Bioengineering

बायोसेंसर आधारित उच्च थ्रूपुट बायोपैनिंग और बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण रणनीति दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन के वैश्विक सत्यापन के लिए

Published: December 1, 2020 doi: 10.3791/61873

¹Institute of Quantum Life Science, National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य दवा-पेप्टाइड इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए एक रणनीति पेश करना है । इस रणनीति में क्वार्ट्ज-क्रिस्टल माइक्रोसैलेंस (क्यूसीएम) बायोसेंसर के आधार पर दवा को पहचानने वाली छोटी पेप्टाइड्स की बायोपैनिंग शामिल है, जिसके बाद मात्रात्मक रूप से दवा मान्यता और प्रोटीन पर दवा-बाध्यकारी साइटों के एनोटेशन के लिए प्राप्त जानकारी का आकलन करने के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण किया जाता है ।

Abstract

रिसेप्टर्स और एंजाइम प्रोटीन महत्वपूर्ण जैव अणु हैं जो जैव सक्रिय छोटे अणुओं के लिए बाध्यकारी लक्ष्य के रूप में कार्य करते हैं। इस प्रकार, दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन का तेजी से और वैश्विक सत्यापन न केवल चिकित्सीय प्रभावकारिता में अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए बल्कि नैदानिक उपयोग के लिए सोखने, वितरण, चयापचय, उत्सर्जन और विषाक्तता (एडीएमईटी) जैसी दवा विशेषताओं का आकलन करने के लिए अत्यधिक वांछनीय है। यहां, हम T7 phage-प्रदर्शित शॉर्ट पेप्टाइड्स के बायोपैनिंग के लिए एक बायोसेंसर-आधारित उच्च थ्रूपुट रणनीति पेश करते हैं जिसे आसानी से फेज कैप्सिड पर प्रदर्शित किया जा सकता है। रिसेप्टर लिगांड संपर्क (RELIC) सुइट में बायोइन्फॉर्मेटिक्स कार्यक्रमों का उपयोग करके दवा-बाध्यकारी साइटों के छोटे खंडों वाले पेप्टाइड्स के अमीनो एसिड दृश्यों का बाद में विश्लेषण भी दिखाया गया है। दो चिकित्सकीय अनुमोदित दवाओं के लिए इस विधि को लागू करके, एक एंटी-ट्यूमर irinotecan, और एक एंटी-फ्लू ओसेल्टामिविर, दवा को पहचानने पेप्टाइड दृश्यों को इकट्ठा करने और लक्षित प्रोटीन की दवा बाध्यकारी साइटों को उजागर करने के लिए विस्तृत प्रक्रिया इस कागज में समझाया जाता है । यहां वर्णित रणनीति ब्याज के किसी भी छोटे अणुओं के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

दवाओं के विकास के साथ-साथ बीमारियों के आणविक तंत्र को समझने के लिए दवाओं के बंधन वाले लक्ष्यों की पहचान एक आवश्यक है । विशेष रूप से, रिसेप्टर और एंजाइम प्रोटीन जैव सक्रिय छोटे अणुओं के सबसे महत्वपूर्ण आणविक लक्ष्य हैं¹। यद्यपि आत्मीयता कैप्चर दवा-बाध्यकारी प्रोटीन 2 की पहचान करने के लिए एक अच्छी तरह से^{स्थापित}तकनीक है, तकनीकी सीमाएं, जैसे प्रोटीन की कम घुलनशीलता, अक्सर दवा लक्ष्यों के सत्यापन में बाधा डालती है^2। सबसे महत्वपूर्ण बात, स्थिर छोटे अणु डॉकिंग के लिए आवश्यक स्वतंत्रता की डिग्री खो देते हैं और बड़े लक्ष्य प्रोटीन पर आंतरिक रूप से स्थित बाध्यकारी साइटों के लिए दुर्गम हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रोटीन गलत गुना, सह-क्रिस्टलीकरण स्थितियों का विश्लेषण करने में असमर्थता, और आणविक आकार के कारण सीमाएं अक्सर एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) के उपयोग में बाधा उत्पन्न करती हैं, और दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए ऐसे अन्य प्रयोगात्मक विश्लेषण।

टी 7 फाज डिस्प्ले बायोपैनिंग का उपयोग छोटे अणु बाइट्स³के लिए प्रोटीन पर बाध्यकारी स्थल का निर्धारण करने का एक कुशल तरीका है। विशेष रूप से, एक T7 फाज-प्रदर्शित यादृच्छिक पेप्टाइड लाइब्रेरी, जिसे एक बहु-क्लोनिंग साइट में सिंथेटिक डीएनए डालकर बनाया जा सकता है, प्रभावी है। प्रोटीन प्रदर्शित T7 phage पुस्तकालय की तुलना में, छोटे पेप्टाइड्स आसानी से शारीरिक प्रतिबंध है, जो किसी भी छोटे अणु एक ठोस समर्थन²पर तय दवा के साथ बाँद संपर्क कर सकते है बिना T7 phage capsid पर प्रदर्शित किया जा करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है । इसके अलावा, टी 7 फाज डिस्प्ले बायोपैनिंग प्लेटफॉर्म में क्वार्ट्ज-क्रिस्टल माइक्रोसैलेंस (क्यूसीएम) बायोसेंसर की शुरुआत क्यूसीएम फ्रीक्वेंसी^4,⁵में कमी की निगरानी करके दवाओं के साथ शॉर्ट पेप्टाइड्स के ऐसे कमजोर लेकिन विशिष्ट इंटरैक्शन की पहचान की अनुमति देती है। बाउंड T7 phage तो सीधे मेजबान Escherichia कोलाई (BLT5615) को संक्रमित करके बरामद किया जाता है, और इस क्षेत्र के डीएनए अनुक्रम है कि एफ़िनिटी चयनित पेप्टाइड शरण दवा पहचानने छोटे खंडों निर्धारित किया जाता है । पेप्टाइड आबादी के अमीनो एसिड अनुक्रम के बाद विश्लेषण दवा मान्यता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। सिलिको जोड़ीवार में बचाया अमीनो एसिड दृश्यों के संरेखण में एक चयनित प्रोटेम के भीतर दवा के जैविक लक्ष्य के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक दवा के प्रति आत्मीयता के साथ प्रोटीन के टुकड़ों की इस उच्च थ्रूपुट पहचान का उपयोग मिट्टी के बर्तनों के शार्ड्स⁶से एक प्राचीन कलाकृतियों के पुनर्निर्माण के समान तरीके से दवा-बाध्यकारी स्थल का पुनर्निर्माण करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, पारंपरिक प्रोटेओमिक्स दृष्टिकोण विफल होने पर यह अनूठा दृष्टिकोण उपयोगी हो सकता है।

यहां, हम छोटे अणुओं के लक्ष्य सत्यापन के लिए T7 फाज-प्रदर्शित पेप्टाइड्स और बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण के बायोपैनिंग के लिए एक बायोसेंसर-आधारित रणनीति प्रस्तुत करते हैं। पारंपरिक तरीकों पर तकनीकी सीमाओं से परे, यह रणनीति समान प्रोटोकॉल के तहत ब्याज के किसी भी छोटे अणु के लिए लक्षित प्रोटीन पर दवा बाध्यकारी साइटों की पहचान करने में सक्षम बनाता है ।

Protocol

नोट: निम्नलिखित एक QCM बायोसेंसर का उपयोग कर दवा पहचानने T7 phages स्क्रीनिंग और ई. कोलाई (BLT5615) संक्रमण के माध्यम से जांच की phages ठीक करने के लिए कदम हैं । एक छोटे से अणु के व्युत्पन्न के संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल जो एक आत्म-इकट्ठा मोनोलेयर (एसएएम) बनाता है और T7 फाज-प्रदर्शित 15-मेर यादृच्छिक पेप्टाइड लाइब्रेरी के निर्माण के लिए कहीं और पाया जा सकता है^6,^7।

1. क्यूसीएम सेंसर चिप की तैयारी

एक 27-मेगाहर्ट्ज QCM उपकरण के ऑसिलेटर पर एक सिरेमिक सेंसर चिप संलग्न है, और छोटे अणु स्थिरीकरण से पहले हवा के चरण में आंतरिक आवृत्ति (हर्ट्ज) रिकॉर्ड ।
चिप को अलग करें और एक छोटे से अणु व्युत्पन्न के समाधान (70% इथेनॉल में 1 mm) के 20 माइक्रोन को छोड़ दें जो एक पिपेट का उपयोग करके सेंसर चिप के सोने के इलेक्ट्रोड पर सैम बनाता है।
सावधानी: सेंसर चिप क्रिस्टल जहां सोने के इलेक्ट्रोड (Au, 0.1 मिमी मोटी, 2.5 मिमी यानी, 4.9^{मिमी 2)}स्थित है बेहद पतली है और आसानी से दरार (एसआईओ_2,0.06 मिमी मोटी, 9 मिमी यानी)। इसलिए, ध्यान से पिपेट करें।
गीले ऊतक के साथ पेट्री डिश में कमरे के तापमान (लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर 1 घंटे के लिए छोड़ दें और कमरे की रोशनी से परिरक्षित करें।
इलेक्ट्रोड की सतह को अल्ट्रापुरे पानी से धीरे-धीरे धोएं; फिर, सिरिंज या एयर डस्टर के साथ हवा उड़ाकर पानी की बूंदों को हटा दें।
क्यूसीएम उपकरण के लिए सेंसर चिप सेट करें और स्थिर किए गए छोटे अणु की मात्रा को मापने के लिए हवा के चरण में आवृत्ति में कमी को रिकॉर्ड करें।
नोट: सफल छोटे अणु स्थिरीकरण के लिए कम से कम 100 हर्ट्ज आंतरिक आवृत्ति आवश्यक है (1 हर्ट्ज 30 स्नातकोत्तर) को स्थिर करता है।

2. क्यूसीएम बायोसेंसर का उपयोग करके T7 फाज लाइब्रेरी का बायोपैनिंग(चित्रा 1)

क्यूटीएम बायोसेंसर पर एक समर्पित चुंबकीय उभार के साथ एक क्यूवेट सेट करें और क्यूवेट में प्रतिक्रिया बफर (10 एमएल ट्रिस-एचसीएल, 200 एमएल एनएसीएल, पीएच 7-8) के 8 एमएल डालें।
ऑसिलेटर के लिए QCM सेंसर चिप संलग्न है और नीचे दोलनकर्ता की बांह खींचने के लिए बफर में चिप विसर्जित किया जा रहा है १००० आरपीएम पर उभारा जा रहा है ।
पर्सनल कंप्यूटर (पीसी) पर क्यूटीएम फ्रीक्वेंसी की निगरानी शुरू करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सेंसरग्राम आवृत्ति बहाव के लगभग 3 हर्ट्ज/मिनट तक न हो।
एक T7 phage पुस्तकालय के 8 μL इंजेक्ट (1-2 × 10¹⁰ pfu/mL) cuvette में (अंतिम एकाग्रता: 1-2 × 10⁷ pfu/l) और सेंसर पर इंजेक्शन बिंदु निशान ।
10 मिनट के लिए सोने के इलेक्ट्रोड सतह पर स्थिर छोटे अणु के लिए T7 phages के बाध्यकारी के कारण आवृत्ति में कमी की निगरानी करें ।
QCM आवृत्ति मॉनिटर बंद करो, दोलन से सेंसर चिप उखाड़ फेंकना, और हवा उड़ाने और/या पोंछे के साथ दूर बाती द्वारा बफर को हटा दें ।
एक आर्द्र पेट्री डिश में सेंसर चिप रखो और ई. कोलाई (BLT5615) (OD_{600 = 0.5-1.0} के निलंबन के 20 μL ड्रॉप 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के बाद 1 mM करने के लिए IPTG जोड़कर) इलेक्ट्रोड पर लॉग चरण में मेजबान कोशिकाओं ।
पकवान के ढक्कन को बंद करें और प्रकाश को ब्लॉक करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ इसे कवर करें।
बाउंड टी7 फैज की रिकवरी बढ़ाने के लिए 96-वेल माइक्रोप्लेट मिक्सर (1000-1500 आरपीएम) पर 30 मिनट के लिए डिश को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
समाधान के 20 माइक्रोन को ठीक करें और इसे एलबी माध्यम के 200 माइक्रोल में निलंबित करें।
नोट: इस चरण में प्राप्त नमूनों को एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है।
निर्माता के निर्देशों में वर्णित सामान्य प्रक्रिया के अनुसार पट्टिका अलगाव और डीएनए अनुक्रमण के लिए फाज समाधान की एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला तैयार करें^8,⁹।
1% सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट समाधान के साथ भिगोए गए सूती झाड़ू के साथ सोने के इलेक्ट्रोड सतह को पोंछें।
सोने की सतह को धोने की बोतल से अल्ट्रापुरे पानी से धोएं और फिर सिरिंज या एयर डस्टर से हवा उड़ाकर पानी की बूंदों को हटा दें।
पिरान्हा समाधान के 5 माइक्रोन ड्रॉप (कॉन एच₂एसओ_4:30% एच₂O₂ = 3:1) सोने की सतह पर और 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
सोने की सतह को पानी से फिर से धोएं और फिर हवा को उड़ाकर सूख जाएं और/या पोंछे के साथ दूर बाती करें ।
चरण 2.14 और 2.15 दोहराएं।
सावधानी: उपयोग करने से तुरंत पहले पिरान्हा समाधान तैयार करें। इस लिक्विड का इस्तेमाल सावधानी से करें, क्योंकि यह बहुत मजबूत एसिड है। 5 मिनट से अधिक समय तक उपचार सेंसर चिप को इरोड करता है।

3. रिसेप्टर लिगांड संपर्क (RELIC) कार्यक्रम सुइट(चित्रा 2)^{10, 11} का उपयोग कर जैव सूचना विश्लेषण

एमएस विंडोज ऑपरेटिंग सिस्टम के साथ पीसी पर स्टैंड-अलोन अवशेष कार्यक्रम को खोलें।
प्रत्येक टेक्स्ट फॉर्मेट फाइल (नाम.txt) में दवा का उपयोग करके या बेतरतीब ढंग से बिना जांच वाले माता-पिता पुस्तकालय से चुने गए 15-मेर पेप्टाइड्स आत्मीयता के अमीनो एसिड दृश्यों को संरेखित करें।
फास्टा फॉर्मेट के साथ प्रत्येक टेक्स्ट फाइल में सिंगल या मल्टीपल प्रोटीन (एस) का अमीनो एसिड सीक्वेंस टाइप करें, या किसी भी प्रोटीन डेटाबेस (जैसे यूनिप्रोट (http://www.uniprot.org/) या ड्रगबैंक (https://www.drugbank.ca/) से फास्टा फॉर्मेट में डेटाबेस टेक्स्ट फाइल्स डाउनलोड करें ।
प्रत्येक अवशेष कार्यक्रम को चलाने के लिए आवश्यक फ़ोल्डर में टेक्स्ट फाइल (और HETEROalign के लिए पीडीबी फाइलें) रखें।
FTN95 के व्यक्तिगत संस्करण को खोलने के लिए स्वतंत्र फ़ोल्डर में AADIV, INFO, MOTIF, MATCH, HETEROalign, FASTAcon, और FASTAskan के लिए निष्पादित फ़ाइल (कार्यक्रम.exe) पर क्लिक करें।
प्रत्येक प्रोग्राम को निष्पादित करने और आवश्यक टेक्स्ट फ़ॉर्मेट फ़ाइल प्राप्त करने के लिए कमांड संदेश में एक्सटेंशन (नाम.txt) के साथ उपयुक्त फ़ाइलनाम टाइप करें।
एक BLOSUM62 (MATCH, HETEROalign) का उपयोग करके गणना की गई सूचना सामग्री (INFO) या संचयी समानता स्कोर का एक भूखंड उत्पन्न करने के लिए परिणामी टेक्स्ट फ़ाइल को स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर (उदाहरण के लिए, एक्सेल) को निर्यात करें।
नोट: मूल अवशेष सर्वर (http://relic.bio.anl.gov) अब उपलब्ध नहीं है और कुछ स्टैंड-अलोन प्रकार के अवशेष कार्यक्रम जो विंडोज प्लेटफॉर्म के साथ पीसी पर काम करते हैं, इसी लेखक (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp) से प्राप्त किए जा सकते हैं।

Representative Results

दो चिकित्सकीय अनुमोदित दवाओं के प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3में दिखाए जाते हैं । इरिनोटकर(चित्रा 3 ए),उन्नत कोलोरेक्टल कैंसर और गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के इलाज के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राकृतिक कैम्पटोथेसिन के पानी में घुलनशील प्रोड्रग, यकृत में एसएन-38 में परिवर्तित हो जाता है, जो कैंसर कोशिकाओं में टोपोइसोमरेज I को रोकता है^12। इसके अलावा, यह यौगिक सीधे एसीटिलकोलिनस्टेरेस (एसीईई)^{13, 14}को रोकता है। रणनीति के माध्यम से, 29 पेप्टाइड्स जिन्होंने आईआरआई को एसएएम के रूप में स्थिर किया था, की पहचान क्यूसीएम बायोसेंसर-आधारित वन-साइकिल बायोपैनिंग सबसेट द्वारा की गई थी। 29 पेप्टाइड्स और AChE के बाद जोड़ीवार संरेखण Y121, Q225, F290, E327, H440, और Y442 के लिए अधिकतम स्कोर मिले और तीन आयामी संरचना में भाग पर प्रकाश डाला । ये अमीनो एसिड अवशेष AChE के Iri-बाध्यकारी साइट बनाने वालों के अनुरूप थे । पेप्टाइड्स के इसी सबसेट ने सफलतापूर्वक कारबॉक्साइलेस्टेरेस (सीई) में उत्प्रेरक ट्रायड (S221, E353, और H467) के आसपास E99, L100, L252, L305, I387, और V474 की पहचान की, यह दर्शाता है कि ये अमीनो एसिड Iri¹⁵के डी-एस्टेरिफिकेशन के दौरान इरी मान्यता के लिए एक पाड़ बनाते हैं। उत्प्रेरक साइट में इस तरह के अमीनो एसिड अवशेषों को पारंपरिक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर विश्लेषण का उपयोग करके सीधे पहचाना नहीं जा सकता है, क्योंकि एंजाइम प्रतिक्रिया सुचारू रूप से आगे बढ़ती है और सामान्य प्रायोगिक परिस्थितियों में स्थिर परिसर नहीं बनाती है। इस प्रकार, एक विशेष दवा के लिए मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं के दौरान एंजाइमों के साथ गठित मध्यवर्ती परिसरों में शामिल कई प्रोटीन की दवा-बाध्यकारी साइटों का संयोजन पता लगाना, एक दवा के लिए निर्धारित आत्मीयता-चयनित पेप्टाइड्स का उपयोग करना संभव है।

चित्रा 3B ओसेल्टामिविर (ओसेल) के लिए प्राप्त अन्य परिणामों को दिखाता है, जो एक एंटी-फ्लू दवा है जो ओसेल्टामिविर कार्बोक्सिलेट में सक्रिय है, जो बदले में इन्फ्लूएंजा वायरस¹⁶के न्यूरामिडास (एनए) को रोकता है। क्यूटीएम सेंसर चिप गोल्ड इलेक्ट्रोड सतह को कवर करने वाले पेप्टाइड्स के 27 ने एनए¹⁶में ओसेल-बाइंडिंग साइट का सफलतापूर्वक पता लगाया। इस बाध्यकारी साइट में असंरचित पेप्टाइड लूप्स होते हैं जो ओसेल के साथ डॉकिंग करते समय संभावित रूप से गतिशील आंदोलन से गुजरते हैं। T7 फाज कैप्सिड पर ओसेल-पहचानने पेप्टाइड्स क्यूटीएम सेंसर चिप के गोल्ड इलेक्ट्रोड सतह पर तय ओसील के लिए बाध्यकारी होने पर इस गतिशील डॉकिंग की नकल कर सकते हैं। इंफ्लूएंजा वाले युवा रोगियों में न्यूरोसाइकियाट्रिक प्रतिकूल घटनाओं (एनपीएई) की पहचान की गई है, जो रोगियों पर प्रभाव संभवतः दवा के बजाय बीमारी से संबंधित हैं। अध्ययनों से पता चला है कि ओसेल को रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी)¹⁷में मल्टीड्रग प्रतिरोध (एमडीआर) प्रोटीन के माध्यम से कृंतक के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से सक्रिय रूप से निर्यात किया जाता है। दरअसल, इस एमडीआर के वर्ग के प्रोटीन में से एक ने हमारे अध्ययन में अन्य ट्रांसपोर्टरों, न्यूरोट्रांसमीटर से संबंधित एंजाइमों और रिसेप्टर्स के अलावा, ड्रगबैंक 1.0 प्रोटीन डेटाबेस^{18 में 4,396}में से एक उच्च स्कोर (4,396 में से शीर्ष 5%) दिखाया। ओसेल के प्रतिकूल प्रभावों की उपस्थिति के संबंध में इन प्रोटीनों के औषधीय महत्व की जांच की जा रही है।

अब तक, लक्ष्य प्रोटीन पर एकल और कई छोटे अणु बाध्यकारी साइटों को सफलतापूर्वक छह छोटे अणु दवाओं के लिए पहचाना गया है हमारी रणनीति(चित्रा 4)का उपयोग कर रहा है । Brz2001 और रॉक्सीथ्रोमाइसिन (RXM) के लिए, एक लक्ष्य प्रोटीन पर समान दवा-बाध्यकारी साइटों की पहचान पेप्टाइड्स के विभिन्न पूलों, संख्या और अमीनो एसिड दृश्यों का उपयोग करके की गई थी, जिसके लिए पूरी तरह से^7,¹⁹भिन्न थे। इसके अलावा, आईआरआई, आरएक्सएम और ओसेल के लिए प्राप्त एकल पेप्टाइड पूल ने प्रत्येक दवा के लिए विभिन्न प्रोटीन पर कई बाध्यकारी साइटों की पहचान की, जैसे कि आईआरआई के लिए AChE और CE(चित्रा 3A)^20,एंजीओटिन और CYP3A4 RXM^19,^21,और एनए और एमडीआर से जुड़े प्रोटीन के लिए ओसेल के लिए। एंटी-ट्यूमर कंपाउंड डॉक्सोरुबिकिन (FANCF)^22,और एंटी-एंजियोजेनिक मैक्रोलाइड एंटीबायोटिक आरएक्सएम (एंजियोमोटिन)¹⁹के लिए एक अज्ञात आणविक लक्ष्य की पहचान की गई थी।

चित्रा 1:T7 फाज-प्रदर्शित पेप्टाइड लाइब्रेरी के क्यूसीएम बायोसेंसर आधारित बायोपैनिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक T7 फाज लाइब्रेरी जो यादृच्छिक पेप्टाइड्स प्रदर्शित करती है, बफर (सरगर्मी के तहत) युक्त क्यूवेट में इंजेक्ट की जाती है जहां क्यूक्यूएम बायोसेंसर चिप डूब जाती है और आवृत्ति स्थिर हो जाती है। सेंसर चिप के गोल्ड इलेक्ट्रोड सतह पर स्थिर छोटे अणुओं के लिए T7 phages के बाध्यकारी के कारण आवृत्ति में कमी की निगरानी के बाद, सेंसर चिप आदोलनकर्ता से अलग है । बाध्य T7 phage से डीएनए तो सीधे मेजबान ई. कोलाई (BLT5615) संक्रमण के बाद बरामद किया जाता है । जिसके परिणामस्वरूप T7 phages पट्टिका गठन के माध्यम से अलग कर रहे है और, अंत में, दवा आत्मीयता के अमीनो एसिड अनुक्रम-T7 phage capsid पर प्रदर्शित पेप्टाइड चयनित सामांय phage प्रदर्शन विधि के अनुसार निर्धारित किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2:दवा चयनित पेप्टाइड्स और एकल या कई प्रोटीन के बीच अनुक्रम तुलना के मात्रात्मक मूल्यांकन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। दवा-चयनित पेप्टाइड दृश्यों को क्रमशः एकल और कई प्रोटीन के प्राथमिक अमीनो एसिड दृश्यों के साथ गठबंधन किया जाता है, और प्रत्येक 3-5 अमीनो एसिड सेट में समानता को संशोधित BLOSUM62 मैट्रिक्स के अनुसार जोड़ीवार संरेखण के माध्यम से संचयी रूप से बनाया जाता है। परिणामस्वरूप भूखंड या आरेख अवशेषों या भागों को इंगित करता है जो प्रोटीन पर एक संभावित दवा-बाध्यकारी साइट का गठन करते हैं। एक उपयुक्त अवशेष कार्यक्रम का उपयोग करके आगे विश्लेषण त्रि-आयामी संरचना पर बाध्यकारी साइट पर प्रकाश डालता है (यदि पीडीबी फ़ाइल उपलब्ध है) या पूरे प्रोटीन को रैंक करता है जो संभवतः बाध्यकारी लक्ष्य हैं (HETEROalign कार्यक्रम वर्तमान में अनुपलब्ध है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 3:पेप्टाइड संग्रह और बाद में बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम. (A)इरिनोटकर (एंटी-ट्यूमर प्रोड्रग, टोपोइसोमरेस आई अवरोधक)। क्यूसीएम फ्रीक्वेंसी में कमी के रूप में T7 फाज इंटरैक्शन पर 10 मिनट तक नजर रखी गई । बाध्य T7 phage के डीएनए बरामद किया गया था और इसी अमीनो एसिड अनुक्रम निर्धारित करने के लिए अनुक्रम । एक चक्र बायोपैनिंग के सबसेट का उपयोग करके एकत्र किए गए 29 15-मेर पेप्टाइड्स के अमीनो एसिड दृश्यों ने अमीनो एसिड पर प्रकाश डाला जो AChE [पीडीबी आईडी 1U65] की आईआरआई-बाध्यकारी साइट बनाते हैं। इसी 29 पेप्टाइड्स का उपयोग करके आगे के आकलन में सीई में उत्प्रेरक ट्रायड के पड़ोसी अमीनो एसिड अवशेषों (डी-एस्टेरिफिकेशन के लिए मचान अवशेषों) पर प्रकाश डाला गया, एक जिगर एंजाइम जो आईआरआई को एसएन-38 (सक्रिय रूप) में परिवर्तित करता है [पीडीबी आईडी: 1K4Y]। पुस्तकालय पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए इन स्कोरों से 103 बेतरतीब^ढंग से चयनित पेप्टाइड्स के समानता स्कोर को इन स्कोर से घटाया गया है। इन आंकड़ों को रेफरी 20 से पुन: पेश किया जाता है, एल्सवियर से अनुमति के साथ। (ख) ओसेल्टामिविर (एंटी फ्लू ड्रग) । ओसेल-पहचानने वाले अमीनो एसिड वाले 27 पेप्टाइड्स ने न्यूरामिनिडास (एनए) (एंजाइम वायरस) [पीडीबी आईडी: 2HT7] के लिए ओसेल-बाध्यकारी साइट के अव्यवस्थित भागों पर प्रकाश डाला। ड्रगबैंक 1.0¹⁸ में 27 पेप्टाइड्स और 4,396 प्रोटीन के बीच अनुक्रम समानता के वैश्विक सत्यापन ने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के कार्यों से जुड़े मेजबान मानव प्रोटीन के अलावा शीर्ष 5% सीमा के भीतर होने का खुलासा किया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 4:छोटे अणुओं का सारांश, जिनमें से बाध्यकारी लक्ष्यों को इस रणनीति का उपयोग करके पहचाना गयाथा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां, दवा को पहचानने वाले पेप्टाइड्स के क्यूसीएम बायोसेंसर आधारित बायोपैनिंग के लिए एक रणनीति प्रस्तुत की गई है, जिसके बाद पहचाने गए पेप्टाइड्स का उपयोग करके दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन को मान्य करने के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण किया गया है। बायोसेंसर के गोल्ड इलेक्ट्रोड पर स्थिरीकरण के लिए छोटे अणु डेरिवेटिव का डिजाइनिंग एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि पेश किया गया लिंकर दवा को पहचानने वाले पेप्टाइड के बाध्यकारी और संग्रह में बाधा डाल सकता है। इससे बचने के लिए, शुरू किए गए लिंकर के विभिन्न पदों वाले डेरिवेटिव²³तैयार किए जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, हाइड्रोफोबिक छोटे अणुओं को स्थिर करने के लिए, सेंसर चिप को 10 सेमी पेट्री डिश में थोक पानी में डुबोया जाता है, और छोटे अणु (डाइमेथिल सल्फोक्साइड में 10 mm समाधान) का 20 माइक्रोन समाधान बायोसेंसर के सोने के इलेक्ट्रोड पर गिरा दिया जाता है, इसकी सतह को कवर करने के लिए, और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटेड होता है। यह छोटे अणुओं की एक उप-सौ हर्ट्ज आंतरिक आवृत्ति को बनाए रखने की अनुमति देता है, जो बायोपैनिंग के दौरान कम से कम 10 मिनट के लिए आयोजित किया जाता है। दरअसल, इस तरह के स्थिरीकरण का उपयोग करते हुए, ओसेल आत्मीयता-चयनित पेप्टाइड्स ने स्पष्ट रूप से एनए(चित्र 3)में ओसेल-बाध्यकारी साइट पर प्रकाश डाला।

यहां पेप्टाइड लाइब्रेरी तैयार करने के लिए उपयोग किया जाने वाला टी 7 फाज आनुवंशिक रूप से एनकेएन₁₅ कैसेट का उपयोग करके इंजीनियर है जो सभी 20 मानक अमीनो एसिड के लिए 32 कोडन को एन्कोड करता है और 2 स्टॉप कोडन (यूएए, यूजीए) के उद्भव का दमन करता है और केवल UAG(चित्रा 1)^{6, 7}उभरता है। यह 15-मेर पूर्ण लंबाई पेप्टाइड्स प्रदर्शित करने और पुस्तकालय की विविधता को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। टी7 फेज डिस्प्ले सिस्टम में 10^{7 -10}⁹ टी7 फेज की टेक्निकल डिस्प्ले लिमिट है। हालांकि, 15-मेर पेप्टाइड लाइब्रेरी की विविधता सैद्धांतिक रूप से 20¹⁵ (3.27 × 10¹⁹⁾है; इस प्रकार, इसका उपयोग पूर्ण पुस्तकालय निर्माण के लिए नहीं किया जा सकता है। फिर भी, संरक्षित रूपांकनों की समानता खोज या खनन पुस्तकालय में पेप्टाइड्स की इस सीमित विविधता के साथ भी प्रोटीन की दवा-बाध्यकारी साइटों को शामिल करते हुए अमीनो एसिड का पता लगाने की अनुमति देता है। इसके अलावा, 3-5 अमीनो एसिड पुस्तकालय पेप्टाइड के भीतर फैला है (उपस्थिति दर 1/20³ और 1/20⁵के बीच है, जिसे T7 फाज डिस्प्ले सिस्टम का उपयोग करके महसूस किया जा सकता है) छोटे अणु दवाओं की मान्यता में शामिल हैं; इसलिए, लक्ष्य प्रोटीन की दवा बाध्यकारी साइट का गठन करने वाले 15-मेर अमीनो एसिड दृश्यों के साथ पेप्टाइड दृश्यों के 100% मैच की आवश्यकता नहीं है। दरअसल, लगभग 30 आत्मीयता का चयन पेप्टाइड्स सफलतापूर्वक प्रत्येक दवा परीक्षण(चित्र 4)के लिए लक्ष्य प्रोटीन की बाध्यकारी साइट पर प्रकाश डाला । इस प्रकार, उपयोग की जाने वाली माता-पिता T7 फाज लाइब्रेरी की विविधता (1.7 × 10⁷ pfu/mL) का उपयोग दवा-बाध्यकारी साइट को पुनर्निर्माण करने के लिए किया जा सकता है।

आमतौर पर, T7 phages की 3-5 प्रतियां है कि 15-मेर अमीनो एसिड दवा पहचानने अमीनो एसिड फैला के उन लोगों के रूप में एक ही दृश्यों को प्रदर्शित 16 सजीले टुकड़े मनमाने ढंग से अलग के भीतर उभरा, हमारे प्रोटोकॉल के तहत आत्मीयता चयन की सफलता का संकेत है । यह इंगित करता है कि 18-30 विभिन्न दवा पहचानने पेप्टाइड दृश्यों को अलग-थलग 96 सजीले टुकड़े के भीतर एकत्र किया जाता है (संख्या माइक्रोप्लेट प्रारूप से जुड़ी हुई है), जिन्हें बाद में डीएनए के अनुक्रमण का उपयोग करके और इसी अमीनो एसिड अनुक्रम प्राप्त करने की पहचान की जाती है। वर्तमान रणनीति में, टी 7 फाज लाइब्रेरी के 8 माइक्रोन का इंजेक्शन 8 एमएल बफर (पुस्तकालय के 1000 गुना कमजोर पड़ने) वाले क्यूवेट में टी 7 फैज के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए उपयुक्त है। आत्मीयता का चयन पेप्टाइड्स की विविधता को बढ़ाने के लिए, एक चक्र चयन कई बार दोहरा और स्क्रीनिंग प्रति 16 या ३२ पट्टिका अलगाव का उपयोग कर एक समय में एक ही समाधान से अलगाव से अधिक प्रभावी साबित हुआ । उदाहरण के लिए, लगभग 30 अलग-अलग अनुक्रमित आत्मीयता-चयनित पेप्टाइड्स को प्रभावी ढंग से एकत्र करने के लिए, एक चक्र चयन के 3-6 सेट आयोजित किए गए थे, प्रत्येक प्रयोग में 16 या 32 सजीले टुकड़े अलग-थलग किए गए थे। सभी 16 या 32 T7 phage सजीले टुकड़े में समान दृश्यों की उपस्थिति पृष्ठभूमि का आकस्मिक पता लगाने का संकेत दिया जाता है या एक कैरीओवर के रूप में संदूषण हो सकता है । इसके विपरीत, 15-मेर लंबाई की तुलना में छोटे पेप्टाइड्स के साथ कई T7 phages के एक ही अनुक्रम या उपस्थिति के साथ T7 phages की अनुपस्थिति इंगित करता है कि गैर-विशेष रूप से उच्च संभावना के साथ उभरा जनसंख्या में T7 phages। चूंकि क्यूसीएम फ्रीक्वेंसी में कमी ऐसे मामलों में भी उसी हद तक होती है, इसलिए अलग-थलग टी 7 फाज के डीएनए को अनुक्रमित करके चयन की सफलता का व्यापक मूल्यांकन किया जाना चाहिए, जिसके बाद पेप्टाइड्स के अमीनो एसिड दृश्यों का बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, पारंपरिक T7 फाज डिस्प्ले प्रोटोकॉल के विपरीत, चयन के दोहराने के दौर कम प्रभावी होते हैं, क्योंकि T7 फैज की भिन्नता और संख्या छोटी होती है और प्रवर्धन और चयन चरण²³को दोहराने के बाद भी केंद्रित नहीं होती है।

महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि मनुष्यों, रोगजनक वायरस और यहां तक कि पौधों के प्रोटेम्स में छोटे अणु-बाध्यकारी स्थलों के खनन के लिए लागू होती है। दिलचस्प बात यह है कि T7 फाज कैप्सिड पर पेप्टाइड्स की संभवतः असंरचित लघु प्रदर्शन लंबाई एक छोटे अणु के साथ डॉकिंग के दौरान प्रोटीन के पेप्टाइड्स की आणविक गतिशीलता की नकल कर सकती है; यह डायनेमिक बाइंडिंग²⁴को प्रतिबिंबित कर सकते हैं . पारंपरिक तरीकों की तकनीकी सीमाओं से परे, यह रणनीति, छोटे अणुओं के लिए समान प्रोटोकॉल पर लागू होती है, नशा करने योग्य प्रोटेम का विस्तार कर सकती है और साथ ही दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन विश्लेषण के बारे में अधिक दानेदारता प्रदान कर सकती है।

इस दृष्टिकोण की कुछ तकनीकी सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए । बायोसेंसर चिप के सोने के इलेक्ट्रोड सतह पर छोटे अणु स्थिरीकरण के लिए कार्बनिक संश्लेषण आवश्यक है। कार्बनिक रसायन विज्ञान में गैर विशेषज्ञों के लिए, कुछ स्थिरीकरण अभिकर्मक व्यावसायिक रूप से युग्मन द्वारा छोटे अणु को ठीक करने के लिए उपलब्ध हैं । इसके अलावा, पेप्टाइड्स के कुछ बकवास भागों के परिणामस्वरूप प्रोटीन के एक हिस्से का पता लगाना हो सकता है जो झूठी सकारात्मक के रूप में दवा डॉकिंग के लिए प्रासंगिक नहीं है। यह अनुभवजन्य रूप से बीटा-शीट या ल्यूसिन-समृद्ध डोमेन से मेल खाता है जो ल्यूसिन या वैलिन अवशेषों से समृद्ध होते हैं, जिन्हें अन्य मानक अमीनो एसिड की तुलना में अधिक कोडन द्वारा एन्कोड किया जाता है, जब T7 फाज की प्रतियां उत्पादित होती हैं। पुस्तकालय पेप्टाइड लंबाई को नियंत्रित करने से झूठी सकारात्मक घटना को नियंत्रित किया जा सकता है। इसके विपरीत, ऐसे मामले हो सकते हैं जहां दवा-बाध्यकारी साइट में अमीनो एसिड अवशेष जो डॉकिंग में शामिल हैं, जैसा कि एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर विश्लेषण का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, का पता नहीं लगाया जाता है। यह बड़ी संख्या में दवा पहचानने वाले पेप्टाइड्स को इकट्ठा करके या सोने के इलेक्ट्रोड पर छोटे अणुओं को ठीक करने की दिशा बदलकर हल किया जा सकता है।

कई दवा-प्रोटीन इंटरैक्शन जो नशीली दवाओं के उपयोग के मुख्य और माध्यमिक प्रभावों से संबंधित हैं, अभी तक प्रोटेम में अज्ञात हो सकते हैं; इसके अलावा, दवा अवशोषण, वितरण, चयापचय, उत्सर्जन और विषाक्तता के लिए जिम्मेदार एंजाइम और ट्रांसपोर्टर भी अभी भी अज्ञात हो सकते हैं। प्रोटीन बाइंडिंग हमेशा किसी दवा की बायोएक्टिविटी के लिए जिम्मेदार नहीं होती है। इस प्रकार, जैविक परख से अन्य जानकारी के संयोजन से दवाओं के मुख्य और प्रतिकूल प्रभावों के लिए जिम्मेदार आवश्यक दवा लक्ष्यों की पहचान में सुधार होगा । इस संक्षिप्त तकनीक के आगे अनुकूलन छोटे अणु दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रोटीन बाध्यकारी स्थलों के खनन के लिए व्यावहारिकता और थ्रूपुट में वृद्धि होगी । यहां प्रस्तुत विधि काफी हद तक संबंधित क्षेत्रों में न केवल बुनियादी शोधों का संचालन करने में योगदान देगी बल्कि नैदानिक उपयोग में चिकित्सीय प्रभावकारिता या दवाओं के अन्य जैविक प्रभावों में अंतर्निहित आणविक तंत्र को भी स्पष्ट करेगी।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक ने ओसेल्टामिविर और डॉ ली माकोवस्की को स्टैंड-अलोन अवशेष कार्यक्रम प्रदान करने के लिए डीआरएस युजिरो हयाशी और हयातो इशिकावा को धन्यवाद दिया। लेखक क्यूसीएम प्रयोग की तकनीकी सहायता के लिए तेत्सुया कावागोई को भी स्वीकार करते हैं । इस काम को आंशिक रूप से जेएसपीएस काकेनही ग्रांट नंबर 17K01363 (वाईटी) द्वारा समर्थित किया गया था।

डेटा उपलब्धता विवरण

स्टैंड-अलोन अवशेष कार्यक्रम और दवाओं के लिए आत्मीयता-चयनित पेप्टाइड्स के अनुक्रम डेटा के साथ-साथ इस पेपर में उपयोग किए जाने वाले प्रोटेम डेटाबेस से प्रोटीन दृश्य इस लेखक से अनुरोध पर (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp) उपलब्ध हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFFINIXQ_N	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCM2008-STKIT	Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC
AADIV	Northeastern University (Lee Makowski)	AADIV.exe	Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library.
Ceramic Sensor Chip	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMST27C	4 sensor chips/package
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D8418
Ethanol	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	09-0850
FASTAcon	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAcon.exe	Identifies proteins from a population with short consensus sequences.
FASTAskan	Northeastern University (Lee Makowski)	FASTAskan.exe	Lists proteins with high similarity to a peptide population.
Immiblization kit for AFFINIX	ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan)	QCMIMKT	SAM reagent and amine coupling reagent
INFO	Northeastern University (Lee Makowski)	INFO.exe	Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule).
Liquid LB medium	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	L3522	Autoclave for 20 min
MATCH	Northeastern University (Lee Makowski)	MATCH.exe	Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length).
MOTIF1	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF1.exe	Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population.
MOTIF2	Northeastern University (Lee Makowski)	MOTIF2.exe	Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths.
NaCl	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	S3014
Receptor ligand contacts (RELIC)	Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA)	https://www.relic.anl.gov	Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request)
Tris	Merck (Kenilworth, NJ, USA)	252859