Summary
Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.
Abstract
Le firebrat Thermobia domestica est une espèce amétabolique et sans ailes qui convient à l’étude des mécanismes de développement des insectes qui ont mené à leur rayonnement évolutif réussi sur la terre. L’application d’outils génétiques tels que l’édition du génome est la clé pour comprendre les changements génétiques qui sont responsables des transitions évolutionnaires dans une approche Evo-Devo. Dans cet article, nous décrivons notre protocole actuel pour générer et maintenir des souches mutantes de T. domestica. Nous rapportons une méthode d’injection sèche, comme alternative à la méthode d’injection humide rapportée, qui nous permet d’obtenir des taux de survie sensiblement élevés dans les embryons injectés. Nous signalons également un environnement optimisé pour accoupler les adultes et obtenir les générations suivantes avec une grande efficacité. Notre méthode souligne l’importance de tenir compte de la biologie unique de chaque espèce pour l’application réussie des méthodes d’édition du génome aux organismes modèles non traditionnels. Nous prévoyons que ces protocoles d’édition du génome aideront à mettre en œuvre T. domestica en tant que modèle de laboratoire et à accélérer davantage le développement et l’application d’outils génétiques utiles chez cette espèce.
Introduction
Thermobia domestica appartient à l’un des ordres d’insectes les plus basiques, Zygentoma, qui conserve un cycle de vie ancestral amétabolique et sans ailes. Cette position phylogénétique basale et ses caractéristiques ancestrales placent cette espèce comme un modèle attrayant pour l’étude des mécanismes sous-jacents au succès des insectes sur Terre, qui couvrent plus de 70 % des espèces animalesdécrites 1. T. domestica a longtemps été utilisé principalement pour étudier les caractéristiques ancestrales de la physiologie des insectes en raison de ses caractéristiques appropriées en tant que modèle de laboratoire, comme un cycle de vie relativement court (2,5-3,0 mois de l’embryon à l’adulte reproducteur; Figure 1A) et une reproduction facile. Au cours des trois dernières décennies, son utilisation a été élargie pour étudier les caractéristiques ancestrales de divers traits tels que le plan corporel, la différenciation neuronale et les rythmescircadiens 2,3,4.
L’application d’outils génétiques avancés dans T. domestica pourrait encore accélérer ces contributions dans un vaste domaine de recherche. L’interférence réussie d’ARN (RNAi)-2-2meint le renversement de gène dans les embryons, les nymphes, et les adultes a été rapporté dans T. domestica4,5,6. L’efficacité de l’ARNi systémique est encore fortement tributaire des espèces — par exemple, elle est généralement élevée chez les coléoptères alors qu’elle est faible dans l’ordre des lépidoptères7. L’efficacité et la durée du renversement du RNAi à T. domestica n’ont pas encore été évaluées. En plus de RNAi, nous avons précédemment rapporté un succès CRISPR/Cas9-19-20 knockout gène dans T. domestica8. Le système CRISPR/Cas a été largement appliqué pour l’édition du génome chez les insectes en particulier pour les knockout génétiques ciblés. Son utilisation pourrait être étendue pour d’autres applications telles que l’analyse de journaliste de gène, le suivi de lignée cellulaire, et la manipulation de l’activité transcriptionnelle en frappant-dans les constructions exogènes après l’établissement d’un protocole pour livrer des composants du système CRISPR/Cas dans les noyaux9. Combinée à l’assemblage dugénome publié 10, l’utilisation à grande échelle et le développement ultérieur de l’édition du génome crispr/cas dans T. domestica faciliteraient des études axées sur les mécanismes évolutifs derrière le succès adaptatif exceptionnel des insectes. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la microinjection embryonnaire et pour l’accouplement adulte T. domestica pour générer une souche mutante à l’aide de CRISPR/Cas9. Compte tenu de cette nouvelle méthode, nous discutons de l’importance de considérer la biologie unique des espèces modèles non traditionnelles pour des applications réussies de ces techniques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Maintien des colonies de laboratoire
- Pour le maintien des populations sauvages et mutantes, utilisez un grand contenant en plastique (460 mm x 360 mm x 170 mm) avec des aliments artificiels réguliers pour le poisson, de l’eau dans des tasses en plastique avec un trou de ventilation sur le dessus, un papier plié pour cacher les insectes et du coton superposé pour pondre desœufs ( figure 2A). Gardez toutes les cultures T. domestica à l’intérieur des incubateurs de 37 °C et réglez l’humidité relative (HR) à l’intérieur de chaque récipient à 60%-80%.
REMARQUE : Étant donné que T. domestica absorbe la vapeur d’eau de l’atmosphère11,un approvisionnement direct en eau n’est pas nécessaire. L’HR approprié est maintenu en raison de la présence de vapeur d’eau provenant de gobelets en plastique contenant un trou de ventilation sur le dessus ou de tasses sans couvercle à l’intérieur de chaque récipient. Il n’est pas nécessaire d’humidifier à l’intérieur d’un incubateur entier qui contient des cultures. La durée approximative de chaque étape du développement dans la condition décrite dans ce protocole est indiquée à la figure 1. La vitesse de développement pourrait être ajustée en changeant la température et/ou rh12. - Ajouter les aliments périodiquement. Ajouter l’eau avant qu’elle ne sèche.
- Transférer les populations dans un nouveau contenant propre au moins tous les 3 mois étant donné que les adultes cessent de pondre dans un environnement sale et/ou une population dense (voir Discussion).
2. Collecte et microinjection d’oeufs
- Concevoir un guide ARN (gRNA)
- Concevoir une séquence d’ARNg pour chaque cible requise et BLAST les séquences d’ARN g contre l’assemblage du génome pour vérifier les sites de reconnaissance hors cible possibles.
- Synthétiser et purifier les ARN selon les instructions du fabricant8.
REMARQUE : À titre d’exemple, dans le cas du ciblage du gène blanc du transporteur de cassettes liant l’ATP, une séquence cible de 20 points de base a été conçue et deux oligonucléotides d’ADN synthétisés 5'-TAATACGACTCACTATAGTGTGTGTGTGGGAC-3' et 5'-TTCTAGCTTATAAAACATCGGTCCCAACACTTA-3' ont été commandés. Le modèle d’ADN a été préparé en annelant ces deux oligonucléotides suivis de l’amplification de PCR et le gRNA est alors transcrit in vitro du modèle avec une polymésexase d’ARN T7.
- Préparer des colonies de collecte d’œufs
- Transférer environ 20 adultes mâles et 20 femelles dans un récipient de taille moyenne (200 mm x 150 mm x 90 mm) avec de la nourriture, de l’approvisionnement en eau, un papier plié et un petit morceau de coton superposé pour la ponte (figure 2B).
- Mettre en place plusieurs colonies pour obtenir un grand nombre d’embryons mis en scène dans un court laps de temps à utiliser pour l’édition du génome.
REMARQUE : On s’attend à ce qu’environ 20 à 40 œufs soient prélevés dans une colonie après 8 h à 37 °C. Il faut habituellement quelques jours aux adultes transférés pour commencer à pondre des œufs, peut-être en raison de l’adaptation à un nouvel environnement.
- Le jour de l’injection, remplacer le coton à l’intérieur des contenants par de nouveaux.
- Placez une bande à double face de 76 mm x 5 mm sur une glissière en verre ordinaire de 76 mm x 26 mm.
- Huit heures plus tard, recueillir les œufs du coton en couches en séparant les couches à l’aide de forceps.
- Alignez les œufs sur le ruban à double face à l’aide d’un pinceau humide et gardez une distance de 2 mm entre les œufs. Tous les oeufs doivent être orientés de sorte que l’axe longitudinal d’un œuf fait face au côté injection (figure 3A). Presser doucement les œufs à l’aide d’un pinceau pour tenir fermement pendant l’injection.
REMARQUE : Dans ce protocole, le champignon pousse rapidement dans les œufs injectés endommagés dans un état humide et chaud. Il est important de garder la distance entre les œufs pour prévenir la contamination croisée et l’expansion du champignon. - Mélanger l’ARN et la protéine Cas9 à une concentration finale de 100 ng/μL et 500 ng/μL, respectivement. Utilisez de l’eau distillée pour la dilution. Incuber le mélange pendant 10 min à température ambiante pour favoriser la formation complexe de ribonucléoprotéines, puis garder le mélange sur la glace.
REMARQUE : Un rouge neutre à une concentration finale de 1 % pourrait être ajouté à la solution d’injection pour surveiller la quantité injectée. - Chargez 2 μL de la solution gRNA/Cas9 dans un capillaire d’injection de verre à l’aide d’un microchargeur. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la solution avant l’injection. Si nécessaire, appuyez sur l’aiguille pour enlever les bulles.
REMARQUE : Dans cette expérience, une aiguille prête à l’herbe est utilisée pour obtenir une pointe d’aiguille fine (figure 3B). Une aiguille maison avec une forme similaire pourrait être utilisée à la place. - Fixez le capillaire d’injection de verre, précédemment chargé de la solution gRNA/Cas9, à un support équipé d’un manipulateur et connectez le support à un microinjecteur électronique.
- Optimisez la forme de la pointe de l’aiguille en la cassant légèrement avec des forceps pour éviter l’engorgement et obtenir une meilleure durabilité tout au long d’une série d’injections (un exemple d’aiguille appropriée est indiqué dans la figure 3C).
REMARQUE : Il est recommandé de changer une aiguille lorsqu’elle est obstruée. Il est possible de continuer à injecter avec la même aiguille si elle est brisée à nouveau avec des forceps, mais une pointe plus large conduit à plus de dommages aux œufs et abaisse leur taux de survie. Comme les œufs de T. domestica sont mous et fragiles, il est essentiel de garder une pointe d’aiguille fine pour avoir un taux de survie élevé après l’injection. - Insérez l’aiguille au milieu de l’axe longitudinal d’un œuf et injectez une légère quantité de la solution (voir la figure 3D-H pour référence sur la quantité d’injection). Ajustez la configuration du microinjecteur électronique pendant l’injection, en fonction de la forme de la pointe de l’aiguille.
REMARQUE : Il est recommandé d’appliquer une pression constante pendant l’injection, sinon le contenu collant d’oeuf peut facilement couler dans l’aiguille en verre et peut l’obstruer. La solution peut être soit d’injecter avec une impulsion de pression courte ou avec une pression constante, selon la quantité de liquide injecté. Gardez à l’esprit que lorsqu’une pointe d’aiguille a une ouverture large, trop de solution est injectée dans un œuf, ce qui provoque la létalité (Figure 3F-H). Dans ce cas, maintenez un flux liquide constant par pression constante, puis insérez l’aiguille dans un œuf et retirez-la immédiatement. S’il provoque trop de débordement ou que l’œuf éclate, changer l’aiguille. - Gardez les oeufs injectés dans un récipient avec la taille appropriée pour le nombre d’oeufs injectés (<20 oeufs: petit plat; >20 oeufs: récipient de taille moyenne) avec 60%-80% RH et 37 °C.
3. Accouplement
- Vérifiez périodiquement les œufs injectés et jetez les œufs endommagés avec des forceps pour éviter la croissancefongique( Figure 3I,J). Dans le cas où trop de champignon pousse sur un œuf, nettoyer la surface de l’œuf avec 70% EtOH.
- Avant l’éclosion (environ 10 jours à 37 °C après la ponte), tremper la glissade de verre avec les œufs injectés dans de la poudre de talc pour enrober la surface du ruban adhésif à double face. Cela permettra d’éviter l’empilement de nymphes écloses. Transférez les glissières en verre enduites de poudre dans un récipient de taille moyenne avec de la nourriture, de l’eau et un papier plié pour cacher les insectes.
- Retirez les glissières de verre après l’éclosion des nymphes. Fournissez périodiquement de la nourriture jusqu’à ce qu’ils atteignent l’âge adulte.
REMARQUE : Il faut environ 2,0 à 2,5 mois pour que les individus atteignent l’âge adulte après leur éclosion (figure 1A). Le stade adulte est jugé sur la base d’un ovipositeur bien développé chez les femelles (Figure 1B). - Pour accoupler les individus, transférez autant d’adultes femelles de type sauvage que nécessaire d’une colonie de laboratoire au récipient de taille moyenne et incubez-les pendant au moins 14 jours à 37 °C pour s’assurer qu’ils sont vierges.
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de recueillir les femelles vierges d’une colonie de laboratoire parce que les T. domestica adultes ont un cycle répété de mue et d’accouplement appelé « cycle reproducteur et muant », au cours duquel les femelles jettent le sperme avec chaque mue et s’accouplent à nouveau dans le prochain cycle de fécondation13. - Transférer un adulte G0 mâle ou femelle qui s’est développé à partir d’un œuf injecté et d’un adulte sauvage à un petit plat en plastique (Ø 100 mm x 40 mm) avec de la nourriture, un papier plié et un petit morceau de coton pour pondre des œufs G1(figure 2C'; plat d’accouplement). Gardez les plats d’accouplement dans un plus grand récipient avec 60%-80% RH (Figure 2C).
REMARQUE : Plusieurs adultes de type sauvage peuvent être inclus dans un plat pour augmenter les chances de succès de l’accouplement, bien que des taux de réussite élevés aient été atteints avec l’appariement en un à un.
4. Genotyping
- Concevoir des paires d’amorce PCR pour chaque rRNA pour amplifier un produit de 100-200 bp qui inclut le site ciblé par l’ARNm. BLAST chaque séquence d’amorce contre l’assemblage du génome pour vérifier sa spécificité (un exemple est montré pour le ciblage du gène blanc dans la figure 4A).
- Vérifiez la transformation germinale des adultes G0.
- Cinq jours après la ponte, recueillir les œufs G1 individuels de chaque paire adulte G0 dans des tubes de 0,2 mL (un œuf par tube; conserver les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme). Séparer les couches de coton pour recueillir les œufs.
REMARQUE : Il est recommandé de génotyper au moins 12 nymphes G1 de chaque paire d’accouplement pour évaluer le succès de la transmission germinale (voir Résultats représentatifs). - Ajouter 15 μL d’une solution Proteinase K de 0,25 mg/mL (dissoute dans le tampon Tris-EDTA) à chaque tube, homogénéiser brièvement les échantillons avec des cure-dents et incuber à 55 °C pendant 3 à 16 h.
- Inactivez la Proteinase K en plaçant les échantillons à 95 °C pendant 10 min.
- Ajouter 90 μL d’eau distillée à chaque tube et bien mélanger. Utilisez 2 μL de supernatant dans un mélange de réaction PCR de 10 μL contenant les amorces conçues à l’étape 4.1.
REMARQUE : L’utilisation d’une polymése d’ADN optimisée pour les modèles bruts est recommandée pour atteindre suffisamment d’amplification PCR. - Pour analyser les produits PCR, effectuez un test de mobilité hétéroduplexe (HMA) avec un système d’électrophoresis à micropuces(figure 3B; voir Ohde et coll., 2018)8.
REMARQUE : Les mutations pourraient être évaluées avec deux méthodes alternatives : (1) HMA avec des polymères de gel standard, tels que 8% polyacrylamide14; (2) digestion des produits PCR avec endonuclease T7 suivie d’électrophoresis gel agarose15. - Ne gardez que les nymphes G1 résultant d’adultes G0 qui contiennent des mutations dans leur lignée germinale et jetez les autres.
- Cinq jours après la ponte, recueillir les œufs G1 individuels de chaque paire adulte G0 dans des tubes de 0,2 mL (un œuf par tube; conserver les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme). Séparer les couches de coton pour recueillir les œufs.
- Génotypage individuel des nymphes/adultes G1
- Isoler les nymphes G1 dans des assiettes de 24 puits à l’aide d’un aspirateur ou d’un pinceau. Placez les plaques de 24 puits dans un récipient plus grand (p. ex., le contenant de taille moyenne utilisé dans ce protocole) avec l’approvisionnement en eau tel que décrit ci-dessus pour maintenir une HR de 60 % à 80 %(figure 1D). Maintenir l’approvisionnement en nourriture artificielle de poisson ordinaire(figure 1D').
NOTE : Bien que cette étape puisse être exécutée à n’importe quel point des étapes nymphales et adultes, il est recommandé de l’exécuter après avoir atteint l’âge adulte et juste avant l’appariement (>2.5 mois après injection ; Figure 1B) parce qu’il est plus facile de maintenir les firebrats dans un grand récipient. L’élevage individuel est nécessaire pour suivre le génotype de chaque nymphe G1 sur les étapes suivantes. Les nymphes G1 du même adulte G0 peuvent avoir des mutations différentes. - Pincez et tirez le cerci et le filament caudal d’une nymphe/adulte à l’aide de forceps et recueillez-les dans un tube de 0,2 mL contenant 50 μL EtOH (stockez les échantillons recueillis à -20 °C pour un stockage à long terme).
REMARQUE : Des échantillons de tissus sont prélevés dans EtOH parce qu’ils empêchent la perte de ces petits échantillons en raison de l’électricité statique. Si l’on a besoin d’arrêter le mouvement des insectes, anesthésier nymphe / adulte sur la glace lors de la prise d’échantillons de tissus. Comme T. domestica ne peut survivre après un refroidissement à long terme sur la glace, ne les anesthésiez pas pendant plus d’une minute et déplacez-les immédiatement à la température ambiante. L’ablation du cerci et du filament caudal ne provoque aucune augmentation de la mortalité. - Placez les tubes d’échantillon avec les couvercles ouverts sur un bloc thermique pendant 15 min à 70 °C pour évaporer l’EtOH.
- Répétez les étapes 4.2.2-4.2.5 pour le génotypage.
- Soumettez les produits PCR dans lesquels un modèle de bande mutante est observé à un service de séquençage Sanger standard.
- Gardez les nymphes/adultes G1 avec les mutations désirées et jetez les autres (voir la figure 4C pour un résultat représentatif de séquençage).
- Isoler les nymphes G1 dans des assiettes de 24 puits à l’aide d’un aspirateur ou d’un pinceau. Placez les plaques de 24 puits dans un récipient plus grand (p. ex., le contenant de taille moyenne utilisé dans ce protocole) avec l’approvisionnement en eau tel que décrit ci-dessus pour maintenir une HR de 60 % à 80 %(figure 1D). Maintenir l’approvisionnement en nourriture artificielle de poisson ordinaire(figure 1D').
- Croisez les adultes contenant les mutations désirées dans un plat d’accouplement et obtenez les générations suivantes pour établir une souche mutante homozygote.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans nos mains, environ 100 oeufs peuvent être bien injectés avec un capillaire à injection unique quand il a la pointe adéquate (Figure 3C). L’injection du complexe de ribonucleoprotein de gRNA/Cas9 dans les embryons dans les 8 premières h après la ponte a comme résultat des indélébiles au site visé de gRNA. Cela provoque des mutations bialéliques dans certaines cellules de la génération injectée (G0) et donc des phénotypes de mosaïque mutante sont généralement obtenus en G0. Par exemple, lorsque ce protocole a été utilisé pour injecter un ARN gRNA conçu pour cibler le gène blanc, 32,6 % des nymphes G0 présentent une perte partielle de pigmentation dans leurs yeux composés et leurs régions dorsales (figure 5)8.
En utilisant la méthode d’injection sèche actuellement décrite, lorsque 80 à 120 œufs sont injectés, le taux de survie des embryons injectés est aussi élevé que 40%-60%. Cela contraste avec la méthode d’injection humide précédente, dans laquelle les œufs sont injectés et maintenus sur une plaque d’agarose, ce qui entraîne parfois un taux de survie inférieur à 10 %.
L’évaluation de la transformation germinale des adultes G0 et des individus mutés de G1 a été faite par PCR génomique suivi de HMA. Dans HMA, wildtype et allèles mutants anneal dans chaque combinaison possible, qui se traduit généralement par quatre bandes distinctes sur une électrophoresis gel (deux homoduplexes et deux hétéroduplexes)14. Dans les échantillons G1, les modèles différentiels de bandes entre les échantillons sauvages et les échantillons mutés sont clairement discernables( figure 4B). La transformation germinale a été trouvée chez 39,1 % des adultes du G0 lorsque nous avons ciblé le gène blanc8. D’après notre expérience, le pourcentage d’individus mutés chez les nymphes G1 d’une seule paire G0 varie de 25 % à 100 %.
Pour évaluer l’effet de notre environnement d’accouplement sur le succès de l’accouplement, nous avons croisé des adultes sauvages dans un plat d’accouplement et obtenu un taux de réussite de 95,8 % (23/24 paires).
Figure 1 : Le cycle de vie de T. domestica. (A) Durée approximative de chaque stade de développement dans T. domestica. (B) Vue dorsale d’une femelle adulte. Arrowhead indique un ovipositeur bien développé. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Environnements artificiels utilisés dans ce protocole. (A) Un grand récipient pour la colonie de laboratoire, (B) un récipient de taille moyenne pour la collecte d’oeufs, (C) accouplement des plats avec des réserves d’eau dans un grand récipient, ( C ' ) un platd’accouplement,(D) une plaque de 24 puits avec approvisionnement en eau dans le récipient de taille moyenne. La région en boîte est agrandie dans (D') pour montrer un individu T. domestica. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Injection sèche d’œufs de T. domestica. (A) Oeufs alignés sur une glissière en verre. La flèche noire indique le point où une aiguille est insérée. (B) Forme d’une pointe d’aiguille en verre utilisée pour l’injection. (C) La même aiguille en verre avant (en haut) et après (en bas) briser la pointe. Les aiguilles étaient remplies de 1 % de rouge neutre. Arrowhead indique le bout de l’aiguille. Barre d’échelle est de 1 mm. (D) Oeuf non injecté. (E) Un bon exemple d’injection. Flèche indique le point d’injection. (F-H) La solution déborde du site injecté (F) ou du côté opposé (G) de l’œuf injecté; trop de volume d’injection a causé une explosion (H). Arrowhead indique une teneur en œufs débordée. (I) Normalement développé embryon tardif. Arrowhead indique l’œil composé coloré. (J) Oeuf endommagé rétréci 3 jours après injection. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Génotypage des personnes du G1. (A) Les amorces PCR sont conçues pour amplifier une région génomique de 120 pb qui inclut le site cible de l’ARNg. (B) Plusieurs bandes d’ADN homoduplexes et hétéroduplexes sont détectées dans des échantillons mutés tandis que des bandes simples apparaissent dans des échantillons non mutés. L: échelle d’ADN, U: échantillons nonmutés, M: échantillons mutés. (C) Résultat représentatif du séquençage direct des produits PCR à partir d’échantillons mutants de type sauvage et hétérozygotes. Des séquences de wildtype et d’allèle mutant 
() sont affichées sur le dessus. L’amorce avant indiquée dans (A) a été utilisée comme amorce de séquençage. La séquence d’un mutant hétérozygote (en bas) est indiquée par deux séquences qui se chevauchent à partir du site de clivage prévu (flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Perte de pigmentations en mosaïque dans les yeux composés et dans la région dorsale après avoir ciblé le gène blanc par injection de protéines gRNA/Cas9. (A) Wildtype et (B ) gRNA blanc / Cas9 protéines injectées premières nymphes instar. La perte partielle de pigmentations noires et roses dans les yeux (pointe de flèche) et dans la région dorsale (flèche) est indiquée. La barre d’échelle est de 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pour la génération réussie du mutant T. domestica désiré avec CRISPR/Cas9, il est d’abord important de recueillir un nombre suffisant d’embryons mis en scène pour injection. Pour une collecte constante d’un nombre suffisant d’œufs T. domestica, la clé est de sélectionner une taille appropriée du récipient pour avoir une densité de population inférieure, car elle aiderait à l’achèvement réussi d’une série de comportements complexes d’accouplement, qui se répète après chaque mueadulte 13. Un adulte mâle de T. domestica transfère son sperme indirectement à une femelle par l’intermédiaire d’un spermatophore. Sweetman (1938) a rapporté qu’il faut des adultes mâles 20 à 35 min de l’initiation du comportement d’accouplement au placement d’un spermatophore12. Il est probable que la perturbation de l’interaction entre une paire d’accouplement par d’autres individus empêche la fécondation réussie, qui pourrait se produire plus fréquemment dans un environnement dense.
Bien que les œufs soient recueillis 8 h après avoir remplacé le coton à l’intérieur d’un récipient pour recueillir suffisamment d’œufs dans notre protocole, l’efficacité plus élevée de l’édition du génome peut être obtenue en recueillant des œufs et en les injectant dans un délai plus court (p. ex., 4 h après la ponte) lorsque les matériaux injectés ont plus de chances d’être livrés à la grande proportion de noyaux. L’injection à un nombre suffisant d’œufs dans un délai plus court pourrait être faite en (1) en augmentant le nombre ou la taille des contenants si l’espace le permet, ou (2) en répétant la même procédure pour obtenir un nombre suffisant d’œufs injectés.
Le site d’injection est généralement considéré comme important pour la transformation réussie de la germline chez les insectes. Les œufs de T. domestica sont habituellement de forme ellipsoidale et contiennent une bande germinale à un pôle de leur axe longitudinal. Il est recommandé d’injecter le mélange gRNA/Cas9 au milieu de l’axe longitudinal de l’œuf parce qu’il est difficile d’identifier le pôle où une bande germinale se forme dans les embryons précoces en raison de la forme variable de l’œuf T. domestica. Bien que la solution gRNA/Cas9 ne soit pas directement injectée sur le site de la formation de la bande germinale, nous avons réalisé une transformation germinale en aussi haut que 39,1% des adultes G08.
Lors de la microinjection des œufs, il est important d’utiliser une pointe d’aiguille fine pour obtenir un taux de survie élevé, comme c’est le cas pour d’autres modèles animaux. Nous avons obtenu un taux de survie plus élevé après injection avec des aiguilles prêtes à l’emploi que lors de l’utilisation d’aiguilles en verre maison dans les œufs T. domestica. Toutefois, un taux de survie tout aussi élevé pourrait être atteint en reproduisant la forme fine de l’aiguille avec des aiguilles maison (comme le montre la figure 3B,C). Selon notre expérience, la méthode d’injection sèche entraîne un taux de survie plus élevé que la méthode d’injection humide précédemment signalée8. Nous avons constaté que l’incubation d’œufs dans un environnement sec est essentielle à cette amélioration, profitant du fait que les œufs de T. domestica et les nymphes précoces sont résistants à la dessiccation. Ceci est conforme aux rapports précédents suggérant que cette espèce préfère un environnement sec en particulier pendant les premiers stades de développement et qu’un environnement humide peut même être nocif16. Au lieu d’une plaque en plastique, un gel d’agarose peut être utilisé pour un alignement rapide des oeufs; toutefois, le transfert des œufs injectés sur une surface sèche entraîne un taux de survie plus élevé.
En conclusion, notre méthode souligne l’importance de prendre en compte la biologie unique de T. domestica pour une édition réussie du génome : garder un environnement clairsemé pour la collecte d’un nombre suffisant d’ovules et d’un environnement sec pour avoir un taux de survie plus élevé d’embryons injectés. Les protocoles de base pour l’injection, l’accouplement et le maintien de la culture signalés ici sont utilisés non seulement pour générer des souches mutantes avec l’édition du génome, mais aussi pour les applications d’autres outils génétiques tels que l’ARNi et la transgenèse et aideront à comprendre les mécanismes sous-jacents à l’évolution précoce des insectes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
To et TD ont été soutenus par les numéros de subvention JSPS KAKENHI 19H02970 et 20H02999, respectivement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plate | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Anti-static cleaner | Hozan | Z-292 | for removing static electricity from a 24-well plate |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Large container |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Electronic microinjector |
| Femtotip II, injection capillary | Eppendorf | 5242957000 | Glass injection capillary |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Middle-sized container |
| Incubator | Panasonic | MIR-554-PJ | for 37 °C incubation. No need to humidify inside the incubator. |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates. |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-8 | for holding the micromanipulator |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MM-3 | |
| Microscope | Olympus | SZX12 | for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Microchip electrophoresis system |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Double-sided tape to place eggs on a glass slide |
| Paint brush (horse hair) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Plant culture dish | SPL Life Sciences | 310100 | Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| SZX 12 microscope | Olympus | SZX 12 | More than 35X magnification is sufficient for the microinjection |
| Talcum powder | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold Growth | Spectrum Brands | Artificial regular fish food |
References
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect. Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).
- Farris, S. M. Developmental organization of the mushroom bodies of Thermobia domestica (Zygentoma, Lepismatidae): Insights into mushroom body evolution from a basal insect. Evolution and Development. 7, 150-159 (2005).
- Kamae, Y., Tanaka, F., Tomioka, K. Molecular cloning and functional analysis of the clock genes, Clock and cycle, in the firebrat Thermobia domestica. Journal of Insect Physiology. 56, 1291-1299 (2010).
- Ohde, T., Masumoto, M., Yaginuma, T., Niimi, T. Embryonic RNAi analysis in the firebrat, Thermobia domestica: Distal-less is required to form caudal filament. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 105, 99-105 (2009).
- Ohde, T., Yaginuma, T., Niimi, T. Nymphal RNAi analysis reveals novel function of scalloped in antenna, cercus and caudal filament formation in the firebrat, Thermobia domestica. Journal of Insect Biotechnology and Sericology. 108, 101-108 (2012).
- Bellés, X. Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).
- Ohde, T., Takehana, Y., Shiotsuki, T., Niimi, T. CRISPR/Cas9-based heritable targeted mutagenesis in Thermobia domestica: A genetic tool in an apterygote development model of wing evolution. Arthropod Structure and Development. 47, 362-369 (2018).
- Nji, C., et al. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Brand, P., et al. The origin of the odorant receptor gene family in insects. eLife. 7, 1-13 (2018).
- Noble-Nesbitt, J. Water balance in the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Exchanges of water with the atmosphere. Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).
- Sweetman, H. L. Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard). Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).
- Nijhout, H. F. Insect Hormones. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Chen, J., et al. Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations. DNA Research. 19, 423-433 (2012).
- Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).
- Adams, J. A. Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard. Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).
