Summary
Vi tilbyr en detaljert protokoll for oppdrett, mikroinjeksjon av egg og for effektiv parring av ildbremsen Thermobia domestica for å generere og opprettholde muterte stammer etter genomredigering.
Abstract
Den ildbremse Thermobia domestica er en ametabolous, vingeløs art som er egnet for å studere utviklingsmekanismer av insekter som førte til deres vellykkede evolusjonære stråling på jorden. Anvendelsen av genetiske verktøy som genomredigering er nøkkelen til å forstå genetiske endringer som er ansvarlige for evolusjonære overganger i en Evo-Devo-tilnærming. I denne artikkelen beskriver vi vår nåværende protokoll for å generere og opprettholde muterte stammer av T. domestica. Vi rapporterer en tørr injeksjonsmetode, som et alternativ til den rapporterte våte injeksjonsmetoden, som gjør at vi kan oppnå stabilt høye overlevelsesrater hos injiserte embryoer. Vi rapporterer også en optimalisert miljøinnstilling for å parre voksne og oppnå etterfølgende generasjoner med høy effektivitet. Vår metode understreker viktigheten av å ta hensyn til hver arts unike biologi for vellykket anvendelse av genomredigeringsmetoder til ikke-tradisjonelle modellorganismer. Vi spår at disse genomredigeringsprotokollene vil bidra til å implementere T. domestica som laboratoriemodell og å ytterligere akselerere utviklingen og anvendelsen av nyttige genetiske verktøy i denne arten.
Introduction
Thermobia domestica tilhører en av de mest basale insektordrene, Zygentoma, som beholder en forfedres ametaboløse og vingeløse livssyklus. Slike basale fylogenetiske posisjon og forfedres egenskaper setter denne arten som en attraktiv modell for å studere mekanismene som ligger til grunn for suksessen til insekter på jorden, som dekker over 70% av de beskrevnedyreartene 1. T. domestica har lenge vært brukt hovedsakelig til å studere forfedrenes egenskaper av insektfysiologi på grunn av egnede egenskaper som laboratoriemodell, for eksempel en relativt kort livssyklus (2,5-3,0 måneder fra embryo til reproduktiv voksen; Figur 1A) og en enkel avl. I de siste tre tiårene har bruken blitt utvidet til å undersøke forfedrenes egenskaper av ulike egenskaper som kroppsplan, nevrale differensiering og døgnrytme2,3,4.
Anvendelsen av avanserte genetiske verktøy i T. domestica kan ytterligere akselerere slike bidrag i et bredt forskningsområde. Vellykket RNA interferens (RNAi)-mediert gen knockdown i embryoer, nymfer, og voksne har blitt rapportert i T. domestica4,5,6. Effektiviteten av systemisk RNAi er fortsatt svært artsavhengig- for eksempel er den generelt høy i coleoptera, mens den er lav i lepidoptera-rekkefølgen7. Effektiviteten og varigheten av RNAi-knockdown i T. domestica er ennå ikke vurdert. I tillegg til RNAi har vi tidligere rapportert en vellykket CRISPR/Cas9-mediert gennedslag i T. domestica8. CRISPR/Cas-systemet har blitt mye brukt på genomredigering i insekter, spesielt for målrettet gennedslag. Bruken kan utvides for andre applikasjoner som genreporteranalyse, sporing av celler og manipulering av transkripsjonsaktivitet ved å banke inn eksogene konstruksjoner etter etableringen av en protokoll for levering av komponenter i CRISPR/Cas-systemet ikjerner 9. Kombinert med den publisertegenomsamlingen 10,vil den brede bruken og videreutviklingen av CRISPR/ Cas-basert genomredigering i T. domestica legge til rette for studier med fokus på de evolusjonære mekanismene bak den enestående adaptive suksessen til insekter. Her beskriver vi en detaljert protokoll for embryomikroinjeksjon og for parring av voksen T. domestica for å generere en mutert stamme ved hjelp av CRISPR/Cas9. Med tanke på denne nye metoden diskuterer vi viktigheten av å vurdere den unike biologien til ikke-tradisjonelle modellarter for vellykkede anvendelser av disse teknikkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedlikehold av laboratoriekolonier
- For vedlikehold av villtype og muterte populasjoner, bruk en stor plastbeholder (460 mm x 360 mm x 170 mm) med vanlig kunstig fiskemat, vann i plastkopper med ventilasjonshull på toppen, et brettet papir for å skjule insekter og lagdelt bomull for legging av egg (figur 2A). Hold alle T. domestica kulturer inne 37 °C inkubatorer og sett den relative fuktigheten (RF) inne i hver beholder til 60%–80 %.
MERK: Fordi T. domestica absorberer vanndamp fra atmosfæren11,er det ikke nødvendig med direkte vannforsyning. Riktig RF opprettholdes på grunn av tilstedeværelsen av vanndamp fra plastkopper som inneholder et ventilasjonshull på toppen eller fra lokkløse kopper inne i hver beholder. Det er ikke nødvendig å fukte inne i en hel inkubator som inneholder kulturer. Den omtrentlige varigheten for hvert utviklingsstadium under betingelsen som er beskrevet i denne protokollen, vises i figur 1. Utviklingshastigheten kan justeres ved å endre temperaturen og/eller RH12. - Tilsett mat med jevne mellomrom. Tilsett vann før det tørker opp.
- Overfør populasjonene til en ny ren beholder minst hver tredje måned, gitt at voksne slutter å legge egg i et skittent miljø og/eller tett befolkning (se Diskusjon).
2. Eggsamling og mikroinjeksjon
- Utforme en veiledning RNA (gRNA)
- Utforme en gRNA-sekvens for hvert nødvendige mål og BLAST gRNA-sekvensene mot genomenheten for å kontrollere mulige områder for off-target-gjenkjenning.
- Syntetisere og rense gRNAs i henhold til produsentens instruksjoner8.
MERK: Som et eksempel, i tilfelle av målretting av ATP-bindende kassetttransportør hvitt gen, ble en 20 bp målsekvens designet og to syntetiserte DNA oligonucleotides 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' og 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCAACACACTTA-3' ble bestilt. DNA-malen ble utarbeidet ved å annealere disse to oligonukleotider etterfulgt av PCR forsterkning og gRNA blir deretter in vitro transkribert fra malen med en T7 RNA polymerase.
- Forbered eggsamlingskolonier
- Overfør ca 20 mannlige og 20 kvinnelige voksne til en mellomstor beholder (200 mm x 150 mm x 90 mm) med mat, vannforsyning, et brettet papir og et lite stykke lagdelt bomull for egglegging (figur 2B).
- Sett opp flere kolonier for å få et stort antall iscenesatte embryoer på kort tid som skal brukes til genomredigering.
MERK: Ca 20-40 egg forventes å bli samlet inn fra en koloni etter 8 t ved 37 °C. Det tar vanligvis noen dager for overførte voksne å begynne å legge egg, muligens på grunn av tilpasning til et nytt miljø.
- På injeksjonsdagen erstatter du bomullen inne i beholderne med nye.
- Plasser en dobbeltsidig tape på 76 mm x 26 mm på et vanlig glasssklie på 76 mm x 26 mm.
- Åtte timer senere, samle eggene fra lagdelt bomull ved å skille lagene ved hjelp av tang.
- Juster eggene på det dobbeltsidige båndet ved hjelp av en våt pensel og hold en 2 mm avstand mellom eggene. Alle egg bør være orientert slik at langsgående akse av et egg vender mot injeksjonssiden (Figur 3A). Trykk forsiktig ned eggene med en pensel for fast holding under injeksjonen.
MERK: I denne protokollen vokser sopp raskt i skadede injiserte egg under våt og varm tilstand. Det er viktig å holde avstanden mellom eggene for å forhindre krysskontaminering og utvidelse av sopp. - Bland gRNA- og Cas9-proteinet til en endelig konsentrasjon på henholdsvis 100 ng/μL og 500 ng/μL. Bruk destillert vann til fortynning. Inkuber blandingen i 10 min ved romtemperatur for å fremme ribonucleoprotein kompleks formasjon og deretter holde blandingen på is.
MERK: Nøytral rød ved en endelig konsentrasjon på 1 % kan tilsettes injeksjonsvæsken for å overvåke den injiserte mengden. - Legg 2 μL av gRNA/Cas9-oppløsningen i et glassinjeksjonskapillær med en mikrolaster. Pass på at det ikke er luftbobler i oppløsningen før injeksjonen. Trykk om nødvendig på nålen for å fjerne boblene.
MERK: I dette eksperimentet brukes en ferdig nål til å få en fin nålespiss (figur 3B). En hjemmelaget nål med lignende form kan brukes i stedet. - Fest kapillæren i glasset, tidligere lastet med gRNA/Cas9-oppløsningen, til en holder utstyrt med en manipulator og koble holderen til en elektronisk mikroinjektor.
- Optimaliser formen på nålespissen ved å bryte den litt med tang for å forhindre tilstopping og få bedre holdbarhet gjennom en rekke injeksjoner (et eksempel på en passende nål er vist i figur 3C).
MERK: Det anbefales å bytte kanyle når den er tilstoppet. Det er mulig å fortsette å injisere med samme nål hvis den er ødelagt igjen med tang, men et bredere tips fører til mer eggskade og senker overlevelsesraten. Som T. domestica egg er myke og skjøre, holde en fin nål tips er nøkkelen for å ha en høy overlevelse etter injeksjon. - Sett nålen midt på det langsgående aksen til et egg og injiser en liten mengde oppløsning (se figur 3D–H for referanse til injeksjonsmengden). Juster konfigurasjonen av den elektroniske mikroinjektoren under injeksjon, avhengig av formen på nålespissen.
MERK: Det anbefales å bruke et konstant trykk under injeksjonen, ellers kan klebrig egginnhold lett strømme inn i glassnålen og kan tette den. Løsningen kan være å enten injisere med kort trykkpuls eller med konstant trykk, avhengig av mengden væske injisert. Husk at når en nålespiss har en bred åpning, injiseres for mye oppløsning i et egg, noe som forårsaker dødelighet (figur 3F-H). I så fall opprettholder du en konstant væskestrøm ved konstant trykk, og sett deretter nålen inn i et egg og trekk den ut umiddelbart. Hvis det forårsaker for mye overløp eller egget brister, bytt nålen. - Oppbevar de injiserte eggene i en beholder med riktig størrelse for antall injiserte egg (<20 egg: liten tallerken; >20 egg: mellomstor beholder) med 60 %–80 % RF og 37 °C.
3. Parring
- Kontroller de injiserte eggene regelmessig og kast skadede egg med tang for å unngå soppvekst (figur 3I, J). I tilfelle for mye sopp vokser på et egg, rydd opp overflaten av egget med 70% EtOH.
- Før klekking (ca. 10 dager ved 37 °C etter egglegging), dypp glasset med de injiserte eggene i talkum for å belegge overflaten av det dobbeltsidige båndet. Dette vil unngå stabling av klekket nymfer. Overfør pulverlakkerte glasssklier til en mellomstor beholder med mat, vann og et brettet papir for skjuling av insekter.
- Fjern glassskliene etter at nymfene har klekket ut. Med jevne mellomrom levere mat til de når voksen alder.
MERK: Det tar ca. 2,0–2,5 måneder før enkeltpersoner når voksen alder etter at de klekkes (figur 1A). Den voksne fasen er dømt basert på en velutviklet ovipositor hos kvinner (figur 1B). - For å parre individene, overfør så mange som nødvendig wildtype kvinnelige voksne fra en laboratoriekoloni til den mellomstore beholderen og inkubere dem i minst 14 dager ved 37 ° C for å sikre at de er jomfru.
MERK: Det er ikke nødvendig å samle jomfrukvinner fra en laboratoriekoloni fordi voksen T. domestica har en gjentatt syklus av smelting og parring kalt "reproduktiv og smeltende syklus", der kvinner kaster bort sæd med hver smeltet og kompis igjen i neste befruktning syklus13. - Overfør enten en mann eller en hunn G0 voksen som utviklet seg fra et injisert egg og wildtype voksen (e) til en liten plastrett (Ø 100 mm x 40 mm) med mat, et brettet papir og et lite stykke bomull for legging av G1 egg (Figur 2C'; parringsfat). Oppbevar paringsrettene i en større beholder med 60 %–80 % RF (figur 2C).
MERK: Flere wildtype voksne kan inkluderes i en tallerken for å øke sjansen for vellykket parring, selv om høye suksessrater er oppnådd med en-til-en-sammenkobling.
4. Genotyping
- Design PCR primer par for hver gRNA å forsterke en 100-200 bp produkt som inkluderer området målrettet av gRNA. BLAST hver primer sekvens mot genomenheten for å kontrollere spesifisiteten (et eksempel er vist for målretting av det hvite genet i figur 4A).
- Sjekk germline transformasjon av G0 voksne.
- Fem dager etter at eggene er lagt, samle individuelle G1 egg fra hver G0 voksen par i 0,2 ml rør (ett egg per rør, lagre innsamlede prøver ved -20 °C for en langsiktig lagring). Skill bomullslagene for å samle eggene.
MERK: Det anbefales å genotype minst 12 G1 nymfer fra hvert parringspar for å evaluere suksessen til germline-overføringen (se Representative resultater). - Tilsett 15 μL av en 0,25 mg/ml Proteinase K-oppløsning (oppløst i Tris-EDTA-buffer) i hvert rør, homogeniser prøver med tannpirkere og inkuber ved 55 °C i 3 til 16 timer.
- Inaktiver Proteinase K ved å plassere prøvene ved 95 °C i 10 min.
- Tilsett 90 μL destillert vann til hvert rør og bland godt. Bruk 2 μL supernatant i en 10 μL PCR reaksjonsblanding som inneholder primerne som er utformet i trinn 4.1.
MERK: Bruk av en DNA-polymerase optimalisert for råoljemaler anbefales å nå nok PCR-forsterkning. - For å analysere PCR-produktene, utfør en heteroduplex mobilitetsanalyse (HMA) med et mikrochip elektroforesesystem (Figur 3B; se Ohde et al., 2018)8.
MERK: Mutasjoner kan vurderes med to alternative metoder: (1) HMA med standard gelpolymerer, for eksempel 8% polyakrylamid14; (2) fordøyelsen av PCR-produkter med T7 endonukleær etterfulgt av agarose gel elektroforese15. - Hold bare G1 nymfer som følge av G0 voksne som inneholder mutasjoner i deres germline og kaste bort de andre.
- Fem dager etter at eggene er lagt, samle individuelle G1 egg fra hver G0 voksen par i 0,2 ml rør (ett egg per rør, lagre innsamlede prøver ved -20 °C for en langsiktig lagring). Skill bomullslagene for å samle eggene.
- Individuell genotyping av G1 nymfer/voksne
- Isoler G1-nymfer i 24-brønnsplater med en aspirator eller en pensel. Plasser de 24-brønnsplatene i en større beholder (f.eks. den mellomstore beholderen som brukes i denne protokollen) med vannforsyning som beskrevet ovenfor for å holde en RF på 60%-80% (figur 1D). Opprettholde tilførselen av kunstig vanlig fiskemat (Figur 1D').
MERK: Selv om dette trinnet kan utføres når som helst i nymphal og voksen stadier, anbefales det å utføre det etter å ha nådd voksen alder og like før paring (> 2,5 måneder etter injeksjon; Figur 1B) fordi det er lettere å vedlikeholde ildbremser i en stor beholder. Individuell oppdrett er nødvendig for å spore genotypen til hver G1 nymfe på følgende trinn. G1 nymfer fra samme G0 voksen kan ha forskjellige mutasjoner. - Klyp og trekk cerci og caudal filament fra en nymfe / voksen ved hjelp av tang og samle dem inn i en 0,2 ml rør som inneholder 50 μL EtOH (lagre de innsamlede prøvene ved -20 ° C for en langsiktig lagring).
MERK: Vevsprøver samles inn i EtOH fordi det forhindrer tap av disse små prøvene på grunn av statisk elektrisitet. Hvis man trenger å stoppe bevegelsen av insekter, bedøve nymfe / voksen på is når du tar vevsprøver. Fordi T. domestica ikke kan overleve etter langsiktig kjøling på is, ikke bedøve dem i mer enn et minutt og umiddelbart flytte dem tilbake til romtemperatur. Ablasjon av cerci og den kaudale filamentet forårsaker ingen økning i dødeligheten. - Plasser prøverørene med lokkene åpne på en termisk blokk i 15 min ved 70 °C for å fordampe EtOH.
- Gjenta trinn 4.2.2–4.2.5 for genotyping.
- Send inn PCR-produktene der et mutert båndmønster observeres til en standard Sanger-sekvenseringstjeneste.
- Hold G1-nymfene/voksne med ønskede mutasjoner og kast de andre (se figur 4C for et representativt sekvenseringsresultat).
- Isoler G1-nymfer i 24-brønnsplater med en aspirator eller en pensel. Plasser de 24-brønnsplatene i en større beholder (f.eks. den mellomstore beholderen som brukes i denne protokollen) med vannforsyning som beskrevet ovenfor for å holde en RF på 60%-80% (figur 1D). Opprettholde tilførselen av kunstig vanlig fiskemat (Figur 1D').
- Kryss de voksne som inneholder de ønskede mutasjonene i en parringsfat og få de neste generasjonene til å etablere en homozygous mutant stamme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I våre hender kan ca 100 egg injiseres godt med en enkelt injeksjon kapillær når den har tilstrekkelig tips (Figur 3C). Injeksjon av gRNA/Cas9 ribonucleoprotein kompleks i embryoer innen de første 8 timer etter egg legging resulterer i indels på gRNA målrettet sted. Dette fører til biallelic mutasjoner i noen celler i injisert generasjon (G0) og dermed muterte mosaikk fenotyper er vanligvis oppnådd i G0. For eksempel, når denne protokollen ble brukt til å injisere en gRNA som er utformet for å målrette det hvite genet, 32,6% av G0 nymfer viser delvis tap av pigmentering i sine sammensatte øyne og dorsale regioner (figur 5)8.
Ved hjelp av den for tiden beskrevne tørre injeksjonsmetoden, når 80–120 egg injiseres, er overlevelsesraten til de injiserte embryoene så høy som 40%–60 %. Dette er i motsetning til den forrige våte injeksjonsmetoden, der egg injiseres og vedlikeholdes på en agaroseplate, noe som av og til resulterer i en overlevelsesrate på mindre enn 10%.
Vurdering av germline transformasjon av G0 voksne og muterte G1 individer ble gjort av genomisk PCR etterfulgt av HMA. I HMA, wildtype og mutant alleler anneal i hver mulig kombinasjon, noe som vanligvis resulterer i fire forskjellige bånd på en gel elektroforese (to homoduplexes og to heteroduplexes)14. I G1-prøver er differensialbåndmønstre mellom wildtype og muterte prøver tydelig skilles (figur 4B). Germline transformasjon ble funnet hos 39,1% av G0 voksne da vi målrettet det hvite genet8. Etter vår erfaring varierer prosentandelen av muterte individer i G1-nymfer fra et enkelt G0-par fra 25% til 100%.
For å evaluere effekten av vårt parringsmiljø på parringssuksessen, krysset vi wildtype voksne i en parringsfat og oppnådde en suksessrate på 95,8% (23/24 par).
Figur 1: Livssyklusen til T. domestica. (A)Omtrentlig varighet av hvert utviklingsstadium i T. domestica. (B) Dorsal syn på en voksen kvinne. Pilspiss indikerer en velutviklet ovipositor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kunstige miljøer som brukes i denne protokollen. (A) En stor beholder for laboratoriekoloni, (B) en mellomstor beholder for eggsamling,(C) parring retter med vannforsyning i en stor beholder, (C ') en parringsfat, (D) en 24-brønns plate med vannforsyning i mellomstore beholderen. Boxed regionen er forstørret i (D ') for å vise en T. domestica person. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Tørr injeksjon av T. domestica egg. (A) Egg justert på et glass lysbilde. Svart pil angir punktet der en nål er satt inn. (B)Form av en glass nål tips brukes til injeksjon. (C) Den samme glassnålen før (øverst) og etter (nederst) bryter spissen. Nåler ble fylt med 1% nøytral rød. Pilspissen indikerer spissen av nålen. Vektstangen er 1 mm. (D) Uinjisert egg. (E) Et godt eksempel på en injeksjon. Pilen angir injeksjonspunktet. (F-H) Oppløsningen renner over fra det injiserte stedet (F) eller fra motsatt side (G) av det injiserte egget; for mye injeksjonsvolum forårsaket et utbrudd (H). Pilspiss indikerer overfylt egginnhold. (I)Normalt utviklet sent embryo. Pilspiss indikerer det fargede sammensatte øyet. (J) Krympet skadet egg 3 dager etter injeksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Genotyping av G1-personer. (A) PCR primere er utformet for å forsterke en 120 bp genomisk region som inkluderer gRNA målområdet. (B)Flere band av homoduplex og heteroduplex DNAs oppdages i muterte prøver mens enkeltbånd vises i uformuterte prøver. L: DNA stige, U: uformuterte prøver, M: muterte prøver. (C) Representativt resultat av direkte sekvensering av PCR-produkter fra wildtype og heterozygous mutant prøver. Sekvenser av wildtype og mutant ( 
) allele vises på toppen. Den fremre primeren vist i (A) ble brukt som sekvensering primer. Sekvensen av en heterozygous mutant (nederst) indikeres av to overlappende sekvenser fra det forventede spaltingsstedet (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Mosaic tap av pigmenter i sammensatte øyne og i dorsal-regionen etter å ha rettet seg mot det hvite genet med gRNA / Cas9 proteininjeksjon. (A) Wildtype og (B) hvit gRNA / Cas9 protein-injisert første instar nymfer. Delvis tap av svarte og rosa pigmenteringer i øyne (pilhode) og i dorsalområdet (pil) er angitt. Skala bar er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For den vellykkede generasjonen av ønsket T. domestica mutant med CRISPR/Cas9, er det først viktig å samle et tilstrekkelig antall iscenesatte embryoer til injeksjon. For en konstant samling av et tilstrekkelig antall T. domestica egg, er nøkkelen å velge en passende størrelse på beholderen for å ha en lavere befolkningstetthet fordi det ville hjelpe vellykket gjennomføring av en rekke komplekse parring atferd, som gjentas etter hver voksen smeltet13. En mannlig T. domestica voksen overfører sin sperm indirekte til en kvinne via en spermatofor. Sweetman (1938) rapporterte at det tar mannlige voksne 20 til 35 min fra initiering av parring atferd til plassering av en spermatofor12. Det er sannsynlig at forstyrrelse av samspillet mellom et parringspar av andre individer forhindrer vellykket befruktning, noe som kan skje oftere i et tett miljø.
Selv om egg samles 8 timer etter å ha erstattet bomullen inne i en beholder for å samle nok egg i vår protokoll, kan høyere effektivitet av genomredigering oppnås ved å samle egg og injisere dem innen kortere tid (f.eks. 4 timer etter egglegging) når injiserte materialer har større sjanse til å bli levert til den store andelen kjerner. Injeksjon til et tilstrekkelig antall egg innen kortere tid kan gjøres ved (1) øke antall eller størrelsen på beholdere hvis plassen tillater, eller (2) gjenta samme prosedyre for å oppnå et tilstrekkelig antall injiserte egg.
Injeksjonsstedet anses generelt å være viktig for vellykket germline transformasjon i insekter. T. domestica egg er vanligvis ellipsoidal i form og inneholder et bakteriebånd på en stang av deres langsgående akse. Det anbefales å injisere gRNA/Cas9-blandingen midtpunktet i eggeveldralaksen fordi det er vanskelig å identifisere stangen der et bakteriebånd dannes i tidlige embryoer på grunn av den variable formen på T. domestica egg. Selv om gRNA/Cas9-løsningen ikke injiseres direkte til stedet for bakteriebånddannelsen, har vi oppnådd germlinetransformasjon i så høyt som 39,1% av G0 voksne8.
Under mikroinjeksjon av egg er det viktig å bruke en fin nålspiss for å oppnå høy overlevelse, da det er tilfelle for andre dyremodeller. Vi oppnådde en høyere overlevelsesrate etter injeksjon med ferdige nåler enn ved bruk av hjemmelagde glassnåler i T. domestica egg. Imidlertid kan en tilsvarende høy overlevelse oppnås ved å replikere den fine nåleformen med hjemmelagde nåler (som vist i figur 3B, C). Ifølge vår erfaring resulterer tørrinjeksjonsmetoden i en høyere overlevelsesrate enn den tidligere rapporterte våtinjeksjonsmetoden8. Vi fant at egginkubasjon i et tørt miljø er nøkkelen til denne forbedringen, og utnytter det faktum at T. domestica egg og tidlige nymfer er motstandsdyktige mot uttørking. Dette er i samsvar med tidligere rapporter som tyder på at denne arten foretrekker et tørt miljø, spesielt i tidlige utviklingsstadier, og at et vått miljø til og med kan være skadelig16. I stedet for en plastplate kan en agarosegel brukes til en rask justering av eggene; Men overføring av injiserte egg til en tørr overflate fører til en høyere overlevelse.
Til slutt understreker vår metode viktigheten av å ta den unike biologien til T. domestica i betraktning for en vellykket genomredigering: å holde et sparsomt miljø for å samle et tilstrekkelig antall egg og et tørt miljø for å ha en høyere overlevelsesrate av injiserte embryoer. De grunnleggende protokollene for injeksjon, parring og kulturvedlikehold rapportert her brukes ikke bare for å generere muterte stammer med genomredigering, men også for anvendelser av andre genetiske verktøy som RNAi og transgenese og vil bidra til å forstå mekanismene som ligger til grunn for den tidlige utviklingen av insekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
TIL og TD ble støttet av JSPS KAKENHI tilskuddsnumre 19H02970 og 20H02999, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
