Chemistry

Insamling och bearbetning av neutronkristallografi för modellering av väteatomer i proteinstrukturer

Published: December 1, 2020 doi: 10.3791/61903

Gabriela C. Schröder^1,2, Flora Meilleur^1,2

¹Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, ²Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Neutronproteinkristallografi är en strukturell teknik som tillåter lokalisering av väteatomer och därmed ger viktiga mekanistiska detaljer om proteinfunktionen. Vi presenterar här arbetsflödet för montering av en proteinkristall, neutrondiffraktionsdatasamling, strukturförfining och analys av kartorna över neutronspridningens längddensitet.

Abstract

Neutronkristallografi är en strukturell teknik som möjliggör bestämning av väteatotompositioner inom biologiska makromolekyler, vilket ger mekanistiskt viktig information om protonations- och hydreringstillstånd utan att inducera strålningsskador. Röntgendiffraktion ger däremot endast begränsad information om ljusatomers position och röntgenstrålen inducerar snabbt strålningsskador på ljuskänsliga kofaktorer och metallcentra. Presenteras här är arbetsflödet som används för IMAGINE och MaNDi beamlines vid Oak Ridge National Laboratory (ORNL) för att erhålla en neutrondiffraktionsstruktur när en proteinkristall av lämplig storlek (> 0,1 ^mm3) har odlats. Vi visar montering av hydrerade protein kristaller i kvarts kapillärer för neutron diffraktion datainsamling. Också presenteras ångutbytesprocessen av de monterade kristallerna med _{D2O-innehållande} buffert för att säkerställa ersättning av väteatomer på utbytbara platser med deuterium. Inkorporering av deuterium minskar bakgrunden till följd av osammanhängande spridning av väteatomer och förhindrar densitetsavstängning orsakad av deras negativa sammanhängande spridningslängd. Strategier för insamling av provjustering och insamling av rumstemperaturdata illustreras med hjälp av kvasi-Laue-datainsamling vid IMAGINE vid Högflödesisotoperreaktorn (HFIR). Dessutom demonstreras kristallmontering och snabb frysning i flytande kväve för insamling av kryodata för att fånga labila reaktionsmediärer vid MaNDi-instrumentet vid Spallation Neutron Source (SNS). Förberedelse av modellkoordinerade datafiler och diffraktionsdatafiler och visualisering av SLD-kartor (neutron scattering length density) kommer också att behandlas. Strukturförfining mot neutrondata eller mot gemensamma röntgen-/neutrondata för att erhålla en helt atomstruktur av det intressanta proteinet kommer slutligen att diskuteras. Processen för att bestämma en neutronstruktur kommer att demonstreras med hjälp av kristaller av lytisk polysackaridmonooxygenas Neurospora crassa LPMO9D, ett kopparhaltigt metalloprotein som är involverat i nedbrytningen av motsträviga polysackarider via oxidativ klyvning av glykosidbindningen.

Introduction

Neutron makromolekylär kristallografi är en teknik som ger ett unikt fönster in i proteiners struktur och underliggande kemi. Konceptuellt lik röntgendiffraktion ger neutrondiffraktion atomistiska detaljer om makromolekylär struktur, men interaktionen mellan neutroner och atomkärnor möjliggör lokalisering av ljusatomer, ofta svåra att upptäcka med röntgendiffraktion1. Under röntgendiffraktion sprids röntgenstrålar från elektronmolnet, vilket gör ljusatomer som väte (H) dåligt synliga i elektrontäthetskartor som inte har nära sub-Ångström-upplösning2. Däremot beror neutronernas spridningsintensitet på komplexa interaktioner med kärnan, med isotoper av samma element som visar olika spridningslängder. Därför har ljusatomer och deras isotoper, såsom väte (^1H) och deuterium (^2H eller D), jämförbar synlighet med stamnätet kol-, kväve- och syreatomer i kartor över neutronspridningslängd (SLD). Eftersom omfattningen av neutronspridningen är oberoende av antalet elektroner, skyms inte heller spridning från ljuselement av tunga element när de är i närheten av varandra, vilket observeras vid röntgenspridning. Den förbättrade synligheten av H och dess isotop D vid användning av neutrondiffraktion ger värdefull information om protonationstillståndet hos katalytiskt viktiga rester, kofaktorer och ligands och hjälper orienteringen av vattenmolekyler, vilket avslöjar viktig information om katalytiska mekanismer och ^proteinkemi3. Neutrondiffraktion erbjuder också fördelen av att vara en icke-destruktiv teknik, särskilt lämpad för biologiska prover som är känsliga för jonisering som proteiner med metallcentra eller ljuskänsliga redox-cofactors2. Det primära fokuset för denna artikel är att ge en översikt över arbetsflödet för att erhålla en högkvalitativ neutronproteinkristallstruktur. Vi hänvisar den intresserade läsaren till Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 och O'Dell et ^al.3 för en utmärkt översikt över neutronproteindiffraktion och Ashkar et ^al.7 för ytterligare tillämpningar av neutronspridning.

Neutroner genereras främst under kärnreaktioner som använder någon av två processer: kärnklyvning vid reaktorkällor eller spallation vid acceleratorbaserade ^källor8. Reaktorkällor ger en kontinuerlig neutronstråle genom att använda kärnklyvning av ^{235U-isotopen} medan spallation neutronkällor producerar en pulserad neutronstråle genom att bombardera ett mål, till exempel en flytande metall som kvicksilver, med ^protoner9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) i Oak Ridge, Tennessee, är värd för både en steady-state neutronkälla vid High Flux Isotope Reactor (HFIR) och en 60 Hz pulsad källa vid Spallation Neutron Source (SNS). IMAGINE beamline, som ligger vid HFIR, är en neutrondiffractometer optimerad för biologiska makromolekyler (kompletterande figur 1)¹⁰. IMAGINE använder en neutronbildskyltdetektor för att mäta kvasi-Laue-data med hjälp av en smal bandpass i intervallet 2,8 – 4,5 Å från enstaka kristaller med enhetscellskanter <150 Å. Den makromolekylära neutrondiffractometern (MaNDi), belägen vid SNS, är en tof-neutrondiffractometer utrustad med en sfärisk detektormatrisram (DAF) (kompletterande figur 2)¹¹. MaNDi mäter data från enstaka kristaller med enhetscellkanter i intervallet 10 – 300 Å genom att använda en tunable 2 Å-våglängdsbandbredd mellan 2,0 – 6,0 ^Å12.

Processen att generera neutroner är mycket energikrävande, vilket resulterar i relativt svaga neutronstråleflöde i kontrast till röntgenstråleflöde vid synkrotronkällor13. För att säkerställa tillräckliga signal-till-brus-förhållanden vid datainsamlingen är det nödvändigt att odla kristaller av lämplig storlek och ^kvalitet14. Vanligtvis behövs kristaller med volymer > 0,1 ^mm3 för att samla in data med adekvat ^statistik15. Förutom lägre flöden måste de inneboende egenskaperna hos interaktionen mellan neutroner och provkärnor ^beaktas16. Neutronernas spridningslängd skiljer sig åt för isotoper av samma element, en egenskap som med fördel kan utnyttjas i små vinklar neutronspridning (SANS) för att maskera eller markera regioner i ett prov – en process som kallas ^{kontrastmatchning17}. I diffraktionsexperiment kan den negativa sammanhängande neutronspridningslängden för H (-3.741 fm för ^1H) leda till annullering av neutronspridningstäthetskartitetsfunktioner eftersom de sammanhängande neutronspridningslängderna hos andra biologiskt relevanta atomer, inklusive kol (6,6511 fm för ^12C), kväve (9,37 fm för ^14N), syre (5,803 fm för ^16O), fosfor (5,13 fm för ^31P) och svavel (2,804 fm för ^32S) är positiva (tabell 1)^12,14. Dessutom ökar den stora inkonsekventa spridningslängden på H (25.274 fm), bakgrunden under datainsamlingen, vilket hämmar datamängdens kvalitet och äventyrar ^{dataupplösningen7}. För att kringgå dessa begränsningar som införts av H är det nödvändigt att för neutrondiffraktion byta H mot dess isotopdeuterium, ^2H(D), som har en positiv sammanhängande neutronspridningslängd (6,671 fm) och betydligt lägre osammanhängande spridningslängd (4,04 fm)¹⁹. Detta kan uppnås genom perdeuteration, en process där proteinet uttrycks av organismer som odlas i fullt deutererade medier som säkerställer fullständigt införlivande av D på ^H-platser20. Det är också möjligt att delvis deuterera protein genom att ersätta H med D enbart på de utbytbara platserna (titrerbara grupper) medan de icke utbytbara kolbundna platserna förblir ^hydrerade21. Detta kan uppnås genom tillväxt av hydrerade proteinkristaller i deutererad ^moderlut22. Vanligast är dock att H/D-utbyte av hydrerade proteiner utförs genom ångväxling efter tillväxt av lämpligt stora kristaller i _H2O-baserad ^buffert23. I sådana fall monteras kristaller i en kvarts kapillär och ångkvilibreras med en _D20-baserad moderlut.

De begränsade neutronflödena vid neutronkällor resulterar i längre datainsamlingstider, från dagar till flera ^veckor24. På ORNL använder både IMAGINE och MaNDi en smal våglängdsbandpass i intervallet 2–6 Å för att optimera ^{datainsamlingen25}. Data kan samlas in i rumstemperatur eller vid kryotemperatur. Kryo-datainsamling kan potentiellt förbättra datakvaliteten och öppnar upp möjligheten för frysfångstkatalytiska intermediärer. Efter insamling av neutrondiffraktionsdata samlas en röntgendatauppsättning vanligtvis in på samma kristall vid samma temperatur eller på en kristall som odlas under identiska ^{förhållanden26}. Datainsamling vid samma temperatur gör det möjligt att utföra strukturförfining mot både röntgen- och neutrondata, vilket förhindrar eventuella temperaturinducerade artefakter, såsom förändringar i vattnets synlighet och position eller beläggning av rester med alternativa ^{konformationer27}. Förfining av gemensamma röntgen neutrondata ökar förhållandet mellan data och parameter och ger fördelen att proteinets stamkoordinater kan förfinas mot röntgendata, medan neutrondiffraktionsdata används för att förfina H/D-atomernas ^position28. Detta är särskilt användbart vid användning av delvis deutererade prover, där densitetsavstängning på grund av H-atomer på icke utbytbara platser på proteinet förekommer. Även om antalet röntgenstrukturer vida överstiger antalet neutronstrukturer som deponeras i Protein Data Bank (PDB), har mjukvarupaket som ursprungligen utformades för förfining av röntgendata utvidgats till att omfatta neutrondata samt3,29,30. Efter datainsamling kan modeller förfinas med hjälp av förfiningspaket som phenix.refine, CNSsolve (nCNS) eller SHELXL28,31,32,33. Under förfiningsprocessen kan neutronspridningsdensitetskartor visualiseras för manuell montering med ^COOT34. Efter strukturlösning kan koordinaterna och neutron- och/eller röntgendiffraktionsdatafilerna skickas till PDB, som validerar och deponerar modellen, vilket gör den tillgänglig för allmänheten18,29,30.

Strukturell analys av proteiner är ett mångfacetterat tillvägagångssätt där många tekniker används för att undersöka deras funktion och ^mekanism35. Neutronproteinkristallografi ger värdefulla kemiska insikter för att expandera på och komplettera resultaten från ytterligare studier som röntgendiffraktion, spektroskopi, kärnmagnetisk resonans (NMR) eller mikrokristallelektrondiffraktion (microED)³⁶. Neutronproteindiffraktion är unikt positionerat för att ge insikter i enzymatiska mekanismer, eftersom H-atomer är centrala för deras kemi. Frånvaron av strålningsskador orsakade av neutroner gör dem till en sond som är exceptionellt lämpad för studier av ^{metalloproteiner37}. Vi presenterar här ett representativt exempel på processen för neutronproteindiffraktion från provberedning till datainsamling, förfining och analys (figur 1). Kristaller av tillräcklig storlek för neutrondiffraktionsexperiment har odlats av metalloproteinet Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D är ett kopparhaltigt metalloprotein som är involverat i nedbrytning av motsträvig cellulosa genom syreatomsinsättning vid glykosidisk ^{bindning38,39}. NcLPMO9D aktiva plats innehåller ett mononukleärt koppar centrum inom en karakteristisk "histidin-ortos" bestående av N-terminalen histidin och en andra bevarad histidin (kompletterande figur 3)⁴⁰. N-terminalen för svamp-LPMOs är metylerad men ändringen efter övergångsövergång sker inte under rekombinant uttryck i jäst. I NcLPMO9D-vilotillståndet är kopparcentret närvarande i ett ^{Cu2 +} oxidationstillstånd och aktiveras genom en enda elektronreduktion till ^{Cu1 +}, vilket gör att molekylärt syre kan binda och aktiveras genom att snabbt reduceras till en superoxidart41,42. Den totala NcLPMO9D-reaktionen kräver ytterligare tillsats av en elektron och två protoner för att bilda den hydroxylerade polysackaridprodukten43. Identiteten på de aktiverade syrearter som ansvarar för väteatoposuttag (HAA) från polysackaridersubstratet har inte identifierats och intensiva strukturella och beräkningsstudier pågår för ^{närvarande44,45}. Med tanke på redoxkemin på nclpmo9D-anläggningen är begränsningen av strålningsskador särskilt relevant. Vi illustrerar här rumstemperatur och kryo-temperatur datainsamling på NcLPMO9D kristaller för att bestämma NcLPMO9D struktur i viloläge och i aktiverad reducerad form, ^respektive46. Tonvikten kommer att läggas på proteinkristallmontering, strålelineinstrumentinställning för datainsamling, utarbetande av data och koordinatfiler och de förfiningssteg som krävs för att modellera en neutronstruktur av alla atomer.

Protocol

1. Utvärdering av kristallstorlek

Mät kristallernas storlek med hjälp av ett mikroskop utrustat med normalt och polariserat ljus. Välj kristaller med en minsta volym på ~0,1 ^mm3 (kompletterande figur 4).
Märk brunnar med tillräckligt stora kristaller och notera de kristalliseringsförhållanden som används för att generera dessa kristaller.

2. Beredning av deutererad kristalliseringsbuffert

Lös upp kristalliseringsbuffertkomponenter i _D2O för att generera deutererad kristalliseringsbuffert.
Justera buffertens pH-pH genom att beräkna lösningens pD med hjälp av följande ekvation:
(1)
där _pHmeas är pH-värdet mätt med en vanlig glaselektrod. Det ursprungliga pH för NcLPMO9D kristalliseringsbufferten var 6,0, därför kommer vi att använda ett pHmeas på 5,6 för den deutererade _{kristalliseringsbufferten} vid pD 6,0.
Sänk ned pH-mätarelektroden i _D2O i tio minuter före användning (kompletterande figur 5).
Justera _pHmeas till 5,6 med hjälp av basen NaOD eller syran DCl.

3. Kristallskörd

Placera silikoniserade 22 mm runda glasglasrutschbanor bredvid kristalliseringsbrickan från vilken kristaller kommer att skördas. Använd en ren glasrutschbana per kristall (bild 2A).
Öppna den förseglade smörgåslådan som innehåller proteinkristallerna i den 9-well stora volym kiselglasplattan.
Ta bort 10-20 μL från kristalliseringsbehållarens lösning med en mikropipett och placera lösningen på glasrutschbanan (bild 2B).
Skörda kristallen med en mikroloop av lämplig storlek och placera kristallen i behållarens lösningsdroppe på glasrutschbanan för att avlägsna skräp som ofta skördas tillsammans med kristallen (figur 2C och figur 2D).
OBS: Det kommer att vara nödvändigt att arbeta snabbt eftersom små volymdroppar kan avdunsta. Skördade kristaller riskerar också att torka ut när de utsätts för atmosfären. Det kan vara nödvändigt att tillsätta någon reservoarlösning till proteinfallet för att förhindra att kristaller torkar ut i små kristalliseringsfallvolymer.

4. Kristallmontering

OBS: Kapillärmonteringsprotokoll varierar med experimentalistpreferenser. För att förhindra skador på kristaller bör kapillärer som behöver förkortas poängsättas med en skärsten eller sandpapper för att säkerställa en jämn paus.

Fyll ena änden av en 2 mm diameter 50 mm längd kvarts kapillär med reservoarbuffert genom kapillärverkan eller genom att direkt leda in ~10 μL reservoarbuffert i kapillären (figur 3A).
OBS: Användare uppmuntras att använda kvarts kapillärrör eftersom det, förutom dess mekaniska styrka, är viktigt att begränsa neutronstråleabsorptionen och lägre bakgrundsbidrag från kapillären. Glaskapillärer introducerar hög bakgrund och absorberar neutroner, vilket äventyrar datakvaliteten.
Placera försiktigt kristallen i reservoarbufferten i kvartskapillären med hjälp av monteringsslingan (figur 3B och figur 3C).
Knacka försiktigt på röret för att flytta reservoarbufferten och den nedsänkta kristallen ner i kapillären (figur 3D).
Placera kristallen inte närmare än 13,5 mm och inte ytterligare 27,5 mm från ena änden av kapillären; Detta kommer att vara monteringsänden (kompletterande figur 6).
Aspirera buffertlösningen runt kristallen med en lång tunn pipettspets och lämna kristallen något våt. Rör inte vid kristallen (kompletterande figur 7A).
Torka kapillärväggarna med en tunn pappersveke (kompletterande figur 7B).
Pipett 20–50 μL deutererad buffertlösning i slutet av kapillären mittemot monteringsänden (figur 4A).
Smält bivax med en värme "trollstav" och sätt försiktigt in kapillären i denna smälta bivax. Upprepa tills en lufttät tätning bildas (figur 4B och figur 4C).
Pipettera en mycket liten mängd deutererad buffert, cirka 5 μL i kapillärens monteringsände för att fungera som en "kylfläns" för det heta bivaxet. Doppa detta ändamål i smält bivax för att generera en lufttät tätning som tidigare beskrivits för att bilda en kapillär förseglad i båda ändarna (figur 4D).
Inspektera den monterade kristallen med hjälp av ett mikroskop efter montering för att säkerställa lufttäthet (figur 4E).
Fäst försiktigt de monterade kristallerna med Kim-våtservetter i en behållare som ett 15 ml Falcon-rör eller Petri Dish och förvara horisontellt vid den temperatur vid vilken kristallerna odlades (figur 4F).

5. Ångväxling

Ersätt den deutererade bufferten med färsk buffert två dagar efter kristallmontering.
Smält vaxtätningen längst bort från kristallen med en värmeslinga och använd en pipett och pappersvekar för att ta bort bufferten.
Fyll på kapillären med 20-50 μL deutererad buffertlösning och försegla med vax.
Upprepa det deutererade buffertbytet två gånger till med fyra dagars intervall för att säkerställa att deutererad buffertångväxling är klar och tillåta ångväxling i minst två veckor.

6. Neutronproteindiffraktion

OBS: Läsare som är intresserade av IMAGINE beam line-detaljerna uppmanas att konsultera Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

Insamling av rumstemperaturdata vid IMAGINE beamline på HFIR
1. Provmontering
  1. Fäst den kapillärmonterade kristallen på goniometern med kitt.
  2. Montera goniometern på provstickan och centrera kristallen i strålen med hjälp av den off-line justeringsstationen.
  3. Fäst provstickan på instrumentprovet (kompletterande figur 1B).
  4. Se till att den experimentella hyddan töms och öppna strållinavslutaren för insamling av neutrondata.
2. Datainsamling
  1. Öppna datainsamlingsprogrammet på styrdatorn för strållinjen och klicka på fliken Installation för att ställa in datainsamlingsstrategin. Under Experimentparametrar skriver du exempelnamnet bredvid exempelnamn och anger förslagsnumret bredvid Förslag. Under Bildnamn väljer du Mappmall och anger målet för de förvärvade data som ska sparas och välj Bildprefix och skriv relevant ramnamn (Kompletterande figur 8).
  2. Öppna optik-GUI och klicka på 2,78 för _λmin och 4,78 för _λmax för att ställa in kvasi-Laue-sortimentet för datainsamling (kompletterande figur 9).
  3. Växla till fliken Samla in och under Nästa skanningsparametrar infoga exponeringstiden i sekunder under Exponering, antalet bildrutor under N-ramar och vinklarna för datainsamling under Δ φ/Frame. Namnge ramen som ska samlas in under Bildprefix och initiera datainsamlingen genom att klicka på knappen Starta skanning (kompletterande bild 10).
  4. De diffracted neutronerna kommer att detekteras av bildplåtsdetektorn. I slutet av varje exponering kommer bildplattan att läsas och mönstret visas på gui för datainsamling (kompletterande figur 11).
  5. Ramar indexeras, integreras, våglängd normaliseras och skalas med Lauegen, ^Lscale50 och Scala av den ansvariga beamline-forskaren, som kommer att förse användaren med den sammanslagna reflektionsfilen efter datainsamling (kompletterande figur 12).
    OBS: Datainsamling vid både IMAGINE och MaNDi kommer att utföras i kvasi-Laue-läge med hjälp av metodik och programvara som utvecklats för Laue diffraction datainsamling som utvecklats av Helliwell et ^al.48 och Nieh et ^al.49.
  6. Samla in en motsvarande röntgendatauppsättning på samma kristall vid samma temperatur efter insamling av neutrondiffraktionsdata (kompletterande figur 13).
    OBS: En kristall som odlas från samma droppe eller under samma kristalliseringsförhållanden kan också användas för att samla in röntgendiffraktionsdata för förfining av led neutron/röntgen.
Cryo datainsamling vid MaNDi-strållinjen på SNS
OBS: Läsare som är intresserade av strållinjespecifikationerna uppmanas att konsultera Coates m.fl. (2015), Meilleur m.fl. 201810,11.
1. Provmontering
  1. Förbered den deutererade askorbat blötläggningslösningen för reduktion av kristallerna och det deutererade kryoprotektanten. Placera 20 μL droppar av var och en av dessa lösningar i sittdroppar i en kristalliseringsplatta.
    OBS: Kryoprotektiva lösningen är vanligtvis kryoprotektörerna som har visat sig vara effektivt för kryotemperaturröntgendiffraktionsdatainsamling som utarbetats i _D2O. Detta kryoskyddsmedel kan vid behov optimeras ytterligare (t.ex. koncentration) för insamling av neutrondata.
  2. Välj slingor för provmontering och fäst dem på en magnetisk kryobas enligt MaNDi-riktlinjerna (kompletterande figur 14).
  3. Fyll ett skum cryo-Dewar med flytande kväve. Placera en kryoskyddshylsa av metall i det flytande kvävet för att svalna (kompletterande figur 15A).
  4. Ta bort vaxpluggarna från kapillärens båda ändar och tryck på kapillären för att flytta buffertpluggen så att den monterade kristallen är nedsänkt i buffert. Tvätta ut kristallen i 20 μL-behållarens fall i sittdroppebrunnen (kompletterande figur 15B och kompletterande figur 15C).
    OBS: Detta steg krävs inte om H/D-utbyte utfördes genom jämvikt av kristalliseringsdroppar mot deutererad buffert eller genom direkt blötläggning av kristallen i deutererad buffert.
  5. Sänk ner kristallen i askorbatdränkningslösningen i två timmar. Montera kristallen i en mikroloop fäst vid en magnetisk kryobas. Sänk ned den monterade kristallen i kryoprotektionsmedlet i 10 sekunder och doppa kristall- och kryofästet i det flytande kvävet för att frysa (kompletterande figur 15D).
  6. När kristallen är frusen, använd förkyld kryostiftstäng och montera kristallen på MaNDi-provstadiet utrustat med en kryoström. Öppna försiktigt kryostiftstängen och se till att kristallen förblir i kryoströmmen (kompletterande figur 2C).
2. Datainsamling
  1. Öppna datainsamlingsprogrammet där experimentinformationen ska ha fyllts i automatiskt.
  2. Klicka på kristallens mitt för att centrera den med den datorstyrda goniometern (Kompletterande figur 16).
  3. Under Tabell fastställer du datainsamlingsstrategin genom att ange vinklarna för datainsamling under "phi" samt den totala exponeringen för neutronstråle per ram under Värde (kompletterande figur 17).
  4. Klicka på Skicka för att starta datainsamlingen.
  5. När data samlas in kommer diffracted neutron att vara synlig (kompletterande figur 17). Diffraktionsfläckar blir tydligare när exponeringstiden ökar, vilket förbättrar signal-till-brus-förhållandet (figur 5).
  6. Ramar kommer att indexeras, integreras, våglängd normaliseras och skalas med Mantid och Lauenorm av den ansvariga beamline-forskaren, som kommer att förse användaren med den sammanslagna intensitetsfilen efter ^{datainsamling51}.

7. Förfining av strukturen

Förfining av ledröntgen och neutrondata
1. Konstruktionsförberedelse
  1. Förfina röntgendata för att erhålla en proteinstruktur med hjälp av programvaran phenix.refine och Coot för manuell byggnad för att få en färdig struktur.
  2. Öppna CCP4 och välj programmet Konvertera till/ändra/utöka MTZ för att matcha neutrondatans R-fria dataflaggor med röntgendatans. Markera det här alternativet om du vill importera reflektionsfilen i MTZ-format . Under Ladda upp den erhållna neutron-MTZ-filen och ladda upp röntgen mtz-filen under Import FreeR MTZ (Kompletterande figur 18). Ange ett namn på den nya MTZ-filen under Ut och klicka på Kör.
  3. Öppna Phenix mjukvarupaket och klicka på ReadySet under Refinement Tools. Bredvid PDB-filen ladda upp PDB-koordinatfilen förfinad mot röntgendata. Välj att lägga till väte som modell om du är frånvarande och välj H/D på utbytbara platser, H någon annanstans på den nedrullningsbara menyn. Välj Tillsätt deuterium till lösningsmedelsmolekyler och lämna de återstående alternativen på deras standardvärden (kompletterande figur 19A).
    OBS: Om ett perdeutererat protein används väljer du alternativet Lägg till väten i modell om det saknas och väljer H/D på utbytbara platser, D någon annanstans.
2. Förfining av struktur
  1. Öppna programmet phenix.refine under fliken Förfining för att ställa in förfiningen med hjälp av både röntgen- och neutrondata. På fliken Konfigurera i indatafiler mata in PDB-filen från röntgenstrukturen som har bearbetats med ReadySet och den nödvändiga CIF-begränsningsfilen för alla relevanta ligands. Ladda upp MTZ-filen från neutrondata med de Rfree-flaggor som tilldelats med CCP4 och tilldela detta som "Neutrondata" och "Neutron R-free" under rubriken Datatyp. Ladda upp MTZ-filen från röntgendata och tilldela den som "röntgendata" och "röntgen R-fri" under rubriken Datatyp. Utrymmesgruppen och dataetiketterna fylls i automatiskt när data har laddats upp (kompletterande figur 19B).
    OBS: När du utför förfiningen och matar in kristallinformationen, använd enhetscellen som bestäms av röntgendata.
  2. Behåll standardförfiningsstrategin under fliken Konfigurera i förfining . Öka antalet cykler till fem (kompletterande figur 20)
  3. Välj Alla parametrar, klicka på Avancerat och välj Hydrogens.... Ändra väteförfiningsmodellen till individ och stäng av Force riding adp (kompletterande figur 20).
  4. Välj Alla parametrar och öppna alternativet Sökparametrar . Sök efter ordet nukleär och välj att använda kärnavstånden för X-H/D (kompletterande figur 20).
  5. Välj Kör för att initiera förfiningen.
3. Modellbyggnad
  1. Efter förfining i Phenix, klicka på Öppna i Coot på fliken Resultat för att visualisera röntgenelektrondensiteten och neutron SLD-kartorna. Klicka på fliken Display Manager och klicka under Kartor på Ta bort karta bredvid _neutron kartor för att ta bort neutronkartorna (kompletterande figur 21). Klicka på Arkiv > Öppna MTZ, mmCIF fcf eller phs.... Markera de aktuella förfiningsfilerna och öppna MTZ-filen. För både Amplitudes och Faser väljer du 2FOFC WT_no_fill_neutron data på den nedrullningsbara menyn. Upprepa detta och öppna _FOFC WT_neutron data. Öppna Display Manager och växla till Bläddra för både neutron- och röntgen 2FOFCWT-kartorna och rulla sedan för att minska rmsd på 2FOFCWT-kartorna till 1,00 (kompletterande figur 21). Växla till Bläddra för både neutron- och röntgen FOFCWT-kartorna och bläddra för att minska rmsd på FOFCWT-kartorna till 3,00.
  2. Utför visuell inspektion av resthalterna för att avgöra om modellen passar data. Bestäm rätt orientering och H/D-beläggning för alla utbytbara platser genom att analysera karttoppar för differensitet. Detta inkluderar hydroxylgrupperna av seriner, treonon och tyrosiner; kväve från histidin, glutamin, sparris och lysin; cykcycydinsulfydryl; Karboxylgrupperna av aspartat och glutamat. ryggrad bland grupper; ligands; kofaktorer och eventuella funktionaliserade resthalter (figur 6).
  3. Omorientera vattenmolekyler enligt neutrondensitet och vätebindningsinteraktioner genom att rotera dem med funktionen Rotera översätt zon/kedja/molekyl (kompletterande figur 22A och kompletterande figur 22B). Justera positionerna för H/D-utbytbara platser med hjälp av verktyget Redigera chivinklar och funktionen Rotera översätt zon/kedja/molekyl (kompletterande figur 22C och kompletterande figur 22D).
Förfining av struktur – förfining av neutrondata
1. Konstruktionsförberedelse
  1. Öppna Phenix och välj "Molekylär ersättning" och välj "Phaser-MR (full featured)" för att härleda fasen av de skalade intensiteterna som tillhandahålls av instrumentforskaren genom molekylär ersättning för att generera en startkoordinatfil i pdb-format. Ange den startande pdb-strukturen på fliken "Indata och allmänna alternativ och slutför alternativen Ensembles, ASU-innehåll och Sökprocedurer .
  2. Öppna modellverktyg och välj PDB-verktyg. Infoga pdb-filen som indatafil. Navigera till fliken Alternativ och välj namnen på lösningsmedlet, liganderna, kofaktorerna och metallerna under Ta bort atomval . Detta tar bort alla vattenmolekyler, kofaktorer, ligands och metalljoner för att generera en minimal modell. Välj dessutom att ta bort alternativa konformatorer från modellen (kompletterande bild 23).
  3. Välj Förfining i Fenix och öppna ReadySet. Mata in den redigerade pdb-koordinatfilen bredvid PDB-filen. Välj om du vill lägga till väte som modell om du är frånvarande och välj H/D på utbytbara platser, H någon annanstans från rullgardinsmenyn med neutronförfiningsalternativ (kompletterande figur 23).
2. Förfining av struktur
  1. Öppna programmet phenix.refine under fliken Förfining i Phenix. På fliken Konfigurera mata in PDB-filen som har bearbetats med ReadySet under rutan Indatafiler . Ladda upp MTZ-filen från neutrondata i rutan Indata och tilldela den som röntgendata och röntgen R-fri under kolumnen Datatyp även om det är neutrondata. Förfiningskonfigurationen som ställs in i nästa steg kommer att användas för att behandla reflektionsfilen som neutrondata. Utrymmesgruppen och dataetiketterna fylls i automatiskt när data har laddats upp (kompletterande figur 24A).
  2. Behåll standardförfiningsstrategin under fliken Konfigurera i förfining. Öka antalet cykler till fem. Välj neutron på rullgardinsmenyn under Andra alternativ. Avmarkera alternativet Att uppdatera vatten (kompletterande figur 24B).
  3. Välj Alla parametrar>Advanced>Hydrogens. I det nya fönstret väljer du Individ i listrutan Hydrogen refinement model och stänger av force riding adp (kompletterande figur 20).
  4. Välj Alla parametrar > Sökparametrar... alternativ. Sök efter ordet nukleär och välj att använda kärnavstånden för X-H/D (kompletterande figur 20).
  5. Välj att köra om du vill initiera förfiningen.
    OBS: Efter den första förfiningen kommer det att vara nödvändigt att visuellt inspektera neutron SLD-kartorna och utföra manuell modellbyggnad i Coot. Det kan vara nödvändigt att infoga ligands/cofactors som finns i modellen. Efterföljande förbättringar kräver den nödvändiga CIF-fasthållningsfilen för alla relevanta ligands och dessa bör laddas upp på fliken Konfigurera på phenix.refine.
3. Modellbyggnad
  1. Efter förfining i Phenix, klicka på Öppna i Coot på fliken Resultat för att visualisera neutron SLD kartor och struktur. Klicka på fliken Display Manager och klicka under Kartor på Delete Map för att ta bort både 2FOFCWT- och FOFCWT-kartorna (kompletterande figur 25). Klicka på Arkiv > Öppna MTZ, mmCIF fcf eller phs.... Markera den aktuella förfiningsmappen och välj MTZ-filen. För både Amplitudes och Faser väljer du 2FOFC WT_no_fill data på den nedrullningsbara menyn. Upprepa genom att klicka på Arkiv > Öppna MTZ, mmCIF fcf eller phs... och välj FOFCWT-data från den nedrullningsbara menyn för både Amplitudes och Phases alternativet. Öppna Display Manager och växla till Bläddra för _2FOFC WT_no_fill-kartan och bläddra sedan för att minska rmsd för _2FOFC WT_no_fill data till 1,00 (kompletterande bild 25). Växla till Bläddra för FOFCWT-kartan och bläddra för att minska rmsd för FOFCWT-data till 3.00.
  2. Utför visuell inspektion av proteinstrukturen för att avgöra om modellen passar neutron SLD-kartan.
  3. Som beskrivs i 7.1.3.2, bestäm rätt orientering och H/D-beläggning av resthalter och grupper med utbytbara H/D-platser. Justera restpositionerna med verktyget Rotera översätt och Redigera chivinklar (bild 6). Vid behov kan Real Space Refine Zone användas. Fixera D-atomer som exploderar från resterna manuellt genom att använda textredigeraren för att infoga rätt atomkoordinater
    OBS: Real Space Refine Zone är inte optimerad för neutron SLD-kartor i Coot och kan resultera i oregelbundna bindningslängder för atomer som är bundna till D, så kallade exploderande rester (kompletterande figur 26). Det är att föredra att manuellt redigera nödvändiga atomkoordinater och undvika användning av Real Space Refine Zone.
  4. Sätt in och omorientera vattenmolekyler enligt neutrondensitet. Om du vill lägga till vatten i Coot väljer du ikonen Placera atom vid pekaren och väljer att sätta in en vattenmolekyl (kompletterande figur 27A). Coot kommer att sätta in en O-atom på denna position som standard.
  5. För att lägga till D-atomer till O-atomerna i vatten som sätts in i Coot använd Phenix. Öppna menyn Förfining och klicka på ReadySet. Bredvid Neutronfinfineringsalternativ väljer du bara alternativet att tillsätta deuterium till lösningsmedelsmolekyler. Avmarkera Lägg till väte i modell om det saknas (kompletterande figur 27B och kompletterande figur 27C).
    OBS: Modellbyggnad med hjälp av neutrondata skiljer sig från modellbyggnad av en gemensam röntgen/neutronstruktur eftersom det inte finns några röntgendata som bidrar till att förfina koordinaterna för ryggraden och tyngre atomer. I en gemensam förfining används elektrontäthetskartan initialt för att bestämma proteinets stamnät och sidechainkoordinater. Denna modell används därefter i en gemensam förfining av röntgen-/neutrondata där orientering och beläggning av H/D-atomer härleds från neutron-SLD-kartan. I en neutronförfining härleds hela strukturen från analys av neutron-SLD-kartorna, vilket kräver att vattenmolekyler, ryggrad, sidokedjor och ligander byggs utöver H/D-atomerna (figur 6). Förhållandet mellan data och parameter är lågt i förfining enbart mot neutrondata och försiktighet bör iakttas för att inte överanpassa data.

Representative Results

Neutron diffraktion data på kristaller av en lytisk polysackarid monooxygenas från Neurospora crassa (NcLPMO9D) samlades in på IMAGINE vid rumstemperatur och på MaNDi vid SNS under cryo-villkor enligt protokollet beskrivs ovan. Kristaller av det hydrerade proteinet som odlas i _H2O-baserad buffert med en volym större än 0,1 ^mm3 användes (belysande exempel på stora kristaller visas i kompletterande figur 4 och därefter siffror). Kristaller monterades i kvarts kapillärer och ångutbyte med den _D2O-baserade bufferten utfördes i tre veckor före datainsamling (figur 4).

Insamling av rumstemperaturdata utfördes på IMAGINE-strållinjen (figur 1). Ett fyra timmars vitstråletest ledde till högupplöst diffraktion som tyder på att kristallen var av lämplig storlek och kvalitet för en fullständig datauppsättning som skulle samlas in. Förutom att ge preliminär information om kristallens diffraktionskvalitet kan den första breda bandpassexponeringen användas för att indexera diffraktionsmönstret och bestämma kristallorienteringsmatrisen. Med tanke på kristallens _{P21-rymdgrupp} implementerades en datainsamlingsstrategi på 18 ramar med en insamlingstid på 20 timmar per bildruta. Precis som vid insamling av röntgendiffraktionsdata kräver rymdgrupper med högre symmetri färre ramar (dvs. mindre vinkeltäckning) för att samla in en komplett datauppsättning. Uppgifterna samlades in i kvasi-Laue-läge med ett våglängdsområde på 2,8 – 4,0 Å. Efter datainsamlingen indexerades, integrerades och sammanfogades uppgifterna för att ge en neutron SLD-fil i MTZ-format med en upplösning på 2,14 Å. Data bedömdes vara av tillräcklig kvalitet enligt liknande riktlinjer för röntgendataanalys, även om en fullständighet på 80 % och en _CC1/2 på minst 0, 3 ansågs godtagbara eftersom neutronproteindiffraktion är en fluxbegränsad teknik.

Efter insamling av neutrondiffraktionsdata i rumstemperatur användes samma kristall för att samla in en röntgendiffraktionsuppsättning i rumstemperatur vid 1,90 Å-upplösning (kompletterande figur 13). Röntgendata användes för att bestämma positionerna för de "tyngre" atomerna inklusive C, N, O och S. Den struktur som förfinades enbart mot röntgendata användes sedan som startmodell för att utföra en gemensam förfining mot röntgen- och neutrondata. Phenix ReadySet användes för att tillsätta H-atomer på icke utbytbara platser, H- och D-atomer på utbytbara platser och D-atomer till vattenmolekyler i startröntgenmodellen. Efter denna modellförberedelse utfördes iterativa förbättringar mot båda datamängderna (kompletterande figur 19 och kompletterande figur 20). Interaktiv modellbyggnad utfördes i Coot genom att visuellt inspektera densitetskartorna för att orientera sidokedjor och vattenmolekyler i enlighet därmed (kompletterande figur 22). Neutrondata användes främst för att bestämma protonationstillstånd och vattenmolekylorienteringar. Jämförelse av elektrontäthetskartan för rester som serin och tryptofan och motsvarande neutron SLD-karta illustrerar den information som kan erhållas om protonationstillstånd vid utbytbara platser från neutronproteindiffraktion (figur 7). Ett kartöverlägg av elektron- och neutron-SLD-kartor för vattenmolekyler visar också att även om interaktioner mellan vätebindning kan härledas från röntgendata, ger neutroner tydlig information om orienteringen av dessa vätebindningar (figur 8). Neutron SLD _FO-FC utelämna kartor genererades för att bestämma protonation stater och H/D orientering av sidokedjor. Illustrerade är de SLD-neutronkartor som erhållits för tyrosin- och treoninrester, där neutron Fo-FC-kartorna tydligt anger positiva toppar som anger närvaron av H/D (figur 9). De insamlade neutrondiffraktionsdata gav också värdefull information om flera protonationstillstånd, såsom -_ND3⁺ gruppen av Lys (figur 10). Förfiningsstatistik (_Rwork och _Rfree) övervakades noggrant under modelloptimering för att förhindra övermontering. Slutlig statistik gav en röntgen _Rwork på 12,77 % och en _Rfree på 18,21 %, och en neutron _Rwork på 14,48 % och en _Rfree på 21,41 % med 389 vattenmolekyler närvarande (kompletterande figur 28).

Kryotemperaturdata samlades in på NcLPMO9D efter en askorbat blötläggning för att minska kopparaktiva platsen från ^CuII till ^CuI på MaNDi-strållinjen (kompletterande figur 2 och kompletterande figur 15)⁴⁵. Data samlades in med tof laue-läge efter ett neutrondiffraktionstest med en 4 timmars exponering för att verifiera kvaliteten på diffraktion. Med tanke på kristallens rymdgrupp utformades en datainsamlingsstrategi på 18 ramar med en insamlingsdos på 80 Coulombs per ram. Uppgifterna samlades in i TOF-Laue-läge med ett våglängdsområde på 2,0 – 4,0 Å. Efter datainsamlingen indexerades, integrerades, skalades och slogs samman för att ge en reflektionsfil i MTZ-format med en upplösning på 2,40 ^Å51,52.

Efter datainsamlingen användes 2,40 Å kryotemperatur NcLPMO9D neutrondiffraktionsdatauppsättning för neutrondataförfining. Neutrondata fasades in genom molekylär ersättning med PDB 5TKH som startmodell. Phenix ReadySet användes för att lägga till H-atomer på icke utbytbara platser och H/D-atomer med partiell beläggning på utbytbara platser. Vattenmolekyler togs bort från startmodellen med PDB-verktyg (kompletterande figur 23). Modellberedningen följdes av förfining med phenix.raffine med hjälp av neutronspridningstabellen (kompletterande figur 24). Interaktiv modellbyggnad utfördes i Coot, med vattenmolekyler som tillsattes med hjälp av de positiva topparna på FO-Fc-kartan och placerades enligt potentiella vätebindningsinteraktioner (figur 11A och figur 11B). Vid analys av neutron SLD-kartor är vattenmolekyler tydligt synliga om de är mycket ordnade, men deras densitet kan vara sfärisk eller ellipsoid om de inte är välordnade (figur 11C-E). Neutron SLD-kartor användes för att ge värdefull information om orienteringen av rester som asparagin, där det kan vara svårt att skilja mellan kolyl- och aminogrupperna vid användning av enbart röntgendiffraktionsdata (figur 12A och figur 12B). Toppar i _FO-FC neutron SLD utelämna kartor var också mycket informativa vid bestämning av protonation tillstånd av histidin rester vid N _δ- eller N _ε-position (figur 12C och figur 12D). Protonationstillståndet för rester med flera H/D utbytbara platser kan också bestämmas med hjälp av neutron SLD-kartor. Detta illustrerades tydligt med en _FO-FC neutron SLD utelämna karta över arginin, som är känd för att ha en positiv laddning (figur 12E och figur 12F). Som tidigare förhindrades övermontering genom övervakning av _Rwork och _Rfree. Slutlig statistik gav ett _Rwork på 22,58% och en _Rfree på 30,84% (kompletterande figur 29). Med tanke på att neutronproteindiffraktion är en begränsad fluxbegränsad teknik där H:s negativa spridningslängd och stora osammanhängande spridningsfaktor måste beaktas, kan man förvänta sig att en neutrondataförfining skulle ha sämre statistik än en förfining av gemensamma röntgen-/neutrondata med färre synliga vattenmolekyler (kompletterande figur 28 och kompletterande figur 29).

Vid analys av neutron SLD-kartor kommer det att bli uppenbart att densitetsavstängning på grund av den negativa neutronspridningslängden för H kommer att uppstå för hydrerade proteiner som utsattes för ångutbyte med _{D2O-innehållande} kristalliseringsbuffert. På grund av denna anledning verkar neutron SLD-kartor där icke utbytbara H-atomer är fästa vid kol ofullständiga jämfört med deras elektrontäthetskartamotsvarighet (figur 13A). Effekten av annullering är ofta tydligare vid sämre upplösningar, vilket gör det absolut nödvändigt att få proteinkristaller av hög kvalitet. Det är därför att föredra att utföra en gemensam förfining av ett prov med både röntgen- och neutrondata där röntgendata kan användas för att bestämma proteinets stam (figur 13B). Dessutom kan svavelatomer i cystein och metionin vara dåligt synliga, vilket kräver röntgendata för exakt atomplacering (figur 13C och figur 13D). Metaller med svaga neutronspridningslängder kan också vara utmanande att modellera i neutron SLD-kartor, vilket framgår av våra LPMO9D-kartor. Insamling av en låg dos (fri från strålningsskador) röntgendatauppsättning på samma kristall är därför användbar, eftersom den tillåter metallatotompositionering med hjälp av elektrontäthetskartor (figur 13E och figur 13F).

Bild 1: Flödesschema över arbetsflödet för neutronproteinkristallografi. Proteinproduktion. För att erhålla en neutronstruktur uttrycks protein först. Bakteriella uttryck i _H2O- eller _D2O-baserade medier används vanligtvis för att producera ett högt utbyte av hydrerat respektive perdeutererat rekombinant protein. Proteinet renas i _H2O-baserad buffert och kristalliseras sedan i antingen _H2O- eller _D2O-baserad kristalliseringsbuffert för att odla kristaller till en minsta storlek på 0,1 ^mm3. Provberedning: Före insamling av neutrondiffraktionsdata genomgår _H2O-odlade kristaller H/D-utbyte för att utbyta proteintitrerbara H-atomer med D. H/D-utbyte genom direkt blötläggning av kristallerna i deutererad kristalliseringsbuffert, jämvikt av kristalliseringsdroppen med en _D2O-baserad reservoar eller genom att montera kristallerna i kvartskapillärer för ångutbyte med deutererad kristalliseringsbuffert. Insamling av neutrondata: Efter H/D-utbyte screenas potentiella kristaller för att bestämma diffraktionskvaliteten. Kristaller med en minsta upplösning på 2,5 Å anses lämpliga för en fullständig datauppsättning som ska samlas in. Kristaller monteras i kvarts kapillärer för datainsamling vid rumstemperatur eller blixtfryst i en kryo-slinga för datainsamling vid kryogen temperatur. En röntgendatauppsättning samlas in på samma (eller en identisk) kristall vid samma temperatur. Modellbyggnad: Förfining utförs med fenix.raffinera mot både neutron- och röntgendata eller endast mot neutrondata. Manuell modellbyggnad av proteinstrukturen utförs i Coot med hjälp av neutron SLD-kartorna. Komplett struktur: Efter slutförandet av proteinstrukturen valideras och deponeras koordinatmodellen i Protein Data Bank. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2: Skörd av proteinkristaller. A) Kristaller hanteras under mikroskop. B) Den förseglade smörgåslådan som innehåller den silikoniserade glasplattan öppnas. Reservoarbufferten är pipetted på silikoniserade glasrutschbanor. C) En kristall skördas med en mikroloop. (D) Kristallen placeras i en droppe moderlut för att tvätta bort skräp som ofta skördas tillsammans med kristallen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3: Överföring av kristall till kvarts kapillär. A) Änden av en kvartskapillär fylls med reservoarbuffert. B) Kristallen överförs till kvartskapillären och C) nedsänkt i reservoarbuffert. (D) Kristallen bärs ner kapillär med hjälp av reservoarbuffert. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 4: Tätning av kvartskapillären. A) Deutererad buffert tillsätts i slutet av kapillären för att bilda en "plugg". B) Vax smälts med en "trollstav". C) Kapillären placeras i det smälta vaxet för att täta. (D) Vaxpluggar bildas i båda ändar för att täta kapillären. (E) Kristallen efter montering. F) Den förseglade kapillären placeras i en Petri-skål och hålls på plats med kitt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 5: Ökat signal-till-brus av neutrondiffraktionsmönstret. När datainsamlingen fortskrider blir diffracted fläckar mer intensiva. (OBS: de levande diffraktionsbilderna som presenteras här är för illustration och togs från olika kristaller.) Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 6: Interaktiv modellbyggnad med hjälp av neutrondata i Coot. A) En positiv _FO-FC neutron SLD densitet topp (grön) som anger serin måste omorienteras genom redigering av chi vinklar. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. B) Korrekt placerad serin. C) Positiva och negativa _FO-FC neutron SLD densitetstoppar (grön respektive röd) som anger att tryptofan måste roteras/översättas för att matcha differensdensitetstoppen. (D) Korrekt orienterad tryptofan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 7: Ytterligare information från neutron SLD-kartor. (A) 2FO-FC elektrontäthetskarta (blå) visar positionerna för de "tyngre" atomerna i serin. (B) 2FO-FC neutron SLD-karta (lila) visar tydligt positionen för den "lättare" D-atomen i serin. (C) 2FO-FC elektrontäthetskarta (blå) visar positionerna för de "tyngre" atomerna i tryptofan. (D) 2FO-FC neutron SLD-karta (lila) visar tydligt positionen för den "lättare" D-atomen i tryptofan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 8: Placering av vattenmolekyler. (A) Den sfäriska formen av en _2FO-FC elektrontäthetskarta (blå) funktion för vatten. (B) _2FO-FC neutron SLD-kartan (lila) ger information om vattenorientering och vätebindningsinteraktion. C) Kartöverlägg av elektron- och neutron-SLD-kartor över vatten. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 9: Neutron SLD _{FO-FComit-kartor}. (A) _FO-FC neutron SLD-kartan (grön) ger tydlig information om tyrosinresternas H/D-orientering. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. B) Tyrosinrester med korrekt H/D-orientering. C) _FO-FC neutron SLD-karta (grön) ger tydlig information om H/D-orienteringen av treoninrester. D) Treoninrester med korrekt H/D-orientering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 10: Flera protonationstillstånd som visas med neutron SLD-kartor. (A) _2FO-FC elektrontäthetskartan (blå) ger endast positionen för N-atomen av lysin ε-ammoniumgrupp. (B-E) _FO-FC neutron SLD utelämnar kartan (grön) visar tydligt den positivt laddade -_NH3-gruppen. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. F) Överlagring av elektrontäthet och SLD-kartor för neutron. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 11: Utseende av vattenmolekyler i neutron SLD-kartor. (A) Vattenmolekyler placeras enligt _FO-FC neutron SLD kartor (grön) och potentiella vätebindningar. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila. B) Korrekt placerad vattenmolekyl. (C-E) De olika formerna av neutron SLD-kartor för vattenmolekyler beroende på B-faktorer och interaktioner mellan vätebindning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 12: Information om aminosyraorientering och protonation som tillhandahålls av neutron SLD-kartor. A) Neutron-SLD FO-FC-karttoppar (gröna) anger felaktig orientering av en asparaginrester. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. B) 2FO-FC neutron SLD karta (lila) med rätt asparaginorientering. C) Neutronen SLD _FO-FC karttopp (grön) indikerar en enda protonering av histidinen vid N _ε. (D) 2FO-FC neutron SLD karta (lila) av histidin N _{ε-protonation}. (E) Neutron SLD _FO-FC utelämnar karttoppar (grön) bekräftar den positiva laddningen av arginin. (F) 2FO-FC neutron SLD karta (lila) av positivt laddad arginin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 13: Oavbruten neutron SLD-kartor. A) 2FO-FC neutron SLD karta (lila) av ett hydrerat, ånga H/D utbytt protein. Glutaminsyra visar neutron SLD-kartavstängning på grund av den negativa spridningslängden för icke utbytbara H-atomer. (B) En överdöd _2FO-FC elektrontäthetskarta (blå) visar tydligt densiteten hos glutaminsyran. (C) Svavelatomen i methionin är dåligt synlig i _2FO-FC neutron SLD kartor (lila). (D) En karta över överdöd elektrontäthet visar tydligt mejoninets densitet. (E) Metallatomer, här koppar, är dåligt synliga i neutron _2FO-FC SLD kartor (lila). (F) En överdöd _2FO-FC elektrontäthetskarta (blå) visar tydligt densiteten hos den samordnade kopparatomen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Isotop	Sammanhängande spridningslängd (fm)	Osammanhängande spridningslängd (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24Mg	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39K	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56Fe	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tabell 1: Neutronspridningslängder och osammanhängande spridningsvärden. Anpassad från Sears, 199216.

Kompletterande figur 1: IMAGINE-instrumentet vid högflödesreaktorn. A) IMAGINE-instrumentet i den kalla neutronstyrningshallen. B) Prov i monterad i en kvarts kapillär fäst med kitt på goniometern. Prov- och detektorbordet stängs för att placera kristallen och den cylindriska bildplattan i neutronstrålen. Modifierad med tillstånd från International Union of ^{Crystallography53}. Bilder med tillstånd från Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 2: MaNDi-instrumentet vid spallations neutronkällan. A) MaNDi Anger kameradetektor array. Reproducerad med tillstånd från International Union of ^{Crystallography11}. B) MaNDi rörligt provsteg. C) Prov monterat i kapillär av kvarts monterad på goniometern vid MaNDi för insamling av rumstemperaturdata. Bilder med tillstånd från Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 3: Lytisk polysackaridmonooxigenes NcLPMO9D: struktur. NcLPMO9D kopparaktiv plats ligger på en plan polysackariderbindningsyta. Kopparn koordineras av två histidinrester i en klassisk "histidinstöd" samt en axiell tyrosinrester. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 4: Kristall med tillräcklig volym i sittdroppekristalliseringsbricka. (A) Stora kristaller odlas i sittande droppar som sätts upp i 9-brunns silikoniserade glasplattor. (B och C) Kristaller mäts för att identifiera kristaller med volym > 0,1 ^mm3. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 5: pH-mätare som ställts in för deutererade buffertavläsningar. pH-elektroden blötläggs i _D2O före användning. NaOD och DCl används för att justera pH-värdet för deutererade buffertar. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 6: MaNDi riktlinjer för provmontering. Maximala dimensioner av kvartskapillären och provpositionen för insamling av data i rumstemperatur.
Reproducerad från: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 7: Avlägsnande av överskottsbuffert. A) Överskottsbufferten aspireras från kvartskapillären med mikrokapillärspetsar. (B) Den återstående bufferten avlägsnas med en tunn pappersveke för att helt torka kapillären. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 8: Gui för datainsamling. Indatafönstret i "Experimentparametrar" för datainsamling. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 9: Optik-GUI. Val av kvasi-Laue-serien för datainsamling och övervakning av neutronräkningshastigheten. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 10: Datainsamling i gui för datainsamling. Exponeringstiden, antalet bildrutor och vinklar för datainsamling anges på fliken "Samla in". Datainsamlingen initieras sedan med hjälp av "Starta skanning". Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 11: Diffracted neutroner detekteras och visas. I slutet av exponeringstiden läses den neutronkänsliga bildskyltsdetektorn av och diffraktionsmönstret visas i det grafiska gränssnittet för datainsamling. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 12: Databehandling efter neutrondiffraktion. Ramar indexeras, integreras, våglängd normaliseras och skalas med Lauegen, Lscale och Scala för att generera en sammanslagen reflektionsfil efter datainsamling. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 13: Insamling av röntgendata. Hemkälla röntgengenerator inställd med kvarts kapillär monterad kristall för insamling av rums temperaturdata. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 14: Monteringsriktlinjer för insamling av mandi-kryodata. Dimensioner av CrystalCaps och stifthöjd för kryo-datainsamling på MaNDi.
Reproducerad från: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 15: Blixtfrysning för insamling av kryo neutrondiffraktionsdata. (A) Ställ in för kristall blötläggning, skörd med en mikroloop och frysning i flytande kväve med hjälp av en cryo kompatibel behållare som en skum Dewar. Den monterade kristallen överförs direkt till beamline cryo goniometer med förkylda kryostift. (B) Vaxtätningen smälts för kristallborttagning. C) Kristallen spolas till slutet av kvartskapillären för skörd. (D) Kristallen blötläggs sekventiellt i askorbat blötläggningsbuffert och därefter kryoprotektör följt av blixtfrysning i flytande kväve. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 16: Exempeljusteringsgränssnitt. Kristalljusteringen i neutronstrålen, representerad av det blå korset, görs efter punkt och klick centrering. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 17: CSS-gui för datainsamling. Datainsamlingsstrategin, inklusive exponeringsdoser och vinklar, laddas upp i CSS GUI. När datainsamlingen fortskrider kommer de diffracted neutroner som detekteras på realtidsdetektorn att visas i den övre panelen. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 18: Matchande R-fria flaggor i CCP4. Neutrondatans R-fria flaggor matchas med de R-fria flaggorna för röntgendata som samlats in på samma eller en identisk kristall för förfining av gemensamma. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 19: Förberedelse och förfining av strukturer. (A) Phenix ReadySet-verktyget används för att lägga till dubbel H/D-beläggning på utbytbara platser. (B) Både neutrondata och röntgendata används för en gemensam förfining, medan den ursprungliga inmatningsmodellen förfinades mot röntgendatauppsättningen som samlats in på samma kristall eller en identisk kristall. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 20: Konfiguration av förfiningsinställningar. Förfiningsmodellen samt kärndistanserna är konfigurerade för förfining av gemensamma röntgen-/neutrondata. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 21: Val av data för Coot-modellbyggnad. Phenix MTZ filutgång som innehåller röntgen och ofyllda neutrondata öppnas i Coot för att generera elektron- och neutron-SLD-kartor för interaktiv modellbyggnad. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 22: Interaktiv modellbyggnad i Coot under gemensam förfining. A) En positiv och negativ _FO-FC neutron SLD densitet topp (grön respektive röd) som anger att vattnet måste omorienteras genom rotation/översättning. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. B) Korrekt placerat vatten. C) En positiv _FO-FC neutron SLD-karttopp (grön) anger att treonin måste roteras för att matcha differensdensdensens topp genom redigering av chivinklar. D) Korrekt orienterad treonin. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 23: Strukturberedning för förfining av neutrondata. Startkoordinatfilen är förberedd för förfining genom avlägsnande av vattenatomer i PDBTools och genom tillägg av dubbel H/D-beläggning på utbytbara platser. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 24: Förfining endast av neutrondata. (A) Neutrondata laddas upp såväl som den förberedda startmodellen. (B) Inställningarna för neutrondataförfining använder neutronspridningstabellen. Klicka här för att ladda ner denna siffra.

Kompletterande figur 25: Val av data för Coot-modellbyggnad. De ofyllda neutrondata öppnas i Coot för interaktiv modellbyggnad. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 26: Verklig rymdförfining i Coot för deutererade rester. A) Positiva och negativa _FO-FC neutron SLD densitetstoppar (grön respektive röd) som anger att en argininrester måste flyttas för att passa _FO-FC densitetstoppar. _2FO-FC neutron SLD-kartan visas i lila och 2FO-FC elektrontäthetskarta visas i blått. (B) Användning av Real Space Refine resulterar i "exploderande" D-atomer på grund av saknade Coot geometri fasthållningsbibliotek. C) D-atomerna rör sig inte med resten av restatomer. (D) D-atompositionerna kan fixeras manuellt med hjälp av en textredigerare. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 27: Tillsats av vattenmolekyler. (A) Vattenmolekyler kan manuellt tillsättas till de positiva _FO-FC neutron SLD-karttäthetstopparna (gröna). De insatta vattenmolekylerna kommer inledningsvis att representeras av en O-atom i Coot. (B) Phenix ReadySet används för att tillsätta D-atomer till O-atomerna för vattenmolekyler. (C) Den deutererade vattenmolekylen tillsätts framgångsrikt. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 28: Förfiningsstatistik. Slutlig dataförfiningsstatistik efter gemensam röntgen/neutronförfining. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 29: Förfiningsstatistik. Slutlig dataförfiningsstatistik efter neutrondata-endast förfining. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Discussion

Neutronproteinkristallografi är en mycket känslig teknik för sondprotonationstillstånd och vattenmolekylorientering i proteiner. Denna information belyser proteinkatalytiska mekanismer eftersom förändringar i protonation och vätebindning interaktioner ofta är centrala för ^enzymkemi10. Neutronproteinkristallografi, om än en informativ teknik, har ett antal faktorer som bör beaktas innan man planerar att genomföra ett neutrondiffraktionsexperiment, nämligen:

Kravet på stora proteinkristaller för datainsamling.
Spridningsegenskaperna hos väte och andra element, såsom metalljoner.
Begränsningar i programvaran för strukturförfining och modellbyggnad när du arbetar med deutererade prover.

Neutronproteinkristallografi är en fluxbegränsad teknik. I motsats till röntgendiffraktionsdatauppsättningar förväntas högre R-faktorer och lägre fullständighet, redundans och signal-till-brus-förhållanden för neutrondatauppsättningar på grund av teknikens inneboende begränsningar (flux limited, quasi-Laue, längre våglängder). Datainsamlingen för en enda bildruta är vanligtvis 12 –18 timmar. Ett försöks framgång är i hög grad beroende av provstorlek och kvalitet med kristaller på 0,1 ^mm3 som ofta är ^{minimikravet3}. Neutrondiffraktion kräver produktion av stora mängder protein för att sätta upp kristalliseringsdroppar från 10 till 800 μL. Minimivolymen för odling av tillräckligt stora kristaller kan uppskattas med hjälp av en volymkalkylator med tanke på kristall- och provparametrarna (https://neutrons.ornl.gov/imagine). Tillväxt av stora kristaller har oftast uppnåtts genom ångdiffusion3. Hängande droppkristallisering tillåter tillväxt av kristaller i stora droppar från 10-25 μL, medan större droppar som sträcker sig upp till ~ 50 μL kan ställas in med kommersiellt tillgänglig sittande ^{dropputrustning14,54}. Silikoniserade glasplattor med nio brunnar kan användas för att ställa in mycket stora droppar, med volymer upp till 800 μL. Dessa glasplattor placeras i "smörgåslådor" kommersiellt tillgängliga från Hampton Research. Ytterligare kristalliseringstekniker inkluderar batchkristallisering, där gränsen för droppstorleken dikteras av kärlet. Batchkristalliseringsexperiment som kan ställas in kan variera från mikroliter till ^milliliter55. Kristallisering kan också utföras med hjälp av den dialysteknik där proteinet balanseras med fällningen via ett dialysmembran eller genom motdiffusion längs en utfällbar koncentrationsgradient eller genom en porös plugg som agarose56,57. Sådd erbjuder ett annat alternativ för att få kristaller av önskad volym. Mikro- och makroseding har framgångsrikt använts för stor kristalltillväxt, inklusive stor kristall av NcLPMO9D45. Viss kunskap om proteinfasdiagrammet, inklusive temperaturens inverkan på lösligheten, hjälper till med stor kristalltillväxt.

När du planerar ett neutrondiffraktionsexperiment är optimering av proteinpreparatet för att maximera signal-till-brus-förhållandet under datainsamling av diffraktion7. För att kringgå densitetsavstängning och hög osammanhängande spridning orsakad av H-atomer kan neutron SLD-kartor förbättras genom att byta H-atomer mot dess isotop D, som har en positiv sammanhängande spridningslängd och låg osammanhängande spridningslängd. För att åstadkomma detta utförs ångutbyte av den hydrerade proteinkristallen mot deutererad kristalliseringsbuffert. Detta säkerställer H/D-utbyte av lösningsmedelsmolekyler och det labila, titrerbara proteinet H ^atomer23. Ångväxling utförs genom montering av den hydrerade kristallen i en kvarts kapillär med _D2O-baserade, deutererade kristalliseringsbuffert "pluggar" och det representerar en effektiv, skonsam teknik som oftast appliceras14,23,35. Utbytet kan ta flera veckor och kräver helst att den deutererade bufferten ändras ofta för att säkerställa maximalT H/D-utbyte. H/D-utbyte kan också utföras genom att direkt blötlägga kristallen i deutererad buffert. För att undvika att kristallen utsätts för påfrestningar på grund av _{D2O-exponering} bör blötläggningsprocessen utföras gradvis genom att gradvis öka _D2O:H2O-förhållandet58. Utöver detta kan kristallisering av hydrerat protein också utföras i deutererad buffert för H/D-utbyte på labila ^{H-platser22,59}. Det bör dock noteras att _D2O-baserad buffert har en effekt på proteinlösligheten som kräver ytterligare justering av de kända _H2O-baserade ^{förhållandena3,59}. D2O-baserade buffertar har också observerats för att leda till mindre kristaller i vissa ^fall59. Fullständigt utbyte av titrerbara och kolbundna H-atomer till D kan uppnås genom att uttrycka proteiner i deutererade medier för att generera ett perdeutererat ^prov20. De resulterande neutron-SLD-kartorna över det perdeutererade provet kommer att förbättras avsevärt, vilket inte längre visar densiteten för den hydrerade provmotsvarigheten. Detta är fördelaktigt när man karakteriserar H/D bunden på icke utbytbara platser i ett protein eller kofaktor. Uttryck av perdeutererat protein är dock både högt i kostnad och lågt i ^utbyte60. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) Center for Structural Molecular Biology (CSMB) erbjuder en deuterationsanläggning för användare som försöker generera ett perdeutererat prov (https://www.ornl.gov/facility/csmb). Perdeuterated uttryck utförs vanligtvis i en bioreaktor på 1 L-skalan som ger ~ 50 mg renat ^protein61.

Efter insamlingen av neutrondiffraktionsdata utförs förfining och interaktiv modellbyggnad. Förfining kan köras med flera programvarusviter, inklusive phenix.refine, nCNS eller SHELXL28,31,32,33. Phenix-sviten är den vanligaste programvaran för förfining av neutrondiffraktionsdata tillsammans med Coot som används för att manuellt bygga modellen från neutron SLD-kartorna34. Även om både Phenix och Coot tillåter bearbetning av neutrondiffraktionsdata, kan de sakna vissa egenskaper som är nödvändiga för att bearbeta de idiosynkrasier som är associerade med neutrondata och deutererade prover. Coot innehåller till exempel inte geometrioptimering för deutererade rester, vilket kan leda till komplikationer under modellbyggnad eftersom funktionen "Real Space Refine" resulterar i "exploderande" rester (kompletterande figur 26)⁶². Detta kan lösas genom att generera fasthållningsfiler för alla deutererade rester. Detta är dock en intensiv process och sådana bibliotek är för närvarande inte offentligt tillgängliga. När du utför förbättringar i Phenix, utbytbara H / D platser kommer initialt att ställas in på 0.50 beläggning för H och D. När förbättringar utförs kommer beläggningen av H och D att förfinas enligt neutron SLD-kartorna. Under interaktiv modellbyggnad är Fo-Fc-kartor med skillnadstäthet mycket informativa vid bedömning av H/D-beläggningar. Kartor kan användas för att bestämma vilka platser som har hög D-beläggning, vilket är särskilt informativt på den aktiva platsen där protonationstillstånd är katalytiskt ^relevanta63. Tvetydiga situationer uppstår dock när H:D beläggningen är nära 0.70:0.30 vilket resulterar i fullständig signalavstängning i neutron SLD-kartor64. Det bör också beaktas att kvasi-Laue neutrondatauppsättningar ofta har fullständighet runt 80%, vilket är lägre än de rutinmässigt observerade ≥ 98% för röntgendiffraktionsdata. Vid raffinering av neutrondiffraktionsdata i Phenix beräknas därför de saknade observerade amplituderna (_Fo) från modellen för att slutföra reflektionslistan, vilket introducerar modellbias. För att ta hänsyn till denna potentiella partiskhet bör "no_fill"-kartor undersökas under interaktiv modellbyggnad i motsats till "fyllda" kartor.

Användare kan välja att utföra en gemensam röntgen-/neutrondataförfining av sin struktur, eller en neutrondata endast förfining. Visualisering av neutron SLD-kartor, särskilt vid lägre upplösning, kan inledningsvis vara oroande speciellt för ett hydrerat protein där H fortfarande finns på icke utbytbara platser trots H/D-ångväxling. Detta resulterar i att neutrondensitetskartningen avbryts, vilket ger intrycket av icke-kontinuerliga ^kartor65,66. Insamling av en motsvarande röntgendatauppsättning kompletterar med fördel dessa avbokningar i en gemensam förfining (figur 13A och figur 13B). En gemensam förfiningsstrategi innebär vanligtvis att förfina proteinets stamkoordinater mot röntgendata, medan neutrondiffraktionsdata används för att förfina H/D-atomernas position och beläggning på utbytbara ^platser28. Eftersom införandet av gemensam H/D-beläggning på utbytbara platser ökar antalet parametrar som förfinas, ökar en gemensam förfining med röntgendata också förhållandet mellan data och parameter. En gemensam förfining kräver att en motsvarande röntgendatauppsättning samlas in vid samma temperatur på samma kristall eller en kristall som odlas under samma förhållanden. För neutrondiffraktionsdata som samlats in vid rumstemperatur (300K) bör motsvarande röntgendatauppsättning samlas in i rumstemperatur med hjälp av en strategi för insamling av lågdosdata för att begränsa strålningsskador. Perdeutererade prover ger däremot förbättrade och kontinuerliga SLD-neutronkartor eftersom de inte har samma storlek som H/D-signalavstängning. Neutronspridningslängden för vissa grundämnen, inklusive metaller och svavel, gör dem dock dåligt synliga i neutron SLD-kartor, även om proteinet har perdutererats (figur 13C-F)¹⁸. Om en metall behöver karakteriseras är det bäst att använda röntgendiffraktion i en gemensam förfining eller tillämpa spektroskopiska tekniker för att komplettera diffraktionsexperiment. Neutrondataförfining utförs ofta när neutrondatauppsättningen har hög upplösning eller om ett perdeutererat protein användes. Dessutom är förfining av neutrondata särskilt användbart om ett protein som är mycket känsligt för strålningsskador studeras, eftersom en röntgenbaserad struktur kan ha strålningsinducerade artefakter. Om en neutrondataförfining ska kunna utföras måste det fastställas om motsvarande neutrondatauppsättning har tillräcklig fullständighet och upplösning.

ORNL erbjuder två anläggningar för insamling av neutrondiffraktionsdata: IMAGINE-strållinjen vid HFIR samt MaNDi-strållinjen vid ^SNS36,67. Båda instrumenten ger effektiva medel för att samla in en neutrondiffraktionsuppsättning med liknande principer, men varje instrument har unika specifikationer som bör beaktas vid tillämpning av stråltid. IMAGINE samlar in kvasi-Laue-data och är optimerad för insamling av rumstemperaturdata på kristaller med enhetsceller upp till ~100 Å. MaNDi kan användas för insamling av rumstemperings- och kryotemperaturdata som använder TOF-Laue-insamling på kristaller med enhetsceller upp till ~ 300 Å. Innan en fullständig datauppsättning samlas in utförs ett test på kristallen för att utvärdera kvaliteten på det erhållna diffraktionsmönstret där kristallen utsätts för neutronstrålen för en enda ram. Om kristallen är av tillräcklig kvalitet kommer en fullständig neutrondiffraktionsuppsättning att samlas in, indexeras, integreras, skalas och slås samman i en process som är jämförbar med röntgendatabehandling. IMAGINE använder Lauegen och Lscale och MaNDi använder Mantid-paketet och använder tredimensionell profilmontering48,50,51,68,69,70. Forskare som blir användare vid någon av dessa anläggningar kommer att förses med en datauppsättning i MTZ- eller HKL-format för vidare analys.

Neutrondiffraktion är en icke-destruktiv, mycket känslig teknik för att undersöka protonationstillståndet och vätebindningsinteraktioner av biologiska makromolekyler. Det är särskilt användbart för fotokänsliga proteiner och metalloproteiner. Flera överväganden om tekniken samt behandlingen av uppgifterna måste beaktas innan ett experiment genomförs, men resultatet ger resultat som kan ge värdefull inblick i den katalytiska mekanismen hos proteinet av intresse. Neutronproteinkristallografi kompletterar beräknings-, struktur-, biokemiska och spektroskopiska studier, vilket gör det till ett värdefullt verktyg i biologens verktygslåda av tekniker som används för att karakterisera biologiska makromolekyler.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Proteinuttrycks-, renings- och kristalliseringsexperiment utfördes vid Center for Structural Molecular Biology (CSMB), en amerikansk avdelning för energibiologisk och miljöforskningsanvändaranläggning vid Oak Ridge National Laboratory. Neutrondiffraktionsdata samlades in vid BL-11B MaNDi vid Spallation Neutron Source (SNS) vid ORNL som sponsras av Scientific User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, U.S. Department of Energy. Författarna tackar Brendan Sullivan för hjälp med datareduktion. Röntgendiffraktionsdata samlades in vid METRIC-anläggningarna (Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center) vid North Carolina State University, som stöds av delstaten North Carolina. GCS bekräftar delvis stöd från National Research Foundation (NRF), Sydafrika och Graduate Opportunities (GO!) -programmet vid ORNL. FM bekräftar stöd från USDA NIFA Hatch 211001.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length	DiaDent/DiaVet	218-292
Capillary wax	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Curved-Tip Forceps	Mitegen	TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector	Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris	XtaLAB Synergy-R	Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL	Eppendorf Research	Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL	Eppendorf Research	Z683825
Pipette Volume 10-100 μL	Eppendorf Research	Z683809
Pipette Volume 20-200 μL	Eppendorf Research	Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder	Sigma-Aldrich	P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length	Hampton	HR6-146	Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System	Olympus	SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases	Mitegen	GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length	VitroCom	CV1012	Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover	Hampton	HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate	Hampton	HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D	Sigma-Aldrich	176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)	Hampton	HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL	VWR	76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL	VWR	76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL	VWR	76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL	VWR	76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL	VWR	76322-134
Wax pen	Hampton	HR4-342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802 (2018).
Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

Chemistry

Insamling och bearbetning av neutronkristallografi för modellering av väteatomer i proteinstrukturer

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.