Chemistry

Protein Yapılarında Hidrojen Atomlarının Modellenmesi için Nötron Kristalografisi Veri Toplama ve İşleme

Published: December 1, 2020 doi: 10.3791/61903

Gabriela C. Schröder^1,2, Flora Meilleur^1,2

¹Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, ²Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

Nötron proteini kristalografisi, hidrojen atomlarının lokalizasyonuna izin veren ve böylece protein fonksiyonunun önemli mekanistik ayrıntılarını sağlayan yapısal bir tekniktir. Burada bir protein kristali montajı için iş akışını sunuyoruz, nötron kırınım veri toplama, yapı iyileştirme ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluk haritalarının analizi.

Abstract

Nötron kristalografisi, biyolojik makromoleküller içindeki hidrojen atomu konumlarının belirlenmesine izin veren, radyasyon hasarına neden olmazken protonasyon ve hidrasyon durumları hakkında mekanistik olarak önemli bilgiler veren yapısal bir tekniktir. Buna karşılık X-ışını kırınımı, ışık atomlarının konumu hakkında sadece sınırlı bilgi sağlar ve X-ışını ışını, ışığa duyarlı kofaktörlerin ve metal merkezlerin radyasyon hasarına neden olur. Burada sunulan, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'ndaki (ORNL) IMAGINE ve MaNDi kiriş hatları için uygun boyutta bir protein kristali (> 0,1 ^mm3) yetiştirildikten sonra nötron kırınım yapısı elde etmek için kullanılan iş akışıdır. Nötron kırınım verisi toplanması için hidrojenize protein kristallerinin kuvars kılcal damarlara montesini gösteriyoruz. Ayrıca, döteryum ile değiştirilebilir sahalarda hidrojen atomlarının değiştirilmesini sağlamak için _D2O içeren tampon ile monte edilmiş kristallerin buhar değişim süreci de sunulmaktadır. Döteryumun birleştirilmesi, hidrojen atomlarının tutarsız saçılımından kaynaklanan arka planı azaltır ve negatif tutarlı saçılma uzunluklarının neden olduğu yoğunluk iptalini önler. Örnek hizalama ve oda sıcaklığı veri toplama stratejileri, Yüksek Akı Izotop Reaktörü'ndeki (HFIR) IMAGINE'de quasi-Laue veri toplama kullanılarak gösterilmiştir. Ayrıca, kristal montajı ve sıvı nitrojende hızlı donma, laboratuvar reaksiyonu aralarını hapsetmek için kriyo-veri toplama, Spallation Nötron Kaynağı'ndaki (SNS) MaNDi uçuş zamanı cihazında gösterilmiştir. Model koordinat ve kırınım veri dosyalarının hazırlanması ve nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) haritalarının görselleştirilmesi de ele alınacaktır. İlgi çekici proteinin tamamen atom yapısını elde etmek için sadece nötron verilerine veya ortak X-ışını/nötron verilerine karşı yapı iyileştirmesi nihayet tartışılacaktır. Nötron yapısının belirlenmesi süreci, glikosidik bağın oksidatif bölünmesi yoluyla recalcitrant polisakkaritlerin bozulmasında rol oynayan bakır içeren bir metalloprotein olan litik polisakkarit monooksijenaz Neurospora crassa LPMO9D kristalleri kullanılarak gösterilecektir.

Introduction

Nötron makromoleküler kristalografi, proteinlerin yapısına ve alttaki kimyasına benzersiz bir pencere sağlayan bir tekniktir. Kavramsal olarak X-ışını kırınımsına benzer şekilde, nötron kırınımı makromoleküler yapının atomik ayrıntılarını sağlar, ancak nötronların çekirdeklerle etkileşimi, genellikle X-ışını kırınımı ile tespit edilmesi zor olan ışık atomlarının lokalizasyonunu ^sağlar1. X-ışını kırınımı sırasında, X ışınları elektron bulutundan dağılır ve hidrojen (H) gibi ışık atomlarını Ångström çözünürlüğüne yakın olmayan elektron yoğunluk haritalarında zayıf görünür hale ^getirir2. Buna karşılık, nötronların saçılma yoğunluğu, aynı elemanın izotoplarının farklı saçılma uzunlukları göstermesiyle çekirdekle karmaşık etkileşimlere bağlıdır. Bu nedenle, ışık atomları ve hidrojen (^1H) ve döteryum (^2H veya D) gibi izotopları, nötron saçılma uzunluğu yoğunluğu (SLD) haritalarındaki omurga karbon, azot ve oksijen atomlarıyla karşılaştırılabilir görünürlüğe sahiptir. Ayrıca, nötron saçılımının büyüklüğü elektron sayısından bağımsız olduğundan, ışık elementlerinden saçılma, X-ışını saçılmalarında da gözlendiği gibi, birbirlerine yakın olduklarında ağır elementler tarafından gizlenmez. Nötron kırınımı kullanırken H ve izotop D'nin gelişmiş görünürlüğü, katalitik olarak önemli kalıntıların, kofaktörlerin ve ligandların protonasyon durumu hakkında değerli bilgiler sağlar ve su moleküllerinin yönlendirilmesine yardımcı olarak katalitik mekanizmalar ve protein kimyası hakkında önemli bilgiler ortaya ^çıkarır3. Nötron kırınımı ayrıca, özellikle metal merkezleri veya ışığa duyarlı redoks kofaktörleri gibi iyonlaşmaya duyarlı biyolojik örneklere uygun tahribatsız bir teknik olma avantajı ^sunar2. Bu makalenin ana odak noktası, yüksek kaliteli bir nötron proteini kristal yapısı elde etmek için iş akışına genel bir bakış sağlamaktır. Nötron protein kırınımının mükemmel bir genel ^{görünümü için ilgili} okuyucuyu Podjarny ve ^ark.4, ^Blakeley5, Blakeley ve ^ark.6 ve O'Dell ve diğerleri için ve nötron saçılımının daha fazla uygulaması için Ashkar ve ^ark.7'ye yönlendiriyoruz.

Nötronlar öncelikle iki işlemden birini kullanan nükleer reaksiyonlar sırasında üretilir: reaktör kaynaklarında nükleer fisyon veya hızlandırıcı tabanlı kaynaklarda ^spallasyon8. Reaktör kaynakları ^{, 235U} izotopun nükleer fizyonunu kullanarak sürekli bir nötron ışını sağlarken, spallation nötron kaynakları bir hedefi, örneğin cıva gibi sıvı bir metali ^protons9 ile bombalayarak darbeli bir nötron ışını üretir. Oak Ridge, Tennessee'deki Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı (ORNL), Yüksek Akı Izotop Reaktörü'nde (HFIR) hem sabit bir nötron kaynağına hem de Spallation Nötron Kaynağı'nda (SNS) 60 Hz darbeli bir kaynağa ev sahipliği yapmaktadır. HFIR'da bulunan IMAGINE beamline, biyolojik makromoleküller için optimize edilmiş bir nötron difaraktometresidir (Ek Şekil 1)¹⁰. IMAGINE, birim hücre kenarları <150 şolan tek kristallerden 2,8 – 4,5 şaralığında dar bir bandpass kullanarak yarı Laue verilerini ölçmek için bir nötron görüntü plakası dedektörü kullanıyor. SNS'de bulunan Makromoleküler Nötron Difaraktometresi (MaNDi), küresel dedektör dizi çerçevesi (DAF) (Ek Şekil 2)¹¹ ile donatılmış bir uçuş zamanı (TOF) Laue nötron difaraktometresidir. MaNDi, 2.0 – 6.0 Å12 arasında ayarlanabilir 2 şdalga boyu bant genişliği kullanarak 10 – 300 ^{şaralığında} birim hücre kenarlarına sahip tek kristallerden gelen verileri ölçer.

Nötron üretme süreci oldukça enerji yoğundur, bu da senkrotron kaynaklarında X-ışını ışını akılarının aksine nispeten zayıf nötron ışını akılarına neden ^olur13. Veri toplama sırasında yeterli sinyal-gürültü oranlarını sağlamak için uygun boyutta ve kalitede kristaller yetiştirmek ^gerekir14. Tipik olarak, yeterli istatistiklerle veri toplamak için hacimleri 0,1 ^mm3'> kristallere ihtiyaç ^vardır15. Daha düşük akılara ek olarak, nötronlar ve örnek çekirdekler arasındaki etkileşimin doğal özellikleri dikkate ^{alınmalıdır16}. Nötronların saçılma uzunluğu, aynı elemanın izotopları için farklılık gösterir, bir numunenin bölgelerini maskelamak veya vurgulamak için küçük açılı nötron saçılmada (SANS) avantajlı bir şekilde yararlanılabilen bir özelliktir - kontrast ^{eşleştirme17} olarak bilinen bir işlem. Kırınım deneylerinde, H'nin negatif tutarlı nötron saçılma uzunluğu (-1H için-3.741 fm), nötron saçılma yoğunluk haritası özelliklerinin iptaline neden olabilir, çünkü diğer biyolojik olarak ilgili atomların tutarlı nötron saçılma uzunlukları, karbon (^12C için 6.6511 fm), azot (^14N için 9.37 fm), oksijen (^16O için 5.803 fm), fosfor (31P için ^5.13 fm) ve kükürt (32S için 2.804 fm), pozitiftir (Tablo 1)^12,14. Ayrıca, H'nin (25.274 fm) büyük tutarsız saçılma uzunluğu, veri toplama sırasında arka planı artırarak veri kümesinin kalitesini engeller ve veri çözünürlüğünü tehlikeye ^atar7. H tarafından getirilen bu sınırlamaları atlatmak için, nötron kırınımı için, H'yi pozitif tutarlı nötron saçılma uzunluğuna (6.671 fm) ve önemli ölçüde daha düşük tutarsız saçılma uzunluğuna (4.04 fm)¹⁹ sahip izotop döteryumu, ^2H(D) ile değiştirmek gerekir. Bu, proteinin tamamen döterlenmiş ortamda yetişen organizmalar tarafından ifade edildiği ve H sitelerinde D'nin tamamen birleştirilmesini sağlayan bir süreç olan perdeuterasyon ile elde ^edilebilir20. Proteini kısmen döterleme, H'yi sadece değiştirilebilir sahalarda (titretilebilir gruplar) D ile değiştirerek, değiştirilebilir olmayan karbona bağlı bölgeler hidrojene ^{olarak kalırken kısmen} deutere etmek de mümkündür21. Bu, döterlenmiş ana likörde hidrojenize protein kristallerinin büyümesiyle elde ^edilebilir22. Bununla birlikte, en yaygın olarak, hidrojenize proteinlerin H / D değişimi, _H2O bazlı ^tampon23'te uygun büyük kristallerin büyümesini takiben buhar değişimi ile gerçekleştirilir. Bu gibi durumlarda, kristaller bir kuvars kılcal damara monte edilir ve _D20 bazlı bir ana likör ile buharla dengelenir.

Nötron kaynaklarındaki sınırlı nötron akıları, günler ile birkaç hafta arasında değişen daha uzun veri toplama sürelerine neden ^oluyor24. ORNL'de hem IMAGINE hem de MaNDi, veri toplamayı optimize etmek için 2-6 şaralığında dar bir dalga boyu bandpası ^kullanır25. Veriler oda sıcaklığında veya kriyo sıcaklığında toplanabilir. Kriyo-veri toplama potansiyel olarak veri kalitesini artırabilir ve dondurarak katalitik ara ürünler için olasılık açar. Nötron kırınım veri toplamayı takiben, bir X-ışını veri kümesi genellikle aynı sıcaklıkta aynı kristalde veya aynı koşullarda yetiştirilen bir kristal üzerinde ^toplanır26. Aynı sıcaklıkta veri toplama, hem X-ışını hem de nötron verilerine karşı yapı iyileştirmesi yapılmasına izin vererek, suların görünürlüğünde ve konumundaki değişiklikler veya alternatif konformasyonlarla kalıntıların doluluğu gibi potansiyel sıcaklık kaynaklı eserleri ^önler27. Ortak X-ışını nötron veri rafine etme veri-parametre oranını artırır ve protein omurga koordinatlarının X-ışını verilerine karşı rafine edilmesine izin verme avantajı sağlarken, nötron kırınım verileri H/D atomlarının konumunu iyileştirmek için ^{kullanılır28}. Bu, protein üzerinde değiş tokuş edilemeyen bölgelerde H atomları nedeniyle yoğunluk iptalinin mevcut olduğu kısmen deuterated örnekleri kullanırken özellikle yararlıdır. X-ışını yapılarının sayısı Protein Veri Bankası'nda (PDB) biriken nötron yapılarının sayısını çok aşsa da, başlangıçta X-ray verilerinin iyileştirilmesi için tasarlanan yazılım paketleri nötron verilerinin yanı sıra ^3,29,30'u kapsayacak şekilde genişletilmiştir. Veri toplamayı takiben modeller phenix.refine, CNSsolve (nCNS) veya SHELXL28,31,32,33 gibi arıtma paketleri kullanılarak geliştirilebilir. Arıtma işlemi sırasında, nötron saçılma yoğunluk haritaları ^COOT34 kullanılarak manuel montaj için görselleştirilebilir. Yapı çözümünü takiben, koordinatlar ve nötron ve/veya X-ışını kırınım veri dosyaları, modeli doğrulayacak ve yatıracak olan PDB'ye gönderilebilir ve bu da genel erişime açık hale ^{getirir18,29,30}.

Proteinlerin yapısal analizi, işlevlerini ve mekanizmalarını araştırmak için çok sayıda tekniğin kullanıldığı çok yönlü bir ^{yaklaşımdır35}. Nötron proteini kristalografisi, X-ışını kırınımı, spektroskopi, nükleer manyetik rezonans (NMR) veya mikro kristal elektron kırınımı (microED)³⁶ gibi ek çalışmalardan elde edilen bulguları genişletmek ve tamamlamak için değerli kimyasal içgörüler sağlar. Nötron protein kırınımı, enzimmatik mekanizmalar hakkında içgörüler sağlamak için benzersiz bir şekilde konumlandırılmıştır, çünkü H atomları kimyalarının merkezindedir. Nötronlar tarafından indüklenen radyasyon hasarının olmaması, onları metalloproteinlerin çalışmasına son derece uygun bir prob haline ^getirir37. Burada, numune hazırlamadan veri toplama, arıtma ve analize kadar nötron protein kırınımı sürecinin temsili bir örneğini sunuyoruz (Şekil 1). Metalloprotein Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D) nötron kırınım deneyleri için yeterli büyüklükte kristaller yetiştirilmiştir. Nc LPMO9D, glikosidik bağda oksijen atomu yerleştirilmesi ile recalcitrant selülozun bozulmasında rol oynayan bakır içeren bir metalloproteindir38,39. NcLPMO9D aktif bölgesi, N-terminal histidin ve ikinci bir korunmuş histidinden oluşan karakteristik bir "histidin-ayraç" içinde mononükleer bakır merkezi içerir (Ek Şekil 3)⁴⁰. Mantar LPMO'larının N terminali metillenmiştir, ancak geçiş sonrası modifikasyon mayadaki rekombinant ekspresyoz sırasında gerçekleşmez. NcLPMO9D dinlenme durumunda, bakır merkezi ^{Cu2 +} oksidasyon durumunda bulunur ve ^Cu1+ için tek elektron azaltımı ile aktive edilir, moleküler oksijenin hızla bir süperoksit türüne indirgenerek bağlanmasına ve aktive edilmesine izin ^verir41,42. Genel NcLPMO9D reaksiyonu, hidroksillenmiş polisakkarit ürününü oluşturmak için bir elektron ve iki protonun daha fazla eklenmesini ^gerektirir43. Polisakkarit substratından hidrojen atom soyutlamasından (HAA) sorumlu aktif oksijen türlerinin kimliği tespit edilememiş diriltilmiş diri dırı dırım ve yoğun yapısal ve hesaplamalı çalışmalar halen devam ^{etmektedir44,45}. NcLPMO9D aktif sahasındaki redoks kimyası göz önüne alındığında, radyasyon hasarının azaltılması özellikle önemlidir. NcLPMO9D yapısını sırasıyla ^46'da, dinlenme durumunda ve etkinleştirilmiş azaltılmış formda belirlemek için NcLPMO9D kristallerinde oda sıcaklığını ve kriyo sıcaklığı veri toplamayı burada gösteriyoruz. Protein kristal montajına, veri toplama için beamline enstrüman kurulumuna, verilerin ve koordinat dosyalarının hazırlanmasına ve tamamen atomlu bir nötron yapısını modellemek için gerekli iyileştirme adımlarına vurgu yapılacaktır.

Protocol

1. Kristal boyutu değerlendirmesi

Normal ve polarize ışıkla donatılmış bir mikroskop kullanarak kristallerin boyutunu ölçün. Minimum hacim ~0,1 ^mm3 olan kristalleri seçin (Ek Şekil 4).
Yeterince büyük kristallere sahip kuyuları etiketle ve bu kristalleri üretmek için kullanılan kristalleşme koşullarını not edin.

2. Kısırlaştırılmış kristalizasyon tamponunun hazırlanması

D2O'daki kristalizasyon tampon bileşenlerini eriterek kısırlaştırılmış kristalizasyon tamponu oluşturun.
Aşağıdaki denklemi kullanarak çözümün pD'sini hesaplayarak arabelleğin pH'ını ayarlayın:
(1)
burada _pHmeas standart bir cam elektrot ile ölçülen pH'dır. NcLPMO9D kristalizasyon tamponunun orijinal pH'ı 6.0 idi, bu nedenle pD 6.0'daki kısırlaştırılmış kristalizasyon tamponu için 5.6 _pHmeas kullanacağız.
pH metre elektrodu kullanmadan önce on dakika boyunca _D2O'ya daldırin (Ek Şekil 5).
Baz NaOD veya asit DCl kullanarak _pHmeas'ı 5,6'ya ayarlayın.

3. Kristal hasadı

Kristalleşme tepsisinin yanına kristalize 22 mm yuvarlak cam kaydıraklar yerleştirin. Kristal başına temiz bir cam slayt kullanın (Şekil 2A).
9 kuyulu büyük hacimli silikonlu cam plakadaki protein kristallerini içeren kapalı sandviç kutusunu açın.
Kristalizasyon rezervuar çözeltisinden bir mikropipette ile 10-20 μL çıkarın ve çözeltiyi cam kaydırağın üzerine yerleştirin (Şekil 2B).
Kristali uygun boyutta bir mikroloop kullanarak hasat edin ve kristalle birlikte sık sık hasat edilen kalıntıları gidermek için kristali cam kaydırağın üzerindeki rezervuar çözeltisi damlasına yerleştirin (Şekil 2C ve Şekil 2D).
NOT: Küçük hacimli damlacıklar buharlaşabileceğinden hızlı bir şekilde çalışmak gerekecektir. Hasat edilen kristaller de atmosfere maruz kaldıklarında kuruma riski altındadır. Kristallerin küçük kristalleşme damla hacimlerinde kurumasını önlemek için protein damlasına bir miktar rezervuar çözeltisi eklemek gerekebilir.

4. Kristal montajı

NOT: Kılcal montaj protokolleri deneysel tercihlere göre değişiklik gösterir. Kristallerin zarar görmesini önlemek için, kısaltılması gereken kılcal damarlar, pürüzsüz bir kırılma sağlamak için bir kesme taşı veya zımpara kağıdı ile puanlanmalıdır.

2 mm çapında 50 mm uzunluğunda kuvars kılcal damarın bir ucunun bir ucunun kılcal damar etkisiyle veya doğrudan kılcal damara ~10 μL rezervuar tamponu pipetleme ile rezervuar tamponu ile doldurun (Şekil 3A).
NOT: Kullanıcılar kuvars kılcal borulardan yararlanmaya teşvik edilir, çünkü mekanik mukavemetine ek olarak, nötron ışını emilimini ve kılcal damardan daha düşük arka plan katkılarını sınırlamak önemlidir. Cam kılcal damarlar yüksek arka plan sunar ve veri kalitesinden ödün vererek nötronları emer.
Kristali montaj halkasını kullanarak kuvars kılcal damardaki rezervuar tamponuna hafifçe yerleştirin (Şekil 3B ve Şekil 3C).
Rezervuar tamponu ve orada batırılmış kristali kılcal damardan aşağı taşımak için tüpe hafifçe dokunun (Şekil 3D).
Kristali kılcal damarın bir ucundan 13,5 mm'den daha yakın ve 27,5 mm'den daha fazla yerleştirmeyin; bu montaj ucu olacaktır (Tamamlayıcı Şekil 6).
Kristalin etrafındaki tampon çözeltisini uzun ince bir pipet ucu kullanarak epire edin ve kristali hafifçe ıslak bırakın. Kristale dokunmayın (Ek Şekil 7A).
Kılcal duvarları ince bir kağıt fitil ile kurulayın (Ek Şekil 7B).
Pipet 20-50 μL sönmüş tampon çözeltisi montaj ucunun karşısındaki kılcal damarın ucuna (Şekil 4A).
Alemini bir ısı "değneği" ile eritin ve kılcal damarları bu erimiş aeswax'a hafifçe yerleştirin. Hava geçirmez bir conta oluşana kadar tekrarlayın (Şekil 4B ve Şekil 4C).
Pipet çok az miktarda sönmüş tampon, kılcal damarın montaj ucunda yaklaşık 5 μL sıcak arı su birikintisi için bir "ısı emici" görevi görür. Her iki ucuna da kapatılmış bir kılcal damar oluşturmak için daha önce açıklandığı gibi hava geçirmez bir conta oluşturmak için bu ucu eritilmiş beeswax'a batırın (Şekil 4D).
Hava geçirmezliği sağlamak için monte edildikten sonra bir mikroskop kullanarak monte edilmiş kristali inceleyin (Şekil 4E).
Monte edilen kristalleri 15 ml Falcon tüpü veya Petri Kabı gibi bir kapta Kim mendilleriyle dikkatlice sabitleyin ve kristallerin yetiştirildiği sıcaklıkta yatay olarak saklayın (Şekil 4F).

5. Buhar değişimi

Kısırlaştırılmış tamponu kristal montajından iki gün sonra taze tamponla değiştirin.
Balmumu contasını kristalden en uzağa bir ısıtma halkası ile eritin ve tamponu çıkarmak için bir pipet ve kağıt fitil kullanın.
Kılcal damarı 20-50 μL döterlenmiş tampon çözeltisi ile yeniden doldurun ve balmumu ile kapatın.
Döterlenmiş tampon buhar değişiminin tamamlandığından emin olmak ve en az iki hafta boyunca buhar değişimine izin vermek için döterlenmiş tampon değişimini dört gün aralıklarla iki kez daha tekrarlayın.

6. Nötron protein kırınımı

NOT: IMAGINE ışın hattı özellikleriyle ilgilenen okuyucuların Meilleur ve ark. 2013, Meilleur ve ark. 201810,47'ye danışmaları teşvik edilir.

HFIR'daki IMAGINE beamline'da oda sıcaklığı veri toplama
1. Örnek montaj
  1. Kılcal damara monte kristali goniometreye macunla sabitleyin.
  2. Goniometreyi numune çubuğuna monte edin ve kristali off-line hizalama istasyonunu kullanarak kirişe ortalayın.
  3. Numune çubuğunu cihaz numune aşamasına sabitleyin (Ek Şekil 1B).
  4. Deneysel mandalın boşaldığından emin olun ve nötron veri toplama için kiriş çizgisi deklanşörunu açın.
2. Veri toplama
  1. Işın çizgisi denetim bilgisayarında veri toplama programını açın ve veri toplama stratejisini ayarlamak için Kur sekmesini tıklatın. Deneme Parametreleri'nin altına Örnek Adın yanına örnek adı yazın ve Teklif'in yanına teklif numarasını girin. Resim Adlandırma altında Klasör şablonünü seçin ve elde edilen verilerin kaydedilecek hedefini ayarlayın ve Görüntü Öneki'ni seçin ve ilgili çerçeve adını yazın (Tamamlayıcı Şekil 8).
  2. Optik GUI'yi açın ve veri toplama için yarı Laue aralığını ayarlamak için _φmin için 2.78 ve _φmax için 4.78'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 9).
  3. Topla sekmesine geçiş yapın ve Sonraki Tarama Parametreleri'nin altına Pozlama altında pozlama süresini saniyeler içinde, N Çerçeveleri altındaki kare sayısını ve Δ φ/Kare altındaki veri toplama açılarını ekleyin. Görüntü Öneki altında toplanacak çerçeveyi adlandırın ve Taramayı Başlat düğmesini (Tamamlayıcı Şekil 10) tıklatarak veri toplamayı başlatın.
  4. Dağınık nötronlar Görüntü Plakası Dedektörü tarafından tespit edilecektir. Her pozlamanın sonunda, görüntü plakası okunacak ve desen veri toplama GUI'sinde görüntülenecektir (Tamamlayıcı Şekil 11).
  5. Çerçeveler, kullanıcıya veri toplamayı takiben birleştirilmiş yansıma dosyasını sağlayacak sorumlu beamline bilim adamı tarafından Lauegen, ^Lscale50 ve Scala kullanılarak dizine dahil edilir, entegre edilir, dalga boyu normalleştirilir ve ölçeklendirilir (Tamamlayıcı Şekil 12).
    NOT: Hem IMAGINE hem de MaNDi'de veri toplama, Helliwell ve ^ark.48 ve Nieh ve ark.49 tarafından geliştirilen Laue kırınım veri toplama için geliştirilen metodoloji ve yazılım kullanılarak yarı Laue modunda gerçekleştirilecektir.
  6. Nötron kırınımı veri toplamayı takiben aynı sıcaklıkta aynı kristal üzerinde karşılık gelen bir X-ışını veri kümesi toplayın (Tamamlayıcı Şekil 13).
    NOT: Aynı damladan veya aynı kristalizasyon koşullarında yetiştirilen bir kristal, eklem nötron/X-ışını arıtma için X-ışını kırınım verilerini toplamak için de kullanılabilir.
SNS'deki MaNDi kiriş hattında cryo veri toplama
NOT: Işın çizgisi özellikleriyle ilgilenen okuyucuların Coates ve ark. (2015), Meilleur ve ark. 201810,11'e danışmaları teşvik ^edilir.
1. Örnek montaj
  1. Kristallerin ve döterlenmiş kriyoprotektörün azaltılması için döterlenmiş askorbat ıslatma çözeltisini hazırlayın. Bu çözeltilerin her birinin 20 μL damlalarını bir kristalizasyon plakasına oturtma kuyularına yerleştirin.
    NOT: Kriyoprotektif çözeltisi genellikle _D2O'da hazırlanan kriyo sıcaklık X-ışını kırınım veri toplama için etkili olduğu kanıtlanmış kriyoprotektanttır. Bu kriyoprotektant, gerekirse nötron veri toplama için daha da optimize edilebilir (örneğin konsantrasyon).
  2. Örnek montajı için döngüleri seçin ve MaNDi yönergelerini izleyerek manyetik kriyo tabanına takın (Tamamlayıcı Şekil 14).
  3. Köpük kriyo-Dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun. Soğutmak için sıvı nitrojenin içine metal bir kriyo koruma manşonu yerleştirin (Ek Şekil 15A).
  4. Balmumu tıkaçlarını kılcal damarın her iki ucundan çıkarın ve tampon fişini hareket ettirmek için kılcal damara dokunun, böylece monte edilen kristal tampona batırılır. Kristali, oturma damlasındaki 20 μL rezervuar çözeltisi damlasına yıkayın (Ek Şekil 15B ve Tamamlayıcı Şekil 15C).
    NOT: Kristalizasyon damlalarının döterlenmiş tampona karşı dengelenmesi veya kristalin kısırlaştırılmış tampona doğrudan batırılması ile H/D değişimi yapıldıysa bu adım gerekli değildir.
  5. Kristali iki saat boyunca askorbat ıslatma çözeltisinin içine daldır. Kristali manyetik kriyo tabanına bağlı bir mikroloop içine monte edin. Monte edilen kristali kriyoprotektantın içine 10 saniye daldırın ve kristali ve kriyo yuvasını donmak üzere sıvı nitrojene daldırın (Ek Şekil 15D).
  6. Kristal dondurulduktan sonra, önceden soğutulmuş kriyo pim maşası kullanın ve kristali bir kriyo akışı ile donatılmış MaNDi örnek aşamasına monte edin. Kriyo pim maşasını yavaşça açın ve kristalin kriyo akışında kaldığından emin olun (Ek Şekil 2C).
2. Veri toplama
  1. Deneme bilgilerinin otomatik olarak doldurulacağı veri toplama yazılımını açın.
  2. Kristalin ortasına tıklayarak bilgisayar kontrollü goniometre ile ortalanın (Ek Şekil 16).
  3. Tablo altında, "phi" altında veri toplama açılarının yanı sıra Değer (Tamamlayıcı Şekil 17) altında kare başına toplam nötron ışını pozlamasını girerek veri toplama stratejisini ayarlayın.
  4. Veri toplamayı başlatmak için Gönder'e tıklayın.
  5. Veriler toplanırken, dağınık nötron görünür olacaktır (Tamamlayıcı Şekil 17). Pozlama süresi arttıkça kırınım noktaları daha net hale gelecek ve sinyal-gürültü oranını artıracaktır (Şekil 5).
  6. Çerçeveler, veri toplamayı takiben kullanıcıya birleştirilmiş yoğunluk dosyasını sağlayacak sorumlu beamline bilim adamı tarafından Mantid ve Lauenorm kullanılarak dizine eklenecek, entegre edilecek, dalga boyu normalleştirilecek ve ^{ölçeklendirilecek51}.

7. Yapı iyileştirmesi

Ortak X-ışını ve nötron veri iyileştirmesi
1. Yapı hazırlığı
  1. Tamamlanmış bir yapı elde etmek için fenix.refine yazılım paketini ve manuel oluşturma için Coot'u kullanarak bir protein yapısı elde etmek için X-ışını verilerini iyileştirin.
  2. CCP4'ü açın ve nötron verilerinin R-free veri bayraklarını X-ray verilerinin bayraklarıyla eşleştirmek için MTZ'ye Dönüştür/değiştir/genişlet programını seçin. Yansıma dosyasını MTZ biçiminde almak için seçin. In altında elde edilen nötron MTZ dosyasını yükleyin ve X-ray mtz dosyasını Import FreeR MTZ (Tamamlayıcı Şekil 18) altında yükleyin. Dışarı'nın altında yeni MTZ dosyası için bir ad verin ve Çalıştır'ı tıklatın.
  3. Phenix yazılım paketini açın ve İyileştirme Araçları altında ReadySet'e tıklayın. PDB dosyasının yanına, X-ray verilerine göre geliştirilmiş PDB koordinat dosyasını yükleyin. Yoksa modele hidrojen eklemek için seçin ve değiştirilebilir sitelerde H/D'yi seçin, açılan menüden H başka bir yerde . Solvent moleküllerine döteryum ekle'yi seçin ve kalan seçenekleri varsayılan değerleri üzerinde bırakın (Tamamlayıcı Şekil 19A).
    NOT: Perdeuterated protein kullanılıyorsa, yoksa modele hidrojen ekle seçeneğini belirleyin ve değiştirilebilir bölgelerde, D'yi başka bir yerde seçin.
2. Yapı iyileştirmesi
  1. Hem X-ray hem de nötron verilerini kullanarak iyileştirmeyi ayarlamak için İyileştirme sekmesinin altındaki phenix.refine programını açın. Giriş dosyalarındaki Yapılandır sekmesinde, ReadySet ile işlenen X-ray yapısından PDB dosyasını ve ilgili ligandlar için gerekli CIF kısıtlama dosyasını girin. MTZ dosyasını CCP4 kullanılarak atanan Rfree bayraklarıyla nötron verilerinden yükleyin ve bunu Veri türü başlığı altında "Nötron verileri" ve "Nötron R-free" olarak atayın. MTZ dosyasını X-ray verilerinden yükleyin ve bunu Veri türü başlığı altında "X-ray data" ve "X-ray R-free" olarak atayın. Veriler yüklendikten sonra Alan grubu ve Veri etiketleri otomatik olarak doldurulur (Tamamlayıcı Şekil 19B).
    NOT: Arıtmayı gerçekleştirirken ve kristal bilgilerini girdiğinizde, X-ışını verilerinden belirlenen birim hücreyi kullanın.
  2. İyileştirme ayarlarındaki Yapılandır sekmesinin altında standart iyileştirme stratejisini koruyun. Döngü sayısını beşe çıkarın (Tamamlayıcı Şekil 20)
  3. Tüm parametreleri seçin, Gelişmiş'e tıklayın ve Hidrojenler'i seçin.... Hidrojen arıtma modelini tek tek değiştirin ve Kuvvet sürme adp'yi kapatın (Tamamlayıcı Şekil 20).
  4. Tüm parametreler'i seçin ve Parametreleri ara seçeneğini açın. Nükleer kelimesini arayın ve X-H/D için nükleer mesafeleri kullanmayı seçin (Ek Şekil 20).
  5. İyileştirmeyi başlatmak için Çalıştır'ı seçin.
3. Model oluşturma
  1. Phenix'teki iyileştirmenin ardından, X-ışını elektron yoğunluğunu ve nötron SLD haritalarını görselleştirmek için Sonuçlar sekmesindeKi Coot'ta Aç'a tıklayın. Görüntü Yöneticisi sekmesine tıklayın ve Haritalar'ın altında nötron haritalarını kaldırmak için haritaları _neutron yanındaki Haritayı Sil'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 21). Dosya > Açık MTZ, mmCIF fcf veya phs...'a tıklayın. Geçerli iyileştirme dosyalarını seçin ve .mtz dosyasını açın. Hem Genlikler hem de Aşamalar seçeneği için açılır menüden 2FOFC WT_no_fill_neutron verilerini seçin. Bunu tekrarlayın ve _FOFC WT_neutron verilerini açın. Ekran Yöneticisi'ni açın ve hem nötron hem de X-ray 2FOFCWT eşlemeleri için Kaydırmak üzere geçiş yapın, ardından 2FOFCWT eşlemelerinin rmsd'sini 1,00'e düşürün (Ek Şekil 21). Hem nötron hem de X-ışını _FOFCWT haritaları için Kaydırmak için geçiş yapın ve _FOFCWT eşlemelerinin rmsd'sini 3.00'e düşürün.
  2. Modelin verilere uyup uymadığını belirlemek için kalıntıların görsel incelemesini gerçekleştirin. Fark yoğunluk haritası zirvelerini analiz ederek değiştirilebilir tüm sitelerin doğru yönlendirmesini ve H/D doluluğunu belirleyin. Bu serines, threonines ve tirozin hidroksil gruplarını içerir; histidin, glutamin, kuşkonmaz ve lizin azot; sistein sülfhidrit; karboksil grup aspartat ve glutamat; omurga amid grupları; ligandlar; kofaktörler ve olası fonksiyonel kalıntılar (Şekil 6).
  3. Su moleküllerini nötron yoğunluğuna ve hidrojen bağı etkileşimlerine göre Döndürme Tercüme Bölgesi/Zincir/Molekül özelliği kullanılarak döndürerek yeniden yönlendirin (Tamamlayıcı Şekil 22A ve Tamamlayıcı Şekil 22B). Chi Açılarını Düzenle aracını ve Çevirme Bölgesini/Zinciri/Molekülü Döndür özelliğini (Tamamlayıcı Şekil 22C ve Tamamlayıcı Şekil 22D ) kullanarak protein kalıntısı H/D değiştirilebilir bölgelerinin konumlarını ayarlayın.
Yapı iyileştirmesi – nötron verilerine özel iyileştirme
1. Yapı hazırlığı
  1. Phenix'i açın ve "Moleküler Değiştirme" yi seçin ve pdb formatında bir başlangıç koordinat dosyası oluşturmak için cihaz bilimcisi tarafından moleküler değiştirme ile sağlanan ölçeklenmiş yoğunlukların aşamasını türetmek için "Phaser-MR (tam özellikli)" seçeneğini seçin. Başlangıç pdb yapısını "Giriş ve genel seçenekler sekmesine girin ve Topluluklar, ASU içeriği ve Arama Prosedürü seçeneklerini tamamlayın.
  2. Model araçlarını açın ve PDB Araçları'nı seçin. pdb dosyasını Giriş dosyası olarak ekleyin. Seçenekler sekmesine gidin ve Atom seçimini kaldır'ın altında çözücü, ligandlar, kofaktörler ve metallerin adlarını seçin. Bu, minimum bir model oluşturmak için tüm su moleküllerini, kofaktörleri, ligandları ve metal iyonlarını ortadan kaldırır. Ayrıca, Modelden alternatif konformatörleri kaldırmak için seçin (Tamamlayıcı Şekil 23).
  3. Fenix'te İyileştir'i seçin ve ReadySet'i açın. Düzenlenen pdb koordinat dosyasını PDB dosyasının yanına girin. Yoksa modele hidrojen eklemek için seçin ve değiştirilebilir sitelerde H/D'yi seçin, Nötron arıtma seçeneklerinin açılır menüsünden başka bir yerde H (Tamamlayıcı Şekil 23).
2. Yapı iyileştirmesi
  1. Phenix'teki arıtma sekmesinin altındaki phenix.refine programını açın. Yapılandır sekmesinde, Giriş dosyaları kutusunun altında ReadySet ile işlenen PDB dosyasını girin. Giriş dosyaları kutusunda nötron verilerinden MTZ dosyasını yükleyin ve nötron verileri olmasına rağmen Veri türü sütunu altında X-ray verileri ve X-ray R-free olarak atayın. Bir sonraki adımda ayarlanan iyileştirme yapılandırması, yansıma dosyasını nötron verisi olarak ele almak için kullanılacaktır. Veriler yüklendikten sonra Alan grubu ve Veri etiketleri otomatik olarak doldurulur (Tamamlayıcı Şekil 24A).
  2. İyileştirme ayarlarındaki Yapılandır sekmesinin altında standart iyileştirme stratejisini koruyun. Döngü sayısını beşe çıkarın. Diğer seçenekler'in altında Saçılma tablosu açılır menüsünden nötron seçin. Suları güncelleme seçeneğinin seçimini kaldırın (Ek Şekil 24B).
  3. Tüm parametreler>Advanced>Hydrogens'i seçin. Yeni pencerede Hidrojen arıtma modeli açılır menüsünden Bireysel'i seçin ve Kuvvet sürme adp'yi kapatın (Tamamlayıcı Şekil 20).
  4. Arama parametreleri > Tüm parametreleri seçin... seçenek. Nükleer kelimesini arayın ve X-H/D için nükleer mesafeleri kullanmayı seçin (Ek Şekil 20).
  5. İyileştirmeyi başlatmak için Çalıştır'ı seçin.
    NOT: İlk iyileştirmeyi takiben, nötron SLD haritalarını görsel olarak incelemek ve Coot'ta manuel model oluşturma gerçekleştirmek gerekecektir. Modelde bulunan ligandları/kofaktörleri yerleştirmek gerekebilir. Sonraki iyileştirmeler, ilgili ligandlar için gerekli CIF kısıtlama dosyasını gerektirir ve bunlar phenix.refine'nin Yapılandır sekmesinde yüklenmelidir.
3. Model oluşturma
  1. Phenix'teki iyileştirmenin ardından, nötron SLD haritalarını ve yapısını görselleştirmek için Sonuçlar sekmesindeKi Coot'ta Aç'a tıklayın. Hem 2FOFCWT hem de FOFCWT haritalarını silmek için Görüntü Yöneticisi sekmesine tıklayın ve Haritalar Haritayı Sil'e tıklayın (Tamamlayıcı Şekil 25). Dosya > Açık MTZ, mmCIF fcf veya phs...'a tıklayın. Geçerli iyileştirme klasörünü seçin ve .mtz dosyasını seçin. Hem Genlikler hem de Aşamalar seçeneği için açılır menüden 2FOFC WT_no_fill verilerini seçin. Dosya > Açık MTZ, mmCIF fcf veya phs... seçeneğine tıklayarak tekrarlayın ve hem Genlikler hem de Aşamalar seçeneği için açılır menüden FOFCWT verilerini seçin. Ekran Yöneticisi'ni açın ve _2FOFC WT_no_fill eşlemesi için Kaydırma'ya geçiş açın, ardından _2FOFC WT_no_fill verilerinin rmsd'sini 1,00'e düşürecek şekilde kaydırın (Tamamlayıcı Şekil 25). _FOFCWT eşlemesi için Kaydırma'ya geçiş ve _FOFCWT verilerinin rmsd'sini 3,00'e azaltmak için kaydırın.
  2. Modelin nötron SLD haritasına uyup uymadığını belirlemek için protein yapısının görsel incelemesini gerçekleştirin.
  3. 7.1.3.2'de açıklandığı gibi, H/D değiştirilebilir sitelere sahip kalıntı ve grupların doğru oryantasyonunu ve H/D doluluğunu belirleyin. Çevir'i Döndür aracını ve Ki Açılarını Düzenle'yi kullanarak kalıntı konumlarını ayarlayın (Şekil 6). Gerekirse, Gerçek Uzay Arıtma Bölgesi kullanılabilir. Doğru atom koordinatlarını eklemek için metin düzenleyicisini kullanarak kalıntıdan patlayan D atomlarını el ile düzeltin
    NOT: Gerçek Uzay Arıtma Bölgesi Coot nötron SLD haritaları için optimize edilmemiştir ve D'ye bağlı atomlar için düzensiz bağ uzunluklarına neden olabilir, patlama artıkları olarak adlandırılan (Ek Şekil 26). Gerekli atomik koordinatları manuel olarak düzenlemek ve Gerçek Uzay Arıtma Bölgesi'nin kullanımından kaçınmak tercih edilir.
  4. Su moleküllerini nötron yoğunluğuna göre yerleştirin ve yeniden yönlendirin. Coot'a su eklemek için İşaretçiye atom yerleştir simgesini seçin ve bir su molekülü eklemeyi seçin (Tamamlayıcı Şekil 27A). Coot varsayılan olarak bu konuma bir O atomı yerleştirilecektir.
  5. Coot'a yerleştirilen suların O atomlarına D atomları eklemek için Phenix kullanın. İyileştirme menüsünü açın ve ReadySet'i tıklatın. Nötron Arıtma Seçenekleri'nin yanında sadece solvent moleküllerine döteryum ekleme seçeneğini belirleyin. Seçimi Kaldırın Yoksa modele hidrojen ekleyin (Tamamlayıcı Şekil 27B ve Tamamlayıcı Şekil 27C).
    NOT: Sadece nötron verilerini kullanan model oluşturma, eklem X-ışını/ nötron yapısının model oluşturmasından farklıdır, çünkü omurga ve daha ağır atomların koordinatlarının iyileştirilmesine katkıda bulunacak bir X-ışını verisi yoktur. Ortak bir arıtmada, elektron yoğunluk haritası başlangıçta protein omurgasını ve yan zincir koordinatlarını belirlemek için kullanılır. Bu model daha sonra H/D atomlarının yöneliminin ve doluluklarının nötron SLD haritasından türetildiği ortak bir X-ışını/nötron veri iyileştirmesinde kullanılır. Sadece nötronlu bir arıtmada, tüm yapı, H/D atomlarına ek olarak su moleküllerinin, omurganın, yan zincirlerin ve ligandların inşasını gerektiren nötron SLD haritalarının analizinden türetilmiştir (Şekil 6). Veri-parametre oranı sadece nötron verilerine karşı iyileştirmelerde düşüktür ve verilere aşırı sığmamak için dikkatli olunmalıdır.

Representative Results

Neurospora crassa'dan (NcLPMO9D) bir litik polisakkarit monooksijenazın kristalleri üzerindeki nötron kırınım verileri, yukarıda açıklanan protokolün ardından kriyo koşulları altında oda sıcaklığında HFIR'da imagine'de ve SNS'de MaNDi'de toplanmıştır. _H2O bazlı tamponda yetişen ve hacmi 0,1 ^mm3'ten büyük olan hidrojenize proteinin kristalleri kullanılmıştır (büyük kristallerin açıklayıcı örneği Ek Şekil 4'te ve daha sonra şekillerde gösterilmiştir). Kristaller kuvars kılcal damarlarına monte edilmiş ve _D2O bazlı tampon ile buhar değişimi veri toplamadan önce üç hafta boyunca gerçeklenmiştir (Şekil 4).

IMAGINE kiriş hattında oda sıcaklığı veri toplama işlemi gerçek gerçekleştirildi (Şekil 1). Dört saatlik beyaz ışın testi, kristalin tam bir veri kümesinin toplanması için uygun boyutta ve kalitede olduğunu öne süren yüksek çözünürlüklü kırınıma yol açtı. Kristalin kırınım kalitesi hakkında ön bilgi sağlamanın yanı sıra, ilk geniş bandpass maruziyeti kırınım desenini indeks etmek ve kristal oryantasyon matrisini belirlemek için kullanılabilir. Kristalin _P21 uzay grubu göz önüne alındığında, kare başına 20 saat toplama süresine sahip 18 karelik bir veri toplama stratejisi uygulandı. X-ışını kırınım veri toplamada olduğu gibi, daha yüksek simetri alanı grupları, tam bir veri kümesi toplamak için daha az kare (yani daha az açısal kapsama alanı) gerektirir. Veriler, 2.8 – 4.0 şdalga boyu aralığı kullanılarak yarı Laue modunda toplanarak toplandırıldırıldı. Veri toplamayı takiben, veriler 2.14 şçözünürlükte MTZ formatında bir nötron SLD dosyası vermek için dizine eklendi, entegre edildi ve birleştirildi. Nötron protein kırınımı akı sınırlı bir teknik olduğu için %80'lik bir bütünlük ve en az 0,3'lük bir _CC1/2 kabul edilebilir kabul edilmesine rağmen, verilerin X-ışını veri analizi için benzer kılavuzları izleyerek yeterli kalitede olduğu değerlendirildi.

Oda sıcaklığı nötron kırınımı veri toplamayı takiben, aynı kristal 1.90 şçözünürlükte bir oda sıcaklığı X-ışını kırınım veri kümesi toplamak için kullanıldı (Ek Şekil 13). X-ışını verileri, C,N,O ve S dahil olmak üzere "daha ağır" atomların konumlarını belirlemek için kullanıldı. Sadece X-ışını verilerine karşı rafine edilen yapı, daha sonra X-ışını ve nötron verilerine karşı ortak bir iyileştirme gerçekleştirmek için başlangıç modeli olarak kullanılmıştır. Phenix ReadySet, değişilemeyen bölgelerde H atomları, değiştirilebilir bölgelerde H ve D atomları ve başlangıç X-ışını modelinin su moleküllerine D atomları eklemek için kullanıldı. Bu model hazırlığının ardından her iki veri kümesine karşı yinelemeli iyileştirmeler gerçekleştirilmiştir (Tamamlayıcı Şekil 19 ve Tamamlayıcı Şekil 20). Coot'ta yan zincirleri ve su moleküllerini buna göre yönlendirmek için yoğunluk haritaları görsel olarak incelenerek interaktif model oluşturma işlemi gerçek gerçekleştirildi (Ek Şekil 22). Nötron verileri öncelikle protonasyon durumlarını ve su molekülü yönelimlerini belirlemek için kullanılmıştır. Serine ve triptofan gibi kalıntıların elektron yoğunluk haritasının ve buna karşılık gelen nötron SLD haritasının karşılaştırılması, nötron protein kırınımından H/D değiştirilebilir sahalardaki protonasyon durumlarında elde edilebilen bilgileri göstermektedir (Şekil 7). Su molekülleri için elektron ve nötron SLD haritalarının harita kaplaması, hidrojen bağı etkileşimlerinin X-ışını verilerinden çıkarılabilmesine neden olsa da, nötronların bu hidrojen bağlarının yönelimi hakkında net bilgi sağladığını göstermektedir (Şekil 8). Nötron SLD _FO-FC atlama haritaları, yan zincirlerin protonasyon durumlarını ve H/D yönelimini belirlemek için oluşturulmuştur. Tirozin ve threonine kalıntıları için elde edilen nötron SLD haritaları, nötron _Fo-FC haritalarının H/ D varlığını gösteren pozitif zirveleri açıkça gösterdiği gösterilmiştir (Şekil 9). Toplanan nötron kırınım verileri, -_ND3⁺ Lys grubu gibi birden fazla protonasyon durumları hakkında da değerli bilgiler sağladı (Şekil 10). Aşırı takılmayı önlemek için model optimizasyonu sırasında iyileştirme istatistikleri (_Rwork ve _Rfree) yakından izlendi. Nihai istatistikler % 12.77 X-ışını _Rwork ve% 18.21 _Rfree ve% 14.48 nötron _Rwork ve 389 su molekülü ile% 21.41 _Rfree verdi (Ek Şekil 28).

MaNDi kiriş hattındaki bakır aktif alanı ^{CuII'den CuI'ye} düşürmek için bir askorbat ıslatma sonrasında NcLPMO9D'de kriyo sıcaklığı verileri toplanmıştır (Ek Şekil 2 ve Tamamlayıcı Şekil 15)⁴⁵. Veriler, kırınım kalitesini doğrulamak için 4 saatlik bir pozlama kullanılarak nötron kırınım testinin ardından TOF Laue modu kullanılarak toplanmıştı. Kristalin uzay grubu göz önüne alındığında, kare başına 80 Coulombs toplama dozu ile 18 karelik bir veri toplama stratejisi tasarlandı. Veriler TOF-Laue modunda 2.0 – 4.0 şdalga boyu aralığında toplanarak toplandırılarak sağlanmıştır. Veri toplamanın ardından veriler 2,40 ^Å51,52 çözünürlükte MTZ formatında bir yansıma dosyası vermek için dizine eklendi, entegre edildi^, ölçeklendirildi ve birleştirildi^.

Veri toplamanın ardından, 2.40 şkriyo-sıcaklık NcLPMO9D nötron kırınım veri kümesi yalnızca nötron veri iyileştirmesi için kullanıldı. Nötron verileri, başlangıç modeli olarak PDB 5TKH kullanılarak moleküler değişim ile aşamalı olarak alındı. Phenix ReadySet, değişemeyen sitelere H atomları ve değiştirilebilir bölgelerde kısmi dolulukları olan H/D atomları eklemek için kullanıldı. PDB Araçları ile başlangıç modelinden su molekülleri çıkarılmıştır (Ek Şekil 23). Model hazırlamayı nötron saçılma tablosu kullanılarak phenix.refine ile iyileştirme takip etti (Tamamlayıcı Şekil 24). Coot'ta etkileşimli model oluşturma gerçekleştirildi ve su molekülleri _FO-Fc haritasının pozitif zirveleri kullanılarak eklendi ve potansiyel hidrojen bağı etkileşimlerine göre konumlandı (Şekil 11A ve Şekil 11B). Nötron SLD haritalarını analiz ederken, su molekülleri yüksek derecede sıralanmışsa açıkça görülebilir, ancak iyi sıralanmış değilse yoğunlukları küresel veya elipsoidal olabilir (Şekil 11C-E). Nötron SLD haritaları, sadece X-ışını kırınım verilerini kullanırken karbonil ve amino gruplar arasında ayrım yapmanın zor olabileceği kuşkonmaz gibi kalıntıların yönelimi hakkında değerli bilgiler sağlamak için kullanılmıştır (Şekil 12A ve Şekil 12B). FO-FC nötron SLD at haritalarındaki zirveler, N _δ veya N ε pozisyonundaki histidin _{kalıntılarının} protonasyon durumlarını belirlemede de çok bilgilendiriciydi (Şekil 12C ve Şekil 12D). Nötron SLD haritaları kullanılarak birden fazla H/D değiştirilebilir bölgeye sahip kalıntıların protonasyon durumu da belirlenebilir. Bu, pozitif bir yüke sahip olduğu bilinen bir _FO-FC nötron SLD atla arginin haritası ile açıkça gösterilmiştir (Şekil 12E ve Şekil 12F). Daha önce olduğu gibi, _Rwork ve _Rfree izlenerek aşırı montaj önlendi. Nihai istatistikler %22,58 _Rwork ve %30,84 _Rfree verdi (Ek Şekil 29). Nötron protein kırınımının, negatif saçılma uzunluğunun ve H'nin büyük tutarsız saçılma faktörünün dikkate alınması gereken akı sınırlı bir teknik olduğu göz önüne alındığında, yalnızca nötron verisi iyileştirmesinin, daha az görünür su molekülüne sahip ortak bir X-ışını / nötron verisi arıtmasından daha zayıf istatistiklere sahip olması beklenebilir (Ek Şekil 28 ve Tamamlayıcı Şekil 29).

Nötron SLD haritaları analiz edilirken, _D2O içeren kristalleşme tamponu ile buhar değişimine maruz kalan hidrojenize proteinler için H'nin negatif nötron saçılma uzunluğu nedeniyle yoğunluk iptalinin meydana geldiği ortaya çıkacaktır. Bu nedenle, değiştirilemeyen H atomlarının karbona tutturulduğu nötron SLD haritaları, elektron yoğunluk haritası muadili ile karşılaştırıldığında eksik görünmektedir (Şekil 13A). İptalin etkisi genellikle daha düşük çözünürlüklerde daha belirgindir, bu da yüksek kalitede protein kristalleri elde etmeyi zorunlu hale getirir. Bu nedenle, protein omurgasının konumunu belirlemek için X-ışını verilerinin kullanılabileceği hem X-ışını hem de nötron verileri ile bir numunenin ortak bir iyileştirmesinin yapılması tercih edilir (Şekil 13B). Ayrıca, sistein ve metiyonindeki kükürt atomları zayıf görülebilir ve tam atom yerleşimi için X-ışını verileri gerektirebilir (Şekil 13C ve Şekil 13D). Zayıf nötron saçılma uzunluklarına sahip metallerin, LPMO9D haritalarımızda da belirtildiği gibi nötron SLD haritalarında modellenilmesi zor olabilir. Aynı kristal üzerinde düşük dozda (radyasyon hasarı içermeyen) X-ışını veri kümesinin toplanması bu nedenle yararlıdır, çünkü elektron yoğunluk haritaları kullanarak metal atom konumlandırmasına izin verir (Şekil 13E ve Şekil 13F).

Şekil 1: Nötron proteini kristalografi iş akışının akış şeması. Protein Üretimi. Nötron yapısı elde etmek için önce protein ifade edilir. _{H2O veya D2O} tabanlı ortamda bakteriyel ekspresyon tipik olarak sırasıyla hidrojene veya perdeuterated rekombinant protein yüksek verim üretmek için kullanılır. Protein _H2O bazlı tamponda saflaştırılır ve daha _{sonra kristalleri} minimum 0,1 ^mm3 boyuta büyütmek için _{H2O veya D2O} bazlı kristalleşme tamponunda kristalize edilir. Örnek Hazırlama: Nötron kırınım veri toplamadan önce, _H2O tarafından yetiştirilen kristaller, protein titretilebilir H atomlarını D. H/D değişimi ile değiştirmek için H/D değişiminden geçer, kristallerin döterlenmiş kristalleşme tamponuna doğrudan ıslatılması, kristalleşme damlasının _D2O tabanlı bir rezervuarla dengelenmesi veya kristallerin kısırlaştırılmış kristalleşme tamponu ile buhar değişimi için kuvars kılcal damarlara monte edilmesi ile yapılabilir. Nötron Veri Toplama: H/D değişimini takiben, kırınım kalitesini belirlemek için potansiyel kristaller taranır. Minimum çözünürlüğe sahip kristaller 2,5 Å, tam bir veri kümesinin toplanması için uygun kabul edilir. Kristaller, oda sıcaklığında veri toplama için kuvars kılcal damarlara monte edilir veya kriyojenik sıcaklıkta veri toplama için kriyo-döngüde dondurulmuş flaş. Bir X-ışını veri kümesi aynı sıcaklıkta aynı (veya aynı) kristalde toplanır. Model Binası: İyileştirme, phenix.refine kullanılarak hem nötron hem de X-ışını verilerine karşı veya yalnızca nötron verilerine karşı gerçekleştirilir. Protein yapısının manuel model yapımı nötron SLD haritaları kullanılarak Coot'ta gerçekleştirilir. Tam Yapı: Protein yapısının tamamlanmasının ardından koordinat modeli doğrulanır ve Protein Veri Bankası'na yatırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protein kristallerinin toplanması. (A) Kristaller mikroskop altında ele alınır. (B) Silikonlu cam plakayı içeren mühürlü sandviç kutusu açılır. Rezervuar tamponu silikonlu cam slaytlara pipetlenmiştir. (C) Bir kristal mikroloop ile toplanır. (D) Kristal, kristalle birlikte sık sık hasat edilen kalıntıları yıkamak için bir damla ana liköre yerleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kristalin kuvars kılcal damara transferi. (A) Kuvars kılcal damarın ucu rezervuar tamponu ile doldurulur. (B) Kristal kuvars kılcal damara aktarılır ve (C) rezervuar tamponuna batırılır. (D) Kristal, rezervuar tamponu kullanılarak kılcal damardan aşağı taşınır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kuvars kılcal damarlarının sızdırmazlığı. (A) Bir "fiş" oluşturmak için kılcal damarın sonuna döterlenmiş tampon eklenir. (B) Balmumu bir "değnek" ile eritilir. (C) Kılcal damar, mühürlemek için eritilmiş balmumuna yerleştirilir. (D) Kılcal damarı kapatmak için her iki uçta balmumu fişleri oluşur. (E) Montajdan sonra kristal. (F) Mühürlü kılcal damar bir Petri kabına yerleştirilir ve macunla yerinde tutulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Nötron kırınım deseninin sinyalden gürültüye artışı. Veri toplama işlemi ilerledikçe, dağınık noktalar daha yoğun hale gelir. (NOT: Burada sunulan canlı kırınım görüntüleri illüstrasyon içindir ve farklı kristallerden alınmıştır.) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Coot nötron verilerini kullanarak interaktif model oluşturma. (A) Serine'yi gösteren pozitif bir _FO-FC nötron SLD yoğunluk zirvesi (yeşil), chi açıları düzenlenerek yeniden yönlendirilmelidir. _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. (B) Serine doğru konumlandırılmıştır. (C) Pozitif ve negatif _FO-FC nötron SLD yoğunluk zirveleri (sırasıyla yeşil ve kırmızı), triptofanın fark yoğunluğu zirvesine uyacak şekilde döndürülmesi/çevrilmesi gerektiğini gösterir. (D) Doğru yönlendirilmiş triptofan. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Nötron SLD haritalarından ek bilgi. (A) 2FO-FC elektron yoğunluk haritası (mavi), serinedeki "daha ağır" atomların konumlarını görüntüler. (B) 2FO-FC nötron SLD haritası (mor), serinedeki "daha hafif" D atomunun konumunu açıkça görüntüler. (C) 2FO-FC elektron yoğunluk haritası (mavi), triptofandaki "daha ağır" atomların konumlarını görüntüler. (D) 2FO-FC nötron SLD haritası (mor), triptofandaki "daha hafif" D atomunun konumunu açıkça görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Su molekülü konumlandırma. (A) Su için 2FO-FC elektron yoğunluk haritası (mavi) unsurunun küresel şekli. (B) _2FO-FC nötron SLD haritası (mor), su yönelimi ve hidrojen bağı etkileşimi hakkında bilgi sağlar. (C) Elektron ve nötron SLD su haritalarının harita kaplaması. _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Nötron SLD _FO-FComit haritaları. (A) _FO-FC nötron SLD haritası (yeşil), tirozin kalıntılarının H/D yönelimi hakkında net bilgi sağlar. _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. (B) Doğru H/D yönelimli tirozin kalıntısı. (C) _FO-FC nötron SLD haritası (yeşil), threonine kalıntılarının H/D yönelimi hakkında net bilgi sağlar. (D) Doğru H/D yönelimli threonine kalıntısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Nötron SLD haritaları ile görüntülenen birden çok protonasyon durumu. (A) _2FO-FC elektron yoğunluk haritası (mavi) sadece lizin ε-amonyum grubunun N atomunun konumunu sağlar. (B-E) _FO-FC nötron SLD atlama haritası (yeşil) pozitif yüklü -_NH3 grubunu açıkça gösterir. _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. (F) Elektron yoğunluğu ve nötron SLD haritalarının yer paylaşımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Nötron SLD haritalarında su moleküllerinin görünümü. (A) Su molekülleri _FO-FC nötron SLD haritalarına (yeşil) ve potansiyel hidrojen bağlarına göre konumlandırılmıştır. _2FO-FC nötron SLD haritası mor renkte görüntülenir. (B) Doğru konumlandırılmış su molekülü. (C-E) Nötron SLD'nin çeşitli şekilleri, B faktörlerine ve hidrojen bağı etkileşimlerine bağlı olarak su molekülleri için haritaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: Nötron SLD haritaları tarafından sağlanan amino asit yönelimi ve protonasyonu hakkında bilgi. (A) Nötron SLD _FO-FC harita tepeleri (yeşil), kuşkonmaz kalıntısının yanlış yönlendirilmesini gösterir. _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. (B) Doğru kuşkonmaz yönünün _2FO-FC nötron SLD haritası (mor). (C) Nötron SLD _FO-FC harita zirvesi (yeşil), N _ε'de histidin tek protonasyonunu gösterir. (D) Histidin N ε-protonasyonun _2FO-FC nötron SLD haritası (mor). (E) Nötron SLD _FO-FC harita tepelerini atlar (yeşil) arginin pozitif yükünü doğrular. (F) Pozitif yüklü arginin _2FO-FC nötron SLD haritası (mor). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 13: Süreksiz nötron SLD haritaları. (A) Hidrojene edilmiş, buhar H/D protein değiş tokuş edilen _2FO-FC nötron SLD haritası (mor). Glutamik asit, değiş tokuş edilemeyen H atomlarının negatif saçılma uzunluğu nedeniyle nötron SLD harita iptalini görüntüler. (B) Bindirilmiş bir 2FO-FC elektron yoğunluk haritası (mavi), glutamik asidin yoğunluğunu açıkça görüntüler. (C) Metiyondeki kükürt atomu _2FO-FC nötron SLD haritalarında (mor) zayıf görünür. (D) Bindirilmiş bir elektron yoğunluk haritası, methioninin yoğunluğunu açıkça görüntüler. (E) Metal atomları, burada bakır, nötron 2FO-FC SLD haritalarında (mor) zayıf görünür. (F) Bindirilmiş bir 2FO-FC elektron yoğunluk haritası (mavi), koordineli bakır atomunun yoğunluğunu açıkça görüntüler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İzotop	Tutarlı saçılma uzunluğu (fm)	Tutarsız saçılma uzunluğu (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24Mg	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39K	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56Fe	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tablo 1: Nötron saçılma uzunlukları ve tutarsız saçılma değerleri. Sears'tan uyarlandı, ¹⁹⁹²¹⁶.

Ek Şekil 1: Yüksek Akı Izotop Reaktöründe IMAGINE Cihazı. (A) Soğuk nötron kılavuz salonunda imagine enstrümanı. (B) Goniometreye macun ile tutturulmuş bir kuvars kılcal damara monte edilmiş numune. Numune ve dedektör masası, kristali ve silindirik görüntü plakasını nötron ışınında konumlandırmak için kapanır. Uluslararası Kristalografi ^{Birliği'nin izniyle değiştirildi53}. Görüntüler Genevieve Martin, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'nın izniyle sağlanmıştır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Spallation Nötron Kaynağındaki MaNDi Cihazı. (A) MaNDi Anger kamera dedektörü dizisi. Uluslararası Kristalografi Birliği'nin izniyle ^{çoğaltıldı11}. (B) MaNDi hareket ettirilebilir örnek aşama. (C) Oda sıcaklığı veri toplama için MaNDi'deki goniometreye monte edilmiş kuvars kılcal damara monte edilmiş örnek. Görüntüler Genevieve Martin, Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'nın izniyle sağlanmıştır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Litik polisakkarit monooksijenaz NcLPMO9D'nin yapısı. NcLPMO9D bakır aktif alan düz bir polisakkarit bağlama yüzeyinde bulunur. Bakır, klasik bir "histidin ayracı" içinde iki histidin kalıntısının yanı sıra eksenel bir tirozin kalıntısı ile koordine edilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Oturma damla kristalizasyon tepsisinde yeterli hacme sahip kristal. (A) 9 kuyu silikonlu cam plakalara kurulan oturma damlalarında büyük kristaller yetiştirilir. (B ve C) Kristaller, hacmi 0,1 ^mm3'> olanları tanımlamak için ölçülür. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: döterlenmiş tampon okumaları için pH ölçer kuruldu. pH elektrot kullanılmadan önce _D2O'ya batırılır. NaOD ve DCl, sönmüş tamponların pH'ını ayarlamak için kullanılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 6: MaNDi örnek montaj yönergeleri. Kuvars kılcal damarlarının maksimum boyutları ve oda sıcaklığı veri toplama için numune pozisyonu.
Çoğaltılan: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: Fazla tamponun çıkarılması. (A) Fazla tampon kuvars kılcal damardan mikrokapsiller uçlarla emilir. (B) Kalan tampon, kılcal damarı tamamen kurutmak için ince bir kağıt fitili ile çıkarılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 8: Veri toplama GUI'si. Veri toplama için "Deneme Parametreleri" giriş penceresi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 9: Optik GUI. Nötron sayım oranının veri toplanması ve izlenmesi için yarı Laue aralığının seçimi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 10: Veri toplama GUI'sinde veri toplama. Veri toplama için pozlama süresi, kare sayısı ve açılar "Topla" sekmesinde belirtilir. Veri toplama daha sonra "Taramayı Başlat" kullanılarak başlatılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 11: Dağınık nötronlar tespit edildi ve görüntülendi. Pozlama süresinin sonunda nötron duyarlı görüntü plakası dedektörü okunur ve kırınım deseni veri toplama GUI'sinde görüntülenir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 12: Nötron kırınımını takiben veri işleme. Çerçeveler dizine dahil edilir, entegre edilir, dalga boyu normalleştirilir ve veri toplamayı takiben birleştirilmiş bir yansıma dosyası oluşturmak için Lauegen, Lscale ve Scala kullanılarak ölçeklendirilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 13: X-ray veri toplama. Oda sıcaklığı veri toplama için kuvars kılcal damar monte kristal ile kurulan ev kaynaklı X-ray jeneratörü. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 14: MaNDi kriyo-veri toplama için montaj yönergeleri. MaNDi'de kriyo-veri toplama için CrystalCaps boyutları ve pim yüksekliği.
Çoğaltılan: https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 15: Cryo nötron kırınım veri toplama için flaş dondurma. (A) Köpük Dewar gibi kriyo uyumlu bir kap kullanarak kristal ıslatma, mikroloop ile hasat ve sıvı nitrojende donma için kurulum. Monte edilen kristal, önceden soğmuş kriyo pim maşaları kullanılarak doğrudan ışın çizgisi kriyo goniometresine aktarılır. (B) Balmumu mührü kristalin çıkarılması için eritilir. (C) Kristal hasat için kuvars kılcal damarın sonuna kadar yıkanır. (D) Kristal sırayla askorbat ıslatma tamponu ve ardından sıvı nitrojende flaş dondurma ile kriyoprotektant içine batırılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 16: Örnek hizalama arayüzü. Mavi haç tarafından temsil edilen nötron kirişinde kristal hizalama, nokta ve tıklama ortalama ile yapılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 17: Veri toplama için CSS GUI. Pozlama dozları ve açıları da dahil olmak üzere veri toplama stratejisi CSS GUI'ye yüklenir. Veri toplama işlemi devam ederken, gerçek zamanlı dedektörde tespit edilen dağınık nötronlar üst panelde görüntülenecektir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 18: CCP4'te R-free bayrakları eşleştirme. Nötron verilerinin R-free bayrakları, aynı veya aynı kristalde toplanan X-ray verilerinin R-free bayraklarıyla eşleştirilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 19: Yapı hazırlama ve iyileştirme. (A) Phenix ReadySet aracı, değiştirilebilir sitelere çift H/D doluluğu eklemek için kullanılır. (B) Hem nötron verileri hem de X-ışını verileri ortak bir arıtma için kullanılırken, ilk giriş modeli aynı kristalde veya aynı kristalde toplanan X-ışını veri kümesine karşı rafine edildi. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 20: Arıtma ayarlarının yapılandırılması. Arıtma modeli ve nükleer mesafeler ortak X-ışını/nötron veri iyileştirmesi için yapılandırılmıştır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 21: Coot model oluşturma için veri seçimi. X-ışını ve doldurulmamış nötron verilerini içeren phenix MTZ dosya çıkışı, etkileşimli model oluşturma için elektron ve nötron SLD haritaları oluşturmak için Coot'ta açılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 22: Ortak bir arıtma sırasında Coot'ta interaktif model oluşturma. (A) Suyun dönme/çeviri ile yeniden yönlendirilmesi gerektiğini gösteren pozitif ve negatif bir _FO-FC nötron SLD yoğunluk zirvesi (sırasıyla yeşil ve kırmızı). _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. (B) Doğru konumlandırılmış su. (C) Pozitif bir _FO-FC nötron SLD harita zirvesi (yeşil), ki açılarını düzenleyerek fark yoğunluğu zirvesine uyacak şekilde threonine döndürülmesi gerektiğini gösterir. (D) Doğru yönlendirilmiş threonine. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 23: Yalnızca nötron veri iyileştirmesi için yapı hazırlığı. Başlangıç koordinat dosyası PDBTools su atom kaldırma ve değiştirilebilir sitelerde çift H / D doluluk ilave ile arıtma için hazırlanmıştır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 24: Nötron yalnızca veri iyileştirmesi. (A) Nötron verileri ve hazırlanan başlangıç modeli yüklenir. (B) Nötron veri iyileştirme ayarları nötron saçılma tablosunu kullanır. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Şekil 25: Coot model oluşturma için veri seçimi. Doldurulmamış nötron verileri etkileşimli model oluşturma için Coot'ta açılır. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 26: Kote edilmiş kalıntılar için Coot'ta gerçek alan iyileştirmesi. (A) Pozitif ve negatif _FO-FC nötron SLD yoğunluk zirveleri (sırasıyla yeşil ve kırmızı), _FO-FC yoğunluk zirvesine uyacak şekilde bir arginin kalıntısının taşınması gerektiğini gösterir. _2FO-FC nötron SLD haritası mor, 2FO-FC elektron yoğunluk haritası ise mavi renkte görüntülenir. (B) Gerçek Uzay Rafine etme, eksik Coot geometri kısıtlama kütüphaneleri nedeniyle "patlayan" D atomları ile sonuçlanır. (C) D atomları kalıntı atomlarının geri kalanıyla birlikte hareket etmez. (D) D atom konumları bir metin düzenleyici kullanılarak manuel olarak sabitlenebilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 27: Su moleküllerinin eklenmesi. (A) Su molekülleri pozitif _FO-FC nötron SLD harita yoğunluk zirvelerine (yeşil) manuel olarak eklenebilir. Eklenen su molekülleri başlangıçta Coot'ta bir O atom ile temsil edilecektir. (B) Phenix ReadySet, su molekülleri için O atomlarına D atomları eklemek için kullanılır. (C) Kısırlaştırılmış su molekülü başarıyla eklenir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 28: Arıtma istatistikleri. Ortak X-ışını/nötron iyileştirmesi sonrasında nihai veri iyileştirme istatistikleri. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 29: Arıtma istatistikleri. Nötron verilerine özel iyileştirmeyi izleyen nihai veri iyileştirme istatistikleri. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Nötron proteini kristalografisi, proteinlerde protonasyon durumlarını ve su molekülü yönelimini araştırmak için oldukça hassas bir tekniktir. Bu bilgi protein katalitik mekanizmalarına ışık tutar, çünkü protonasyon ve hidrojen bağlanma etkileşimlerindeki değişiklikler genellikle enzim kimyası için ^merkezidir10. Nötron proteini kristalografisi, bilgilendirici bir teknik olsa da, nötron kırınım deneyi yapmayı planlamadan önce dikkate alınması gereken bir dizi faktöre sahiptir, yani:

Veri toplama için büyük protein kristalleri gereksinimi.
Hidrojenin ve metal iyonları gibi diğer elementlerin saçılma özellikleri.
Kısırlaştırılmış örneklerle çalışırken yapı iyileştirme ve model oluşturma yazılımındaki sınırlamalar.

Nötron proteini kristalografisi akı sınırlı bir tekniktir. X-ışını kırınım veri kümelerinin aksine, nötron veri kümeleri için doğal sınırlamalar (akı sınırlı, yarı Laue, daha uzun dalga boyları) nedeniyle nötron veri kümeleri için daha yüksek R faktörleri ve daha düşük tamlık, artıklık ve sinyal-gürültü oranları beklenmektedir. Tek bir çerçevenin veri toplaması genellikle 12 - 18 saattir. Bir deneyin başarısı, genellikle minimum gereksinim olan 0,1 ^mm3 kristallerle numune boyutuna ve kalitesine oldukça ^bağlıdır3. Nötron kırınımı, 10 ila 800 μL arasında değişen kristalizasyon damlaları kurmak için büyük miktarlarda protein üretimi gerektirir. Yeterince büyük kristaller yetiştirmek için minimum hacim, kristal ve numune parametreleri (https://neutrons.ornl.gov/imagine) verilen bir Hacim Hesaplayıcısı kullanılarak tahmin edilebilir. Büyük kristallerin büyümesi en yaygın olarak buhar difüzyonu ^{ile gerçeklenmiştir3}. Asılı damla kristalizasyonu, kristallerin 10-25 μL arasında değişen büyük damlalarda büyümesine izin verirken, ~ 50 μL'ye kadar değişen daha büyük damlalar ticari olarak mevcut oturma damlası ^{ekipmanı14,54} kullanılarak ayarlanabilir. Silikonize dokuz kuyulu cam plakalar, 800 μL'ye kadar hacimlerle çok büyük damlalar kurmak için kullanılabilir. Bu cam tabaklar, Hampton Research'ün ticari olarak kullanabileceği "sandviç kutularına" yerleştirilir. Diğer kristalizasyon teknikleri, damla boyutunun sınırının gemi tarafından dikte edildiği toplu kristalizasyonu içerir. Toplu kristalizasyon deneyi kurulumu mikrolitrelerden mililitrelere kadar ^{değişebilir55}. Kristalizasyon, proteinin bir diyaliz zarı aracılığıyla çökelti ile denge edildiği diyaliz tekniği kullanılarak veya çökelti konsantrasyon gradyanı boyunca veya agarose56,57 gibi gözenekli bir tıkaç aracılığıyla karşı difüzyon ile de gerçekleştirilebilir. Tohumlama, istenen hacimde kristaller elde etmek için başka bir alternatif sunar. Mikro ve macroseeding, NcLPMO9D45'in büyük kristali de dahil olmak üzere büyük kristal büyümesi için başarıyla ^edilmiştir. Sıcaklığın çözünürlük üzerindeki etkisi de dahil olmak üzere protein faz diyagramı hakkında bazı bilgiler, büyük kristal büyümesine yardımcı oluyor.

Nötron kırınım deneyi planlarken, kırınım veri toplama sırasında sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için protein hazırlığının optimizasyonu ^esastır7. H atomlarının neden olduğu yoğunluk iptalini ve yüksek tutarsız saçılmaları atlatmak için nötron SLD haritaları, pozitif tutarlı saçılma uzunluğuna ve düşük tutarsız saçılma uzunluğuna sahip olan Izotop D'siyle H atomları değiş tokuş edilerek geliştirilebilir. Bunu başarmak için hidrojenize protein kristalinin döterlenmiş kristalleşme tamponuna karşı buhar değişimi gerçekleştirilir. Bu, çözücü moleküllerin ve labile, titrilebilir protein H atomlarının H/ D değişimini ^sağlar23. Buhar değişimi, hidrojenize kristalin _D2O bazlı, döterlenmiş kristalleşme tamponu "fişleri" ile bir kuvars kılcal damara monte edilmesiyle gerçekleştirilir ve en sık uygulanan etkili, nazik bir tekniği temsil eder14,23,35. Değişim birkaç hafta sürebilir ve tercihen maksimum H/D değişimini sağlamak için deuterated arabelleğin sık sık değiştirilmesini gerektirir. H/D değişimi, kristalin doğrudan sönmüş tampona batırılmasıyla da gerçekleştirilebilir. _D2O maruziyeti nedeniyle kristalin stres altında kalmasını önlemek için, emme işlemi _D2O:H2O oranının artarak kademeli olarak gerçekleştirilmesi ^gerekir58. Buna ek olarak, hidrojenize proteinin kristalizasyonu labile H bölgelerinde H/D değişimi için döterlenmiş tamponda da ^{yapılabilir22,59}. Bununla birlikte, _D2O tabanlı tamponun bilinen _H2O tabanlı koşulların daha fazla ayarlandırılmasını gerektiren protein çözünürlüğü üzerinde bir etkisi olduğu belirtilmelidir3,59. _D2O bazlı tamponların da bazı durumlarda daha küçük kristallere yol açacağı gözlenmiştir59. Titretilebilir ve karbona bağlı H atomlarının D ile tam değişimi, perdeuterated bir örnek oluşturmak için kısırlaştırılmış ortamdaki proteinlerin ifade edilmesiyle elde ^edilebilir20. Perdeuterated numunenin elde edilen nötron SLD haritaları önemli ölçüde iyileştirilecek ve artık hidrojene numune muadili yoğunluk iptalini görüntülemeyecektir. Bu, bir protein veya kofaktörde değiş tokuş edilemeyen bölgelere bağlı H / D'yi karakterize ederken faydalıdır. Bununla birlikte, perdeuterated proteinin ekspresy ekspresy ifadesi hem maliyeti yüksektir hem de verimi ^{düşüktür60}. Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı (ORNL) Yapısal Moleküler Biyoloji Merkezi (CSMB), perdeuterated örnek (https://www.ornl.gov/facility/csmb) oluşturmak isteyen kullanıcılar için bir döterasyon olanağı sunmaktadır. Perdeuterated ekspresyon tipik olarak 1 L ölçeğinde bir biyoreaktörde gerçekleştirilir ve ~50 mg saflaştırılmış ^protein61 verir.

Nötron kırınım verilerinin toplanmasının ardından arıtma ve interaktif model oluşturma işlemi gerçekleştirilir. İyileştirme, phenix.refine, nCNS veya SHELXL28,31,32,33 dahil olmak üzere birden fazla yazılım paketi kullanılarak çalıştırılabilir^. Phenix paketi, modeli nötron SLD haritalarından manuel olarak oluşturmak için kullanılan Coot ile birlikte nötron kırınım verilerinin iyileştirilmesi için en yaygın kullanılan ^{yazılımdır34}. Hem Phenix hem de Coot nötron kırınım verilerinin işlenmesine izin verse de, nötron verileri ve kısırlaştırılmış örneklerle ilişkili özellikleri işlemek için gerekli bazı özelliklerden yoksun olabilirler. Örneğin, Coot, "Gerçek Uzay Rafine Etme" özelliği "patlayan" kalıntılarla sonuçladığı için model oluşturma sırasında komplikasyonlara yol açabilecek, kısırlaştırılmış kalıntılar için geometri optimizasyonu içermez (Ek Şekil 26)⁶². Bu, tüm kısırlaştırılmış kalıntılar için kısıtlama dosyaları oluşturularak çözülebilir. Ancak, bu yoğun bir işlemdir ve bu tür kitaplıklar şu anda herkese açık değildir. Phenix'te iyileştirmeler yapılırken, değiştirilebilir H/D siteleri başlangıçta H ve D için 0,50 doluluk olarak ayarlanacaktır. Arıtmalar yapıldıkça, H ve D'nin doluluğu nötron SLD haritalarına göre iyileştirilecektir. İnteraktif model oluşturma sırasında, fark yoğunluğu _Fo-Fc haritaları H / D doluluklarını değerlendirmede çok bilgilendiricidir. Haritalar, hangi sitelerin yüksek D doluluğuna sahip olduğunu belirlemek için kullanılabilir, bu da özellikle protonasyon durumlarının katalitik olarak ilgili olduğu aktif sitede ^{bilgilendiricidir63}. Belirsiz durumlar ortaya çıkar, ancak, H:D doluluk 0.70:0.30'a yakındır ve bu da nötron SLD haritalarında tam sinyal iptali ^{ile sonuçlanır64}. Ayrıca, yarı Laue nötron veri setlerinin genellikle X-ışını kırınım verileri için rutin olarak gözlenenden ≥% 98'den daha düşük olan% 80 civarında bütünlüğe sahip olduğu dikkate alınmalıdır. Phenix nötron kırınım verileri iyileştirilirken, eksik gözlemlenen genlikler (_Fo) bu nedenle yansıma listesini tamamlamak için modelden hesaplanır, böylece model önyargısı ortaya çıkarır. Bu potansiyel önyargıyı hesaba katmak için "no_fill" haritaları , "doldurulmuş" haritaların aksine etkileşimli model oluşturma sırasında incelenmelidir.

Kullanıcılar, yapılarının ortak bir X-ışını/nötron veri iyileştirmesini veya yalnızca nötron verilerinin iyileştirilmesini gerçekleştirmeyi seçebilir. Nötron SLD haritalarını özellikle daha düşük çözünürlükte görselleştirmek, özellikle H/D buhar değişimine rağmen H'nin hala değişemeyen yerlerde bulunduğu hidrojenize bir protein için başlangıçta rahatsız edici olabilir. Bu, nötron yoğunluğu haritası iptalleriyle sonuçlanır ve süreksiz haritalar ^{izlenimi verir65,66}. karşılık gelen bir X-ray veri kümesinin toplanması, bu iptalleri ortak bir iyileştirmede avantajlı bir şekilde tamamlar (Şekil 13A ve Şekil 13B). Ortak iyileştirme stratejisi tipik olarak protein omurga koordinatlarının X-ışını verilerine karşı rafine edilmesini içerirken, nötron kırınım verileri değiştirilebilir sahalarda H/D atomlarının konumunu ve doluluğunu iyileştirmek için ^{kullanılır28}. Değiştirilebilir sahalarda ortak H/D doluluğunun getirilmesi rafine edilen parametrelerin sayısını artırdığından, X-ray verileriyle ortak bir iyileştirme de veri-parametre oranını artırır. Bir eklem iyileştirmesi, karşılık gelen bir X-ışını veri kümesinin aynı kristal veya aynı koşullar altında yetiştirilen bir kristal üzerinde aynı sıcaklıkta toplanmasını gerektirir. Oda sıcaklığında (300K) toplanan nötron kırınım verileri için, ilgili X-ışını veri kümesi, radyasyon hasarını sınırlamak için düşük doz veri toplama stratejisi kullanılarak oda sıcaklığında toplanmalıdır. Perdeuterated numuneler, aksine, aynı büyüklükte H/D sinyal iptali olmadığı için geliştirilmiş ve sürekli nötron SLD haritaları sağlar. Bununla birlikte, metaller ve kükürt de dahil olmak üzere belirli elementlerin nötron saçılma uzunluğu, protein perdeuterated olsa bile nötron SLD haritalarında zayıf görünür hale getirir (Şekil 13C-F)¹⁸. Bir metalin karakterize edilmesi gerekiyorsa, bir eklem iyileştirmesinde X-ışını kırınımını kullanmak veya kırınım deneylerini tamamlamak için spektroskopik teknikler uygulamak en iyisidir. Nötron veri kümesi yüksek çözünürlüğe sahip olduğunda veya perdeuterated protein kullanıldığında genellikle yalnızca nötron veri iyileştirmeleri gerçekleştirilir. Ek olarak, sadece nötron veri rafinajı, radyasyon hasarına karşı oldukça hassas bir protein üzerinde çalışılıyorsa özellikle yararlıdır, çünkü X-ışını türevi bir yapı radyasyon kaynaklı eserlere sahip olabilir. Yalnızca nötron verisi iyileştirmesi yapılacaksa, karşılık gelen nötron veri kümesinin yeterli eksiksizliğe ve çözünürlüğe sahip olup olmadığı tespit edilmelidir.

ORNL, nötron kırınım verilerinin toplanması için iki olanak sunar: HFIR'daki IMAGINE beamline ve ^{SNS36,67'deki} MaNDi kiriş hattı. Her iki cihaz da benzer ilkeleri kullanan bir nötron kırınım veri kümesi toplamak için etkili araçlar sağlarken, her enstrüman ışın süresi için başvururken dikkate alınması gereken benzersiz özelliklere sahiptir. IMAGINE, quasi-Laue verilerini toplar ve ~100 Å'ya kadar birim hücrelere sahip kristallerde oda sıcaklığı verisi toplanması için optimize edilmiştir. MaNDi, ~ 300 Å'ya kadar birim hücrelere sahip kristaller üzerinde TOF-Laue toplamayı kullanan oda sıcaklığı ve kriyo sıcaklığı verilerinin toplanması için kullanılabilir. Tam bir veri kümesini toplamadan önce, kristalin nötron ışınlarına tek bir kare için maruz kaldığı elde edilen kırınım deseninin kalitesini değerlendirmek için kristal üzerinde bir test yapılır. Kristal yeterli kalitedeyse, X-ray veri işlemeye benzer bir işlemde tam bir nötron kırınım veri kümesi toplanacak, dizine eklenecek, entegre edilecek, ölçeklendirilecek ve birleştirilecektir. IMAGINE Lauegen ve Lscale'den yararlanır ve MaNDi Mantid paketini kullanır ve üç boyutlu profil uydurması kullanır48,50,51,68,69,70. Bu tesislerden herhangi birine kullanıcı olan bilim insanlarına daha fazla analiz için MTZ veya HKL formatında bir veri kümesi sağlanacaktır.

Nötron kırınımı, biyolojik makromoleküllerin protonasyon durumunu ve hidrojen bağı etkileşimlerini yok etmek için tahribatsız, son derece hassas bir tekniktir. Özellikle fotoğrafa duyarlı proteinler ve metalloproteinler için faydalıdır. Bir deney yapmadan önce teknik ve verilerin işlenmesi ile ilgili çeşitli hususlar dikkate alınmalıdır, ancak sonuç, ilgi proteininin katalitik mekanizması hakkında değerli bilgiler verebilecek sonuçlar verir. Nötron proteini kristalografisi hesaplamalı, yapısal, biyokimyasal ve spektroskopik çalışmaları tamamlayarak biyoloğun biyolojik makromolekülleri karakterize etmek için kullanılan teknikler araç kutusunda değerli bir araç haline getirir.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı'ndaki ABD Enerji Bakanlığı Biyolojik ve Çevresel Araştırma Kullanıcı Tesisi olan Yapısal Moleküler Biyoloji Merkezi'nde (CSMB) protein ekspresyasyonu, saflaştırma ve kristalizasyon deneyleri yapıldı. Nötron kırınım verileri BL-11B MaNDi'de, ABD Enerji Bakanlığı Temel Enerji Bilimleri Ofisi Bilimsel Kullanıcı Tesisleri Bölümü tarafından desteklenen ORNL'deki Spallation Nötron Kaynağı'nda (SNS) toplanmıştır. Yazarlar Brendan Sullivan'a veri azaltma konusundaki yardımları için teşekkür ediyorlar. X-ışını kırınım verileri, Kuzey Carolina Eyaleti tarafından desteklenen North Carolina State Üniversitesi Moleküler Eğitim, Teknoloji ve Araştırma İnovasyon Merkezi (METRIC) tesislerinde toplanmıştır. GCS, kısmen Ulusal Araştırma Vakfı (NRF), Güney Afrika ve ORNL'deki Lisansüstü Fırsatlar (GO!) programından destek kabul eder. FM, USDA NIFA Hatch 211001 desteğini kabul ediyor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent Paper Points Size #30-#40, 60 mm length	DiaDent/DiaVet	218-292
Capillary wax	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Corning	CLS430790
Conical Centrifuge Tubes (50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Curved-Tip Forceps	Mitegen	TW-CTF-1
Deuterium chloride solution, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D	Sigma-Aldrich	543047
Deuterium oxide 99.9 atom % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µm	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH meter F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (T),	Sigma-Aldrich	54457
High flux rotating anode X-ray diffractomemeter with EIGER 4M detector	Rigaku, Oxford Cryostream and Dectris	XtaLAB Synergy-R	Home source X-ray diffractometer
Magnetic Wand Straight	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, tip for filling Femtotips and other glass microcapillaries (for research use only), 0.5 – 20 µL, 100 mm, light gray, 192 pcs. (2 racks × 96 pcs.)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1.5 mL	Eppendorf	Z606340
Petri Dishes with Clear Lid 100 mm diameter	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 μL	Eppendorf Research	Z683779
Pipette Volume 100-1000 μL	Eppendorf Research	Z683825
Pipette Volume 10-100 μL	Eppendorf Research	Z683809
Pipette Volume 20-200 μL	Eppendorf Research	Z683817
Poly(ethylene glycol) BioXtra, average mol wt 3,350, powder	Sigma-Aldrich	P4338
Quartz Capillary , 1.00 mm inner diameter, 80 mm length	Hampton	HR6-146	Thin-walled capillary
Research Stereomicroscope System	Olympus	SZX16
Reusable B3 (SSRL/SAM Style) Goniometer Bases	Mitegen	GB-B3-R
Round - Miniature Hollow Glass Tubing (VitroTubes) Clear Fused Quartz / 1.00 mm inner diameter, 100 mm length	VitroCom	CV1012	Thick-walled capillary
Sandwich Box with cover	Hampton	HR3-132
Siliconized 9 Well Glass Plate	Hampton	HR3-134
Sitting Drop Crystallization Plate (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99 atom % D	Sigma-Aldrich	176788
Thick Siliconized circle cover slides (22 mm x 0.96 mm)	Hampton	HR3-247
Universal Pipet Tips, 0.1 - 10 µL	VWR	76322-528
Universal Pipet Tips, 1 - 100 µL	VWR	76322-136
Universal Pipet Tips, 100 - 1000 µL	VWR	76322-154
Universal Pipet Tips, 20 - 200 µL	VWR	76322-150
Universal Pipet Tips, 1 - 20 µL	VWR	76322-134
Wax pen	Hampton	HR4-342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802 (2018).
Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

Chemistry

Protein Yapılarında Hidrojen Atomlarının Modellenmesi için Nötron Kristalografisi Veri Toplama ve İşleme

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.