Summary
Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.
Abstract
La captura de los procesos dinámicos de replicación y ensamblaje de virus se ha visto obstaculizada por la falta de tecnologías robustas de hibridación in situ (ISH) que permitan el etiquetado sensible y simultáneo de ácidos nucleicos y proteínas virales. Los métodos convencionales de hibridación in situ por fluorescencia de ADN (FISH) a menudo no son compatibles con la inmunotinción. Por lo tanto, hemos desarrollado un enfoque de imagen, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein), que permite la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína en una sola célula. En comparación con los peces de ADN convencionales, MICDDRP utiliza la tecnología ISH de ADN ramificado (ADNb), que mejora drásticamente la sensibilidad y detección de la sonda de oligonucleótidos. Pequeñas modificaciones de MICDDRP permiten obtener imágenes de proteínas virales concomitantemente con ácidos nucleicos (ARN o ADN) de diferentes cadenas. Hemos aplicado estos protocolos para estudiar los ciclos de vida de múltiples patógenos virales, incluido el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus del Zika (ZKV) y el virus de la influenza A (IAV). Demostramos que podemos etiquetar eficientemente los ácidos nucleicos y las proteínas virales en una amplia gama de virus. Estos estudios pueden proporcionarnos una mejor comprensión mecanicista de múltiples sistemas virales y, además, servir como plantilla para la aplicación de imágenes de fluorescencia multiplexada de ADN, ARN y proteínas en un amplio espectro de sistemas celulares.
Introduction
Si bien hay miles de anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar específicamente las proteínas a través de enfoques convencionales de inmunotinción, y mientras que las proteínas de fusión se pueden diseñar con etiquetas fluorescentes fotooptimizadas para rastrear múltiples proteínas en una muestra1, la visualización microscópica de proteínas a menudo no es compatible con la hibridación in situ de fluorescencia de ADN convencional (FISH)2 . Las limitaciones técnicas en la visualización simultánea de ADN, ARN y proteínas utilizando enfoques basados en fluorescencia han obstaculizado la comprensión profunda de la replicación del virus. El seguimiento tanto del ácido nucleico viral como de la proteína durante el curso de la infección permite a los virólogos visualizar los procesos fundamentales que subyacen a la replicación y ensamblaje del virus 3,4,5,6.
Hemos desarrollado un enfoque de imagen, la detección dbasada en ml ultiplex immunofluorescent cell-based de DNA, RNA y Protein (MICDDRP)3, que utiliza la tecnología in situ de ADN ramificado (ADNb) para mejorar la sensibilidad de ladetección de ácidos nucleicos 7,8,9 . Además, este método utiliza sondas pareadas para mejorar la especificidad. Las sondas específicas de secuencia de ADNb utilizan ADN de preamplificador ramificado y amplificador para producir una señal intensa y localizada, mejorando los métodos de hibridación anteriores que se basaban en apuntar a regiones repetidas en el ADN9. Las células infectadas en un contexto clínico a menudo no contienen abundante material genético viral, proporcionando un producto para un método sensible para la detección de ácidos nucleicos fluorescentes en entornos de diagnóstico. La comercialización de la tecnología bDNA a través de enfoques como RNAscope7 y ViewRNA10 han llenado este nicho. La sensibilidad de las imágenes de fluorescencia de ADNb también tiene una utilidad importante en biología celular, permitiendo la detección de especies escasas de ácidos nucleicos en modelos de cultivo celular. La gran mejora de la sensibilidad hace que los métodos de imagen basados en ADNb sean adecuados para estudiar virus. Una deficiencia potencial, sin embargo, es que estos métodos se centran en la visualización de ARN o ARN y proteína. Todas las células replicantes y muchos virus tienen genomas de ADN o forman ADN durante su ciclo de replicación, lo que hace que los métodos capaces de obtener imágenes tanto de ARN como de ADN, así como proteínas, sean altamente deseables.
En el protocolo MICDDRP, realizamos bDNA FISH para la detección de ácido nucleico viral utilizando el método RNAscope, con modificaciones7. Una de las principales modificaciones de este protocolo es la optimización del tratamiento con proteasa después de la fijación química. El tratamiento con proteasa facilita la eliminación de proteínas unidas al ácido nucleico para mejorar la eficiencia de la hibridación de la sonda. El tratamiento con proteasa es seguido por la incubación con sondas de oligonucleótidos ramificados. Después de la aplicación de las sondas de ADNb, las muestras se lavan y posteriormente se incuban con ADN de preamplificador de señal y amplificador. La hibridación in situ multiplexada (ISH), el etiquetado de múltiples dianas génicas requiere sondas diana con diferentes canales de color para la diferenciación espectral7. La incubación con amplificadores de ADN es seguida por inmunofluorescencia (IF).
bDNA ISH imparte mejoras en la relación señal-ruido mediante la amplificación de señales específicas del objetivo, con una reducción del ruido de fondo de eventos de hibridación no específicos 7,11. Las sondas objetivo se diseñan utilizando programas de software disponibles públicamente que predicen la probabilidad de eventos de hibridación no específicos, así como calculan la temperatura de fusión (Tm) del híbrido sonda-objetivo 7,11. Las sondas objetivo contienen una región de 18 a 25 bases complementaria a la secuencia de ADN/ARN objetivo, una secuencia de espaciador y una secuencia de cola de 14 bases. Un par de sondas objetivo, cada una con una secuencia de cola distinta, se hibridan a una región objetivo (que abarca ~ 50 bases). Las dos secuencias de cola forman un sitio de hibridación para las sondas del preamplificador, que contienen 20 sitios de unión para las sondas del amplificador, que, además, contienen 20 sitios de unión para la sonda de etiqueta. Como ejemplo, una región de un kilobase (kb) en la molécula de ácido nucleico es objetivo de 20 pares de sondas, creando un andamio molecular para la hibridación secuencial con el preamplificador, el amplificador y la sonda de etiqueta. Por lo tanto, esto puede conducir a un rendimiento teórico de 8000 etiquetas fluorescentes por molécula de ácido nucleico, lo que permite la detección de moléculas individuales y grandes mejoras sobre los enfoques convencionales de FISH7 (Ver Figura 1A para el esquema de amplificación de señales de ADNb). Para configurar sondas para ISH multiplexado, cada sonda de destino debe estar en un canal de color diferente (C1, C2 o C3). Estas sondas objetivo con diferentes canales de color poseen distintas secuencias de cola de 14 bases. Estas secuencias de cola se unirán a distintos amplificadores de señal con diferentes sondas fluorescentes, lo que permitirá una fácil diferenciación espectral a través de múltiples objetivos. En el Protocolo presentado, la Tabla 4 en el Paso 9, proporciona más información sobre el etiquetado fluorescente de las sondas objetivo. Además, la Figura 2 y la Figura 3 proporcionan ejemplos de cómo elegimos el amplificador 4-FL (A, B o C) apropiado (sonda fluorescente y el paso final de hibridación) para lograr un etiquetado fluorescente específico de múltiples objetivos de ácido nucleico viral después de las infecciones por VIH-1 y HTLV-1.
Hemos demostrado varias aplicaciones de visualización simultánea de fluorescencia de ARN, ADN y proteínas, observando etapas críticas de replicación del virus con alta resolución espaciotemporal 3,4,5. Por ejemplo, la visualización simultánea de una sola célula de ARN viral, ADN citoplasmático y nuclear y proteínas nos ha permitido visualizar eventos clave durante la infección por VIH-1, incluido el seguimiento de núcleos que contienen ARN en el citoplasma antes de la entrada nuclear y la integración del ADN proviral3. Además, hemos aplicado MICDDRP para caracterizar los efectos de los factores del huésped y el tratamiento farmacológico sobre la infección viral y la replicación 4,5. En Ukah et al., rastreamos la reactivación de la transcripción del VIH-1 en modelos de células de latencia tratados con diferentes agentes de reversión de latencia para visualizar la transcripción del VIH y la reversión de la latencia4. Además, MICDDRP puede permitirnos visualizar cambios fenotípicos asociados con la inhibición antiviral atribuida al tratamiento de moléculas pequeñas o la restricción del factor huésped. Como prueba de concepto de la solidez y amplia aplicabilidad de nuestro enfoque, hemos demostrado que podemos utilizar modificaciones de nuestro protocolo para etiquetar eficientemente el ácido nucleico viral para seguir la infección no solo en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, sino también en el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), Virus del Zika (ZIKV) y virus de la influenza A (IAV). Como el ciclo de vida del VIH-1 consiste en especies de ADN y ARN virales, hemos realizado la mayor parte de nuestra optimización de MICDDRP siguiendo la cinética de replicación del VIH-1. Sin embargo, además, hemos demostrado que podemos rastrear la síntesis de diferentes transcripciones de ARN viral de uno o ambos nervios de sentido (+) y antisentido (-) en virus como ZIKV, IAV, HBV y VHC para monitorear la transcripción y replicación viral 3,4,5,6. Los estudios tienen como objetivo mejorar la comprensión mecanicista de varios procesos virales y servir como guía para implementar esta tecnología de imágenes de fluorescencia en una amplia gama de modelos celulares.
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Protocol
1. Células semilla (Suspensión vs. Células Adherentes) en cubreobjetos o portaobjetos de cámara (el protocolo presentado utiliza cubreobjetos).
- Siembra de células de suspensión
- Prepare cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) (facilita la adherencia de las células de suspensión al cubreobjetos) incubando primero los cubobjetos en etanol (EtOH) durante 5 minutos (esteriliza los cubreobjetos y elimina cualquier residuo). Luego lavar 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de incubar los cubobjetos en PDL (20 μg/ml) durante 30 minutos (min) a temperatura ambiente (RT).
- Retire PDL y lave 2x en PBS. Células granulares (previamente infectadas/tratadas en función de las condiciones de imagen deseadas) y resuspender 106células en 50 μL de PBS. Detectar 50 μL de células en vidrio (recubierto de PDL) e incubar a RT durante 30 min.
- Siembra de células adherentes
- Cultive células en un cubreobjetos estéril colocado en un plato de 6 pocillos e infecte las células con partículas virales o trate con un compuesto de interés. Permitir que las células alcancen una confluencia del 50-70% antes de la preparación de la muestra para los experimentos de imágenes.
2. Fijación celular: Para preservar la morfología celular para estudios de imágenes de fluorescencia
NOTA: Mantenga el 4% de PFA y PBS en RT durante al menos 30 minutos antes de la fijación celular.
- Aspire los medios celulares, lave las células en cubreobjetos 3x en PBS y fije las células en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos. Aspirar PFA y lavar las células en PBS 2x.
NOTA: Las células ahora pueden ser deshidratadas y almacenadas, si el experimentador desea reanudar el experimento en otra fecha. Las células fijas se pueden deshidratar en EtOH antes del almacenamiento.- Eliminar el PBS después del lavado después de la fijación celular y reemplazar con 500 μL de EtOH al 50% (v/v en agua). Incubar a RT durante 5 min.
- Retire el 50% de EtOH y reemplácelo con 500 μL de EtOH al 70%. Incubar a RT durante 5 min.
- Eliminar el 70% de EtOH y reemplazarlo con 500 μL de 100% de EtOH. Incubar a RT durante 5 min.
- Retire 100% EtOH y reemplácelo con 100% EtOH fresco.
NOTA: Las células deshidratadas se pueden almacenar a -20 °C durante 6 meses. Selle las placas con cinta o parafilm antes del almacenamiento para evitar la evaporación de EtOH. - Rehidratar las células para pasar al etiquetado de fluorescencia multiplexada de células / virus.
- Retire el 100% de EtOH y reemplácelo con 500 μL de EtOH al 70%. Incubar en RT durante 2 min.
NOTA: No deje que las células se sequen en ningún momento. Siempre use suficiente solución para sumergir todas las células. - Eliminar el 70% de EtOH y reemplazarlo con 500 μL de 50% de EtOH. Incubar en RT durante 2 min.
- Elimine el 50% de EtOH y reemplácelo con 1x PBS.
NOTA: Prepare la dilución de proteasa, las sondas de hibridación y el tampón de lavado antes del tratamiento con proteasa (Paso 4) y la aplicación de la sonda objetivo (Paso 5). Las instrucciones específicas sobre la preparación del reactivo se presentan al comienzo de cada paso respectivo.
| Reactivos | Otras notas |
| Solución de proteasa | Prepárese en 1X PBS |
| Sonda(s) de oligonucletodie diana | Diluir en tampón de hibridación |
| Tampón de lavado | Lavados siguiendo los pasos de hibridación objetivo |
| Tampón de hibridación | Receta presentada en la Tabla 3 |
Tabla 1: Reactivos clave en el protocolo MICDDRP.
3. Permebilización celular: Aumenta el acceso a la célula y a los orgánulos celulares para la entrada de moléculas grandes (anticuerpos, sondas de hibridación de ácidos nucleicos)
- Retire 1x PBS después de la fijación celular o rehidratación y reemplácelo con 500 μL de 0.1% (v/v) Tween-20 en 1x PBS. Incubar en RT durante 10 min. Reemplace uno por uno. Lavar una vez con 500 μL de 1x PBS y añadir 1x PBS fresco.
4. Inmovilización de cubreobjetos en portaobjetos de vidrio y tratamiento con proteasa para eliminar las proteínas de unión al ácido nucleico del ácido nucleico viral / celular fijo para mejorar la eficiencia de la hibridación
NOTA: Prepare la solución diluida de proteasa III (ver detalles del reactivo en la Tabla de materiales) durante la permeabilización celular. Deje que la proteasa alcance la RT durante 10 minutos antes de la permeabilización.
- Coloque una pequeña gota de esmalte de uñas en un portaobjetos de vidrio esterilizado. Seque la espalda (lado sin capa celular) y coloque el borde del cubreobjetos sobre la gota de esmalte de uñas, con el lado con las células adheridas hacia arriba. Agregue unas gotas de PBS en el cubreobjetos inmovilizado para evitar que se seque.
- Dibuje un círculo (a unos 3 mm de distancia del cubreobjetos) alrededor del perímetro del cubreobjetos ahora adherido a la diapositiva con un bolígrafo de barrera hidrófobo (bolígrafo repelente al agua que mantiene los reactivos localizados en las células).
- Proteasa III diluida en 1x PBS (100 μL/cubreobjetos).
NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la concentración de proteasa dependiendo de las diferencias en los tipos de células, sondas o ácidos nucleicos diana a través de la optimización empírica (Ver Discusión). Para un etiquetado de ARN/ADN más eficiente en diferentes sistemas virales, tuvimos éxito con las siguientes diluciones presentadas en la Tabla 2 a continuación con diluciones que van desde (1 a 2 )-(1 a 15) (proteasa a 1x PBS).
| Objetivos de sondeo | Dilución de proteasa en PBS 1X (proteasa III a 1X PBS) |
| ADN/ARN del VIH-1 | 1 a 5 |
| HTLV-1 ADN/ARN | 1 a 5 |
| PGRNA del VHB y ARN total del VHB | 1 a 15 |
| ARN IAV | 1 a 15 |
| ARN ZIKV | 1 a 2 |
Tabla 2: Diluciones de proteasa III en PBS para hibridación de ácidos nucleicos virales.
- Decantar el 1x PBS en el cubreobjetos después de la inmovilización y aplicar la proteasa III diluida.
- Incubar en un horno humidificado a 40 °C durante 15 min.
- Decantar la solución de proteasa y sumergir los portaobjetos en 1x PBS. Agitar con un plato mecedor durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo PBS 1x.
- Solo para la detección de ADN, lavar las muestras tres veces con agua libre de nucleasas durante 2 minutos cada una, seguido de la incubación con 5 mg/ml de RNasa A diluida en PBS durante 30 min a 37 °C.
- Decantar la solución de RNasa A y lavar 3 veces durante 2 minutos con agua ultrapura. Continúe con ISH de las sondas objetivo.
NOTA: El tampón de hibridación mejora la detección de vDNA sin afectar la eficiencia de tinción de vRNA para los resultados presentados (Resultados representativos). Sondas diluidas del canal de ADN 1 (C1) 1:1 con sonda de hibridación. Sondas de ARN C2 y C3 diluidas en tampón de hibridación. Las sondas C2 y C3 utilizadas en nuestros estudios de imagen están en soluciones 50X (1:50; sonda de destino a tampón de hibridación).
- Prepare el tampón de hibridación en agua libre de nucleasas siguiendo el procedimiento paso a paso a continuación:
- En un tubo de 15 ml, añadir 700 μL de agua libre de nucleasa, 300 μL de sulfato de dextrano al 50% (peso/volumen (p/v)], 300 μL de NaCl 5M, 125 μL de citrato de sodio de 200 mM (pH 6,2) y 375 mg (polvo) de carbonato de etileno.
- Mezcle bien usando un vórtice para disolver el carbonato de etileno (asegúrese de que todo el polvo esté disuelto y la solución clara).
- Añadir 25 μL de Tween-20 al 10% (volumen/volumen (v/v)) y suficiente agua libre de nucleasas para completar 2,5 ml (solución 2x).
NOTA: La receta para el tampón de hibridación presentado se puede encontrar en la Tabla 3 a continuación. La solución es estable durante una semana. Asegúrese de mezclar suficiente detergente Tween-20, teniendo cuidado de evitar el burbujeo de la solución.
| Reactivo | Concentración de existencias | Notas adicionales |
| Agua libre de nucleasas | NA | |
| Sulfato de dextrano | 50% (p/v) | Muy viscoso |
| Cloruro de sodio | 5 M | |
| Citrato de sodio (pH 6.2) | 200 mM | Conservar a 4 °C |
| Carbonato de etileno | NA | Polvo |
| Preadolescente-20 | 10% (v/v) |
Tabla 3: Lista de reactivos tampón de hibridación.
5. Incubación con sondas de hibridación diana de ADN/ARN: Las sondas de oligonucleótidos diana se unen a la(s) región(es) de interés, creando un andamio molecular para que se unan preamplificadores, amplificadores y sondas fluorescentes.
NOTA: Calentar las sondas de ADN/ARN a 40 °C durante 10 min (durante la permeabilización celular) y enfriar a RT durante al menos 10 min, si no se incluye tratamiento con RNasa. Si se necesita tratamiento con RNasa o tratamiento adicional con la muestra antes de la hibridación de la sonda objetivo, caliente las sondas en consecuencia. Girar las sondas C2 y C3 después del calentamiento y diluir en tampón de hibridación. Después de la dilución, las sondas C2 y C3 se pueden calentar brevemente. Calentar el tampón de lavado 50x (ver Tabla de materiales para más detalles) a 40 °C durante 10-20 min y diluir hasta 1x en agua de grado de biología molecular.
- Incubar 200 μL del tampón de hibridación a 67 °C durante 10 min antes de añadir la(s) sonda(s) de hibridación. Sonda diluida en tampón de hibridación (receta indicada en la Tabla 2). Añadir 50 μL/cubreobjetos.
- Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 2 horas (h). Decantar sondas y sumergir diapositivas en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.
6. Hibridación 1-FL del amplificador (amp): Adición de un preamplificador que es complementario a la secuencia de cola de las sondas de ADN/ARN objetivo (Paso 5)
NOTA: Los amplificadores deben estar en RT antes de su uso. Saque cada amplificador individual de la nevera 30 minutos antes de usarlo y déjelo en el banco en RT.
- Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
- Agregue 1 gota de Amp 1-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 30 min.
- Decantar Amp 1-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.
7. Hibridación Amp 2-FL: Incubación con amplificador de señal con secuencia de reconocimiento afín a preamplificadores (Amp 1-FL)
- Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
- Agregue 1 gota de Amp 2-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 15 min.
- Decantar Amp 2-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.
8. Hibridación Amp 3-FL: Incubación con segundo amplificador de señal
- Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
- Añade 1 gota de Amp 3-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 30 min.
- Decantar Amp 3-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.
9. Hibridación Amp 4-FL: etiqueta fluorescente y paso final de hibridación
NOTA: En primer lugar, consulte la Tabla 4 para elegir el Amp 4 (A, B o C)- FL adecuado en función de los canales de las sondas objetivo. Evalúe qué Amp 4-FL se necesita para etiquetar el ADN/ARN de interés. En la siguiente tabla se proporciona un ejemplo:
| Un | B | C | |
| Canal de ADN 1 (C1) | 488 | 550 | 550 |
| Canal 2 (C2) de ADN/ARN | 550 | 488 | 647 |
| Canal de ARN 3 (C3) | 647 | 647 | 488 |
Tabla 4: Selección de la sonda fluorescente Amp 4 (A, B o C)-FL para ISH multiplexada.
NOTA: Para FISH multiplexados (múltiples objetivos), elegir el Amp 4 (A, B o C)- FL correcto es fundamental para etiquetar correctamente su (s) objetivo (s) de interés. Las sondas de destino (Paso 5) tienen diferentes canales de color (C1, C2 o C3), que dictan su respectiva etiqueta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 o Alexa 647), según el Amp 4-FL elegido. Los ejemplos de elección de combinaciones de fluoróforos para imágenes multiplexadas se proporcionan en las leyendas de la Figura 2 y la Figura 3. Como ejemplo adicional, la selección de Amp 4B-FL marcará selectivamente las sondas de ADN C1 con Atto 550 y las sondas de ARN C3 con Alexa 647.
- Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.
- Añade 1 gota de Amp 4-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 15 min.
NOTA: Siguiendo el paso 9.2, mantenga las muestras cubiertas, protegidas de la luz. - Decantar Amp 4-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x. Lavar con 1x PBS (2 min) y almacenar en PBS.
10. Inmunotinción de proteínas: Para etiquetar la(s) proteína(s) de interés
- Decantar PBS y agregar 200 μL de tampón de bloqueo (1% p/v BSA, 10% v/v FBS en PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) al cubreobjetos. Incubar 1 h en RT.
- Decantar el tampón de bloqueo y aplicar 200 μL de anticuerpo primario diluido en PBST + 1% p/v BSA. Incubar 1 h en RT.
- Lave el portaobjetos dos veces con PBST durante 10 minutos en RT con agitación.
- Aplicar el anticuerpo secundario de elección durante 1 h en RT en PBST + 1% p/v BSA.
- Lave el portaobjetos con PBST durante 10 minutos en RT con agitación.
11. Tinción nuclear: Núcleos contra tinción después de la inmunotinción
- Decantar PBST y aplicar DAPI o tinción nuclear de elección durante 1 min en RT.
- Lave el portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos en RT con agitación.
12. Montaje
- Coloque 1 gota de solución antidecoloración (por ejemplo, Prolong Gold) en un nuevo portaobjetos de vidrio estéril (primero, limpie el portaobjetos con EtOH y deje secar para asegurarse de que no haya residuos en el vidrio). Con la misma punta, extienda la gota de la solución antidecoloración para cubrir un área aproximadamente del tamaño del cubreobjetos.
NOTA: La solución antidecoloración es muy viscosa y puede ser difícil de pipetear. Cortar la punta de una punta de 200 μL antes del pipeteo puede mitigar estos problemas. - Retire el cubreobjetos con muestra de celda del portaobjetos y sumérjalo en PBS para eliminar el esmalte de uñas residual en la parte posterior utilizando los fórceps y PBS. Fórceps secos y parte posterior del cubreobjetos con un Kimwipe.
- Incruste suavemente el cubreobjetos en la gota de solución antidecoloración, colocando el lado de la muestra (lado con la capa celular) del cubreobjetos sobre la gota).
- Deje que las muestras se sequen durante la noche.
13. Imágenes
- Imagen con un microscopio epifluorescente.
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Representative Results
Un esquema de MICDDRP se representa en la Figura 1. El etiquetado del ADN y el ARN es seguido por la inmunotinción. El uso de amplificadores de ramificación aumenta la señal, lo que permite la detección de moléculas individuales de ácido nucleico.
Figura 1: Esquema de MICDDRP y flujo de trabajo paso a paso. (A) La señal de ADNb se amplifica a través de preamplificadores de ramificación y ADN amplificador para mejorar la detección de ADN viral (1) y especies de ARN (2). Las sondas de oligonucleótidos se hibridan en pares (ZZ en esquema) a los objetivos de interés, creando un andamio para preamplificador (Amp 1-FL, Paso 6 en Protocolo), amplificador (Amp 2- y 3-FL) y sondas fluorescentes (Amp 4, Paso 9 en Protocolo). Consulte la Tabla 4 para elegir el amplificador 4 (A, B o C)-FL apropiado para ISH multiplexado. El etiquetado del ácido nucleico es seguido por proteínas inmunotinentes de interés (3). (B) Trece pasos principales en el protocolo MICDDRP con estimación de la duración del tiempo para cada paso respectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La aplicación de MICDDRP para estudiar el curso de la infección por VIH-1 ha sido una herramienta útil para rastrear la cinética de replicación viral en células primarias. Como prueba de concepto de este procedimiento, el ADN, el ARN y la proteína del VIH-1 se etiquetan y visualizan simultáneamente microscópicamente a nivel de una sola célula (Figura 2). Dos genomas de ADN del VIH-1 se visualizan en una sola célula, ya que están transcribiendo activamente el ARN viral (ARNv). El ARNv se ha exportado a través del complejo de poro nuclear y la proteína viral se sintetiza en el citoplasma.
Figura 2: MICDDRP de células mononucleares primarias de sangre (PMBC) infectadas con VIH-1. PMBC infectados con VIH-1 (NL4.3) a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Las células se fijaron 48 horas después de la infección (hpi). (A) Sonda VIH-1 bDNA FISH (etiquetada con ATTO 550; rojo en la figura). Esta sonda hibrida con la hebra de vDNA plantilla (3'<-5') para evitar la diafonía con el vRNA sensorial (+). (B) ARN del VIH-1 sin empalmar (etiquetado con Alexa 647; verde en la figura). La sonda de ARNv del VIH-1 se hibrida con transcripciones virales transcritas en la orientación 5'->3'. (C) Inmunotinción de la proteína de la cápside del VIH-1 (p24) (anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488; figura blanca). (D) Imagen combinada. La barra de escala representa 5 μm. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Para etiquetar el ADN del VIH-1 (sonda de ADN C1) con ATTO 550 y el ARN del VIH-1 (sonda de ARN C3) con Alexa 647, respectivamente, las muestras se incubaron con Amp 4-FL 'B' (Consulte la Tabla 4 en Protocolo para elegir los colores de canal apropiados para las sondas de hibridación). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además, hemos realizado tinción dual de ADN viral (ADNv) y ARNv para seguir la infección por HTLV-1. Para optimizar el etiquetado de ácidos nucleicos, nos adherimos estrechamente al procedimiento de tinción vDNA/VRNA desarrollado para imágenes de fluorescencia multiplexada de la infección por VIH. Hemos demostrado que podemos etiquetar específicamente el ADN y el ARN del HTLV-1 simultáneamente.
Figura 3: Etiquetado simultáneo de HTLV-1 vDNA y vRNA en células MT-2. (A) HTLV-1 vDNA (marcado con ATTO 550; rojo en la figura) (B) HTLV-1 sin empalmar sentido (+) ARN (sonda de ARN C2 y etiquetado con Alexa 488; verde en la figura)). (C) HTLV-1 HBZ antisentido (-) vRNA (sonda RNA C3 & (etiquetado con Alexa 647; blanco en la figura)). (D) Imagen combinada. La barra de escala representa 20 μm. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Se utilizó Amp 4-FL 'B' (consulte la Tabla 4 en Protocolo) para lograr el etiquetado multiplexado del ARN HTLV-1 ('+' y '-'). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Experimentos de control para evaluar la especificidad y los antecedentes de la sonda objetivo. Se evaluó la especificidad de las sondas diana de VIH-1 y HTLV-1 después de la infección en líneas celulares linfocíticas (células T Jurkat no infectadas, células infectadas por HTLV-1 (MT2) y células infectadas por VIH-1 (H9111B)). Las barras de escala representan 10 μm. (A) Las células fueron tratadas con sondas de ARN HTLV-1. (B) Las células fueron tratadas con sonda de ARN del VIH-1 (+) (C-D). Demostración adicional de la especificidad de las sondas HTLV-1 sin reactividad cruzada con el VIH-1. Las flechas blancas en la Figura 4C denotan ADN HTLV-1 (rojo). (E-F). Tinción de ARNv (verde) +/- Tratamiento con RNasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para verificar la especificidad de las sondas de hibridación y evaluar cómo el método de etiquetado ISH afecta la eficiencia de la tinción de proteínas y los antecedentes generales, realizamos controles críticos para garantizar el más alto nivel de rigor y reproducibilidad para los experimentos. Como ejemplo, en la Figura 4A-D, verificamos la especificidad de nuestras sondas de vDNA y ARNv de VIH-1 y HTLV-1, ya que mostramos muy poca o ninguna reactividad cruzada entre los conjuntos de sondas en los dos virus. A pesar del etiquetado de dos retrovirus con el potencial de reactividad cruzada de la sonda, las sondas de VIH-1 solo son específicas para el material genético del VIH-1 y no para el HTLV-1. La misma tendencia es cierta para las sondas HTLV-1. Además, en la Figura 4F, mostramos que podemos eliminar la tinción de ARNv si tratamos nuestras células con RNasa durante la preparación de la muestra. Para evaluar la posibilidad de atenuación de la eficiencia de tinción de proteínas debido al tratamiento con ISH (tratamiento con proteasa (Paso 4 en el Protocolo y Figura 1B) y las condiciones de hibridación, que pueden conducir a la ablación del reconocimiento de epítopos o al aumento de la señal de fondo, demostramos que la eficiencia de tinción de proteínas para el marcador de moteado nuclear, sc-35, es comparable entre los enfoques convencionales de FI y la inmunotinción durante el protocolo MICDDRP. En el protocolo IF convencional, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 15 minutos, en lugar de permeabilización con Tween-20 al 0,1% durante 10 minutos, que se utiliza en el protocolo MICDDRP (Paso 3 en Protocolo y flujo de trabajo en la Figura 1B). La tinción de proteínas en ambas condiciones (IF vs . MICDDRP) produjo una señal varios órdenes de magnitud mayor que el control (MICDDRP sin anticuerpo primario), lo que demuestra aún más el bajo fondo generado siguiendo este protocolo y la preservación de epítopos proteicos para una inmunotinción eficiente. La cuantificación de la imagen de la intensidad media integrada de fluorescencia de la señal sc-35 por célula (Figura 5E) se realizó como se describió anteriormente3. Para todos los resultados de imágenes mostrados, aseguramos la especificidad de la sonda y los anticuerpos, así como evaluamos cualquier posible perturbación o ruido de fondo superior al normal atribuido a nuestro enfoque ISH.
Figura 5: Comparación de la eficiencia de tinción de proteínas después de IF convencional vs . MICDDRP. La proteína celular, sc-35, un biomarcador para manchas nucleares, fue inmunoteñida en células T Jurkat. Todas las barras de escala representan 10 μm. (A) Las células T de Jurkat no infectadas se sometieron al protocolo MICDDRP y fueron tratadas con sondas de hibridación de ADN/ARN del VIH-1 utilizadas en la Figura 2 y la Figura 4 anteriores. Durante la inmunotinción, no se añadió ningún anticuerpo primario. (B). Las células T Jurkat no infectadas se sometieron a FI convencional, marcando sc-35 (blanco). Las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% durante 15 minutos. (C). La MICDDRP se realizó en células T Jurkat infectadas por el VIH. El ARNv está marcado en verde, el ADNv es rojo y el sc-35 es blanco. (D). Primer plano del ARNv, el ADNv y el etiquetado de proteínas (sc-35) en células infectadas por el VIH. (E) Cuantificación de la señal media de fluorescencia integrada por célula de sc-35 en diferentes condiciones de inmunotinción. El eje y está en una escala logarítmica. La línea punteada representa la señal de fondo de las células no infectadas que se sometieron al protocolo MICDDRP donde no se agregó ningún anticuerpo primario. No hubo diferencias significativas en la señal después de MICDDRP vs . FI convencional. Se tomaron muestras de más de 500 células para su cuantificación de la condición respectiva de alcance. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este método también se puede aplicar para estudiar virus de ARN que pueden o no incluir plantillas de ADN para la replicación viral. Por ejemplo, las sondas de ADNb específicas de hebras pueden diseñarse para monitorear la expresión de ARN de hebra de cadena sensorial (+) o antisentido (-) y diferentes especies de ARNv en virus como HBV, HCV, IAV y ZIKV. La visualización de diferentes especies de ARN durante el curso de la infección puede proporcionar información sobre la cinética de replicación de varios sistemas virales.
Siguiendo el curso temporal de la infección por VHB, podemos ver que la cantidad de ARN pregenómico del VHB (PGRNA) y el ARN total del VHB aumenta en función del tiempo. Además, inmunoteñimos simultáneamente un factor huésped celular, MOV10 (Figura 6).
Figura 6: VHB. Curso temporal de la infección por VHB de las células 3E8. Las células fueron infectadas con 300 genomas de VHB por célula. La replicación viral se muestra en tres puntos de tiempo (24, 48 y 72 hpi). pgRNA (marcado con ATTO 550; rojo en la figura), ARN total del VHB (marcado con Alexa 647; verde en la figura) y MOV10 (anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488; blanco en la figura). Los núcleos se tiñen con DAPI en azul. La barra de escala en las imágenes combinadas representa 10 μm. hpi, horas después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las imágenes se realizaron mediante microscopía confocal utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60x. Las longitudes de onda de paso de banda de excitación/emisión utilizadas para detectar DAPI, Alexa 488, ATTO 550 y Alexa 647 se establecieron en 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610 y 647/655-705 nm, respectivamente (Figura 7, Figura 8 y Figura 9).
Figura 7: Evolución temporal de la infección por VHC de las células Huh-7.5.1. Las células Huh-7.5.1 se infectaron con el virus de la hepatitis C (VHC) Jc1 / Gluc2A a un MOI de 0.5. En los intervalos de tiempo indicados, las células se fijaron y sondearon secuencialmente para detectar (+) ARNv, antisentido (-) ARNv y NS5A (proteína VHC). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. Imágenes representativas combinadas de cada punto de tiempo, mostrando (+) ARN en verde (etiquetado con Alexa 647), (-) ARN en rojo (etiquetado con Atto 555), NS5A en blanco (secundario anti-ratón de cabra conjugado a Alexa 488) y núcleos en azul. Las barras de escala representan 10 μm. Las imágenes inferiores son recortes ampliados desde el punto de tiempo correspondiente. HPI, horas después de la infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: FISH de ADNb específico de hebras e inmunotinción de células A549 infectadas con el virus de la influenza A. Las células A549 infectadas con el virus de la influenza A PR8 se fijaron y sondearon para (A) ARN de nucleoproteína IAV (NP) (marcada con Alexa 488; verde en la figura) y (B) proteína polimerasa IAV (PB1) (anti-ratón secundario de cabra Atto 550; rojo en la figura) y los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). (C) Imagen combinada. La barra de escala representa 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: FISH de ADNb específico de hebra en células infectadas por el virus del Zika (ZIKV). Las células Vero se infectaron con ZIKV a un MOI de 0.1. Las celdas se fijaron en 48 hpi. (A) Las células se tiñeron simultáneamente para el sentido (+) vRNA (etiquetado con Alexa 488; verde en la figura) y el antisentido (-) vRNA (etiquetado con Atto 550; rojo en la figura). Los núcleos fueron teñidos con DAPI. En (A), el cuadro blanco denota una región con (+) y (-) vRNA. Los recuadros presentan un primer plano de (+) ARNv (verde) y las especies de ARNv (rojo) más escasas (-). (B) sentido (+) ARNv (verde). (C) antisentido (-) ARNv (rojo). La barra de escala en (A) representa 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La visualización simultánea de ARN, ADN y proteína a menudo requiere una optimización extensa. Dos métodos comúnmente utilizados son el etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU) y DNA FISH. El etiquetado de EdU se ha aplicado para visualizar el ADN viral y la proteína simultáneamente, ya que EdU se incorpora en el ADN naciente y posteriormente se marca con colorantes fluorescentes que contienen azida a través de la química de clic. Por lo tanto, el etiquetado EdU se puede utilizar para monitorear la cinética de replicación de virus nativos de virus de ADN o virus con plantillas de ADN para replicación12. Sin embargo, una deficiencia del etiquetado de EdU es que en las células en división, el genoma replicante incorporará EdU, generando un alto fondo y un análisis de imágenes confusas. DNA FISH puede eludir estos problemas hibridando directamente una sonda de ácido nucleico al objetivo respectivo, independientemente del ciclo celular. Sin embargo, el FISH convencional a menudo dependía de altas temperaturas para lograr una hibridación eficiente de la sonda, dificultando la inmunotinción o incluso la tinción simultánea de ARN13. MICDDRP puede potencialmente eludir estos problemas proporcionando un marcado fluorescente simultáneo robusto de ADN, ARN y proteína en una variedad de sistemas celulares.
Si bien hemos demostrado que podemos etiquetar proteínas y ácidos nucleicos simultáneamente utilizando nuestro protocolo MICDDRP, se necesitaba optimización en diferentes sistemas. El primer parámetro importante que tuvimos que optimizar fue el tratamiento con proteasa. Se varió la concentración de proteasa III a través de las condiciones. La optimización del tratamiento con proteasa fue empírica, ya que utilizamos diferentes diluciones para evaluar qué produjo la mayor eficiencia de hibridación, sin comprometer la eficiencia de inmunotinción. Se realizaron controles apropiados lado a lado para evaluar la especificidad de la sonda y los cambios en la eficiencia de tinción de proteínas atribuidos al tratamiento con proteasa. Los siguientes parámetros importantes que necesitaban optimización fueron el diseño de la sonda y la hibridación de la sonda.
El diseño adecuado de las sondas de captura y amplificador es fundamental para lograr la sensibilidad y la especificidad de la tecnología bDNA. Los paquetes de software que predicen la probabilidad de eventos de hibridación no específicos están disponibles para mejorar el diseño de la sonda 7,11. Las sondas de ADNb con el preamplificador, el amplificador y las sondas de etiqueta fluorescente que las acompañan ahora se pueden comprar comercialmente para garantizar la compatibilidad con los kits de imágenes de ADNb. Los usuarios pueden proporcionar a los fabricantes información de secuencia (~ 300-1000 pares de bases) para la(s) región(es) objetivo(s) en forma de un archivo fasta (formato basado en texto para representar la secuencia de nucleótidos). Las sondas objetivo se generan con > homología de secuencia del 90% a la secuencia suministrada.
Para el etiquetado de ADN, hemos encontrado que la dilución de las sondas en el tampón de hibridación descrito en el Paso 5 del Protocolo mejora la hibridación del ADN. Al etiquetar tanto el ADN como el ARN, la sonda de ARN se puede diluir en el tampón de hibridación. El etiquetado de ADN en ausencia de RNasa no puede excluir la posibilidad de que el ácido nucleico observado incluya ARN del canal objetivo. La temperatura también puede tener que ajustarse para mejorar la eficiencia de la hibridación. El aumento de la temperatura puede afectar la eficiencia de la tinción de proteínas, ya que el aumento de las temperaturas puede promover la desnaturalización de las proteínas, ablacionando el reconocimiento del epítopo del anticuerpo primario. En los datos representativos presentados, hemos realizado ISH a 40 °C.
En comparación con los peces de ADN convencionales, MICDDRP proporciona un procedimiento mejorado para etiquetar simultáneamente ADN, ARN y proteínas para visualizar a través de microscopía de fluorescencia. Una limitación potencial es que la selección de la sonda puede afectar la eficiencia de la hibridación y la capacidad de comparar cuantitativamente los datos entre sondas. Este protocolo ha sido efectivo en diversos sistemas celulares y virales en nuestras manos con solo una optimización menor necesaria en diferentes condiciones. Publicaciones recientes de alto perfil han utilizado nuestro enfoque para estudiar la selección del sitio de integración del VIH14 y la cinética de transcripción inversa del VIH15. Las aplicaciones futuras de MICDDRP podrían incluir la visualización de ácidos nucleicos virales concomitantemente con secuencias de ácidos nucleicos de genes celulares específicos y proteínas celulares.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en su totalidad o en parte por los Institutos Nacionales de Salud (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 y U54 AI150472). Agradecemos al Dr. Raymond F. Schinazi y Sadie Amichai por proporcionar células infectadas con el virus de la influenza A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% PFA | |||
| 50% dextran sulfate | Amreso | 198 | For DNA hybridization buffer |
| 50X wash buffer | ACD Bio | 320058 | |
| 6-well plates | |||
| Amplifier 1-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 2-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 3-FL | ACD Bio | ||
| Amplifier 4-FL | ACD Bio | Consult Amp-4 table in protocol | |
| Anti-HCV NS5a antibody | Abcam | ab13833 | Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4 |
| Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody | NIH AIDS Reagent Program | 3537 | |
| Anti-Mov10 antibody | Abcam | ab80613 | Rabbit polyclonal |
| Anti-PB1 antibody | GeneTex | GTX125923 | Antibody against flu protein |
| Bovine serum albumin | Blocking reagent for immunostaining | ||
| Cell media with supplements | Media appropriate for cell model | ||
| Coverslips | |||
| DAPI | ACD Bio | Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio) | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) | Gibco | 14190250 | No calcium and magnesium |
| Ethylene carbonate | Sigma | E26258 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS) | ||
| Fisherbrand colorfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-17/18/19 | Precleaned |
| HCV-GT2a-sense-C2 probe | ACD Bio | 441371 | HCV(+) sense RNA probe |
| HIV-gagpol-C1 | ACD Bio | 317701 | HIV-1 cDNA probe |
| HIV-nongagpol-C3 | ACD Bio | 317711-C | HIV-1 RNA probe |
| HybEZ hybridization oven | ACD Bio | 321710/321720 | |
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Nail polish | For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment | ||
| Nuclease free water | Ambion | AM9937 | |
| Poly-d-lysine (PDL) | Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes | ||
| Probe diluent | ACD Bio | 300041 | For diluting RNA C2 or C3 probes |
| Prolong gold antifade | Invitrogen | P36930 | |
| Protease III | ACD Bio | 322337 | |
| RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | |
| RNase A | Qiagen | ||
| Secondary antibodies | |||
| Slides | |||
| Sodium chloride | For DNA hybridization buffer | ||
| Sodium citrate, pH 6.2 | For DNA hybridization buffer | ||
| Tween-20 | For DNA hybridization buffer and PBS-T | ||
| V-HBV-GTD | ACD Bio | 441351 | Total HBV RNA |
| V-HBV-GTD-01-C2 | ACD Bio | 465531-C2 | HBV pgRNA probe |
| V-HCV-GT2a probe | ACD Bio | 441361 | HCV(-) sense RNA probe |
| V-HTLV-HBZ-sense-C3 | ACD Bio | 495071-C3 | HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ |
| V-HTLV1-GAG-C2 | ACD Bio | 495051-C2 | HTLV-1 DNA probe |
| V-HTLV1-GAG-POL-sense | ACD Bio | 495061 | HTLV-1 (+) sense RNA probe |
| V-Influenza-H1N1-H5N1-NP | ACD Bio | 436221 | IAV RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2 | ACD Bio | 464531 | Zika(+) sense RNA probe |
| V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 | ACD Bio | 478731-C2 | Zika(-) sense RNA probe |
References
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