Summary
我们描述了一种从 非洲爪蟾 卵中制备和实时成像未稀释的细胞质提取物的方法。
Abstract
非洲 爪蟾 卵提取物传统上用于批量生化测定，已成为一种强大的基于成像的工具，用于研究细胞质现象，例如细胞分裂、有丝分裂纺锤体形成和细胞核组装。基于对在稀疏时间点采样的固定提取物进行成像的早期方法，最近的方法使用延时显微镜对实时提取物进行成像，揭示了具有增强时间分辨率的更多动态特征。这些方法通常需要对成像容器进行复杂的表面处理。在这里，我们介绍了一种无需化学表面处理的鸡蛋提取物实时成像的替代方法。它易于实施，并利用批量生产的实验室耗材进行成像。我们描述了一种可用于宽场和共聚焦显微镜的系统。它专为二维（2D）场中的提取物成像而设计，但可以轻松扩展到3D成像。它非常适合研究细胞质内的空间模式形成。通过代表性数据，我们证明了使用该方法制备的相间提取物中微管，细胞核和线粒体的典型动态组织。这些图像数据可以提供有关细胞质动力学和空间组织的定量信息。
Introduction
细胞质构成细胞的主要体积，具有独特的组织。真核细胞质的成分可以自组装成广泛的空间结构，例如微管紫苑和高尔基体，而微管紫苑又根据细胞的身份和生理状态动态排列和翻转。因此，了解细胞质的空间组织及其与细胞功能的联系对于理解细胞如何工作非常重要。非洲爪蟾卵提取物传统上用于批量生化测定1，2，3，4，5，6，7，8，但最近的工作将它们确立为强大的实时成像系统，用于细胞质结构及其细胞功能的机制研究9，10，11，12，13，14，15，16，17，18.这些未稀释的提取物保留了细胞质的许多结构和功能，同时允许直接操作细胞质内容物，这是传统基于细胞的模型无法实现的19，20。这使得它们成为表征细胞质现象和剖析其机制基础的理想选择。
现有的提取物成像方法需要化学表面改性或制造微流体装置。一种基于盖玻片的方法需要对玻璃盖玻片进行聚乙二醇（PEG）钝化21。基于微乳液的方法需要在玻璃表面上气相沉积三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷22，23。基于微流体的系统可以精确控制提取物液滴的体积、几何形状和组成，但需要专门的微细加工设施11，12，24。
在这里，我们介绍了一种对卵子提取物进行成像的替代方法，该方法易于实施并利用现成的低成本材料。这包括制备带有载玻片和涂有氟化乙烯丙烯（FEP）胶带的盖玻片的成像室。该腔室可用于使用各种显微镜系统对提取物进行成像，包括立体镜以及正置和倒置显微镜。该方法不需要对表面进行化学处理，同时获得与上述现有玻璃方法相似的光学透明度。它旨在对 2D 视场中厚度均匀的提取物层进行成像，并且可以轻松扩展以对提取物的 3D 体积进行成像。它非常适合在大视场上对集体细胞质行为进行延时成像。
我们使用相间停滞的卵提取物来演示我们的成像方法。提取物制备遵循戴明和科恩布鲁斯19的方案。简而言之，在减数分裂II中期自然停滞的卵子被低速旋转压碎。该旋转将细胞质从减数分裂停滞中释放出来，并允许提取物进入间期。通常，在粉碎自旋之前添加细胞松弛素B以抑制F-肌动蛋白的形成。然而， 如果需要 F-肌动蛋白， 它可以省略.在粉碎旋转之前还添加环己酰亚胺，以防止中间提取物进入下一个有丝分裂。随后将提取物置于上述成像室中并置于显微镜上。最后，通过连接到显微镜的相机以定义的时间间隔记录图像，生成延时图像系列，在2D场中捕获提取物的动态行为。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 载玻片和盖玻片的准备
- 用滚筒涂抹器将一层氟化乙烯丙烯（FEP）胶带涂在载玻片上。用干净的剃须刀片剪掉边缘上多余的胶带。以相同的方式制备FEP胶带包被的盖玻片（图1A）。
- 将双面粘性成像垫片涂在载玻片的FEP胶带涂层面上。保持顶部的保护衬垫未剥落（图1A）。
注意：载玻片和盖玻片应在实验前准备好。它们可以立即使用，也可以存放在盒子中，以防止灰尘积聚在表面上。成像间隔器中的孔深120μm，直径为9mm。
2. 相间停滞卵提取物的制备和实时成像
注意：以下协议改编自Deming和Kornbluth19，Murray20以及Smythe和Newport25 。除非另有说明，否则所有步骤都应在室温下进行。
- 取卵前三至十天，将成熟的雌性非洲 爪 蟾皮下注射到背淋巴囊中，并加入100 IU妊娠母马血清促性腺激素（PMSG）。
- 在计划取卵前16至18小时，向步骤2.1中的青蛙注射500 IU的人绒毛膜促性腺激素（hCG）。将青蛙在18°C的产卵缓冲液（100mM NaCl，2mM KCl，1mM MgSO 4.7H 2 O，2.5mMCaCl 2·2H2 O，0.5mM HEPES，0.1mM EDTA）中，在pH7.4下制备为20x储备溶液，并在使用前用干净的青蛙罐水稀释至1x）直到收集卵子。
- 在实验当天，将鸡蛋收集在一个大的玻璃培养皿中并评估卵子质量。丢弃任何看起来像白色浮肿球或呈绳状出现的鸡蛋（图1B）。在立体镜下检查卵子，保持鸡蛋外观正常（图1C），并丢弃色素不规则或斑驳的鸡蛋（图1D）。
注意：该协议适用于从单个青蛙收集的鸡蛋，通常在 hCG 注射后 25 小时产下 16 mL 的鸡蛋。通常，hCG共诱导3至6只青蛙，选择卵质最高的青蛙进行提取物制备实验。 - 将鸡蛋转移到 400 mL 玻璃烧杯中，并通过倾析尽可能多地去除产蛋缓冲液。
- 将鸡蛋在 100 mL 新鲜制备的脱冻溶液（2% w/v L-半胱氨酸在水中，用 NaOH 调节至 pH 8.0）中孵育，并定期轻轻旋转。约3分钟后，倒出溶液，加入100mL新鲜脱冻液。继续孵育，直到鸡蛋紧密包装（鸡蛋之间没有空间），但避免将鸡蛋留在脱冻溶液中超过 5 分钟。
- 通过倾析尽可能多地去除果冻溶液，并在0.25x MMR缓冲液（25mM NaCl，0.5mM KCl，0.25mM MgCl2，0.5mM CaCl2，0.025mM EDTA，1.25mM HEPES，制备为10x储备溶液，用NaOH调节pH至7.8，并在使用前用Milli-Q水稀释）中洗涤鸡蛋加入缓冲液， 旋转鸡蛋，然后倒出缓冲液。重复几次，直到总共使用1L缓冲液进行洗涤。
- 用总共 400 mL 的鸡蛋裂解缓冲液（250 mM 蔗糖、10 mM HEPES、50 mM KCl、2.5 mM MgCl2、1 mM DTT，新鲜制作并用 KOH 调节至 pH 7.7）清洗鸡蛋几次。在洗涤之间使用巴斯德移液管去除外观异常的鸡蛋。
注意：外观异常的鸡蛋是指那些看起来像白色浮肿球（图1B），有斑驳的色素沉着（图1D），随着白色区域的增长而恶化（图1E），或在动物半球显示深色和收缩色素区（图1F）。 - 使用尖端切开的转移移液器，将鸡蛋转移到含有 1 mL 鸡蛋裂解缓冲液的 17 mL 圆底离心管中。在临床离心机中以400× g 旋转试管15秒以包装卵子。
- 使用巴斯德移液管从包装鸡蛋的顶部尽可能多地去除鸡蛋裂解缓冲液。
注意：重要的是从包装好的鸡蛋中去除尽可能多的缓冲液，以尽量减少鸡蛋提取物的稀释。有时需要去除一些松散的鸡蛋以及残留的缓冲液来完成此操作。 - 确定包装鸡蛋的大致体积，然后直接在包装鸡蛋上添加 5 μg/mL 抑肽酶、5 μg/mL 亮肽酶、5 μg/mL 细胞松弛素 B 和 50 μg/mL 环己酰亚胺。
注意：抑肽酶和亮肽酶是蛋白酶抑制剂。细胞松弛素B抑制肌动蛋白聚合，防止提取物收缩和胶凝26。环己酰亚胺抑制蛋白质合成，从而使提取物保持在细胞周期的中间期。 - 通过在摆动桶转子中以12，000× g，4°C离心管15分钟来压碎鸡蛋。
注意：在离心结束时，鸡蛋应该已经破裂，裂解物分成三个主要层：顶部的黄色脂质层，中间的细胞质提取物（也称为粗提取物）和底部包含色素颗粒的深色致密层（图1G）。 - 将18号针头连接到注射器上。针尖斜面朝上，从细胞质层底部的一侧刺穿管子，然后缓慢抽取提取物。
注意：缓慢绘制细胞质提取物，以避免包含来自黄色脂质层的污染内容物。 - 将回收的细胞质提取物转移到新的微量离心管中并将其保持在冰上。在 1 小时内使用提取物。
- 准备好成像后，用所需的试剂和荧光成像探针补充提取物。
注意：荧光成像探针标记特定的细胞质结构，以便可以通过荧光显微镜观察它们。 - 从步骤1.2制备的载玻片上的成像垫片上取下顶部保护衬垫，并在孔的中心沉积约7μL提取物。立即使用FEP胶带涂层的盖玻片，FEP面朝向提取物以密封孔。快速进行成像（图1H，I）。
- 将载玻片放在带有电动载物台和数码相机的倒置或正置显微镜上。在明场和荧光通道中以所需的空间位置和时间间隔对提取物进行成像。
注意：通常使用5倍物镜进行成像。电动载物台可在多个定义的空间位置进行自动图像采集。明场显微镜以不同程度的透明度可视化细胞质结构。荧光显微镜可视化由步骤2.14中添加的荧光成像探针特异性标记的细胞质结构。相机记录这些结构的延时图像，从而捕捉细胞质组织的动态。
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Representative Results
非洲爪蟾卵提取物可用于研究间期细胞质的自组织。图2A显示了成功实验的结果。我们用浓度为 27 个细胞核/μL 的去膜爪蟾精子核19 和 0.38 μM 纯化的 GST-GFP-NLS27、28、29、30（由谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白和核定位序列组成的融合蛋白）补充了相间停滞提取物，以实现间期细胞核的重建和可视化。我们还添加了 1 μM 荧光标记的微管蛋白来可视化微管，并添加了 500 nM MitoTracker Red CMXRos 来可视化线粒体。将提取物放入成像室后不久，细胞质显得杂乱无章。在室温下接下来的30分钟内，细胞质开始自我组织成细胞样区室。微管紫苑从与精子核一起引入的中心体生长而来，当遇到来自邻近紫苑的微管时，形成微管耗尽的边界区域。GST-GFP-NLS蛋白从添加的去膜化精子核中易位到自组装的圆形间期细胞核中。在明场和线粒体通道中都可以看到光散射细胞质成分耗尽的区域（图2A，20分钟和35分钟）。线粒体也从微管建立的边界中耗尽，并在与微管区室对齐的孤立隔室中富集。在室温下60分钟，由细胞样隔室组成的空间模式应该建立良好，微管形成空心花环状结构，线粒体明确划分到每个隔室中（图2A，53分钟）。
图2B比较了在玻璃上使用和不使用FEP胶带的成像室中的提取物性能。我们用去膜爪蟾精子核19 补充了相间停滞提取物，浓度为 27 个细胞核/μL 和 0.35 μM GST-mCherry-NLS27，28，29，30（由谷胱甘肽-S-转移酶、mCherry 荧光蛋白和核定位序列组成的融合蛋白），以允许间期细胞核的重建和可视化。我们还添加了1μM荧光标记的微管蛋白以可视化微管。在室温下，动力学差异在大约20分钟时变得明显。在用FEP胶带玻璃制成的腔室中，提取物自组织成正常的细胞样图案（图2B，第1行和第3行中的图像）。然而，在玻璃表面未被FEP胶带覆盖（未钝化）的腔室中，提取物显示出异常的明场和微管图案，随着时间的推移变得越来越被破坏（图2B，第2行和第4行中的图像）。在GST-mCherry-NLS蛋白的核导入方面没有观察到显着差异（图2B，第5行和第6行的图像）。
图1：与实验程序相关的原理图和照片。 （A）制备FEP胶带涂层玻璃盖玻片和载玻片的示意图。（B）非洲爪蟾卵沉积在产卵缓冲液中，用箭头表示劣质种蛋的例子。黄色箭头，看起来像白色浮肿球的鸡蛋的例子。红色箭头，字符串中出现的鸡蛋示例。（C）外观正常的非洲爪蟾卵的例子。（D）色素不规则或斑驳的劣质鸡蛋的例子。（E）变质的鸡蛋，白色区域不断增长。（F）显示色素区变黑和收缩的卵子，可能是由于孤雌生殖激活。（G）步骤2.11中12，000×g离心后破裂的非洲爪蟾卵形成的层。（H）步骤2.15中制备提取物成像室的示意图。（I）准备好的成像室的照片，里面有卵子提取物。（C） 和 （D） 在 （D） 的底部共享相同的比例尺。（E） 和 （F） 在 （F） 的底部共享相同的比例尺。（B） （C） （D） （E） （F） 和 （I） 中的比例尺是近似值。请点击此处查看此图的大图。
图2：间歇性停滞的卵子提取物自组织成细胞样区室 。 （A）在相间停滞的非洲 爪蟾 卵提取物的薄层（120μm）中自组织模式形成的延时蒙太奇。提取物补充了27个细胞核/μL去膜化的 非洲爪蟾 精子核，以允许重建间期核。微管由HiLyte 647标记的微管蛋白（以洋红色显示）可视化，线粒体由MitoTracker Red CMXRos（以红色显示）可视化，细胞核由GST-GFP-NLS（以绿色显示）可视化。（B）在相间停滞的 非洲爪蟾 卵提取物中自组织图案形成，放置在有和没有FEP胶带覆盖玻璃表面的腔室中。提取物补充有27个细胞核/μL去膜爪 蟾 精子核，以重建间期核。微管由HiLyte 488标记的微管蛋白（以洋红色显示）可视化，细胞核由GST-mCherry-NLS可视化（以绿色显示）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：成像室的可选二级密封。 用矿物油制备可选二级密封的示意图，以防止提取物与空气长时间接触。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
非洲爪蟾卵提取物已成为一种强大的模型系统，用于各种亚细胞结构的成像研究10，14，15，16，17，18，21，31，32，33，34，35，36和整个细胞质组织细胞规模9.在这里，我们描述了一种适用于2D动态细胞质组织的实时成像方法。具有代表性的结果证明了该方法的有效性。
有几个步骤对于该方法的成功至关重要。卵子质量对提取物很重要，因此步骤2.3和2.7至关重要。根据我们的经验，优质卵子的动物半球具有均匀的色素沉着，中心有一个明显的白点（表明生发囊泡分解，GVBD），以及与植物半球的清晰边界（图1C）。由优质鸡蛋制成的提取物在我们的成像条件下具有更好的性能。如果超过5%的鸡蛋有斑驳的色素（图1D），色素沉着区域变暗和收缩（图1F），看起来像白色浮肿的球（图1B），出现在一串（图1B），或者在步骤2.6和2.7中洗涤后出现恶化的迹象（图1E），那么整批鸡蛋应该被丢弃。提取物保留了显着的生物活性，因为它们基本上是未稀释的细胞质。因此，旨在最大限度地减少提取物稀释的步骤（步骤2.9）对于实验的成功非常重要。对于成像，提取物的处理量非常小，如果长时间与空气接触，提取物会迅速蒸发。这将对他们的活动产生负面影响。因此，在步骤2.15中，提取物沉积后，必须尽快用FEP胶带涂层的盖玻片面密封。可以通过垫片上的粘合剂和盖玻片之间接触部位的质地变化来目视确认密封。如果使用得当，垫片应该能够形成完整的密封。但是，如果需要额外的密封，可以在盖玻片的悬垂物和载玻片之间分配矿物油。油可以通过毛细管作用在垫片周围形成额外的密封（图3）。玻璃表面的钝化可以减少分子的非特异性吸附，并且对于提取物21，37中的相间微管紫苑很重要。此处描述的在玻璃表面上应用FEP胶带似乎提供了类似的好处，正如正常相间微管紫苑的组装所表明的那样（图2，6分钟）。因此，步骤 1.1 也至关重要。
我们按照Deming和Kornbluth19的方案演示了使用相间停滞卵提取物的成像方法的应用。默认情况下，该方案用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B补充提取物，以防止在室温下延长孵育26后提取物中的凝胶收缩。为了允许肌动蛋白聚合并观察肌动蛋白动力学，可以在方案9的步骤2.10中省略细胞松弛素B。我们对戴明和科恩布鲁斯协议所做的修改是，我们不用能量混合物补充提取物来再生ATP19。这是因为在我们手中，在补充了这种ATP再生混合物19 和精子核的提取物中，微管偶尔会形成交联晶格，干扰细胞质模式的形成。因此，该协议不包括将能量混合物添加到提取物19的步骤。
间期提取物方案依赖于在不含EGTA的缓冲液中压碎鸡蛋以释放它们脱离减数分裂停滞（CSF停滞）37。提取物随后进入间期，并通过环己酰胺保持在相间。还有其他已建立的制备相间提取物的方法。一些方法首先通过在EGTA38的裂解缓冲液中粉碎鸡蛋来制备维持减数分裂停滞的提取物，然后通过添加钙释放阻滞，将提取物驱动到间期21，37，39。提取物随后可以通过添加蛋白质合成抑制剂（例如环己酰亚胺37，39）保持在相间。其他方法用钙离子载体（A23187）或电击激活卵，以释放它们脱离减数分裂停滞，然后在没有EGTA20，28的情况下压碎卵（在Field等人37中回顾）。这些提取物可以进入间期，但通常不会停留在那里，因为它们能够经历多个细胞周期。同样，已经开发了针对制备具有完整肌动蛋白细胞骨架的提取物而优化的成熟方法10，37，39。成像方法可能适用于这些类型的提取物，但我们尚未对其进行测试。
为了对细胞质的内部组织进行成像，这里介绍的成像系统相对容易设置，只需要在玻璃表面上涂上FEP胶带。它允许在更复杂的成像系统中报告的提取物9中组装细胞骨架结构，其中玻璃表面用聚-L-赖氨酸-g-聚乙二醇（PLL-g-PEG）处理钝化或涂有支持的脂质双层10，21。该方法允许形成具有定义厚度的提取层（由间隔物的深度决定，对于图1A，1H，1I和图2所示的系统，间隔物的深度为120μm）。我们可以通过堆叠额外的垫片来调整厚度。我们已经堆叠了多达 6 个这样的垫片（720 μm 厚），并且隔间正常形成。这种灵活性使未来的应用成为可能，例如使用共聚焦或光片显微镜对提取物进行3D成像。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢J. Kamenz、Y. Chen和W. Y. C. Huang对手稿的评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01 GM110564，P50 GM107615和R35 GM131792）的资助，授予James E. Ferrell，Jr.。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 ml centrifuge tube | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm square #1 cover glass | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Protease inhibitor |
| Cycloheximide | MilliporeSigma | 01810 | Protein synthesis inhibitor |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | C6762 | Actin polymerization inhibitor |
| Female Xenopus laevis frogs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescent HiLyte 488 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL488M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorescent HiLyte 647 labeled tubulin protein | Cytoskeleton, Inc. | TL670M-A | For visualizing the microtubule cytoskeleton |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) optically clear tape | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Human chorionic gonadotropin (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Imaging spacer | Electron Microscopy Sciences | 70327-8S | |
| Leupeptin | MilliporeSigma | 11017101001 | Protease inhibitor |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | For visualizing mitochondria |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | BioVendor | RP1782725000 | |
| Roller applicator | Amazon | B07HMBJSP8 | For applying the FEP tape to the glass slides and coverslips |
| Single-edged razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | For removing excessive FEP tape |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M |
References
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