Summary
Vi leverer en detaljeret protokol for opdræt, mikroinjection af æg og for effektiv parring af firebrat Thermobia domestica at generere og vedligeholde mutant stammer efter genom redigering.
Abstract
Den firebrat Thermobia domestica er en ametaboløs, vingeløs art, der er egnet til at studere de udviklingsmæssige mekanismer af insekter, der førte til deres vellykkede evolutionære stråling på jorden. Anvendelsen af genetiske værktøjer såsom genomredigering er nøglen til at forstå genetiske ændringer, der er ansvarlige for evolutionære overgange i en Evo-Devo-tilgang. I denne artikel beskriver vi vores nuværende protokol til generering og vedligeholdelse af mutantstammer af T. domestica. Vi rapporterer en tør injektionsmetode som et alternativ til den rapporterede våde injektionsmetode, der giver os mulighed for at opnå stabilt høje overlevelsesrater i injicerede embryoner. Vi rapporterer også en optimeret miljøindstilling for at parre voksne og opnå efterfølgende generationer med høj effektivitet. Vores metode understreger vigtigheden af at tage hensyn til hver arts unikke biologi for en vellykket anvendelse af genomredigeringsmetoder på ikke-traditionelle modelorganismer. Vi forudser, at disse genomredigeringsprotokoller vil hjælpe med at implementere T. domestica som laboratoriemodel og yderligere fremskynde udviklingen og anvendelsen af nyttige genetiske værktøjer i denne art.
Introduction
Thermobia domestica tilhører en af de mest basale insektordrer, Zygentoma, som bevarer en forfædres ametaboløs og vingeløs livscyklus. En sådan basal fylogenetisk position og forfædres egenskaber sætter denne art som en attraktiv model til undersøgelse af de mekanismer, der ligger til grund for insekternes succes på Jorden, som dækker over 70% af de beskrevne dyrearter1. T. domestica har længe hovedsagelig været anvendt til at studere insektfysiologiens forfædres egenskaber på grund af dens egnede egenskaber som laboratoriemodel, såsom en relativt kort livscyklus (2,5-3,0 måneder fra embryo til reproduktiv voksen; Figur 1A) og en nem avl. I de sidste tre årtier er dets anvendelse blevet udvidet til at undersøge forfædres egenskaber ved forskellige træk som kropsplan, neural differentiering og døgnrytme2,3,4.
Anvendelsen af avancerede genetiske værktøjer i T. domestica kunne yderligere fremskynde sådanne bidrag på et bredt forskningsområde. Vellykket RNA interferens (RNAi)-medieret gen knockdown i embryoner, nymfer, og voksne er blevet rapporteret i T. domestica4,5,6. Effektiviteten af systemisk RNAi er stadig meget artsafhængig - for eksempel er den generelt høj i coleoptera, mens den er lav i lepidoptera-rækkefølgen7. Effektiviteten og varigheden af RNAi knockdown i T. domestica er endnu ikke vurderet. Ud over RNAi har vi tidligere rapporteret en vellykket CRISPR/Cas9-medieret gen knockout i T. domestica8. CRISPR/Cas-systemet er i vid udstrækning blevet anvendt til genomredigering i insekter, især til målrettet gen knockout. Dens anvendelse kunne udvides til andre applikationer såsom gen reporter assay, celle afstamning tracking, og manipulation af transskriptionel aktivitet ved at banke-in udefrakommende konstruktioner efter oprettelsen af en protokol for levering af komponenter i CRISPR / Cas-systemet i kerne9. Kombineret med den offentliggjorte genomsamling10vil den brede anvendelse og videreudvikling af den CRISPR/Cas-baserede genomredigering i T. domestica lette undersøgelser med fokus på de evolutionære mekanismer bag insekternes enestående adaptive succes. Her beskriver vi en detaljeret protokol for embryomikroinjection og for parring af voksen T. domestica for at generere en mutant stamme ved hjælp af CRISPR/Cas9. I betragtning af denne nye metode diskuterer vi vigtigheden af at overveje den unikke biologi af ikke-traditionelle modelarter til vellykkede anvendelser af disse teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vedligeholdelse af laboratoriekolonier
- Til vedligeholdelse af vilde og mutantpopulationer skal du bruge en stor plastbeholder (460 mm x 360 mm x 170 mm) med almindelig kunstig fiskefoder, vand i plastikkopper med et ventilationshul på toppen, et foldet papir til at skjule insekterne og lagdelt bomuld til æglægning (Figur 2A). Hold alle T. domestica kulturer inde i 37 °C inkubatorer og sæt den relative luftfugtighed (RH) inde i hver beholder til 60%-80%.
BEMÆRK: Da T. domestica absorberer vanddamp fra atmosfæren11, er der ikke behov for en direkte vandforsyning. Den relevante RH opretholdes på grund af tilstedeværelsen af vanddamp fra plastikkopper, der indeholder et ventilationshul på toppen eller fra lågløse kopper inde i hver beholder. Der er ingen grund til at befugte inde i en hel inkubator, der indeholder kulturer. Den omtrentlige varighed af hvert udviklingsstadium på den betingelse, der er beskrevet i denne protokol, er vist i figur 1. Udviklingshastigheden kan justeres ved at ændre temperaturen og/eller RH12. - Tilsæt mad med jævne mellemrum. Tilsæt vand, før det tørrer op.
- Overfør populationerne til en ny ren beholder mindst hver 3. måned, da voksne holder op med at lægge æg i et beskidt miljø og/eller en tæt population (se diskussion).
2. Ægindsamling og mikroinjection
- Design en guide RNA (gRNA)
- Design en gRNA-sekvens for hvert påkrævet mål, og BLAST gRNA-sekvenserne mod genomsamlingen for at kontrollere mulige steder, hvor genkendelse uden for målet kan identificeres.
- Syntetisere og rense gRNA'erne i overensstemmelse med producentens anvisninger8.
BEMÆRK: Som et eksempel blev der i forbindelse med målretning af det ATP-bindende kassettetransportørhvide gen designet en 20 bp-målsekvens, og to syntetiserede DNA-oligonukleotider 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' og 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' blev bestilt. DNA-skabelonen blev udarbejdet ved at annealere disse to oligonukleotider efterfulgt af PCR-forstærkning, og gRNA'et transskriberes derefter fra skabelonen med en T7 RNA-polymerase.
- Forbered æg indsamling kolonier
- Der overføres ca. 20 han- og 20 voksne kvinder til en mellemstor beholder (200 mm x 150 mm x 90 mm) med mad, vandforsyning, foldet papir og et lille stykke lagdelt bomuld til æglægning (Figur 2B).
- Opret flere kolonier for at opnå et stort antal iscenesatte embryoner på kort tid, der skal bruges til genomredigering.
BEMÆRK: Omkring 20-40 æg forventes at blive indsamlet fra en koloni efter 8 timer ved 37 °C. Det tager normalt et par dage for overførte voksne at begynde at lægge æg, muligvis på grund af tilpasning til et nyt miljø.
- På injektionsdagen skal bomulden udskiftes inde i beholderne med nye.
- Placer et dobbeltsidet bånd på 76 mm x 26 mm på en almindelig glasrutsjebane på 76 mm x 26 mm.
- Otte timer senere skal du samle æggene fra den lagdelte bomuld ved at adskille lagene ved hjælp af pincet.
- Juster æggene på det dobbeltsidede tape ved hjælp af en våd pensel og hold en 2 mm afstand mellem æggene. Alle æg skal være orienteret, så et ægs længdeakse vender mod injektionssiden (Figur 3A). Tryk forsigtigt æggene ned med en pensel for fast opbevaring under injektionen.
BEMÆRK: I denne protokol vokser svampen hurtigt i beskadigede injicerede æg under våd og varm tilstand. Det er vigtigt at holde afstanden mellem æggene for at forhindre krydskontaminering og udvidelse af svamp. - GRNA- og Cas9-proteinet blandes til en endelig koncentration på henholdsvis 100 ng/μL og 500 ng/μL. Brug destilleret vand til fortynding. Inkuber blandingen i 10 minutter ved stuetemperatur for at fremme ribonukleoprotein kompleks dannelse og derefter holde blandingen på is.
BEMÆRK: Neutral rød ved en 1% endelig koncentration kan tilsættes til injektionsopløsningen for at overvåge den injicerede mængde. - 2 μL af gRNA/Cas9-opløsningen indlæses i en kapillær med glasindsprøjtning med en mikrolæsser. Sørg for, at der ikke er luftbobler i opløsningen før injektionen. Tryk om nødvendigt på nålen for at fjerne boblerne.
BEMÆRK: I dette forsøg anvendes en færdig nål til at opnå en fin nålespids (Figur 3B). En hjemmelavet nål med en lignende form kunne bruges i stedet. - Sæt glasindsprøjtningskapillæren, der tidligere var fyldt med gRNA/Cas9-opløsningen, på en holder, der er udstyret med en manipulator, og tilslut holderen til en elektronisk mikroinjektor.
- Optimer nålespidsens form ved at bryde den lidt med tang for at forhindre tilstopning og få bedre holdbarhed gennem en række injektioner (et eksempel på en passende nål er vist i figur 3C).
BEMÆRK: Det anbefales at skifte nål, når den er tilstoppet. Det er muligt at fortsætte med at injicere med den samme nål, hvis den brydes igen med pincet, men en bredere spids fører til mere ægskade og sænker deres overlevelsesrate. Da T. domestica æg er bløde og skrøbelige, holde en fin nål spids er nøglen til at have en høj overlevelsesrate efter injektion. - Indslut nålen midt på et ægs længdeakse, og indsprøjt en lille mængde af opløsningen (se figur 3D-H som reference på injektionsmængden). Juster konfigurationen af den elektroniske mikroinjektor under injektionen, afhængigt af nålespidsens form.
BEMÆRK: Det anbefales at trykke konstant under injektionen, da indholdet af klæbrige æg ellers let kan strømme ind i glasnålen og kan tilstoppe det. Opløsningen kan være enten at injicere med en kort trykpuls eller med et konstant tryk, afhængigt af mængden af væske, der injiceres. Husk, at når en nålespids har en bred åbning, injiceres der for meget opløsning i et æg, hvilket forårsager dødelighed (Figur 3F-H). I dette tilfælde skal du opretholde en konstant væskestrøm ved konstant tryk, derefter indsætte nålen i et æg og trække den ud med det samme. Hvis det forårsager for meget overløb eller ægget brister, skal du ændre nålen. - De injicerede æg opbevares i en beholder med en passende størrelse til antallet af injicerede æg (<20 æg: lille skål; >20 æg: mellemstor beholder) med 60%-80% RH og 37 °C.
3. Parring
- Kontroller de injicerede æg med jævne mellemrum, og kassér beskadigede æg med pincet for at undgå svampevækst (figur 3I,J). I tilfælde af at der vokser for meget svamp på et æg, skal du rydde op i æggets overflade med 70% EtOH.
- Før udklækning (ca. 10 dage ved 37 °C efter æglægning) dyppes glasrutsjebanen med de injicerede æg i talkum for at belægge overfladen af det dobbeltsidede bånd. Dette vil undgå stabling af udklækkede nymfer. Overfør de pulverlakerede glasrutsjebaner til en mellemstor beholder med mad, vand og et foldet papir til skjul af insekterne.
- Fjern glasrutsjebanerne, når nymferne er udklækket. Leverer regelmæssigt mad, indtil de når voksenalderen.
BEMÆRK: Det tager omkring 2,0-2,5 måneder for enkeltpersoner at nå voksenalderen, når de klækkes (Figur 1A). Voksenstadiet bedømmes på grundlag af en veludviklet ovipositor hos kvinder(figur 1B). - For at parre individerne skal du overføre så mange som nødvendigt vilde kvindelige voksne fra en laboratoriekoloni til den mellemstore beholder og inkubere dem i mindst 14 dage ved 37 °C for at sikre, at de er jomfruelige.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at samle jomfruhunner fra en laboratoriekoloni, fordi voksne T. domestica har en gentagen cyklus af smeltning og parring kaldet "reproduktiv og smeltende cyklus", hvor kvinder smider sæd med hver smeltning og parrer sig igen i den næste befrugtningscyklus13. - Overfør enten en mandlig eller en kvindelig G0 voksen, der udviklede sig fra en injiceret æg og wildtype voksen (r) til en lille plastik parabol (Ø 100 mm x 40 mm) med mad, et foldet papir, og et lille stykke bomuld til lægning G1 æg(Figur 2C'; parring parabol). Hold parringsskålene i en større beholder med 60%-80% RH (Figur 2C).
BEMÆRK: Flere wildtype voksne kan indgå i en skål for at øge chancen for vellykket parring, selv om høje succesrater er opnået med en-til-en parring.
4. Genotyping
- Design PCR primer par for hver gRNA at forstærke en 100-200 bp produkt, der omfatter det websted, der er målrettet af gRNA. BLAST hver primer sekvens mod genomet forsamling for at kontrollere dens specificitet (et eksempel er vist for målretning af det hvide gen i figur 4A).
- Tjek kønsceller transformation af G0 voksne.
- Fem dage efter æggene lægges, indsamles individuelle G1-æg fra hvert G0-voksenpar i 0,2 mL-rør (et æg pr. rør; opbevarer indsamlede prøver ved -20 °C til langtidsopbevaring). Adskil bomuldslagene for at samle æggene.
BEMÆRK: Det anbefales at genotype mindst 12 G1 nymfer fra hvert parringspar for at evaluere succesen af kønsceller transmission (se repræsentative resultater). - Der tilsættes 15 μL af en 0,25 mg/mL Proteinase K-opløsning (opløst i Tris-EDTA-buffer) til hvert rør, homogeniseres kort prøver med tandstikkere, og der inkuberes ved 55 °C i 3 til 16 timer.
- Proteinase K inaktiveres ved at anbringe prøverne ved 95 °C i 10 min.
- Der tilsættes 90 μL destilleret vand til hvert rør og blandes godt. Der anvendes 2 μL supernatant i en 10 μL PCR-reaktionsblanding, der indeholder primere designet i trin 4.1.
BEMÆRK: Brugen af en DNA-polymerase, der er optimeret til rå skabeloner, anbefales at nå nok PCR-forstærkning. - Hvis du vil analysere PCR-produkterne, skal du udføre en heteroduplex mobilitetsanalyse (HMA) med et mikrochipelektroforesesystem(Figur 3B; se Ohde et al., 2018)8.
BEMÆRK: Mutationer kan vurderes med to alternative metoder: (1) HMA med standardgelpolymerer, såsom 8% polyacrylamid14; (2) fordøjelse af PCR-produkter med T7 endonuklease efterfulgt af agarosegelelektrophoresis15. - Hold kun G1 nymfer som følge af G0 voksne, der indeholder mutationer i deres kønsceller og kassere de andre.
- Fem dage efter æggene lægges, indsamles individuelle G1-æg fra hvert G0-voksenpar i 0,2 mL-rør (et æg pr. rør; opbevarer indsamlede prøver ved -20 °C til langtidsopbevaring). Adskil bomuldslagene for at samle æggene.
- Individuel genotypning af G1 nymfer/voksne
- Isoler G1 nymfer i 24-brønds plader med en aspirator eller en pensel. Placer 24-brøndspladerne i en større beholder (f.eks. den mellemstore beholder, der anvendes i denne protokol) med vandforsyning som beskrevet ovenfor for at holde en RH på 60%-80% (Figur 1D). Opretholde forsyningen af kunstige almindelige fiskefoder(figur 1D').
BEMÆRK: Selvom dette trin kan udføres på ethvert tidspunkt af nymphal og voksne stadier, anbefales det at udføre det efter at have nået voksenalderen og lige før parring (>2,5 måneder efter injektion; Figur 1B) fordi det er lettere at vedligeholde brandslukninger i en stor beholder. Individuel opdræt er nødvendig for at spore genotypen for hver G1 nymfe på følgende trin. G1 nymfer fra samme G0 voksen kan have forskellige mutationer. - Knib og træk cerci og kaudale glødetråd fra en nymfe / voksen ved hjælp af pincet og samle dem i en 0,2 mL rør, der indeholder 50 μL EtOH (opbevar de indsamlede prøver ved -20 °C for en langsigtet opbevaring).
BEMÆRK: Vævsprøver indsamles i EtOH, fordi det forhindrer tab af disse små prøver på grund af statisk elektricitet. Hvis man har brug for at stoppe bevægelsen af insekter, bedøve nymfe / voksen på is, når man tager vævsprøver. Fordi T. domestica ikke kan overleve efter langvarig afkøling på is, må du ikke bedøve dem i mere end et minut og straks flytte dem tilbage til stuetemperatur. Ablation af cerci og kaudale filament forårsager ingen stigning i dødeligheden. - Prøverørene anbringes med lågene åbne på en termisk blok i 15 minutter ved 70 °C for at fordampe EtOH.
- Gentag trin 4.2.2-4.2.5 for genotyping.
- Indsend de PCR-produkter, hvor et mutantbåndsmønster observeres, til en standard Sanger-sekventeringstjeneste.
- Hold G1 nymferne/de voksne med de ønskede mutationer, og kassér de andre (se figur 4C for et repræsentativt sekventeringsresultat).
- Isoler G1 nymfer i 24-brønds plader med en aspirator eller en pensel. Placer 24-brøndspladerne i en større beholder (f.eks. den mellemstore beholder, der anvendes i denne protokol) med vandforsyning som beskrevet ovenfor for at holde en RH på 60%-80% (Figur 1D). Opretholde forsyningen af kunstige almindelige fiskefoder(figur 1D').
- Kryds de voksne, der indeholder de ønskede mutationer i en parringsskål, og få de næste generationer til at etablere en homozygot mutant stamme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vores hænder kan omkring 100 æg injiceres godt med en enkelt injektion kapillær, når den har tilstrækkelig spids (Figur 3C). Injektion af gRNA/Cas9 ribonucleoproteinkompleks i embryoner inden for de første 8 timer efter æglægning resulterer i indeller på det gRNA-målrettede sted. Dette forårsager biallelic mutationer i nogle celler i den injicerede generation (G0) og dermed mutant mosaik fænotyper er normalt opnået i G0. For eksempel, når denne protokol blev brugt til at injicere et gRNA, der er designet til at målrette det hvide gen, viser 32,6% af G0 nymfer delvis tab af pigmentering i deres sammensatte øjne og dorsale regioner (Figur 5)8.
Ved hjælp af den nuværende beskrevne tør injektionsmetode, når der injiceres 80-120 æg, er overlevelsesraten for de injicerede embryoner så høj som 40%-60%. Dette er i modsætning til den tidligere våde injektionsmetode, hvor æg injiceres og vedligeholdes på en agaroseplade, hvilket lejlighedsvis resulterer i en overlevelsesrate på mindre end 10%.
Vurdering af kønsceller transformation af G0 voksne og muterede G1 individer blev udført af genomisk PCR efterfulgt af HMA. I HMA, wildtype og mutant alleler anneal i hver mulig kombination, hvilket typisk resulterer i fire forskellige bånd på en gel elektroforese (to homoduplexer og to heteroduplexer)14. I G1-prøver skelnes der klart mellem differentialbåndsmønstre mellem vilde og muterede prøver (figur 4B). Germline transformation blev fundet i 39,1% af G0 voksne, da vi målrettet det hvide gen8. Det er vores erfaring, at procentdelen af muterede individer i G1 nymfer fra et enkelt G0-par varierer fra 25% til 100%.
For at evaluere effekten af vores parringsmiljø på parringssuccesen krydsede vi vilde type voksne i en parringsskål og opnåede en succesrate på 95,8% (23/24 par).
Figur 1: Livscyklussen for T. domestica. (A)Omtrentlig varighed af hvert udviklingsstadium i T. domestica. (B) Dorsal opfattelse af en voksen kvinde. Pilespids angiver en veludviklet ovipositor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kunstige miljøer, der anvendes i denne protokol. (A) En stor beholder til laboratoriekoloni ,B) en mellemstor beholder til ægopsamling ,( C) parringsretter med vandforsyning i en stor beholder , c) enparringsskål, d ) en 24-brønds plade med vandforsyning i den mellemstore beholder. Boxed region er forstørret i (D ') for at vise en T. domestica person. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tør injektion af T. domestica æg. (A)Æg justeret på en glasrutsjebane. Sort pil angiver det punkt, hvor en nål indsættes. (B) Formen på en glasnålspids, der anvendes til injektion. (C) Den samme glasnål før (øverst) og efter (nederst) at bryde spidsen. Nåle var fyldt med 1% neutral rød. Pilespidsen angiver nålespidsen. Skalastangen er 1 mm. (D) Æg, der ikke injiceres. (E)Et godt eksempel på en injektion. Pilen angiver injektionspunktet. (F-H) Opløsningen er overfyldt fra det injicerede sted (F) eller fra den modsatte side (G) af det injicerede æg; for meget injektionsvolumen forårsagede en eksplosion (H). Pilespids angiver overløb af ægindhold. (I) Normalt udviklet sent embryo. Pilespids angiver det farvede sammensatte øje. (J) Indskrumpet beskadiget æg 3 dage efter injektionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Genotyping af G1 individer. (A) PCR primere er designet til at forstærke en 120 bp genomisk region, der omfatter gRNA-målstedet. (B) Der påvises flere bånd af homoduplex og heteroduplex-DNA'er i muterede prøver, mens enkelte bånd forekommer i ikke-udtømte prøver. L: DNA stige, U: ikke-udtømt prøver, M: muterede prøver. (C) Repræsentativt resultat af direkte sekvensering af PCR-produkter af vilde typer og heterozygobåde mutantprøver. Sekvenser af wildtype og mutant ( 
) allel er vist på toppen. Den forreste primer vist i (A) blev brugt som en sekventering primer. Sekvensen af en heterozygot mutant (nederst) er angivet med to overlappende sekvenser fra det forudsagte kavalergangssted (pil). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Mosaiktab af pigmenteringer i sammensatte øjne og i dorsalområdet efter at have rettet mod det hvide gen med gRNA/Cas9 proteinindsprøjtning. (A) Wildtype og (B) hvid gRNA/Cas9 proteinindsprøjtet første instar nymfer. Delvist tab af sorte og lyserøde pigmenteringer i øjne (pilespids) og i det dorsale område (pil) er angivet. Skalalinjen er 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For en vellykket generation af den ønskede T. domestica mutant med CRISPR/Cas9 er det først vigtigt at indsamle et tilstrækkeligt antal iscenesatte embryoner til injektion. For en konstant samling af et tilstrækkeligt antal T. domestica æg er nøglen at vælge en passende størrelse af beholderen for at have en lavere befolkningstæthed, fordi det ville hjælpe med en vellykket færdiggørelse af en række komplekse parringsadfærd, som gentages efter hver voksen smeltet13. En mandlig T. domestica voksen overfører sin sæd indirekte til en kvinde via en spermatophore. Sweetman (1938) rapporterede, at det tager mandlige voksne 20 til 35 minutter fra indledningen af parringsadfærden til placeringen af en spermatophore12. Det er sandsynligt, at forstyrrelse af samspillet mellem et parringspar af andre individer forhindrer vellykket befrugtning, hvilket kan ske oftere i et tæt miljø.
Selvom æg opsamles 8 timer efter udskiftning af bomulden inde i en beholder for at samle nok æg i vores protokol, kan den højere effektivitet af genomredigering opnås ved at samle æg og injicere dem inden for kortere tid (f.eks. 4 timer efter æglægning), når injicerede materialer har større chance for at blive leveret til den store andel af kerner. Injektion til et tilstrækkeligt antal æg inden for kortere tid kan ske ved (1) at øge antallet eller størrelsen af beholdere, hvis pladsen tillader det, eller (2) gentage den samme procedure for at opnå et tilstrækkeligt antal injicerede æg.
Injektionsstedet anses generelt for at være vigtigt for en vellykket kønstransformation i insekter. T. domestica æg er normalt ellipsoide i form og indeholder et kimbånd på en pol af deres langsgående akse. Det anbefales at injicere gRNA/Cas9-blandingen midt på æggets længdeakse, fordi det er svært at identificere stangen, hvor der dannes et kimbånd i tidlige embryoner på grund af den variable form af T. domestica æg. Selvom gRNA/Cas9-opløsningen ikke direkte injiceres på kimbåndsdannelsens sted, har vi opnået kønscelletransformation i så højt som 39,1% af G0 voksne8.
Under mikroinjektionen af æg er det vigtigt at bruge en fin nålespids for at opnå en høj overlevelsesrate, da det er tilfældet for andre dyremodeller. Vi opnåede en højere overlevelsesrate efter injektion med færdige nåle end ved brug af hjemmelavede glasnåle i T. domestica æg. En tilsvarende høj overlevelsesrate kunne imidlertid opnås ved at kopiere den fine nåleform med hjemmelavede nåle (som vist i figur 3B,C). Ifølge vores erfaring resulterer den tørre injektionsmetode i en højere overlevelsesrate end den tidligere rapporterede våde injektionsmetode8. Vi fandt, at æg inkubation i et tørt miljø er nøglen til denne forbedring, drage fordel af det faktum, at T. domestica æg og tidlige nymfer er resistente over for udtørring. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der tyder på, at denne art foretrækker et tørt miljø, især i tidlige udviklingsstadier, og at et vådt miljø endda kan være skadeligt16. I stedet for en plastikplade kan en agarosegel bruges til en hurtig justering af æggene; Overførsel af de injicerede æg til en tør overflade fører dog til en højere overlevelsesrate.
Afslutningsvis understreger vores metode vigtigheden af at tage hensyn til T. domesticas unikke biologi for en vellykket genomredigering: at holde et sparsomt miljø til indsamling af et tilstrækkeligt antal æg og et tørt miljø for at have en højere overlevelsesrate for injicerede embryoner. De grundlæggende protokoller for injektion, parring og kulturvedligeholdelse, der rapporteres her, bruges ikke kun til at generere mutantstammer med genomredigering, men også til anvendelser af andre genetiske værktøjer som RNAi og transgenese og vil bidrage til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for insekternes tidlige udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
TO og TD blev støttet af JSPS KAKENHI tilskud numre 19H02970 og 20H02999, hhv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
