Summary
Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.
Abstract
Die Erfassung der dynamischen Replikations- und Assemblierungsprozesse von Viren wurde durch den Mangel an robusten In-situ-Hybridisierungstechnologien (ISH) behindert, die eine empfindliche und gleichzeitige Markierung von viraler Nukleinsäure und -protein ermöglichen. Herkömmliche Methoden der DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sind oft nicht mit der Immunfärbung kompatibel. Wir haben daher einen bildgebenden Ansatz entwickelt, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of D NA, RNA and protein), der die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von DNA, RNA und Protein ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Fischen verwendet micddrp die verzweigte DNA (bDNA) ISH-Technologie, die die Empfindlichkeit und Detektion von Oligonukleotidsonden drastisch verbessert. Kleine Modifikationen von MICDDRP ermöglichen die Abbildung viraler Proteine gleichzeitig mit Nukleinsäuren (RNA oder DNA) unterschiedlicher Litze. Wir haben diese Protokolle angewendet, um die Lebenszyklen mehrerer viraler Krankheitserreger zu untersuchen, darunter das humane Immundefizienzvirus (HIV)-1, das humane T-lymphotrope Virus (HTLV)-1, das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das Zika-Virus (ZKV) und das Influenza-A-Virus (IAV). Wir haben gezeigt, dass wir virale Nukleinsäuren und Proteine über eine Vielzahl von Viren hinweg effizient markieren können. Diese Studien können uns ein verbessertes mechanistisches Verständnis mehrerer viraler Systeme liefern und dienen darüber hinaus als Vorlage für die Anwendung der Multiplex-Fluoreszenzbildgebung von DNA, RNA und Protein in einem breiten Spektrum zellulärer Systeme.
Introduction
Während Tausende von kommerziellen Antikörpern verfügbar sind, um Proteine über konventionelle Immunfärbungsansätze spezifisch zu markieren, und während Fusionsproteine mit photooptimierten fluoreszierenden Tags zur Verfolgung mehrerer Proteine in einer Probe hergestellt werden können1, ist die mikroskopische Visualisierung von Proteinen oft nicht kompatibel mit der herkömmlichen DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)2 . Technische Einschränkungen bei der gleichzeitigen Visualisierung von DNA, RNA und Protein mit fluoreszenzbasierten Ansätzen haben ein tiefes Verständnis der Virusreplikation behindert. Die Verfolgung von viraler Nukleinsäure und Protein während der Infektion ermöglicht es Virologen, grundlegende Prozesse zu visualisieren, die der Replikation und Assemblierung von Viren zugrunde liegen 3,4,5,6.
Wir haben einen bildgebenden Ansatz entwickelt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)3, der verzweigte DNA (bDNA) in situ Technologie verwendet, um die Empfindlichkeit der Nukleinsäuredetektion zu verbessern 7,8,9 . Darüber hinaus verwendet diese Methode gepaarte Sonden für eine verbesserte Spezifität. bDNA-sequenzspezifische Sonden verwenden verzweigte Vorverstärker- und Verstärker-DNAs, um ein intensives und lokalisiertes Signal zu erzeugen und frühere Hybridisierungsmethoden zu verbessern, die auf wiederholten Regionen in der DNA beruhten9. Infizierte Zellen in einem klinischen Kontext enthalten oft kein reichlich vorhandenes virales genetisches Material, was eine Ware für eine empfindliche Methode zum Nachweis fluoreszierender Nukleinsäure in diagnostischen Umgebungen darstellt. Die Kommerzialisierung der bDNA-Technologie durch Ansätze wie RNAscope7 und ViewRNA10 hat diese Nische gefüllt. Die Empfindlichkeit der bDNA-Fluoreszenzbildgebung hat auch einen wichtigen Nutzen in der Zellbiologie, da sie den Nachweis seltener Nukleinsäurespezies in Zellkulturmodellen ermöglicht. Die enorme Verbesserung der Empfindlichkeit macht bDNA-basierte Bildgebungsverfahren für die Untersuchung von Viren geeignet. Ein mögliches Manko ist jedoch, dass sich diese Methoden auf die Visualisierung von RNA oder RNA und Protein konzentrieren. Alle replizierenden Zellen und viele Viren haben DNA-Genome oder bilden während ihres Replikationszyklus DNA, was Methoden, die sowohl RNA und DNA als auch Protein abbilden können, sehr wünschenswert macht.
Im MICDDRP-Protokoll führen wir bDNA-FISH zum Nachweis viraler Nukleinsäure mit der RNAscope-Methode mit Modifikationen7 durch. Eine der wichtigsten Änderungen an diesem Protokoll ist die Optimierung der Proteasebehandlung nach chemischer Fixierung. Die Proteasebehandlung erleichtert die Entfernung von Proteinen, die an Nukleinsäure gebunden sind, um die Effizienz der Sondenhybridisierung zu verbessern. Auf die Proteasebehandlung folgt die Inkubation mit verzweigten Oligonukleotidsonden. Nach dem Auftragen der bDNA-Sonde(n) werden die Proben gewaschen und anschließend mit Signalvorverstärker- und Verstärker-DNAs inkubiert. Die multiplexierte In-situ-Hybridisierung (ISH), die Markierung mehrerer Gentargets, erfordert Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen für die spektrale Differenzierung7. Auf die Inkubation mit DNA-Verstärkern folgt die Immunfluoreszenz (IF).
bDNA ISH bewirkt Verbesserungen des Signal-Rauschens durch Verstärkung zielspezifischer Signale, mit einer Reduktion des Hintergrundrauschens von unspezifischen Hybridisierungsereignissen 7,11. Zielsonden werden unter Verwendung öffentlich zugänglicher Softwareprogramme entworfen, die die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungsereignisse vorhersagen und die Schmelztemperatur (Tm) des Sonden-Ziel-Hybrids 7,11 berechnen. Zielsonden enthalten eine 18- bis 25-Basen-Region, die komplementär zur Ziel-DNA/RNA-Sequenz ist, eine Spacer-Sequenz und eine 14-Basen-Schwanzsequenz. Ein Paar Zielsonden, jede mit einer bestimmten Schwanzsequenz, hybridisiert zu einer Zielregion (über ~ 50 Basen). Die beiden Schwanzsequenzen bilden eine Hybridisierungsstelle für die Vorverstärkersonden, die 20 Bindungsstellen für die Verstärkersonden enthalten, die zusätzlich 20 Bindungsstellen für die Markierungssonde enthalten. Zum Beispiel wird eine Region von einer Kilobase (kb) auf dem Nukleinsäuremolekül von 20 Sondenpaaren anvisiert, wodurch ein molekulares Gerüst für die sequentielle Hybridisierung mit dem Vorverstärker, dem Verstärker und der Markierungssonde entsteht. Dies kann somit zu einer theoretischen Ausbeute von 8000 fluoreszierenden Markierungen pro Nukleinsäuremolekül führen, was den Nachweis einzelner Moleküle und enorme Verbesserungen gegenüber herkömmlichen FISH-Ansätzen ermöglicht7 (siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung der bDNA-Signalamplifikation). Um Sonden für gemultiplextes ISH einzurichten, muss sich jede Zielsonde in einem anderen Farbkanal befinden (C1, C2 oder C3). Diese Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen besitzen unterschiedliche 14-Basen-Schwanzsequenzen. Diese Schwanzsequenzen binden unterschiedliche Signalverstärker mit verschiedenen Fluoreszenzsonden und ermöglichen so eine einfache spektrale Differenzierung über mehrere Ziele hinweg. Im vorgestellten Protokoll enthält Tabelle 4 in Schritt 9 weitere Informationen zu fluoreszenzmarkierenden Zielsonden. Darüber hinaus zeigen Abbildung 2 und Abbildung 3 Beispiele, wie wir den geeigneten Verstärker 4-FL (A, B oder C) (Fluoreszenzsonde und den letzten Hybridisierungsschritt) ausgewählt haben, um eine spezifische fluoreszierende Markierung mehrerer viraler Nukleinsäureziele nach HIV-1- und HTLV-1-Infektionen zu erreichen.
Wir haben mehrere Anwendungen der simultanen Fluoreszenzvisualisierung von RNA, DNA und Proteinen demonstriert und kritische Stadien der Virusreplikation mit hoher raumzeitlicher Auflösung 3,4,5 beobachtet. Zum Beispiel hat uns die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von viraler RNA, zytoplasmatischer und nukleärer DNA und Proteinen ermöglicht, Schlüsselereignisse während der HIV-1-Infektion zu visualisieren, einschließlich der Verfolgung von RNA-haltigen Kernen im Zytoplasma vor dem Kerneintritt und der Integration von proviraler DNA3. Darüber hinaus haben wir MICDDRP angewendet, um die Auswirkungen von Wirtsfaktoren und medikamentöser Behandlung auf Virusinfektionen und Replikation zu charakterisieren 4,5. In Ukah et al. verfolgten wir die Reaktivierung der HIV-1-Transkription in Latenzzellmodellen, die mit verschiedenen Latenzumkehrern behandelt wurden, um die HIV-Transkription und die Latenzumkehrung 4 zu visualisieren. Darüber hinaus kann MICDDRP es uns ermöglichen, phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit antiviraler Hemmung zu visualisieren, die auf die Behandlung kleiner Moleküle oder die Einschränkung des Wirtsfaktors zurückzuführen sind. Als Proof of Concept für die Robustheit und breite Anwendbarkeit unseres Ansatzes haben wir gezeigt, dass wir Modifikationen unseres Protokolls verwenden können, um virale Nukleinsäure effizient zu markieren, um Infektionen nicht nur im humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1, sondern auch im humanen T-lymphotropen Virus (HTLV)-1, Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Zika-Virus (ZIKV) und Influenza-A-Virus (IAV). Da der HIV-1-Lebenszyklus sowohl aus viraler DNA als auch aus RNA-Spezies besteht, haben wir den Großteil unserer Optimierung von MICDDRP nach HIV-1-Replikationskinetik durchgeführt. Darüber hinaus haben wir jedoch gezeigt, dass wir die Synthese verschiedener viraler RNA-Transkripte von einem oder beiden Sense- (+) und Antisense- (-) Strängen in Viren wie ZIKV, IAV, HBV und HCV verfolgen können, um die virale Transkription und Replikation zu überwachen 3,4,5,6. Die Studien zielen darauf ab, das mechanistische Verständnis mehrerer viraler Prozesse zu verbessern und dienen als Richtlinie für die Implementierung dieser Fluoreszenzbildgebungstechnologie auf ein breites Spektrum von Zellmodellen.
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Protocol
1. Samenzellen (Suspension vs. Adhärent Cells) auf Deckgläsern oder Kammerobjektträgern (vorgestelltes Protokoll verwendet Deckgläser).
- Aussaat von Suspensionszellen
- Bereiten Sie mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtete Deckgläser vor (erleichtert die Anhaftung von Suspensionszellen an Deckglas), indem Sie zuerst Deckgläser in Ethanol (EtOH) für 5 Minuten inkubieren (sterilisiert Deckgläser und entfernt alle Rückstände). Anschließend 2x in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, bevor Deckgläser in PDL (20 μg/ml) für 30 Minuten (min) bei Raumtemperatur (RT) inkubiert werden.
- PDL entfernen und 2x in PBS waschen. Pelletzellen (zuvor infiziert/behandelt basierend auf den gewünschten Bildgebungsbedingungen) und resuspendieren 106Zellen in 50 μL PBS. 50 μL Zellen auf Glas (PDL-beschichtet) eintauchen und bei RT 30 min inkubieren.
- Aussaat von adhärenten Zellen
- Kulturzellen auf sterilem Deckglas in 6-Well-Schale und infizieren Zellen mit viralen Partikeln oder behandeln mit Verbindung von Interesse. Lassen Sie die Zellen vor der Probenvorbereitung für bildgebende Experimente eine Konfluenz von 50-70% erreichen.
2. Zelluläre Fixierung: Zur Erhaltung der Zellmorphologie für Fluoreszenzbildgebungsstudien
HINWEIS: Halten Sie 4% PFA und PBS mindestens 30 Minuten vor der zellulären Fixierung bei RT.
- Die zellulären Medien absaugen, Zellen auf Deckgläsern 3x in PBS waschen und Zellen in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min fixieren. PFA absaugen und Zellen in PBS 2x waschen.
HINWEIS: Zellen können nun dehydriert und gelagert werden, wenn der Experimentator das Experiment zu einem anderen Zeitpunkt fortsetzen möchte. Fixierte Zellen können vor der Lagerung in EtOH dehydriert werden.- Entfernen Sie PBS nach dem Waschen nach zellulärer Fixierung und ersetzen Sie es durch 500 μL 50% EtOH (v/v in Wasser). Inkubieren bei RT für 5 min.
- Entfernen Sie 50% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 70% EtOH. Inkubieren bei RT für 5 min.
- Entfernen Sie 70% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 100% EtOH. Inkubieren bei RT für 5 min.
- Entfernen Sie 100% EtOH und ersetzen Sie es durch frisches 100% EtOH.
HINWEIS: Dehydrierte Zellen können bei -20 °C für 6 Monate gelagert werden. Versiegeln Sie die Platten vor der Lagerung mit Klebeband oder Parafilm, um das Verdampfen von EtOH zu verhindern. - Rehydrieren Sie die Zellen, um zur multiplexten Fluoreszenzmarkierung von Zellen / Viren überzugehen.
- Entfernen Sie 100% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 70% EtOH. Inkubieren bei RT für 2 min.
HINWEIS: Lassen Sie die Zellen zu keiner Zeit austrocknen. Verwenden Sie immer genügend Lösung, um alle Zellen einzutauchen. - Entfernen Sie 70% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 50% EtOH. Inkubieren bei RT für 2 min.
- Entfernen Sie 50% EtOH und ersetzen Sie es durch 1x PBS.
HINWEIS: Bereiten Sie Proteaseverdünnung, Hybridisierungssonden und Waschpuffer vor der Proteasebehandlung (Schritt 4) und der Zielsondenanwendung (Schritt 5) vor. Spezifische Anweisungen zur Reagenzienzubereitung finden Sie zu Beginn jedes jeweiligen Schritts.
| Reagenzien | Sonstige Anmerkungen |
| Protease-Lösung | Vorbereiten in 1X PBS |
| Ziel-Oligonukletodie-Sonde(n) | Verdünnung im Hybridisierungspuffer |
| Waschpuffer | Wascht nach Zielhybridisierungsschritten |
| Hybridisierungspuffer | Rezept in Tabelle 3 |
Tabelle 1: Schlüsselreagenzien im MICDDRP-Protokoll.
3. Zellpermeabilisierung: Erhöht den Zugang in die Zelle und zellulären Organellen für den Eintritt großer Moleküle (Antikörper, Nukleinsäure-Hybridisierungssonden)
- Entfernen Sie 1x PBS nach zellulärer Fixierung oder Rehydratation und ersetzen Sie es durch 500 μL 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Inkubieren bei RT für 10 min. Ersetzen Sie eins nach dem anderen. Einmal mit 500 μL 1x PBS waschen und frisches 1x PBS hinzufügen.
4. Deckglasimmobilisierung auf Objektträger und Proteasebehandlung zur Entfernung von Nukleinsäure-bindenden Proteinen aus fixierter viraler/zellulärer Nukleinsäure zur Verbesserung der Hybridisierungseffizienz
HINWEIS: Bereiten Sie die verdünnte Protease III-Lösung (siehe Besonderheiten des Reagenzes in der Materialtabelle) während der zellulären Permeabilisierung vor. Lassen Sie die Protease vor der Permeabilisierung 10 Minuten lang RT erreichen.
- Legen Sie einen kleinen Tropfen Nagellack auf einen sterilisierten Glasobjektträger. Trocknen Sie den Rücken (Seite ohne Zellschicht) und legen Sie den Rand des Deckglases auf den Nagellacktropfen, wobei die Seite mit den verklebten Zellen nach oben zeigt. Fügen Sie einige Tropfen PBS auf das immobilisierte Deckglas hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Zeichnen Sie einen Kreis (ca. 3 mm vom Deckglas entfernt) um den Umfang des Deckglases, das jetzt mit einem hydrophoben Barrierestift (wasserabweisender Stift, der Reagenzien auf Zellen lokalisiert) auf dem Objektträger haftet.
- Verdünnte Protease III in 1x PBS (100 μL/Deckglas).
HINWEIS: Die Proteasekonzentration muss möglicherweise in Abhängigkeit von Unterschieden in Zelltypen, Sonden oder Zielnukleinsäure(n) durch empirische Optimierung angepasst werden (siehe Diskussion). Für die effizienteste RNA/DNA-Markierung über verschiedene Virussysteme hinweg hatten wir Erfolg mit den folgenden Verdünnungen in Tabelle 2 unten mit Verdünnungen von (1 bis 2)-(1 bis 15) (Protease bis 1x PBS).
| Sondenziele | Proteaseverdünnung in 1X PBS (Protease III bis 1X PBS) |
| HIV-1 DNA/RNA | 1 bis 5 |
| HTLV-1 DNA/RNA | 1 bis 5 |
| HBV-pgRNA und Gesamt-HBV-RNA | 1 bis 15 |
| IAV-RNA | 1 bis 15 |
| ZIKV-RNA | 1 bis 2 |
Tabelle 2: Protease III-Verdünnungen in PBS für die virale Nukleinsäurehybridisierung.
- Dekantieren Sie das 1x PBS nach der Immobilisierung auf dem Deckglas und tragen Sie die verdünnte Protease III auf.
- In einem befeuchteten Ofen bei 40 °C für 15 min inkubieren.
- Dekantieren Sie Proteaselösung und tauchen Sie Objektträger in 1x PBS. Mit einer Schaukelschale 2 min bei RT rühren. Wiederholen Sie das Waschen mit dem neuen 1x PBS.
- Für den DNA-Nachweis werden die Proben dreimal mit nukleasefreiem Wasser für jeweils 2 min gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit 5 mg/ml RNase A, verdünnt in PBS für 30 min bei 37 °C.
- Dekantieren Sie RNase A-Lösung und waschen Sie 3x für 2 min mit Reinstwasser. Fahren Sie mit ISH der Zielsonde(n) fort.
HINWEIS: Hybridisierungspuffer verbessert die vDNA-Erkennung, ohne die vRNA-Färbeeffizienz für die vorgestellten Ergebnisse zu beeinträchtigen (repräsentative Ergebnisse). Verdünnte DNA Kanal 1 (C1) Sonden 1:1 mit Hybridisierungssonde. Verdünnte RNA C2- und C3-Sonden im Hybridisierungspuffer. Die in unseren bildgebenden Untersuchungen verwendeten C2- und C3-Sonden befinden sich in 50X-Lösungen (1:50; Zielsonde zu Hybridisierungspuffer).
- Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer in nukleasefreiem Wasser nach dem folgenden Schritt-für-Schritt-Verfahren vor:
- In einem 15-ml-Röhrchen werden 700 μL Nuklease-freies Wasser, 300 μL 50% (Gewicht/Volumen (w/v)) Dextransulfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM Natriumcitrat (pH 6,2) und 375 mg (Pulver) Ethylencarbonat hinzugefügt.
- Mischen Sie gut mit einem Wirbel, um Ethylencarbonat aufzulösen (stellen Sie sicher, dass das gesamte Pulver gelöst und klar gelöst ist).
- Fügen Sie 25 μL von 10% (Volumen / Volumen (v / v)) Tween-20 und genügend nukleasefreies Wasser hinzu, um 2,5 ml (2x Lösung) zu vervollständigen.
HINWEIS: Das Rezept für den Hybridisierungspuffer finden Sie in Tabelle 3 unten. Die Lösung ist für eine Woche stabil. Stellen Sie sicher, dass Tween-20-Reinigungsmittel ausreichend gemischt wird, und achten Sie darauf, ein Sprudeln der Lösung zu vermeiden.
| Reagenz | Bestandskonzentration | Zusätzliche Hinweise |
| Nukleasefreies Wasser | NA | |
| Dextransulfat | 50% (w/v) | Sehr viskos |
| Natriumchlorid | 5 M | |
| Natriumcitrat (pH 6,2) | 200 mM | Bei 4 °C lagern |
| Ethylencarbonat | NA | Pulver |
| Tween-20 | 10% (v/v) |
Tabelle 3: Hybridisierungspufferliste der Reagenzien.
5. Inkubation mit DNA/RNA-Zielhybridisierungssonden: Ziel-Oligonukleotid-Sonden binden an interessierende Regionen und erzeugen ein molekulares Gerüst für Vorverstärker, Verstärker und Fluoreszenzsonden zum Binden.
HINWEIS: Warme DNA/RNA-Sonden bei 40 °C für 10 min (während der Zellpermeabilisierung) und kühlen für mindestens 10 min auf RT ab, wenn keine RNase-Behandlung enthalten ist. Wenn vor der Hybridisierung der Zielsonde eine RNase-Behandlung oder eine weitere Probenbehandlung erforderlich ist, werden die Sonden entsprechend warm. C2- und C3-Sonden nach dem Erwärmen herunterdrehen und im Hybridisierungspuffer verdünnen. Nach der Verdünnung können C2- und C3-Sonden kurz erwärmt werden. 50x Waschpuffer (siehe Materialtabelle ) bei 40 °C für 10-20 min erwärmen und auf 1x in molekularbiologischem Wasser verdünnen.
- 200 μL des Hybridisierungspuffers bei 67 °C für 10 min vor Zugabe der Hybridisierungssonde(n) inkubieren. Verdünnte Sonde im Hybridisierungspuffer (Rezept in Tabelle 2 aufgeführt). Fügen Sie 50 μL/Deckglas hinzu.
- Im befeuchteten Ofen bei 40 °C für 2 Stunden (h) inkubieren. Dekantsonden und Tauchschlitten in 1x Waschpuffer. Rühren, indem Sie die Schale für 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.
6. Verstärker (Amp) 1-FL Hybridisierung: Hinzufügen eines Vorverstärkers, der komplementär zur Schwanzsequenz der Ziel-DNA/RNA-Sonden ist (Schritt 5)
HINWEIS: Verstärker sollten vor dem Gebrauch auf RT sein. Holen Sie jeden einzelnen Verstärker 30 Minuten vor Gebrauch aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn bei RT auf der Bank.
- Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Fügen Sie 1 Tropfen Amp 1-FL auf das Deckglas hinzu. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C 30 min inkubieren.
- Decant Amp 1-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.
7. Amp 2-FL Hybridisierung: Inkubation mit Signalverstärker mit verwandter Erkennungssequenz zu Vorverstärkern (Amp 1-FL)
- Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Fügen Sie 1 Tropfen Amp 2-FL auf das Deckglas hinzu. Im Befeuchtungsofen bei 40 °C 15 min inkubieren.
- Decant Amp 2-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.
8. Amp 3-FL Hybridisierung: Inkubation mit zweitem Signalverstärker
- Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Fügen Sie 1 Tropfen Amp 3-FL auf das Deckglas hinzu. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C 30 min inkubieren.
- Decant Amp 3-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.
9. Amp 4-FL Hybridisierung: Fluoreszierende Markierung und letzter Hybridisierungsschritt
HINWEIS: In Tabelle 4 können Sie zunächst den geeigneten Amp 4 (A, B oder C)- FL basierend auf den Kanälen der Zielsonde(n) auswählen. Beurteilen Sie, welcher Amp 4-FL benötigt wird, um DNA / RNA von Interesse zu markieren. Ein Beispiel finden Sie in der folgenden Tabelle:
| Ein | B | C | |
| DNA-Kanal 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| DNA/RNA Kanal 2 (C2) | 550 | 488 | 647 |
| RNA-Kanal 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabelle 4: Auswahl der Amp 4 (A, B oder C)-FL Fluoreszenzsonde für gemultiplexte ISH.
HINWEIS: Für gemultiplexte FISH (mehrere Ziele) ist die Auswahl des richtigen Amp 4 (A, B oder C)- FL entscheidend für die korrekte Kennzeichnung Ihres Ziels von Interesse. Zielsonden (Schritt 5) haben unterschiedliche Farbkanäle (C1, C2 oder C3), die ihre jeweilige fluoreszierende Markierung (Alexa 488, Atto 550 oder Alexa 647) bestimmen, basierend auf dem gewählten Amp 4-FL. Beispiele für die Auswahl von Fluorophorkombinationen für die Multiplexbildgebung finden Sie in den Legenden von Abbildung 2 und Abbildung 3. Als weiteres Beispiel wird die Auswahl von Amp 4B-FL selektiv DNA-C1-Sonden mit Atto 550 und RNA-C3-Sonden mit Alexa 647 markieren.
- Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Fügen Sie 1 Tropfen Amp 4-FL auf das Deckglas hinzu. Im Befeuchtungsofen bei 40 °C 15 min inkubieren.
HINWEIS: Bewahren Sie nach Schritt 9.2 die Proben bedeckt und vor Licht geschützt auf. - Decant Amp 4-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale für 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer. Mit 1x PBS waschen (2 min) und in PBS lagern.
10. Proteinimmunfärbung: Zur Markierung von Protein(en) von Interesse
- Dekantieren Sie PBS und geben Sie 200 μL Blockierpuffer (1% w/v BSA, 10% v/v FBS in PBS mit 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) zum Deckglas. Inkubation 1 h bei RT.
- Dekant blockierenden Puffer und 200 μL primären Antikörper verdünnt in PBST + 1% w/v BSA auftragen. Inkubation 1 h bei RT.
- Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBST für 10 min bei RT mit Schütteln.
- Wenden Sie sekundäre Antikörper Ihrer Wahl für 1 h bei RT in PBST + 1% w/v BSA an.
- Waschen Sie den Objektträger mit PBST für 10 min bei RT mit Schütteln.
11. Kernfärbung: Gegenfärbungskerne nach Immunfärbung
- Dekantieren Sie PBST und tragen Sie DAPI oder Kernfärbung Ihrer Wahl für 1 min bei RT auf.
- Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBS für 10 min bei RT mit Schütteln.
12. Montage
- Geben Sie 1 Tropfen Antifade-Lösung (z. B. Prolong Gold) auf den neuen sterilen Objektträger (zuerst den Objektträger mit EtOH reinigen und trocknen lassen, um sicherzustellen, dass sich keine Rückstände auf dem Glas befinden). Verteilen Sie mit derselben Spitze den Antifade-Lösungstropfen, um einen Bereich von der Größe des Deckglases zu bedecken.
HINWEIS: Die Antifade-Lösung ist sehr viskos und kann schwierig zu pipetten sein. Das Abschneiden der Spitze einer 200-μL-Spitze vor dem Pipettieren kann diese Probleme mildern. - Entfernen Sie Deckglas mit Zellprobe vom Objektträger und tauchen Sie in PBS ein, um den restlichen Nagellack auf der Rückseite mit der Pinzette und PBS zu entfernen. Trocknen Sie die Pinzette und die Rückseite des Deckglases mit einem Kimwipe.
- Deckglas vorsichtig in den Tropfen der Antifade-Lösung einbetten und Probenseite (Seite mit Zellschicht) des Deckglases auf Tropfen legen).
- Proben über Nacht trocknen lassen.
13. Bildgebung
- Bild mit einem Epifluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung von MICDDRP. Auf die Markierung von DNA und RNA folgt die Immunfärbung. Die Verwendung von Verzweigungsverstärkern erhöht das Signal und ermöglicht den Nachweis einzelner Nukleinsäuremoleküle.
Abbildung 1: Schematische Darstellung von MICDDRP und Schritt-für-Schritt-Workflow. (A) Das bDNA-Signal wird über verzweigte Vorverstärker- und Verstärker-DNAs verstärkt, um den Nachweis viraler DNA (1) und RNA-Spezies (2) zu verbessern. Oligonukleotidsonden werden paarweise (ZZ im Schaltplan) zu interessanten Zielen hybridisiert, wodurch ein Gerüst für Vorverstärker (Amp 1-FL, Schritt 6 im Protokoll), Verstärker (Amp 2- & 3-FL) und Fluoreszenzsonden (Amp 4, Schritt 9 im Protokoll) entsteht. In Tabelle 4 finden Sie Informationen zur Auswahl geeigneter Amp 4 (A,B oder C)-FL für gemultiplextes ISH. Auf die Markierung der Nukleinsäure folgen immunfärbende Proteine von Interesse (3). (B) Dreizehn Hauptschritte im MICDDRP-Protokoll mit Schätzung der Zeitdauer für jeden einzelnen Schritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Anwendung von MICDDRP zur Untersuchung des Verlaufs einer HIV-1-Infektion war ein nützliches Werkzeug bei der Verfolgung der viralen Replikationskinetik in Primärzellen. Als Proof of Concept dieses Verfahrens werden HIV-1 DNA, RNA und Protein gleichzeitig auf Einzelzellebene markiert und mikroskopisch sichtbar gemacht (Abbildung 2). Zwei HIV-1-DNA-Genome werden in einer einzigen Zelle visualisiert, da sie aktiv virale RNA (vRNA) transkribieren. vRNA wurde durch den Kernporenkomplex exportiert und virales Protein wird im Zytoplasma synthetisiert.
Abbildung 2: MICDDRP von primären mononukleären Blutzellen (PMBCs), die mit HIV-1 infiziert sind. PMBCs, die mit HIV-1 (NL4.3) bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 2 infiziert sind. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion (hpi) fixiert. (A) HIV-1 bDNA FISH-Sonde (markiert mit ATTO 550; rot in der Abbildung). Diese Sonde hybridisiert mit dem vDNA-Strang der Vorlage (3'<—5'), um Übersprechen mit Sinn (+) vRNA zu verhindern. (B) Unspleißte HIV-1-RNA (markiert mit Alexa 647; grün in der Abbildung). Die HIV-1-vRNA-Sonde hybridisiert mit viralen Transkripten, die in der 5'->3'-Orientierung transkribiert werden. (C) Immunfärbung des HIV-1-Kapsids (p24) -Proteins (sekundärer Antikörper konjugiert mit Alexa 488; weiß in der Abbildung). (D) Zusammengeführtes Bild. Der Maßstabsbalken stellt 5 μm dar. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) angefärbt. Um HIV-1-DNA (DNA-C1-Sonde) mit ATTO 550 bzw. HIV-1-RNA (RNA-C3-Sonde) mit Alexa 647 zu markieren, wurden die Proben mit Amp 4-FL 'B' inkubiert (siehe Tabelle 4 im Protokoll , um geeignete Kanalfarben für Hybridisierungssonden auszuwählen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Darüber hinaus haben wir duale virale DNA (vDNA) und vRNA-Färbung durchgeführt, um einer HTLV-1-Infektion zu folgen. Zur Optimierung der Nukleinsäuremarkierung haben wir uns eng an das vDNA/VRNA-Färbeverfahren gehalten, das für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung von HIV-Infektionen entwickelt wurde. Wir haben gezeigt, dass wir HTLV-1-DNA und RNA gleichzeitig spezifisch markieren können.
Abbildung 3: Gleichzeitige Markierung von HTLV-1 vDNA und vRNA in MT-2 Zellen. (A) HTLV-1 vDNA (markiert mit ATTO 550; rot in der Abbildung) (B) Unspliced HTLV-1 sense (+) RNA (RNA C2 Sonde & markiert mit Alexa 488; grün in der Abbildung)). (C) HTLV-1 HBZ Antisense (-) vRNA (RNA C3 Sonde & (markiert mit Alexa 647; weiß in der Abbildung)). (D) Zusammengeführtes Bild. Der Maßstabsbalken stellt 20 μm dar. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) angefärbt. Amp 4-FL 'B' wurde verwendet (siehe Tabelle 4 im Protokoll), um eine gemultiplexte Markierung von HTLV-1 ('+' & '-') RNA zu erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Kontrollexperimente zur Beurteilung der Spezifität und des Hintergrunds der Zielsonde. Die Spezifität der HIV-1- und HTLV-1-Zielsonden wurde nach einer Infektion in lymphozytären Zelllinien (nicht infizierte Jurkat-T-Zellen, HTLV-1-infizierte Zellen (MT2) und HIV-1-infizierte Zellen (H9111B)) untersucht. Maßstabsbalken repräsentieren 10 μm. (A) Die Zellen wurden mit HTLV-1-RNA-Sonden behandelt. (B) Die Zellen wurden mit einer HIV-1 (+) RNA-Sonde (C-D) behandelt. Ein weiterer Nachweis der Spezifität von HTLV-1-Sonden ohne Kreuzreaktivität mit HIV-1. Weiße Pfeile in Abbildung 4C bezeichnen HTLV-1-DNA (rot). (E-F). vRNA-Färbung (grün) +/- RNase-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Um die Spezifität der Hybridisierungssonden zu überprüfen und zu beurteilen, wie sich die ISH-Markierungsmethode auf die Effizienz der Proteinfärbung und den Gesamthintergrund auswirkt, führen wir kritische Kontrollen durch, um ein Höchstmaß an Strenge und Reproduzierbarkeit für die Experimente zu gewährleisten. Zum Beispiel überprüfen wir in Abbildung 4A-D die Spezifität unserer HIV-1 und HTLV-1 vDNA- und vRNA-Sonden, da wir sehr wenig bis keine Kreuzreaktivität zwischen den Sondensätzen über die beiden Viren zeigen. Trotz der Markierung von zwei Retroviren mit dem Potenzial für Sondenkreuzreaktivität sind die HIV-1-Sonden nur spezifisch für HIV-1-Genmaterial und nicht HTLV-1. Der gleiche Trend gilt für die HTLV-1-Sonden. Darüber hinaus zeigen wir in Abbildung 4F, dass wir die vRNA-Färbung eliminieren können, wenn wir unsere Zellen während der Probenvorbereitung mit RNase behandeln. Um die Möglichkeit einer Abschwächung der Proteinfärbungseffizienz aufgrund von ISH (Proteasebehandlung (Schritt 4 in Protokoll & Abbildung 1B) und Hybridisierungsbedingungen zu bewerten, die zu einer Ablation der Epitoperkennung oder einem erhöhten Hintergrundsignal führen können, zeigen wir, dass die Proteinfärbungseffizienz für den nuklearen Speckle-Marker sc-35 mit herkömmlichen IF-Ansätzen und Immunfärbung während des MICDDRP-Protokolls vergleichbar ist. Im herkömmlichen IF-Protokoll wurden die Zellen mit 0,1% Triton X-100 für 15 Minuten permeabilisiert, anstatt mit 0,1% Tween-20 für 10 Minuten, die im MICDDRP-Protokoll verwendet wird (Schritt 3 in Protokoll & Workflow in Abbildung 1B). Die Proteinfärbung unter beiden Bedingungen (IF vs . MICDDRP) erzeugte ein Signal, das um mehrere Größenordnungen größer war als die Kontrolle (MICDDRP ohne primären Antikörper), was den niedrigen Hintergrund, der nach diesem Protokoll erzeugt wurde, und die Erhaltung von Proteinepitopen für eine effiziente Immunfärbung weiter demonstriert. Die Bildquantifizierung der mittleren integrierten Fluoreszenzintensität des sc-35-Signals pro Zelle (Abbildung 5E) wurde wie zuvor beschriebendurchgeführt 3. Für alle gezeigten Bildgebungsergebnisse stellten wir die Sonden- und Antikörperspezifität sicher und bewerteten mögliche Störungen oder höheres Hintergrundrauschen als normal, die unserem ISH-Ansatz zugeschrieben wurden.
Abbildung 5: Vergleich der Proteinfärbungseffizienz nach konventionellem IF vs . MICDDRP. Das zelluläre Protein sc-35, ein Biomarker für nukleäre Flecken, wurde in Jurkat-T-Zellen immungefärbt. Alle Maßstabsbalken repräsentieren 10 μm. (A) Nicht infizierte Jurkat-T-Zellen durchliefen das MICDDRP-Protokoll und wurden mit HIV-1-DNA/RNA-Hybridisierungssonden behandelt, die in Abbildung 2 und Abbildung 4 oben verwendet wurden. Während der Immunfärbung wurde kein primärer Antikörper hinzugefügt. (B). Nicht infizierte Jurkat-T-Zellen wurden einer konventionellen IF unterzogen und sc-35 (weiß) markiert. Die Zellen wurden mit 0,1% Triton X-100 für 15 Minuten permeabilisiert. (C). MICDDRP wurde an HIV-infizierten Jurkat-T-Zellen durchgeführt. vRNA ist grün, vDNA rot und sc-35 weiß markiert. (D). Nahaufnahme von vRNA, vDNA und Proteinmarkierung (sc-35) in HIV-infizierten Zellen. (E) Quantifizierung des mittleren integrierten Fluoreszenzsignals pro Zelle von sc-35 über verschiedene Immunfärbungsbedingungen. Die y-Achse ist auf einer logarithmischen Skala. Die gestrichelte Linie stellt das Hintergrundsignal von nicht infizierten Zellen dar, die das MICDDRP-Protokoll durchlaufen haben, bei dem kein primärer Antikörper hinzugefügt wurde. Kein signifikanter Unterschied im Signal nach MICDDRP vs. herkömmlicher IF . Über 500 Zellen wurden zur Quantifizierung für den jeweiligen Zustand beprobt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Diese Methode kann auch angewendet werden, um RNA-Viren zu untersuchen, die DNA-Vorlagen für die virale Replikation enthalten können oder nicht. Zum Beispiel können strangspezifische bDNA-Sonden entwickelt werden, um die Expression von Sense- (+) oder Antisense-(-) Strang-RNA und verschiedenen vRNA-Spezies in Viren wie HBV, HCV, IAV und ZIKV zu überwachen. Die Visualisierung verschiedener RNA-Spezies im Verlauf einer Infektion kann Einblicke in die Replikationskinetik verschiedener viraler Systeme geben.
Folgt man dem zeitlichen Verlauf der HBV-Infektion, können wir sehen, dass die Menge an HBV-prägenomischer RNA (pgRNA) und der gesamten HBV-RNA als Funktion der Zeit zunimmt. Darüber hinaus haben wir gleichzeitig einen zellulären Wirtsfaktor, MOV10, immungefärbt (Abbildung 6).
Abbildung 6: HBV. Zeitverlauf der HBV-Infektion von 3E8-Zellen. Die Zellen wurden mit 300 HBV-Genomen pro Zelle infiziert. Die Virusreplikation wird zu drei Zeitpunkten (24, 48 und 72 hpi) gezeigt. pgRNA (markiert mit ATTO 550; rot in der Abbildung), Gesamt-HBV-RNA (markiert mit Alexa 647; grün in Abbildung) und MOV10 (sekundärer Antikörper konjugiert zu Alexa 488; weiß in Abbildung). Kerne sind mit DAPI blau gefärbt. Der Maßstabsbalken auf zusammengeführten Bildern stellt 10 μm hpi, Stunden nach der Infektion dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Bildgebung erfolgte mittels konfokaler Mikroskopie mit einem 60-fachen Ölimmersionsobjektiv. Die Anregungs-/Emissionsbandpasswellenlängen, die zur Detektion von DAPI, Alexa 488, ATTO 550 und Alexa 647 verwendet werden, wurden auf 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 bzw. 647/655-705 nm eingestellt (Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9).
Abbildung 7: Zeitverlauf der HCV-Infektion von Huh-7.5.1-Zellen. Huh-7.5.1-Zellen wurden mit dem Hepatitis-C-Virus (HCV) Jc1/Gluc2A bei einem MOI von 0,5 infiziert. In den angegebenen Zeitintervallen wurden die Zellen fixiert und sequentiell auf Sense (+) vRNA, Antisense (-) vRNA und NS5A (HCV-Protein) untersucht. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. Repräsentative zusammengeführte Bilder von jedem Zeitpunkt, die (+) RNA in grün (markiert mit Alexa 647) (-) RNA in rot (markiert mit Atto 555), NS5A in weiß (sekundäre Ziegen-Anti-Maus konjugiert mit Alexa 488) und Kerne in blau zeigen. Maßstabsbalken stellen 10 μm dar. Die unteren Bilder sind vergrößerte Ausschnitte aus dem entsprechenden Zeitpunkt. HPI, Stunden nach der Infektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Strandspezifische bDNA-FISH und Immunfärbung von A549-Zellen, die mit dem Influenza-A-Virus infiziert sind. A549-Zellen, die mit dem PR8-Grippe-A-Virus infiziert waren, wurden fixiert und auf (A) IAV-Nukleoprotein (NP) RNA (markiert mit Alexa 488; grün in der Abbildung) und (B) IAV-Polymerase-Protein (PB1) (sekundäres Ziegen-Anti-Maus-Atto 550; rot in der Abbildung) untersucht und Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. (C) Zusammengeführtes Bild. Der Maßstabsbalken stellt 10 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 9: Strandspezifische bDNA FISH in Zika-Virus (ZIKV)-infizierten Zellen. Vero-Zellen wurden mit ZIKV bei einem MOI von 0,1 infiziert. Die Zellen wurden auf 48 hpi fixiert. (A) Die Zellen wurden gleichzeitig für sense (+) vRNA (markiert mit Alexa 488; grün in der Abbildung) und antisense (-) vRNA (markiert mit Atto 550; rot in der Abbildung) gefärbt. Kerne wurden mit DAPI gefärbt. In (A) bezeichnet der weiße Kasten einen Bereich mit (+) und (-) vRNA. Die Einschübe zeigen eine Nahaufnahme von (+) vRNA (grün) und der selteneren (-) vRNA-Spezies (rot). (B) Sinn (+) vRNA (grün). (C) Antisense (-) vRNA (rot). Der Maßstabsbalken in (A) entspricht 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die gleichzeitige Visualisierung von RNA, DNA und Protein erfordert oft umfangreiche Optimierungen. Zwei häufig verwendete Methoden sind die 5-Ethinyl-2-Desoxyuridin-Markierung (EdU) und die DNA-FISH. Die EdU-Markierung wurde angewendet, um virale DNA und Protein gleichzeitig sichtbar zu machen, da EdU in naszierende DNA eingebaut und anschließend mit azidhaltigen Fluoreszenzfarbstoffen über Klickchemie markiert wird. Die EdU-Markierung kann somit verwendet werden, um die native Virusreplikationskinetik von DNA-Viren oder Viren mit DNA-Templates für die Replikationzu überwachen 12. Ein Manko der EdU-Markierung ist jedoch, dass das replizierende Genom in sich teilenden Zellen EdU enthält, was zu einer hohen Hintergrund- und verwirrenden Bildanalyse führt. DNA FISH kann diese Probleme umgehen, indem es eine Nukleinsäuresonde unabhängig vom Zellzyklus direkt zum jeweiligen Ziel hybridisiert. Konventionelle FISH verließ sich jedoch oft auf hohe Temperaturen, um eine effiziente Sondenhybridisierung zu erreichen, die die Immunfärbung oder sogar die gleichzeitige RNA-Färbung behinderte13. MICDDRP kann diese Probleme möglicherweise umgehen, indem es eine robuste simultane fluoreszierende Markierung von DNA, RNA und Protein in einer Vielzahl von zellulären Systemen bietet.
Während wir gezeigt haben, dass wir Protein und Nukleinsäure gleichzeitig mit unserem MICDDRP-Protokoll markieren können, war eine Optimierung über verschiedene Systeme hinweg erforderlich. Der erste wichtige Parameter, den wir optimieren mussten, war die Proteasebehandlung. Wir variierten die Protease-III-Konzentration über die Bedingungen hinweg. Die Optimierung der Proteasebehandlung war empirisch, da wir verschiedene Verdünnungen verwendeten, um zu beurteilen, was die größte Hybridisierungseffizienz ergab, ohne die Immunfärbungseffizienz zu beeinträchtigen. Geeignete Kontrollen wurden nebeneinander durchgeführt, um die Sondenspezifität und Veränderungen der Proteinfärbungseffizienz aufgrund der Proteasebehandlung zu bewerten. Die nächsten wichtigen Parameter, die optimiert werden mussten, waren Sondendesign und Sondenhybridisierung.
Das richtige Design von Capture- und Verstärkersonden ist entscheidend, um die Sensitivität und Spezifität der bDNA-Technologie zu erreichen. Softwarepakete, die die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungsereignisse vorhersagen, sind verfügbar, um das Sondendesign 7,11 zu verbessern. bDNA-Sonden mit den zugehörigen Vorverstärker-, Verstärker- und Fluoreszenzmarkierungssonden können jetzt kommerziell erworben werden, um die Kompatibilität mit bDNA-Bildgebungskits zu gewährleisten. Anwender können Herstellern Sequenzinformationen (~300-1000 Basenpaare) für die Zielregion(en) in Form einer Fasta-Datei (textbasiertes Format zur Darstellung der Nukleotidsequenz) zur Verfügung stellen. Zielsonden werden mit > 90%igen Sequenzhomologie zur gelieferten Sequenz erzeugt.
Für die DNA-Markierung haben wir festgestellt, dass die Verdünnung der Sonden in dem in Schritt 5 des Protokolls beschriebenen Hybridisierungspuffer die DNA-Hybridisierung verbessert. Bei der Markierung von DNA und RNA kann die RNA-Sonde im Hybridisierungspuffer verdünnt werden. Die DNA-Markierung in Abwesenheit von RNase kann nicht ausschließen, dass die beobachtete Nukleinsäure RNA der Zielstrandung enthält. Die Temperatur muss möglicherweise auch angepasst werden, um die Hybridisierungseffizienz zu verbessern. Eine Erhöhung der Temperatur kann die Effizienz der Proteinfärbung beeinträchtigen, da erhöhte Temperaturen die Proteindenaturierung fördern und die Epitoperkennung des primären Antikörpers abtragen können. In unseren vorgestellten repräsentativen Daten haben wir ISH bei 40 °C durchgeführt.
Im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Fischen bietet micddrp ein verbessertes Verfahren zur gleichzeitigen Markierung von DNA, RNA und Protein, um mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Eine mögliche Einschränkung besteht darin, dass die Auswahl der Sonde die Effizienz der Hybridisierung und die Fähigkeit, Daten zwischen Sonden quantitativ zu vergleichen, beeinflussen kann. Dieses Protokoll hat sich in verschiedenen zellulären und viralen Systemen in unseren Händen als wirksam erwiesen, wobei nur eine geringfügige Optimierung unter verschiedenen Bedingungen erforderlich war. Jüngste hochkarätige Publikationen haben unseren Ansatz genutzt, um die Auswahl der HIV-Integrationsstelle14 und die HIV-Reverse-Transkriptionskinetik15 zu untersuchen. Zukünftige Anwendungen von MICDDRP könnten die Visualisierung viraler Nukleinsäuren gleichzeitig mit Nukleinsäuresequenzen spezifischer zellulärer Gene und zellulärer Proteine umfassen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde ganz oder teilweise von den National Institutes of Health unterstützt (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 und U54 AI150472). Wir danken Dr. Raymond F. Schinazi und Sadie Amichai für die Bereitstellung von Zellen, die mit dem Influenza-A-Virus infiziert sind.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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