리케이션의 경우 설치가 누출되지 않는 것이 필수적입니다. 시스템에는 두 가지 약점이 있습니다: 압력 도관에 전기 스펀 이식편을 장착하는 매듭과 생물 반응기 기지와 유량 배양 챔버 사이의 연결. 2.5.2 및 2.5.4 단계에 설명된 바와 같이, 여러 개의 꽉 매듭은 새겨진 홈에 정확하게 배치되어야 합니다. 매듭이 충분히 단단하지 않거나 홈 위 또는 홈 아래에 약간 배치되면 유량 배양 챔버로 유압 유체가 약간 누출 될 수 있습니다. 이러한 누출은 유압 저장소의 압력 강하와 스트레인 펌프의 전압이 꾸준히 증가하여 설정된 압력 값에 도달할 때 검출될 수 있다. 게다가, 이것은 유량 배양 챔버에서 방해된 흐름, 세포 배양의 오염의 증가한 리스크 및 매체의 희석으로 이끌어 냅니다. 이 경우, 흐름 배양 챔버는 실험에서 꺼내야하며 유압 저장소의 나사 스레드는 흰색 루어 캡으로 닫혀야합니다. 다른 7개의 유량 배양 챔버에 대한 실험의 적절한 지속을 보장하는 데 필요한 완전한 샘플을 채취하는 이 주요 척도는 새겨진 홈에 정확하게 매듭을 정확하게 배치하는 것의 중요성을 강조합니다. 그런 다음에야 유압 저수지의 물과 유량 배양 챔버의 배지 사이에 적절한 분리를 보장할 수 있다. 스캐폴드 장착의 견고성을 향상시키기 위해 압력 도관의 홈은 생물 반응기의 개정 된 버전에서 약간 더 깊게 만들어보다 쉽고 더 나은 매듭 배치를 가능하게하여 배지에서 유압 유체를 안전하게 분리할 수 있습니다.
누설의 또 다른 잠재적 인 소스는 생물 반응기 기지의 나사 스레드와 유량 배양 챔버의 흰색 Luer 커넥터 사이에 있습니다. 테플론 소재의 마모 및 마모가 가능하기 때문에 누출방지를 위해 추가 실리콘 O-링을 추가할 수 있다(5.2.3단계). 더욱이, 스트레인 펌프의 테플론 벨로우는 실험(1.4단계)하루 전에 O/N을 약간 확장할 수 있어야 한다. 누설이 발생하면 8개의 나사 실 중 하나를 통해 소량의 초순수수를 추가하여 손실된 유압 유체를 보상해야 합니다(바늘과 유연한 와이어로 주사기를 사용). 흐름 배양 챔버를 흐름 배양 챔버의 하단 구획에 나사 스레드와 흰색 Luer 커넥터 사이에 작은 파라필름 조각으로 다시 놓습니다. 향후 실험에서 이러한 누출 문제를 극복하기 위해 생물반응기 기지의 현재 테플론 나사 실은 차세대 생물반응기의 스테인리스 스틸 실로 대체되어 시스템의 마모를 방지합니다.
스트레치(도3C)의변화는 WSS(도3D)의변동보다 크며, 스트레치를 제어하기가 더 어렵기 때문에. 그럼에도 불구하고, 누출을 방지하기 위한 조치 외에도, (i) 플루트(1.4 단계 및 5.2.1)및 (ii) 상이한 시료(2.5.3) 중 일관된 사전 스트레칭을 보장하고, (iii) 상이한 샘플(step 1.3)에서일관된 스캐폴드 특성을 보장하는 등 스트레치의 변동을 제한하는 다른 조치가 있다.
마지막으로, 실리콘 튜브(2.3단계)에전기스펀 스캐폴드를 장착할 때 는 주의가 필요합니다. 특히, 연약한 전기스펀 스캐폴드가 뻗은 실리콘 튜브 위로 당겨져야 할 때, 특히 전자스펀 이식편이 손상되는 것을 막기 위해 너무 많은 힘을 가하지 않는 것이 중요하다. 전기접이식의 내부에서 손상이 발생하면, 강력한 당기기또는 실리콘 튜브의 너무 약한 스트레칭으로부터, 전기스펀 섬유에 대한 손상의 정도는 구조가 수확되고 분석된 후에만 가시화된다. 현재 설정에서, 시종의 성공은 시료를 희생한 후에 면역형광 또는 면역히스토케미컬 분석에 의해서만 확인할 수 있다. 그러나, 피브린을 세포담체로서 파종절차는 전형적으로 충분히 큰 모공 크기를 가진 스캐폴드에 대한 균질성 세포 분포를 유도하는 잘 확립된방법(67)이다. 세포 파종에 대하여 가장 중요한 양상 중 하나는 스캐폴드가 파종(Step 4.4)전에 가능한 한 건조하도록 하고, 세포가 젖은 비계를 통과하는 것을 방지하는 것으로, 불균성 파종의 결과로. 마지막으로, UV 방사선에 의한 전기스펀 이식편의 오염 제거 방법은 30% 에탄올에 담그고 생체 내에서 제조된 전기스펀 이식편의 살균만큼 엄격하지는 않지만, 종종 에틸렌 산화물 또는 감마 조사에 의해 살균되는, 오염의 흔적없이 최대 20 일 까지 지속 될 수있는 체외 배양 실험에 충분하다 (예를 들어, 그림 3참조, 도 3, 도 4, 도 5, 도 6,반 하프텐과 위싱 (2020)44). 더욱이, 여기서 사용되는 PCL-BU 물질은 높은 에탄올 농도에 장시간 노출을 허용하지 않는다. 가장 적합한 살균 방법은 사용되는 재료에 따라 선택할 수 있습니다.
이전에 수행 된 공동 배양 연구의 결과 외에도 동일한 시스템으로 광범위한 연구를 수행 할 수 있습니다. 이 시스템은 이전에 각체섬유아세포(보충도1A-B)와대식세포(보충도1C-D)의동적 단일배양을 수행하여 개별 세포 유형및 파라크리온신호신호(19,43)에대한 혈역학 적재의 효과를 조사하기 위해 사용되었다. 다른 혈역학 적재 정권은 10 일 후에 근섬유 세포(보충 도 1A)와뚜렷하게 다른 콜라겐 증착(보충 도 1B)에서명확한 액틴 섬유 방향을 초래했다. THP1 유래 대식세포에 의한 사이토카인 생성은 다른 혈역학적재(보충 도 1C)사이에서 크게 상이했으며, 적재시 보다 더 프로염증성 프로파일을 보였다(보충도 1D). 다른 검증 된 가능성은 추가 펌프 및 유체 장치를 사용하여 진동 흐름의 적용을 포함한다. 배지의 점도는 혈액 점도의 범위(예를 들어, 크산탄 검을 첨가하여)(69)의범위로 증가될 수 있다. 중간 점도를 조절하는 것은 적용 가능한 전단 응력의 범위를 넓히기 위한 추가 변수를 나타냅니다. 마지막으로, 설명된 프로토콜은 'Ibidi' 유동 컨디셔닝 설정을 사용하지만, 유사한 흐름 정권이 적용될 수 있는 한 다른 제조업체의 설정도 사용할 수 있습니다.
이 생물 반응기 시스템을 사용하는 주요 장점 중 하나는 혈역학적으로 적재될 수 있는 비교적 큰 구조(약 15mm x 10.5mm)로 단일 샘플에서 추출될 수 있는 다양한 판독 매개변수를 허용합니다. 동시에, 상기 구조 크기는 특히 1차 세포가 사용되는 경우, 또는 배양 배지가 값비싼 첨가제를 필요로 하는 경우 상대적으로 많은 양의(때로는 비용이 많이 드는) 물질을 필요로 하기 때문에, 한계로 볼 수 있다. 또한, 설정의 처리량이 상대적으로 낮습니다. 따라서, 현재 설정은 제한된 판독을 가진 많은 변수의 선별보다는 제한된 수의 변수를 포괄적으로 테스트하는 가설 중심의 연구에 특히 적합합니다. 향후 실험의 경우, 현재 설정에 대한 작은 개선이 이루어지면서 더 작은 스캐폴드를 장착하고 중간 저장소의 크기를 축소할 수 있습니다. 후자에 대하여, 중간 저수지의 현재 부피는 원하는 전단 응력을 달성하기 에 충분한 체피 유량을 가능하게 하는 데 필요합니다. 필요한 유량-그리고 그와 함께, 중간 저수지의 부피는 매체의 점도를 증가시킴으로써 감소될 수 있다(예를 들어, 이전에 설립된69와같이 xanthan 껌을 추가하여).
결론을 내리기 위해, 이 생물 반응기는 조직 성장에 전단 스트레스와 순환 스트레칭의 개별 및 결합 된 효과의 정량화를 허용하고 다양한 탄성질 3D 생물 재료 스캐폴드에 리모델링합니다. 생물 반응기는 다양한 적재 조건하에서 최대 8개의 혈관 구조를 배양할 수 있습니다. 생체 반응기는 설계로 인해 혈역학과 시상 혈관 TE 프로세스 간의 상호 작용을 연구하는 데 특히 적합합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 LSH 2Treat 프로그램 (436001003)과 네덜란드 신장 재단 (14a2d507)의 일환으로 ZonMw에 의해 재정적으로 지원됩니다. N.A.K.는 유럽 연구 위원회 (851960)의 지원을 인정합니다. 네덜란드 과학연구기구(024.003.013)가 후원한 중력프로그램 '재료 중심재생'을 감사하게 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| advanced Dulbecco’s modified EagleMedium (aDMEM) | Gibco | 12491-015 | cell culture medium for fibroblasts |
| Aqua Stabil | Julabo | 8940012 | prevent microorganism growth in bioreactor-hydraulic reservoir |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold |
| Bovine thrombin | Sigma | T4648 | to prepare fibrinogen gel to seed the cells on the electrospun scaffold |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | to spin down cells and conditioned medium |
| Clamp scissor - "kelly forceps" | Almedic | P-422 | clamp the silicone tubing and apply pre-stretch to the scaffold so the scaffold can be sutured into the engraved groove (autoclave at step 1, step 7) |
| CO2 cell culture incubators | Sanyo | MCO-170AIC-PE | for cell culturing |
| Compressed air reservoir | Festo | CRVZS-5 | smoothing air pressure fluctuations and create time delays for pressure build-up |
| Custom Matlab script to calculate the maximum stretches | Matlab | R2017. The Mathworks, Natick, MA | calculate the minimum and maximum outer diameter of the electrospun scaffold |
| Data acquisition board | National Instruments | BNC-2090 | data processing in between amplifier system and computer |
| Ethanol | VWR | VWRK4096-9005 | to keep sterile working conditions |
| Fetal bovine calf serum (FBS) | Greiner | 758087 | cell culture medium supplement; serum-supplement |
| Flow culture chamber compartments, consisting of a pressure conduit with engraved grooves and small holes to apply pressure on silicone tubing, a screw thread, nose cone, top compartment with flow inlet and bottom compartment flow outlet, adapter bushing | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | flow culture chamber compartments (autoclave at step 1, step 7) |
| Glass Pasteur pipet | Assistant | HE40567002 | apply vacuum on electrospun scaffold (autoclave at step 1) |
| Glass tubes of the flow culture chamber | Custon made, Equipment & Prototype Center, Eindhoven University of Technology | n.a. | part of the flow culture chamber (clean and store in 70% ethanol, at step 1 and 7) |
| GlutaMax | Gibco | 35050061 | cell culture medium amino acid supplement, minimizes ammonia build-up |
| High speed camera | MotionScope | M-5 | to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles) |
| High speed camera lens - Micro-NIKKOR 55mm f/2.8 - lens | Nikon | JAA616AB | to monitor the stretch during culture; time-lapse photographs of the scaffolds are captured at a frequency of 30 Hz for 6 sec (i.e. 3 stretch cycles) |
| Hose clip | ibidi GmbH | 10821 | block medium flow (autoclave at step 1, step 7) |
| Hydraulic reservoir with 8 screw threads for 8 flow culture chambers | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | to apply pressure to the silicone mounted constructs (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol, rinse reservoir with 70% ethanol followed by demi water, at step 1 and 7) |
| Ibidi pump system (8x) including ibidi pump, PumpControl software, fluidic unit, perfusion set (medium tubing), air pressure tubing, drying bottles with orange silica beads | ibidi GmbH | 10902 | set up used to control the flow in the flow culture chambers. Note 1: the ibidi pumps were modified by the manufacturer to enable 200 mbar capacity. Note 2: can be replaced by pump system of other manufacturer, as long as same flow regimes can be applied. |
| Knives (no.10 sterile blades, individual foil pack) and scalpel handle (stainless steel, individually wrapped) | Swann Morton | 0301; 0933 | to cut the silicone tubing in the correct size for the scaffold and to cut the suture material |
| LabVIEW Software | National Instruments | version 2018 | to control the stretch applied to the scaffolds |
| Laminar flow biosafety cabinet with UV light | Labconco | 302310001 | to ensure sterile working conditions. The UV is used to decontaminate everything that cannot be autoclaved, or touched after autoclaving |
| Large and small petri dishes | Greiner | 664-160 | for sterile working conditions |
| L-ascorbic acid 2-phosphate (vitamin C) | Sigma | A8960 | cell culture medium supplement, important for collagen production |
| LED light cold source KL2500 | Zeiss | Schott AG | to aid in visualization for the time lapse of the scaffolds during monitoring of the stretch |
| Luer (female and male) locks and connectors, white luer caps | ibidi GmbH | various, see (https://ibidi.com/26-flow-accessories) | to close or connect parts of the bioreactor and the ibidi pump (autoclave at step 1, step 7) |
| Measuring amplifier (PICAS) | PEEKEL instruments B.V. | n.a. | to amplify the signal from the pressure sensor and feedback to LabView |
| Medium reservoir (large syringes 60 mL) and reservoir holders | ibidi GmbH | 10974 | medium reservoir (autoclave at step 1, step 7) |
| Medium tubing with 4.25 mm outer diameter and 1 mm inner diameter | Rubber BV | 1805 | to allow for a larger flow rate, the ibidi medium tubing with larger diameter is used. Note: the part of medium tubing guided through the fluidic unit valves are the same as the default ibidi medium tubing |
| Motion Studio Software | Idtvision | 2.15.00 | to make the high speed time lapse images for stretch monitoring |
| Needle (19G) | BD Microlance | 301700 | together with thin flexible tubing used to fill the hydraulic reservoir with ultrapure water without adding air bubbles |
| Needle driver | Adson | 2429218 | to handle the needle of the nylon suture through the silicone tube (autoclave at step 1, step 7) |
| Paper tissues | Kleenex | 38044001 | for cleaning of the equipment with 70% ethanol |
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | quick fix if leakage occurs |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Lonza | DE17-602E | cell culture medium supplement; prevent bacterial contamination |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P4417-100TAB | for storage and washing steps (autoclave at step 1) |
| Plastic containers (60 mL) with red screw caps | Greiner | 206202 | to prepare the fibrinogen solution |
| Pneumatic cylinder | Festo | AEVC-20-10-I-P | to actuate the Teflon bellow (clean with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7) |
| Polycaprolactone bisurea (PCL-BU) tubular scaffolds (3 mm inner diameter, 200 µm wall thickness, 20 mm length) | SyMO-Chem, Eindhoven, The Netherlands | n.a. | produced using electrospinning from 15% (w/w) chloroform (Sigma; 372978) polymer solutions. See Van Haaften et al Tissue Engineering Part C (2018) for more details |
| Pressure conduit without holes (for static control) | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | to mount electrospun tubes on silicon tubing (autoclave at step 1, step 7) |
| Pressure sensor and transducer | BD | TC-XX and P 10 EZ | the air pressure going to the pneumatic actuated pump is raised until it reaches the set pressure |
| Proportional air pressure control valve and pressure sensor | Festo | MPPES-3-1/8-2-010, 159596 | provides compressed air to the pneumatic actuated pump |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) | Gibco | A1049101 | cell culture medium for monocyte/macrophage |
| Safe lock Eppendorf tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | multiple applications (autoclave at step 1) |
| Sodium dodecyl sulfate solution 20% | Sigma | 5030 | Used to clean materials, at a concentration of 0.1%. |
| Silicone O-rings | Technirub | 1250S | to prevent leakage (autoclave at step 1, step 7) |
| Silicone tubing (2.8 mm outer diameter, 400 um wall thickness) | Rubber BV | 1805 | to mount the electrospun tubes on the pressure conduits (autoclave at step 1) |
| Sterile tube (15 mL) | Falcon | 352095 | multiple applications |
| Suture, 5-0 prolene with pre-attached taper point needle | Ethicon, Johnson&Johnson | EH7404H | Prolene suture wire 5-0 (75cm length, TF taper point needle, 1/2 circle, 13 mm needle length) |
| Syringe (24 mL) | B. Braun Melsungen AG | 2057932 | to add the ultrapure water or medium to the hydraulic reservoir or flow culture chamber |
| Syringe filter (0.2 µm) | Satorius | 17597-K | to filter the fibrinogen solution |
| T150 cell culture flask with filter cap | Nunc | 178983 | to degas culture medium |
| T75 Cell culture flask with filter cap | Nunc | 156499 | to culture static control samples |
| Teflon bellow | Custom made, Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology | n.a. | to load the hydraulic reservoir (clean outside with a paper tissue with 70% ethanol at step 1 and 7) |
| Tray (stainless steel) | PolarWare | 15-248 | for easy transport of the fluidic culture chambers and the bioreactor from incubator to laminar flow cabinet and back (clean with a paper tissue with 70% ethanol before and after use) |
| Tweezers | Wironit | 4910 | sterile handling of individual parts (autoclave at step 1 and 7) |
| Ultrapure water | Stakpure | Omniapure UV 18200002 | to correct for medium evaporation, mixed with aqua stabil mixed and used as hydraulic fluid. (autoclave ultrapure water at step 1) |
| UV light | Philips | TUV 30W/G30 T8 | for decontamination of grafts and bioreactor parts before seeding |
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