Summary
We bieden een gedetailleerd protocol voor het fokken, micro-injectie van eieren en voor een efficiënte paring van de firebrat Thermobia domestica om mutante stammen te genereren en te onderhouden na genoombewerking.
Abstract
De vuurstilte Thermobia domestica is een ametabolische, vleugelloze soort die geschikt is voor het bestuderen van de ontwikkelingsmechanismen van insecten die hebben geleid tot hun succesvolle evolutionaire straling op aarde. De toepassing van genetische instrumenten zoals genoombewerking is de sleutel tot het begrijpen van genetische veranderingen die verantwoordelijk zijn voor evolutionaire transities in een Evo-Devo-benadering. In dit artikel beschrijven we ons huidige protocol voor het genereren en onderhouden van mutante stammen van T. domestica. We rapporteren een droge injectiemethode, als alternatief voor de gerapporteerde natte injectiemethode, waarmee we stabiel hoge overlevingspercentages in geïnjecteerde embryo's kunnen verkrijgen. We rapporteren ook een geoptimaliseerde omgevingsinstelling om volwassenen te paren en volgende generaties met een hoog rendement te verkrijgen. Onze methode onderstreept het belang om rekening te houden met de unieke biologie van elke soort voor de succesvolle toepassing van genoombewerkingsmethoden op niet-traditionele modelorganismen. We voorspellen dat deze genoombewerkingsprotocollen zullen helpen bij de implementatie van T. domestica als laboratoriummodel en om de ontwikkeling en toepassing van nuttige genetische hulpmiddelen bij deze soort verder te versnellen.
Introduction
Thermobia domestica behoort tot een van de meest basale insectenorden, Zygentoma, die een voorouderlijke ametaboleuze en vleugelloze levenscyclus behoudt. Een dergelijke basale fylogenetische positie en voorouderlijke kenmerken stellen deze soort als een aantrekkelijk model voor het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het succes van insecten op aarde, die meer dan 70% van de beschreven diersoorten bestrijken1. T. domestica wordt al lang voornamelijk gebruikt om voorouderlijke kenmerken van insectenfysiologie te bestuderen vanwege de geschikte kenmerken als laboratoriummodel, zoals een relatief korte levenscyclus (2,5-3,0 maanden van embryo tot reproductieve volwassene; Figuur 1A) en een gemakkelijke fokkerij. In de afgelopen drie decennia is het gebruik ervan uitgebreid om voorouderlijke kenmerken van verschillende eigenschappen zoals lichaamsplan, neurale differentiatie en circadiane ritmes2,3,4te onderzoeken.
De toepassing van geavanceerde genetische instrumenten in T. domestica zou dergelijke bijdragen op een breed onderzoeksgebied verder kunnen versnellen. Succesvolle RNA interferentie (RNAi)-gemedieerde gen knockdown in embryo's, nimfen en volwassenen is gemeld in T. domestica4,5,6. De efficiëntie van systemische RNAi is nog steeds sterk afhankelijk van soorten - het is bijvoorbeeld over het algemeen hoog in coleoptera, terwijl het laag is in de lepidoptera-orde7. De efficiëntie en duur van de RNAi knockdown in T. domestica moet nog worden beoordeeld. Naast RNAi, hebben we eerder gemeld een succesvolle CRISPR / Cas9-gemedieerde gen knock-out in T. domestica8. Het CRISPR/Cas-systeem is op grote schaal toegepast voor genoombewerking bij insecten, met name voor gerichte gen knock-out. Het gebruik ervan kan worden uitgebreid voor andere toepassingen, zoals genverslaggevertest, cellijntracking en manipulatie van transcriptieactiviteit door exogene constructies in te kloppen na de vaststelling van een protocol voor het leveren van componenten van het CRISPR/Cas-systeem inkernen 9. In combinatie met de gepubliceerde genoomassemblage10zou het brede gebruik en de verdere ontwikkeling van de CRISPR/Cas-gebaseerde genoombewerking in T. domestica studies vergemakkelijken die zich richten op de evolutionaire mechanismen achter het uitstekende adaptieve succes van insecten. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor embryomicro-injectie en voor het paren van volwassen T. domestica om een mutante stam te genereren met CRISPR/Cas9. Gezien deze nieuwe methode bespreken we het belang van het overwegen van de unieke biologie van niet-traditionele modelsoorten voor succesvolle toepassingen van deze technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud van laboratoriumkolonies
- Gebruik voor het onderhoud van wildtype- en mutantpopulaties een grote plastic container (460 mm x 360 mm x 170 mm) met regelmatig kunstmatig visvoer, water in plastic bekers met een ventilatiegat aan de bovenkant, een gevouwen papier om de insecten te verbergen en gelaagd katoen voor het leggen van eieren (figuur 2A). Houd alle T. domestica culturen binnen 37 °C incubators en stel de relatieve luchtvochtigheid (RH) in elke container in op 60%–80%.
OPMERKING: Omdat T. domestica waterdamp uit de atmosfeerabsorbeert 11, is een directe watervoorziening niet nodig. De juiste RH wordt gehandhaafd vanwege de aanwezigheid van waterdamp uit plastic bekers met een ventilatiegat aan de bovenkant of van dekselloze kopjes in elke container. Het is niet nodig om te bevochtigen in een hele incubator die culturen bevat. De geschatte duur van elke ontwikkelingsfase onder de in dit protocol beschreven voorwaarde wordt weergegeven in figuur 1. De ontwikkelingssnelheid kon worden aangepast door de temperatuur en/of RH12te wijzigen . - Voeg periodiek voedsel toe. Voeg water toe voordat het opdroogt.
- Breng de populaties ten minste om de 3 maanden over naar een nieuwe schone container, aangezien volwassenen stoppen met het leggen van eieren in een vuile omgeving en/of dichte populatie (zie Discussie).
2. Eiverzameling en micro-injectie
- Ontwerp een gids RNA (gRNA)
- Ontwerp een gRNA-sequentie voor elk vereist doel en BLAST de gRNA-sequenties tegen de genoomassemblage om mogelijke off-target herkenningslocaties te controleren.
- Synthetiseer en zuiver de gRNA's volgens de instructies van de fabrikant8.
OPMERKING: Als voorbeeld, in het geval van het richten op het ATP-bindende cassettetransporter witte gen, werd een doelsequentie van 20 bp ontworpen en werden twee gesynthetiseerde DNA-oligonucleotiden 5'-TAATACGACTCACTATAGTAAGTGTTGTGGGAC-3' en 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCGGTCCCACAACACTTA-3' besteld. Het DNA-sjabloon werd voorbereid door deze twee oligonucleotiden te gloeien, gevolgd door PCR-versterking en het gRNA wordt vervolgens in vitro getranscribeerd uit de sjabloon met een T7 RNA-polymerase.
- Eierverzamelingskolonies voorbereiden
- Breng ongeveer 20 mannelijke en 20 vrouwelijke volwassenen over in een middelgrote container (200 mm x 150 mm x 90 mm) met voedsel, watervoorziening, een gevouwen papier en een klein stukje gelaagd katoen voor het leggen van eieren(figuur 2B).
- Stel verschillende kolonies in om in korte tijd een groot aantal geënsceneerde embryo's te verkrijgen die moeten worden gebruikt voor genoombewerking.
OPMERKING: Naar verwachting worden na 8 uur bij 37 °C ongeveer 20-40 eieren uit een kolonie verzameld. Het duurt meestal een paar dagen voordat overgedragen volwassenen beginnen met het leggen van eieren, mogelijk als gevolg van aanpassing aan een nieuwe omgeving.
- Vervang op de dag van injectie het katoen in de containers door nieuwe.
- Plaats een dubbelzijdige tape van 76 mm x 5 mm op een gewone glazen schuif van 76 mm x 26 mm.
- Verzamel acht uur later de eieren van het gelaagde katoen door de lagen met een tang te scheiden.
- Lijn de eieren uit op de dubbelzijdige tape met een natte verfborstel en houd een afstand van 2 mm tussen de eieren. Alle eieren moeten zo worden georiënteerd dat de lengteas van een ei naar de injectiezijde kijkt (figuur 3A). Druk de eieren voorzichtig naar beneden met een verfborstel voor stevig vasthouden tijdens de injectie.
OPMERKING: In dit protocol groeit schimmel snel in beschadigde geïnjecteerde eieren onder natte en warme toestand. Het is belangrijk om de afstand tussen de eieren te houden om kruisbesmetting en uitzetting van schimmel te voorkomen. - Meng het gRNA- en Cas9-eiwit tot een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 100 ng/μL en 500 ng/μL. Gebruik gedestilleerd water voor verdunning. Incubeer de mix gedurende 10 minuten op kamertemperatuur om de vorming van ribonucleoproteïnecomplex te bevorderen en houd de mix vervolgens op ijs.
OPMERKING: Neutraal rood bij een eindconcentratie van 1% kan aan de injectieoplossing worden toegevoegd om de geïnjecteerde hoeveelheid te controleren. - Laad 2 μL van de gRNA/Cas9-oplossing in een glazen injectiecapillair met een microloader. Zorg ervoor dat er vóór de injectie geen luchtbellen in de oplossing zitten. Tik indien nodig op de naald om de bellen te verwijderen.
OPMERKING: In dit experiment wordt een kant-en-klare naald gebruikt om een fijne naaldpunt te verkrijgen (figuur 3B). In plaats daarvan zou een zelfgemaakte naald met een vergelijkbare vorm kunnen worden gebruikt. - Bevestig de glazen injectiecapillair, eerder geladen met de gRNA/Cas9-oplossing, aan een houder uitgerust met een manipulator en sluit de houder aan op een elektronische micro-injector.
- Optimaliseer de vorm van de naaldpunt door deze lichtjes te breken met een tang om verstopping te voorkomen en een betere duurzaamheid te krijgen tijdens een reeks injecties (een voorbeeld van een geschikte naald wordt weergegeven in figuur 3C).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een naald te verwisselen wanneer deze verstopt is. Het is mogelijk om met dezelfde naald te blijven injecteren als deze opnieuw wordt gebroken met een tang, maar een bredere punt leidt tot meer eischade en verlaagt hun overlevingskans. Omdat T. domestica-eieren zacht en breekbaar zijn, is het houden van een fijne naaldpunt de sleutel voor een hoge overlevingskans na injectie. - Steek de naald in het midden van de lengteas van een ei en injecteer een kleine hoeveelheid van de oplossing (zie figuur 3D–H ter referentie over de hoeveelheid injectie). Pas de configuratie van de elektronische micro-injector aan tijdens de injectie, afhankelijk van de vorm van de naaldpunt.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om tijdens de injectie een constante druk uit te oefenen, anders kan de inhoud van plakkerige eieren gemakkelijk in de glazen naald stromen en deze verstoppen. De oplossing kan zijn om te injecteren met een korte drukpuls of met een constante druk, afhankelijk van de hoeveelheid geïnjecteerde vloeistof. Houd er rekening mee dat wanneer een naaldpunt een brede opening heeft, er te veel oplossing in een ei wordt geïnjecteerd, wat dodelijkheid veroorzaakt (figuur 3F–H). Houd in dat geval een constante vloeistofstroom door constante druk, steek de naald vervolgens in een ei en trek het er onmiddellijk uit. Als het te veel overloop veroorzaakt of het ei barst, verander dan de naald. - Bewaar de geïnjecteerde eieren in een recipiënt met de juiste grootte voor het aantal geïnjecteerde eieren (<20 eieren: kleine schaal; >20 eieren: middelgrote recipiënt) met 60%–80% RH en 37 °C.
3. Paring
- Controleer de geïnjecteerde eieren regelmatig en gooi beschadigde eieren weg met een tang om schimmelgroei te voorkomen(figuur 3I, J). Als er te veel schimmel op een ei groeit, ruim dan het oppervlak van het ei op met 70% EtOH.
- Voordat u uitkomt (ongeveer 10 dagen bij 37 °C na het leggen van eieren), dompelt u de glazen glijbaan met de geïnjecteerde eieren in talkpoeder om het oppervlak van de dubbelzijdige tape te bedekken. Dit voorkomt het stapelen van uitgebroede nimfen. Breng de gepoedercoate glazen dia's over in een middelgrote container met voedsel, water en een gevouwen papier om de insecten te verbergen.
- Verwijder de glazen dia's nadat de nimfen zijn uitgebroed. Lever periodiek voedsel tot ze volwassen zijn.
OPMERKING: Het duurt ongeveer 2,0-2,5 maanden voordat individuen volwassen zijn geworden nadat ze zijn uitgekomen (figuur 1A). Het volwassen stadium wordt beoordeeld op basis van een goed ontwikkelde legboor bij vrouwen (figuur 1B). - Om de individuen te paren, breng je zoveel als nodig vrouwelijke volwassenen van een laboratoriumkolonie over naar de middelgrote container en incubeer je ze gedurende ten minste 14 dagen bij 37 °C om er zeker van te zijn dat ze maagd zijn.
OPMERKING: Het is niet nodig om maagdelijke vrouwtjes uit een laboratoriumkolonie te verzamelen, omdat volwassen T. domestica een herhaalde cyclus van rui en paring hebben die "reproductieve en ruicyclus" wordt genoemd, waarbij vrouwtjes sperma met elke vervelling weggooien en opnieuw paren in de volgende bevruchtingscyclus13. - Breng een mannelijke of vrouwelijke G0-volwassene die zich heeft ontwikkeld van een geïnjecteerd ei en wildtype volwassene(n) over in een kleine plastic schaal (Ø 100 mm x 40 mm) met voedsel, een gevouwen papier en een klein stukje katoen voor het leggen van G1-eieren(figuur 2C'; paringsschaal). Bewaar de paringsschalen in een grotere bak met 60%–80% RV (Figuur 2C).
OPMERKING: Meerdere wildtype volwassenen kunnen worden opgenomen in een gerecht om de kans op succesvolle paring te vergroten, hoewel hoge slagingspercentages zijn bereikt met een-op-een-koppeling.
4. Genotyperen
- Ontwerp PCR-primerparen voor elk gRNA om een 100-200 bp-product te versterken dat de site bevat waarop het gRNA zich richt. BLAST elke primersequentie tegen de genoomassemblage om de specificiteit ervan te controleren (een voorbeeld wordt getoond voor de targeting van het witte gen in figuur 4A).
- Controleer de kiembaantransformatie van G0-volwassenen.
- Verzamel vijf dagen nadat de eieren zijn gelegd individuele G1-eieren van elk G0-volwassen paar in tubes van 0,2 ml (één ei per buis; bewaar verzamelde monsters bij -20 °C voor een langdurige opslag). Scheid de katoenen lagen om de eieren te verzamelen.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om ten minste 12 G1-nimfen van elk paar te genotyperen om het succes van de kiembaantransmissie te evalueren (zie Representatieve resultaten). - Voeg 15 μL van een 0,25 mg/ml Proteinase K-oplossing (opgelost in Tris-EDTA-buffer) toe aan elke buis, homogeniseer monsters kort met tandenstokers en incubeer gedurende 3 tot 16 uur bij 55 °C.
- Activeer de Proteinase K door de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C te plaatsen.
- Voeg 90 μL gedestilleerd water toe aan elke buis en meng goed. Gebruik 2 μL supernatant in een PCR-reactiemix van 10 μL met de primers die zijn ontworpen in stap 4.1.
OPMERKING: Het gebruik van een DNA-polymerase geoptimaliseerd voor ruwe sjablonen wordt aanbevolen om voldoende PCR-versterking te bereiken. - Om de PCR-producten te analyseren, voert u een heteroduplex mobility assay (HMA) uit met een microchip-elektroforesesysteem (figuur 3B; zie Ohde et al., 2018)8.
OPMERKING: Mutaties kunnen worden beoordeeld met twee alternatieve methoden: (1) HMA met standaardgelpolymeren, zoals 8% polyacrylamide14; (2) vertering van PCR-producten met T7-endonuclease gevolgd door agarosegelelektroforese15. - Bewaar alleen de G1-nimfen als gevolg van G0-volwassenen die mutaties in hun kiembaan bevatten en gooi de anderen weg.
- Verzamel vijf dagen nadat de eieren zijn gelegd individuele G1-eieren van elk G0-volwassen paar in tubes van 0,2 ml (één ei per buis; bewaar verzamelde monsters bij -20 °C voor een langdurige opslag). Scheid de katoenen lagen om de eieren te verzamelen.
- Individuele genotypering van G1 nimfen/volwassenen
- Isoleer G1 nimfen in 24-put platen met een aspirator of een verfborstel. Plaats de 24-putplaten in een grotere container (bijv. de middelgrote container die in dit protocol wordt gebruikt) met watervoorziening zoals hierboven beschreven om een RH van 60%-80% te houden (figuur 1D). Behoud de aanvoer van kunstmatig regulier visvoer(figuur 1D').
OPMERKING: Hoewel deze stap op elk punt van nymfale en volwassen stadia kan worden uitgevoerd, wordt aanbevolen om deze uit te voeren na het bereiken van de volwassenheid en vlak voor het koppelen (>2,5 maanden na injectie; Figuur 1B) omdat het gemakkelijker is om brandbrats in een grote container te onderhouden. Individuele opfok is vereist om het genotype van elke G1-nimf op de volgende stappen te volgen. G1 nimfen van dezelfde G0 volwassene kunnen verschillende mutaties hebben. - Knijp en trek cerci en het caudale filament van een nimf/volwassene met behulp van een tang en verzamel ze in een buis van 0,2 ml met 50 μL EtOH (bewaar de verzamelde monsters bij -20 °C voor een langdurige opslag).
OPMERKING: Weefselmonsters worden verzameld in EtOH omdat het het verlies van deze kleine monsters als gevolg van statische elektriciteit voorkomt. Als men de beweging van insecten moet stoppen, verdoof nimf / volwassene op ijs bij het nemen van weefselmonsters. Omdat T. domestica niet kan overleven na langdurige koeling op ijs, verdoof ze niet langer dan een minuut en verplaats ze onmiddellijk terug naar kamertemperatuur. Ablatie van cerci en de caudale gloeidraad veroorzaakt geen toename van de mortaliteit. - Plaats monsterbuizen met de deksels open op een thermisch blok gedurende 15 minuten bij 70 °C om de EtOH te verdampen.
- Herhaal stap 4.2.2–4.2.5 voor genotypering.
- Dien de PCR-producten waarin een mutant bandpatroon wordt nageleefd in bij een standaard Sanger-sequencingservice.
- Bewaar de G1 nimfen/volwassenen met de gewenste mutaties en gooi de andere weg (zie figuur 4C voor een representatief sequencingresultaat).
- Isoleer G1 nimfen in 24-put platen met een aspirator of een verfborstel. Plaats de 24-putplaten in een grotere container (bijv. de middelgrote container die in dit protocol wordt gebruikt) met watervoorziening zoals hierboven beschreven om een RH van 60%-80% te houden (figuur 1D). Behoud de aanvoer van kunstmatig regulier visvoer(figuur 1D').
- Kruis de volwassenen met de gewenste mutaties in een paringsschaal en verkrijg de volgende generaties om een homozygote mutante stam op te zetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In onze handen kunnen ongeveer 100 eieren goed worden geïnjecteerd met een enkele injectie capillair wanneer het de juiste punt heeft(figuur 3C). Injectie van gRNA/Cas9 ribonucleoproteïne complex in embryo's binnen de eerste 8 uur na het leggen van eieren resulteert in indels op de gRNA gerichte site. Dit veroorzaakt biallelic mutaties in sommige cellen van de geïnjecteerde generatie (G0) en dus mutant mozaïek fenotypes worden meestal verkregen in G0. Wanneer dit protocol bijvoorbeeld werd gebruikt om een gRNA te injecteren dat is ontworpen om het witte gen te targeten, vertoont 32,6% van de G0-nimfen gedeeltelijk verlies van pigmentatie in hun samengestelde ogen en dorsale gebieden (figuur 5)8.
Met behulp van de momenteel beschreven droge injectiemethode is bij het injecteren van 80-120 eieren de overlevingskans van de geïnjecteerde embryo's maar liefst 40%–60%. Dit in tegenstelling tot de vorige natte injectiemethode, waarbij eieren worden geïnjecteerd en onderhouden op een agaroseplaat, wat af en toe resulteert in een overlevingskans van minder dan 10%.
Beoordeling van de kiembaantransformatie van G0-volwassenen en gemuteerde G1-individuen werd uitgevoerd door genomische PCR gevolgd door HMA. Bij HMA gloeien wildtype en mutante allelen in elke mogelijke combinatie, wat meestal resulteert in vier verschillende banden op een gel-elektroforese (twee homoduplexen en twee heteroduplexen)14. In G1-samples zijn differentiële bandpatronen tussen wildtype en gemuteerde samples duidelijk te onderscheiden (figuur 4B). Kiembaantransformatie werd gevonden bij 39,1% van de G0-volwassenen toen we ons richtten op het witte gen8. In onze ervaring varieert het percentage gemuteerde personen in G1-nimfen van een enkel G0-paar van 25% tot 100%.
Om het effect van onze paringsomgeving op het paringssucces te evalueren, kruisten we wildtype volwassenen in een paringsschaal en behaalden we een slagingspercentage van 95,8% (23/24 paar).
Figuur 1: De levenscyclus van T. domestica. (A) Geschatte duur van elke ontwikkelingsfase in T. domestica. (B) Dorsale weergave van een volwassen vrouw. Pijlpunt duidt op een goed ontwikkelde legboor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kunstmatige omgevingen die in dit protocol worden gebruikt. (A) Een grote container voor laboratoriumkolonie, (B) een middelgrote container voor het verzamelen van eieren, (C) paringsschalen met watervoorziening in een grote container, (C)een paringsschaal, (D) een 24-puts bord met watervoorziening in de middelgrote container. Boxed regio wordt vergroot in (D') om een T. domestica individu weer te geven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Droge injectie van T. domestica eieren. (A) Eieren uitgelijnd op een glazen glijbaan. Zwarte pijl geeft het punt aan waar een naald wordt ingebracht. (B) Vorm van een glazen naaldpunt die wordt gebruikt voor injectie. (C) Dezelfde glazen naald voor (boven) en na (onder) het breken van de punt. Naalden waren gevuld met 1% neutraal rood. Pijlpunt geeft de punt van de naald aan. Schaalbalk is 1 mm. (D) Ongeïnjecteerd ei. (E) Een goed voorbeeld van een injectie. Pijl geeft het injectiepunt aan. (F–H) De oplossing loopt over van de geïnjecteerde plaats (F) of van de andere kant (G) van het geïnjecteerde ei; te veel injectievolume veroorzaakte een uitbarsting (H). Pijlpunt geeft overgelopen eigehalte aan. (I) Normaal gesproken ontwikkeld laat embryo. Pijlpunt geeft het gekleurde samengestelde oog aan. (J) Gekrompen beschadigd ei 3 dagen na injectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Genotypering van G1-individuen. (A) PCR-primers zijn ontworpen om een genomisch gebied van 120 bp te versterken dat de gRNA-doellocatie omvat. (B) Meerdere banden van homoduplex- en heteroduplex-DNA's worden gedetecteerd in gemuteerde samples, terwijl enkele banden in niet-gemuteerde samples verschijnen. L: DNA-ladder, U: ongemuteerde monsters, M: gemuteerde monsters. (C) Representatief resultaat van directe sequencing van PCR-producten uit wildtype- en heterozygote mutantmonsters. Sequenties van wildtype en mutant ( 
) allel worden bovenaan weergegeven. De voorwaartse primer in (A) werd gebruikt als sequencingprimer. De opeenvolging van een heterozygote mutant (onder) wordt aangegeven door twee overlappende sequenties van de voorspelde decolletéplaats (pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Mozaïekverlies van pigmentaties in samengestelde ogen en in het dorsale gebied na het richten van het witte gen met gRNA/Cas9 eiwitinjectie. (A) Wildtype en (B) witte gRNA/Cas9 eiwit-geïnjecteerde eerste instar nimfen. Gedeeltelijk verlies van zwarte en roze pigmentaties in de ogen (pijlpunt) en in het dorsale gebied (pijl) zijn aangegeven. Schaalbalk is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de succesvolle generatie van de gewenste T. domestica mutant met CRISPR/Cas9 is het eerst belangrijk om een voldoende aantal geënsceneerde embryo's te verzamelen voor injectie. Voor een constante verzameling van een voldoende aantal T. domestica-eieren, is de sleutel om een geschikte grootte van de container te selecteren om een lagere populatiedichtheid te hebben, omdat het zou helpen bij het succesvol voltooien van een reeks complex paringsgedrag, dat wordt herhaald na elke vervelling voor volwassenen13. Een mannelijke T. domestica volwassene brengt zijn sperma indirect over naar een vrouw via een spermatofore. Sweetman (1938) meldde dat het mannelijke volwassenen 20 tot 35 minuten duurt van het initiëren van het paringsgedrag tot de plaatsing van een spermatofore12. Het is waarschijnlijk dat verstoring van de interactie tussen een paringspaar door andere individuen succesvolle bevruchting voorkomt, wat vaker kan gebeuren in een dichte omgeving.
Hoewel eieren 8 uur na het vervangen van het katoen in een container worden verzameld om voldoende eieren in ons protocol te verzamelen, kan de hogere efficiëntie van genoombewerking worden bereikt door eieren te verzamelen en ze binnen een kortere tijd te injecteren (bijv. 4 uur na het leggen van eieren) wanneer geïnjecteerde materialen meer kans hebben om aan het grote deel van de kernen te worden geleverd. Injectie in een voldoende aantal eieren binnen een kortere tijd kan worden gedaan door (1) het aantal of de grootte van de recipiënten te vergroten indien de ruimte het toelaat, of (2) dezelfde procedure te herhalen om een voldoende aantal geïnjecteerde eieren te verkrijgen.
De injectieplaats wordt over het algemeen als belangrijk beschouwd voor succesvolle kiembaantransformatie bij insecten. T. domestica-eieren zijn meestal ellipsoïdaal van vorm en bevatten een kiemband op één pool van hun lengteas. Het wordt aanbevolen om het gRNA/Cas9-mengsel in het midden van de lengteas van het ei te injecteren, omdat het moeilijk is om de pool te identificeren waar een kiemband in vroege embryo's wordt gevormd vanwege de variabele vorm van T. domestica-ei. Hoewel de gRNA/Cas9-oplossing niet rechtstreeks wordt geïnjecteerd op de plaats van de kiembandvorming, hebben we kiembaantransformatie bereikt in maar liefst 39,1% van de G0-volwassenen8.
Tijdens het micro-injecteren van eieren is het belangrijk om een fijne naaldpunt te gebruiken om een hoge overlevingskans te verkrijgen, zoals het geval is voor andere diermodellen. We kregen een hogere overlevingskans na injectie met kant-en-klare naalden dan bij het gebruik van zelfgemaakte glazen naalden in T. domestica-eieren. Een even hoge overlevingskans zou echter kunnen worden bereikt door de fijne naaldvorm te repliceren met zelfgemaakte naalden (zoals weergegeven in figuur 3B,C). Volgens onze ervaring resulteert de droge injectiemethode in een hogere overlevingskans dan de eerder gerapporteerde natte injectiemethode8. We ontdekten dat ei-incubatie in een droge omgeving de sleutel is voor deze verbetering, gebruikmakend van het feit dat T. domestica-eieren en vroege nimfen resistent zijn tegen uitdroging. Dit is in overeenstemming met eerdere rapporten die suggereren dat deze soort de voorkeur geeft aan een droge omgeving, vooral tijdens vroege ontwikkelingsstadia en dat een natte omgeving zelfs schadelijk kan zijn16. In plaats van een plastic plaat kan een agarosegel worden gebruikt voor een snelle uitlijning van de eieren; het overbrengen van de geïnjecteerde eieren naar een droog oppervlak leidt echter tot een hogere overlevingskans.
Tot slot onderstreept onze methode het belang om rekening te houden met de unieke biologie van T. domestica voor een succesvolle genoombewerking: het behouden van een schaarse omgeving voor het verzamelen van voldoende eieren en een droge omgeving voor een hogere overlevingskans van geïnjecteerde embryo's. De basisprotocollen voor injectie, paring en kweekonderhoud die hier worden gerapporteerd, worden niet alleen gebruikt voor het genereren van mutante stammen met genoombewerking, maar ook voor toepassingen van andere genetische hulpmiddelen zoals RNAi en transgenese en zullen helpen om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de vroege evolutie van insecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
TO en TD werden ondersteund door respectievelijk JSPS KAKENHI-subsidienummers 19H02970 en 20H02999.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
