Summary
A reação de condensação de Claisen-Schmidt é uma metodologia importante para a geração de compostos aromáticos bicíclicos conjugados com ponte de methine. Através da utilização de uma variante mediada pela base da reação aldol, uma gama de moléculas fluorescentes e/ou biologicamente relevantes pode ser acessada através de uma abordagem sintética geralmente barata e operacionalmente simples.
Abstract
Compostos aromáticos bicíclicos conjugados com ponte de methine são constituintes comuns de uma gama de moléculas biologicamente relevantes, como porfirinas, dipírrinones e fármacos. Além disso, A rotação restrita desses sistemas muitas vezes resulta em sistemas altamente a moderadamente fluorescentes, como observado em 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pirimidin-3-ones, xanthoglows, análogos pirroloindolizinedionos, analógicos BODIPY, e os sistemas de anel fenólico e imidazolinone da Proteína Fluorescente Verde (GFP). Este manuscrito descreve um método barato e operacionalmente simples de realizar uma condensação claisen-Schmidt para gerar uma série de piraole/imidazol/imidazol/isoindolone dipyrrinone fluorescente. Embora a metodologia ilustre a síntese de análogos dipyrrinone, ela pode ser traduzida para produzir uma ampla gama de compostos aromáticos bicitílicos conjugados. A reação de condensação de Claisen-Schmidt utilizada neste método é limitada no escopo de nucleófilos e eletrofilos que são enolizáveis em condições básicas (componente nucleófilo) e aldeídos não enolizáveis (componente eletrophile). Além disso, tanto os reagentes nucleofílicos quanto eletrofílicos devem conter grupos funcionais que não reagirão inadvertidamente com hidróxido. Apesar dessas limitações, essa metodologia oferece acesso a sistemas completamente novos que podem ser empregados como sondas biológicas ou moleculares.
Introduction
Uma série de sistemas bicíclicos conjugados, nos quais dois anéis aromáticos são ligados por uma ponte monomethine, passam por isomerização via rotação de vínculos, quando animados com um fóton (Figura 1A)1,2,3,4,5. O isômero animado geralmente relaxará para o estado terrestre através de processos de decomposição não radiativa6. Se a barreira energética para a rotação de títulos for aumentada em grande medida, é possível restringir ou impedir a fotoisomerização. Em vez disso, a excitação fotônica resulta em um estado singlet animado que muitas vezes relaxa via fluorescência em vez de decadência não radiativa(Figura 1B). A fotoisomerização de contenção é mais comumente realizada restringindo mecanicamente a rotação de ligações através da amarração dos dois sistemas de anéis aromáticos por ligações covalentes, bloqueando assim a molécula em um estado isomerico particular. Esta abordagem tem sido utilizada para criar vários diferentes linálogos tricíclicos tricíclicos e dipyrrolemetanos como: 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones(1), xan Os análogos(2)6,7,análogos pirroloindolizinedione(3)8, e os análogos BODIPY9 (4, Figura 2) pelos quais os sistemas de anel pirrolidina e/ou pirrole estão amarrados com metileno, carbonil, ou linkers de boro difluoro. Normalmente, 1-4 possuem ΦF > 0,7 sugerindo que esses sistemas são muito eficientes como unidades fluoródricas.
Também é possível restringir a fotoisomerização através de meios que não a ligação covalente dos sistemas de anéis. Por exemplo, os anéis fenólicos e imidazolinona(Figura 2)da Proteína Fluorescente Verde (GFP) estão restritos à rotação pelo ambiente proteico; a configuração restritiva aumenta o rendimento quântico em três ordens de magnitude em comparação com a mesma unidade cromófora na solução livre10. Acredita-se que o andaime proteico de GFP fornece uma barreira rotacional através dos efeitos estericos e eletrostáticos11. Recentemente, nosso grupo em colaboração com o grupo Odoh na Universidade de Nevada, Reno descobriu outro sistema fluoróforo que tem semelhança estrutural com os sistemas xanthoglow baseados em dipyrrinone(Figura 2)12. Estes análogos de dipyrrinone, no entanto, diferem do sistema xanthoglow naquela ligação de hidrogênio intramolecular, em vez de ligações covalentes, deter a fotoisomerização e resultar em um sistema motocíclico fluorescente. Além disso, os análogos pirázio, imidazol e dipyrrinone isoindolone podem se ligar hidrogênio em estados protoados e desprotosados; a desprotonação resulta na mudança vermelha tanto dos comprimentos de onda de excitação quanto das emissões, provavelmente devido a uma mudança na natureza eletrônica do sistema. Embora a ligação de hidrogênio tenha sido relatada para aumentar os rendimentos quânticos embora a rotação restrita13,14,15,16, não estamos cientes de qualquer outro sistema fluoroforeiro no qual a isomerização restrita serve como um modo de fluorescência em ambos os estados protonsados e desprotosados da molécula. Portanto, esses fluoroforos de dipyrrinone dependentes de pH são únicos a esse respeito.
Neste vídeo, focamos na síntese e caracterização química da série analógica fluorescente dipyrrinone. Em particular, há uma ênfase na metodologia de condensação Claisen-Schmidt que foi usada para construir a série completa de análogos fluorescentes. Essa reação se baseia na geração de um íon enolate de enolate mediado pela base que ataca um grupo de aldeído, para produzir um álcool que posteriormente passa por eliminação. Para a série analógica dipirorinona, uma pirrolinona/isoindolone é convertida em um enolato para facilitar um ataque a um grupo de aldeído ligado a um anel pirazol ou imidazol(Figura 3); após a eliminação, forma-se um sistema bicíclico totalmente conjugado, ligado por uma ponte methine. Vale ressaltar que toda a série de análogos dipyrrinone pode ser construída a partir de materiais comerciais prontamente disponíveis e pode ser produzida em uma única sequência de reação de um pote tipicamente em rendimentos moderados a altos (os rendimentos variam de aproximadamente 50-95%). Uma vez que a maioria dos análogos de dipirorinono são de natureza altamente cristalina, muito pouca purificação fora das condições padrão de trabalho é necessária para produzir amostras analiticamente puras. Consequentemente, este sistema fluorforeiro requer apenas alguns passos para acessar a partir de materiais comerciais prontamente disponíveis e pode ser sintetizado, purificado e preparado para estudos analíticos ou biológicos em um período de tempo relativamente curto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Procedimento Geral para Síntese de Analogias Dipyrrinone 16-25
- Dissolver pirrolinona/isoindolone (1,00 mmol) e o aldeído pirarole/imidazol correspondente (1,00 mmol) em 5,0 mL de etanol em um frasco de fundo redondo.
- Adicione KOH aquoso (24,0 mmol, 10 M, 2,40 mL) ao frasco em uma porção.
- Mexa e refluxee a mistura até que a conclusão da reação seja confirmada pelo TLC (Veja a Tabela 1 para uma lista de tempos de reação). Utilizou-se um eluente TLC de 10% de metanol em diclorometano e os análogos possuem valores Rf na faixa de 0,62 a 0,86. Aplique uma quantidade suficiente de graxa de vácuo ou use uma manga PTFE na interfase das articulações de vidro para evitar que o vidro do condensador e o frasco de fundo redondo se adouquem sob altas temperaturas e condições básicas.
- Deixe a mistura de reação esfriar à temperatura ambiente e evaporar voláteis sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo.
- Esfrie a mistura de reação a 0 °C usando um banho de gelo.
- Neutralize a mistura oleosa restante adicionando ácido acético (30,0 mmol, 1,70 mL) em uma porção.
- Purifique o material resultante do produto utilizando filtragem a vácuo (ver Etapa 2a, para compostos: 17, 18, 20-22, 24 e 25) ou use extração líquido/cromatografia de coluna (ver Passo 2b, para compostos: 16, 19e 23).
2. Purificação do procedimento
- via Filtragem de vácuo
- Coloque um funil Hirsch em um frasco de braço lateral usando um adaptador de borracha instalado.
- Aplique um pedaço de papel filtro redondo no funil Hirsch e levemente molhado usando água deionizada para permitir a adesão ao funil.
- Conecte uma fonte de vácuo ao braço lateral do frasco e certifique-se de que há uma vedação de vácuo suficiente, certificando-se de que nenhum dos vidros pode ser separado enquanto estiver sob vácuo.
- Despeje o frasco contendo o produto cristalizado sobre o filtro de vácuo e deixe filtrar. Enxágüe os cristais com 10 mL de água deionizada gelada.
- Deixe que os cristais filtrados continuem a secar em cima do papel filtro, enquanto ainda estão conectados à fonte de vácuo, após a filtragem de todos os líquidos.
- Colete os cristais filtrados e coloque em um frasco de fundo redondo de 25 mL.
- Conecte o frasco de fundo redondo a um adaptador de vidro moído fritado/adaptador de linha de vácuo. Segure a união conjunta de vidro com um clipe keck.
- Para a extremidade costelada do adaptador de linha de vácuo alto de vidro, conecte uma linha de vácuo que é roteada para uma bomba de vácuo alta e esfrie adequadamente uma armadilha de vácuo (usando refrigerante como nitrogênio líquido ou gelo seco/acetona) para condensar quaisquer materiais voláteis que possam evaporar do material cristalino. Ligue a bomba de vácuo alta para garantir a evaporação completa de quaisquer vestígios de solvente restante dos cristais.
- Deixe os cristais secarem sob alto vácuo por um mínimo de 1h. Remova o frasco de fundo redondo da linha/adaptador de vácuo, desligue a bomba de vácuo alta e limpe a armadilha de vácuo.
-
Purificação do procedimento via Cromatografia de Coluna
- Diluir o conteúdo da mistura de reação tratada por ácido acético (a partir da etapa 1.6) com 10 mL de água desionizada e transferir para um funil separador. Adicione 10 mL de diclorometano ao funil separador. Agite suavemente e desfoque o funil separador para separar as duas camadas.
- Extrair a camada aquosa utilizando porções subsequentes de diclorometano (3 x 5 mL). Combine as frações orgânicas e seque usando anidro Na2SO4. Decantar e remover todos os voláteis sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo.
- Diluir o resíduo obtido a partir da etapa 2.2.2. com 5 mL de CH2Cl2. Realize cromatografia de coluna flash usando aproximadamente 75 g de gel de sílica. Elute a amostra com uma solução de 10% de metanol em diclorometano.
- Remova as frações coletadas de solvente sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo. Transfira o resíduo sólido para um frasco de fundo redondo de 25 mL usando aproximadamente 10 mL de CH2Cl2. Remova o solvente sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo.
- Seque o resíduo sólido restante sob alto vácuo, como descrito anteriormente nas etapas 2.1.7 - 2.1.9.
3. Aquisição de Absortividade Molar e UV/Vis pKa Studies for Analogs 16-25
- Crie soluções de estoque composto para espectrofotometria UV/Vis para análogos 16 - 25.
- Pesar 10 μmol do análogo dipyrrinone selecionado(16 - 25) e adicioná-lo a um frasco volumétrica de 10 mL.
- Adicione DMSO à marca de 10,0 mL no frasco volumoso.
NOTA: Se o composto não se dissolver completamente, aqueça o frasco usando uma arma de calor e agitar o frasco conforme necessário para dissolver completamente o composto.
- Faça soluções salina tamponadas de fosfato (PBS) em vários níveis de pH. Os análogos foram caracterizados em buffers PBS variando em pH de aproximadamente 4 a 15.
- Utilizando um cilindro volumoso de 1 L, crie 1 L de solução de estoque PBS diluindo 100 mL de PBS (x100) em 900 mL de água desionizada.
- Transfira 50 mL da solução de estoque PBS preparada (passo 3.2.1) para um béquer de 100 mL e adicione uma barra de agitação magnética. Em seguida, usando um medidor de pH calibrado para monitorar as alterações no pH, titula o buffer PBS com um Aquos 1.0 M NaOH (para obter buffers com pH > 7,0) ou 1,0 M HCl (para obter buffers com pH < 7,0).
NOTA: Para obter dados que resultem em uma curva de titulação bem definida, recomendamos a geração de buffers de pH em incrementos de 0,1 pH unidades dentro de ± 0,5 do ponto de inflexão antecipado e incrementos de 0,5 fora do ponto de inflexão previsto.
- Adquira espectros de absortividade molar para soluções analógicas 16 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH (pH 14.0).
- Prepare um "branco" usando um cuvette de quartzo limpo e seco e adicione 2,0 mL de solução de estoque PBS (pH 7.0) ou aquoso 1.0 M NaOH ao cuvette usando uma micropipette de 100 - 1000 μL.
NOTA: É importante para a integridade do processo de aquisição de dados de solução em branco para garantir que não haja bolhas de ar na solução cuvette e limpar completamente os lados do cuvette com uma limpeza Kim para evitar dispersão de luz resultante de poeira ou detritos na parte externa da cuvette. Se as bolhas persistirem, bata suavemente e repetidamente a cuvette em uma toalha de papel colocada sobre uma superfície dura. - Usando um espectrofotômetro UV/Vis, em branco a solução selecionada para uma faixa de 200 a 800 nm.
- Em um segundo cuvette de quartzo limpo e seco adicione 2,00 mL de PBS (pH 7.0) ou 1,0 M NaOH (pH 14) seguido por 10 μL da solução de estoque dipirona(16 - 25) solução de estoque (ver passo 3.1) com um micropiette de 5-50 μL. Coloque uma tampa na cuvette e agite bem, além de inverter a cuvette.
NOTA: É importante para a integridade do processo de aquisição de dados de solução de amostra para garantir que não haja bolhas de ar na solução cuvette e limpar completamente os lados do cuvette com uma limpeza Kim para evitar dispersão de luz resultante de poeira ou detritos na parte externa da cuvette. Se as bolhas persistirem, bata suavemente e repetidamente a cuvette em uma toalha de papel colocada sobre uma superfície dura. - Utilizando o espectrofotômetro UV/Vis, adquira um espectro de absorção para a solução analógica dipyrrinone para uma faixa de 200 - 800 nm.
- Ao mesmo cuvette, adicione mais 10 μL da solução de estoque analógico dipyrrinone e repita as etapas 3.3.3 e 3.3.4.
- Repetir o passo 3.3.5 até um total de 50 μL de solução de ações analógicas de dipyrrinone foi adicionado ao cuvette, a fim de adquirir pelo menos cinco pontos de dados de comprimento de onda de excitação. Repetição passos 3.3.1 - 3.3.6 até que todas as soluções de estoque de 16 - 25 foram obtidas tanto em PBS (pH 7.0) quanto em 1.0 M NaOH.
- Prepare um "branco" usando um cuvette de quartzo limpo e seco e adicione 2,0 mL de solução de estoque PBS (pH 7.0) ou aquoso 1.0 M NaOH ao cuvette usando uma micropipette de 100 - 1000 μL.
- Obtenha valores de absortividade molar para 16 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1,0 M NaOH utilizando a melhor análise de regressão linear.
- Usando um programa de grafagem como o GraphPad Prism 7, plote a absorvância medida (eixo y) contra a concentração analógica dipirana (x-eixo). Crie uma análise de regressão linear mais adequada para os cinco pontos plotados. Deve-se observar uma relação linear e a análise estatística deve mostrar um valor de R2 ≥ 0,98.
- Repita o passo 3.4.1 para os analógicos 16 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH.
- Calcule a absortividade molar para 16 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH usando o valor de inclinação extrapolado da curva linear mais adequada.
- Determine o pKa valores de 16 - 25 estudos usando espectrofotometria UV/Vis
- Em uma cuvette de quartzo limpo e seco, transfira 1.900 μL do buffer PBS no nível de pH selecionado (preparado na Etapa 3.2) usando uma micropipette de 100 - 1000 μL.
NOTA: Notamos no armazenamento que um precipitado branco pode se formar em alguns dos buffers. Para garantir que o buffer seja completamente homogêneo e se algum precipitado for visível, use filtragem de gravidade para remover qualquer precipitado imediatamente antes de ser usado. Veja a nota após o passo 3.3.1. - Usando o espectrofotômetro UV/Vis, em branco a solução de buffer PBS selecionada para uma faixa de 200 a 800 nm.
- Em uma segunda cuvette de quartzo limpo e seco, transfira 1.900 μL do buffer PBS selecionado e adicione 100 μL da solução de estoque analógico selecionada usando uma micropipette de 5-50 μL. Coloque uma tampa na cuvette e agite bem, além de inverter a cuvette.
NOTA: Veja a nota anterior após a etapa 3.3.3. - Utilizando o espectrofotômetro UV/Vis, adquira o espectro de absorção para o analógico dipyrrinone para uma faixa de 200 a 800 nm.
- Repetição de passos 3.5.1 - 3.5.4 para 16 - 25 em cada um dos buffers PBS gerados na etapa 3.2.
- Em uma cuvette de quartzo limpo e seco, transfira 1.900 μL do buffer PBS no nível de pH selecionado (preparado na Etapa 3.2) usando uma micropipette de 100 - 1000 μL.
- Determine os valores pKpara 16 - 25 usando uma função de montagem de curva sigmoidal de melhor ajuste.
- Usando um programa de grafagem, gráfico a absorvância medida vs. comprimento de onda (nm) para 16 - 25 nos vários níveis de pH.
- Escolha um comprimento de onda entre 380-415 nm onde em níveis mais baixos de pH (< 7,0) a absorção é pequena (0-0,1 unidades) e em pH maior (> 12,0) a absorção é consideravelmente maior (0,8-1,0 unidades). Plote a absorvência no comprimento de onda escolhido vs. o pH.
- Usando uma função curva sigmoidal, gere uma curva de ajuste melhor para cada um dos análogos 16 - 25. Informe o pH extrapolado na meia altura da curva. Este é o valor relatadopK.
4. Estudos de Aquisição de Rendimentos Quânticos e Fluorescência
- Crie soluções de estoque de estudo de fluorescência para análogos de dipyrrinone 16 - 18 e 20 - 25.
- Utilizando uma solução de estoque analógico dipyrrinone criada na etapa 3.1, realize uma diluição da solução de estoque adicionando 10 μL da solução de estoque a um frasco volumoso de 1 mL usando uma micropipette de 2 - 20 μL e, em seguida, adicione o buffer PBS (pH 7.0) à marca de 1 mL. Coloque uma tampa no frasco volumoso e misture bem invertendo e sacudindo o frasco. Esta solução de estoque diluída será usada para gerar o espectro da fluorescência e será referida como a solução de estoque de fluorescência.
- Repita o passo 4.1.1 para os analógicos 16 - 18 e 20 - 25.
- Adquira espectros de emissão de fluorescência em concentrações variadas, para os análogos 16 - 18 e 20 - 25. Para todos os análogos que não 18,adquira cinco espectros para cada analógico em soluções de pH 7 e 14 em concentrações de: 19,96, 39,84, 59,64, 79,37 e 99,01 nM. Para o analógico 18, adquira cinco espectros em uma solução de pH 7 nas concentrações de: 49,75, 99,01, 147,8, 196,1 e 243,9 nM. Em uma solução de pH 14, adquira cinco espectros para analógico 18 em concentrações de: 99.01, 196.1, 291.3, 384.6, 476,2 nM.
- Em um cuvette de quartzo transparente de quatro lados, adicione 3,00 mL de PBS (pH 7.0) ou 1.0 NaOH usando uma micropipette de 100 -1.000 μL em três incrementos de 1.000 μL.
NOTA: Veja nota após a etapa 3.3.1. - Usando o fluorômetro e o programa de software fluorômetro FluorEssence, adquira um espectro de emissão para a solução selecionada e rotule-a como a solução "em branco".
- Ao mesmo cuvette, adicione 6 μL de solução de estoque de fluorescência para o analógico dipyrrinone selecionado (Parte 4.1) usando uma micropipette de 0,5-10 μL. Coloque a tampa sobre a cuvette e misture bem invertendo e sacudindo suavemente a cuvette.
NOTA: Veja nota após a etapa 3.3.3. - Usando o fluorômetro, adquira um espectro de emissão para a solução composta selecionada usando λmax abs como o comprimento de onda de excitação. A intensidade de excitação foi medida ao longo de uma faixa de 200 nm a partir de 15 nm além do comprimento de onda de excitação (tipicamente uma faixa de 200 nm é necessária para que a intensidade da fluorescência retorne à linha de base).
- Repetição passos 4.2.3 - 4.2.4 até um total de 30 μL de solução de estoque de fluorescência foi adicionado ao cuvette.
- Repetição de passos 4.2.1 - 4.2.5 para análogos 16 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH.
NOTA: As concentrações de cuvette foram alteradas para o analógico 18 e os dados foram adquiridos utilizando-se: 2,0 mL de PBS com cinco incrementos consecutivos de 10 μL de solução de estoque de fluorescência para um neutro (pro 18) solução e 2,0 mL de 1,0 M NaOH com cinco incrementos de 20 μL de solução de estoque composto adicionado para uma solução básica (desprotosada de 18).
- Em um cuvette de quartzo transparente de quatro lados, adicione 3,00 mL de PBS (pH 7.0) ou 1.0 NaOH usando uma micropipette de 100 -1.000 μL em três incrementos de 1.000 μL.
- Determine o rendimento quântico usando o método de Williams, A. T. et al.17
- Usando um programa de software de planilha (ou seja, Microsoft Excel), importe os dados (pontos de dados de intensidade de emissão) para o espectro de emissões para um único analógico dipyrrinone (tomado em PBS [pH 7.0] ou 1,0 M NaOH) nos vários níveis de concentração.
- Importar os pontos de dados dos espectros de emissões para a solução "em branco" (etapas 4.2.1 - 4.2.2) e subtrair os pontos de dados de intensidade de emissão "em branco" dos pontos de dados de intensidade de emissão, nos comprimentos de onda correspondentes, adquiridos em vários níveis de concentração.
- Transfira os pontos de dados de intensidade de emissão corrigidos "em branco" para um programa de grafia, como o GraphPad Prism 7, e a emissão de gráficos vs. comprimento de onda. Calcule a área sob a curva para cada uma das curvas obtidas nos vários níveis de concentração do analógico dipyrrinone.
- Seguindo a técnica delineada por Williams, A. T. et al, calcule um valor de absorção extrapolado para cada um dos diferentes níveis de concentração do analógico dipirorinone. Isso é feito multiplicando o valor calculado de absortividade molar (da análise de regressão linear mais adequada, ver o passo 3.4) por cada concentração de dipyrrinono analógico utilizado nas etapas 4.2.3-4.2.5.
- Usando um programa de grafagem como o GraphPad Prism 7, crie um gráfico da absorvância extrapolada (x-eixo) do analógico contra a área calculada sob cada curva de concentração (passo 4.3.4) para o comprimento de onda de emissão correspondente ao maior valor de emissão. Deve-se observar uma relação linear com r2 ≥ 0,96.
- Realizar etapas análogas a 3.1-3.4 e 4.1-4.3.5 para quinina em 0,5 M H2SO4 (ΦF = 0,55)18 e anticraceno no etanol (ΦF = 0,27)18,19 para obter dados para as normas.
- Obtenha os valores de rendimento quântico para 16 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH usando as encostas extrapoladas obtidas das etapas 4.3.5 e 4.3.6 na seguinte equação:
Φx =Φst(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
onde Φst representa o rendimento quântico do padrão, Φx representa o rendimento quântico do desconhecido, Grad é a inclinação do melhor ajuste linear, e η é o índice refrativo do solvente utilizado (a razão de índice de refração foi calculada usando η = 1,36 para etanol e η = 1,35 para 0,5 M H2SO4). - Reporte os rendimentos quânticos para 16 - 18 e 20 - 25 em PBS (pH 7.0) e 1,0 M NaOH como uma média do Φx obtido para quinina e anticraceno.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A reação de condensação de Claisen-Schmidt proporcionou acesso a análogos de dipiranos(16-25, Figura 4) utilizando o procedimento de um pote descrito na seção de protocolo (ver etapa 1). Os análogos 16-25 foram todos gerados por pirólinona condensadora 9, bromoisoindolone 10, ou isoindolone 11 com 1H-imidazol-2-carboxaldeído(12), 1H-imidazol-5-carboxaldeído(13),1H-pirazole-3-carboxaldeído(14), ou 1H-pirazole-4-carboxaldeído(15); as combinações produziram dez análogos diferentes, incluindo um composto de controle, 19, que é incapaz de formar ligações de hidrogênio intramolecular(Tabela 1). Os tempos de reação normalmente necessitavam de 24h de refluxo para conclusão, porém, no caso de 20 apenas 6h eram necessários, enquanto, para 23 e 24 tempos ligeiramente mais longos de 30h e 27 h, respectivamente, eram necessários. Os rendimentos dos produtos variaram de 41% a 96%, conforme ilustrado na Tabela 1, que segue tendências tradicionais de reações análogas de condensação para dipyrrinones. Os compostos 17, 18, 20-22,24 e 25, devido à sua natureza altamente cristalina, foram todos purificados por métodos simples de filtragem de vácuo; apenas os compostos 16, 19e 23 necessários cromatografia para purificação.
As propriedades fotofísicas dos compostos 16-25, obtidas a partir da realização das etapas 3 - 4 na seção de protocolo, são resumidas na Tabela 2. Osvalores medidos por cada composto variaram de 12 a > 13,5, sugerindo que condições suficientemente básicas são necessárias para desprotorar completamente cada análogo dipirana. Devido a diferentes propriedades fotofísicas nos estados protonsados e desprotosados de cada composto, foram adquiridos espectros utilizando soluções neutras (pH 7.0 PBS) e básicas (1,0 M NaOH) de 16a25. Em pH neutro (estado protoado), os compostos 16-25 têm abdominaismáximos λ variando de 324 nm a 365 nm, que são todos de 10 a 37 nm em comparação com os estados desprotosados. As absorções molares variam de 15.000 a 30.000, mas não parecem desviar substancialmente entre os estados protoados e desprotosados de um determinado analógico. O analógico 19 não apresentou fluorescência detectável, porém, 16-18 e 20-25 luz emitida com λmax em variando de 409 a 457 nm em pH neutro e 443 - 482 nm no pH básico; uma tendência de mudança vermelha semelhante à dos comprimentos de onda de absorção protonado/desprotosados é observada para os comprimentos de onda de emissão também. O ΦF variou de 0,01 a 0,30 em soluções aquosas neutras e básicas, que são consideravelmente inferiores aos xanthoglows comparáveis, mas os compostos 16, 20e 25 caem na região semelhante de fluoroforos fortemente utilizados, como rhodamina B (ΦF = 0,23),20 laranja acridina (ΦF = 0.36),21 pironina Y (ΦF = 0,22),20 e a maioria da série de corante de cianina (tipicamente ΦF = 0,12-0,28). 22
Os análogos de dipyrrinone 16-25 foram todos quimicamente caracterizados por meio da análise de ponto de fusão, espectroscopia de IR, espectroscopia de 1H E 13C NMR, e espectrometria de massa de alta resolução, além dos experimentos de espectroscopia de UV/Vis e fluorescência resumidos na Tabela 2. A caracterização química e os espectros originais de 1H NMR e 13C NMR podem ser encontrados a partir da fonte original da literatura,12 no entanto, por conveniência, caracterização para compostos 16, 20e 23, que possuem os maiores rendimentos quânticos são relatados abaixo:
(Z)-5-(1H-imidazol-2-yl)-3-ethyl-4-metil-1,5-dihydro-2H-pyrrol-2-one (16). Decompõe-se a 160 °C; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,3 (brs, 1H), 9,87 (s, 1H), 7,13 (apps, 2H), 5,93 (s, 1H), 2,23 (q, J = 7,5 Hz, 2H), 2,00 (s, 3H), 0,98 (t, J = 7,5 Hz, 3H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,7, 144,8, 140,0, 139,6, 133,9, 130,2, 117,6, 94,1, 16,7, 13,6, 9,33; IR (filme fino) 3742, 3148, 3063, 2924, 2353, 1651, 1543, 1450, 771, 717 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd para C11H13N3ONa 226.0956, Encontrado 226.0956.
(Z)-5-(1H-pyrazol-4-yl)-3-ethyl-4-metil-1,5-dihydro-2H-pyrrol-2-one (19). Decompondo-se a 202 °C; 1 H NMR (400 MHz, 20% CD3OD em CDCl3) δ 1H NMR (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 7,74 (s, 2H), 6,01 (s, 1H), 2,27 (q, J = 7,4 Hz, 2H), 2,02 (s, 3H), 1,02 (t, J = 7,4 Hz, 3H); 13 C{1H} NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173,7, 141,9, 136,0, 133,0, 116,1, 105,0, 100,8, 16,9, 13,4, 9,61; IR (filme fino) 3163, 3117, 3048, 2963, 2362, 1674, 1558, 1512, 1396, 1257, 1157, 948, 871, 794, 702 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd para C11H13N3ONa 226.0956, Encontrado 226.0955.
(Z)-3-(1H-imidazol-2-yl)metileno)-5-bromoisoindolin1-um (20). Decompondo-se a 213 °C; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,97 (s, 1H), 7,59 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,48 (d, J = 8,0, 1H), 7,06 (s, 2H), 6,57 (s, 1H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,7, 146,6, 140,2, 134,5, 131,7, 129,1, 125,8, 125,03, 124,99, 123,6, 96,5; IR (filme fino) 3742, 3240, 2314, 1682, 1543, 1520, 1435, 1312, 1080, 826, 694 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd para C12H8BrN3ONa 311,9749, Encontrado 311,9752.
(Z)-3-(1H-imidazol-2-yl)metileno)isoindolina-1-1 (23). Decompondo-se a 228 °C; 1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,34 (s, 1H), 10,74 (s, 1H), 7,90 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,74 (d, J = 7,6 Hz, 1S), 7,63 (dd, J = 7,6, 7,2 Hz, 1H), 7,50 (dd, J = 7,6, 7,3 Hz, 1H), 7,17 (s, 2H), 6,46 (s, 1H); 13 C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,3, 144,9, 137,3, 135,1, 132,8, 129,9, 129,3, 123,6, 121,0, 117,6, 92,9; IR (filme fino) 3741, 3201, 3086, 2361, 2322, 1682, 1543, 1520, 1119, 748, 687 cm-1; HRMS (ESI-TOF) m/z: [M+Na]+ Calcd para C12H9N3ONa 234.0643, Encontrado 234.0641.
| entrada | Pirrolinona/Isoindolone | aldeído | Rendimento (%)b | Tempo (h) | produto |
| 1 | 9 | 12 | 80 | 24 | 16 |
| 2 | 9 | 13 | 41 | 24 | 17 |
| 3 | 9 | 14 | 79 | 24 | 18 |
| 4 | 9 | 15 | 61 | 24 | 19 |
| 5 | 10 | 12 | 96 | 6 | 20 |
| 6 | 10 | 13 | 70 | 24 | 21 |
| 7 | 10 | 14 | 66 | 24 | 22 |
| 8 | 11 | 12 | 49 | 30 | 23 |
| 9 | 11 | 13 | 49 | 27 | 24 |
| 10 | 11 | 14 | 94 | 24 | 25 |
Mesa 1. Condições e rendimentos de reação para a síntese de 16-25a
uma reações realizadas em uma escala de 1 mmol em 5 mL de EtOH. b Rendimento isolado.
| composto | Abs. λmax (nm) | ε (M-1 cm-1) | fluorita. λmax (nm) | Φb | pKum |
| 16 | 351 (384) | 24500 (22800) | 451 (482) | 0.30 (0.30) | 12.7 |
| 17 | 338 (380) | 18600 (18600) | 442 (462) | 0.01 (0.03) | 12.8 |
| 18 | 324 (349) | 29800 (25700) | 455 (465) | 0.01 (0.02) | 13 |
| 19 | 326 (358) | 29900 (21300) | –um | –um | 12.9 |
| 20 | 365 (378) | 15000 (15500) | 457 (475) | 0.22 (0.20) | 12.5 |
| 21 | 355 (380) | 15100 (16800) | 409 (443) | 0.03 (0.01) | 12.9 |
| 22 | 341 (363) | 19800 (23100) | 427 (452) | 0.02 (0.01) | >13,5 |
| 23 | 360 (373) | 29000 (21300) | 449 (474) | 0.25 (0.26) | 12 |
| 24 | 351 (373) | 17200 (19400) | 432 (454) | 0.07 (0.05) | 12.8 |
| 25 | 340 (357) | 20200 (23500) | 410 (449) | 0.02 (0.02) | >13,5 |
Mesa 2. Propriedades fotofísicas e valores pKa de 6-14 e 22 em tampão pH 7.0 PBS e 1 M NaOH (dado entre parênteses).
uma Fluorescência não foi detectável por 19. b Quinina (Q = 0,55)15 e Anticraceno (Q = 0,27)15,16 foram utilizadas como padrões.
Figura 1: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A abordagem de condensação claisen-Schmidt fornece um meio bastante robusto de gerar pirazole, imidazol e fluorophores de dipyrrinone isoindolone através de um protocolo relativamente simplista operacionalmente. Embora a síntese dos análogos fluorescentes dipyrrinone tenha sido o foco deste estudo, deve-se notar que condições semelhantes podem ser aplicadas para acessar outros sistemas de anéis ligados à methine bicicíclica, como dipyrrinones23,24,25 e adutos de piróle-furano2 26, bem como adutos 3H-pyrazol-3-um-furano27, adutos de pirrole isoindolone28, e 2H-Indol-2-uma-pirindina adutos29 que mantêm a promessa como potenciais fármacos. Em geral, o procedimento descrito fornece produtos de reação em rendimentos moderados a altos, no entanto, é importante notar que o monitoramento contínuo do progresso da reação é essencial para resultados bem-sucedidos. Em alguns de nossos ensaios preliminares, verificou-se que o aquecimento para tempos de reação excessiva, bem além (5 - 24 h) da conclusão da reação, levou a produtos de decomposição que podem complicar as etapas subsequentes de purificação. Por essa razão, é altamente recomendável que a análise TLC seja realizada às 1h, 3h, 6h, 12h e 24h para monitorar o progresso da reação e ter uma noção da taxa de reação, bem como a taxa de decomposição do produto.
Os análogos dipirorinono 16-25, no estado protonado/neutro, possuem uma gama de propriedades de solubilidade em solventes orgânicos comumente usados que podem ser problemáticos ao estudar propriedades fotofísicas, biológicas e analíticas. Em geral, 16-25 tinham solubilidade variada na água, solventes de álcool (metanol/etanol), e CH2Cl2, mas todos tinham boa solubilidade em solventes apóticos altamente polares, como DMF, DMSO e acetonitrilo. Consequentemente, todas as soluções de estoque para UV/Vis (Etapa 3.1 de protocolo) e estudos de fluorescência (Etapa 4.1 do protocolo) e a maioria dos estudos de RMN foram realizados utilizando DMSO ou DMSO-d6. Embora a maioria dos compostos exigisse aquecimento suave (usando uma pistola de calor) para solubilizar completamente no DMSO, uma vez dissolvido, 16-25 parecem permanecer solúveis e podem até mesmo ser diluídos em soluções aquosas sem precipitar. Devido à natureza altamente polar do estado iônico, os análogos 16-25 em solução básica são altamente solúveis em água, mas têm pouca solubilidade em solventes orgânicos.
Embora a reação de condensação de Claisen-Schmidt forneça acesso a uma gama de compostos aromáticos bicíclicos ligados à methine, além dos análogos dipirorinonos descritos dentro, as condições de reação podem limitar os tipos de moléculas produzidas através deste método. Como requisito fundamental da reação, tanto um nucleófilo enolizável (como uma pirrolinona ou isoindolone) quanto um eletrofiloto aldeído não enolizável devem reagir para permitir a condensação. O não cumprimento desse requisito básico pode resultar na incapacidade de vincular os sistemas de anéis e/ou a geração de produtos paralelos concorrentes. Além disso, condições consideravelmente básicas são utilizadas para a geração do nucleófilo enolate, que pode criar incompatibilidades com grupos funcionais (ou seja, ésteres, nitridas, halides, etc.) que são suscetíveis a reações com hidróxido. Nesses casos, é possível substituir hidróxido por bases nitrogenadas ou carbonato, como foi realizado com 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU)30, trietilamina31, piperidina32, base de Hünig33, e Na2CO334. Para realizar uma reação análoga, optamos por usar hidróxido de sódio simplesmente devido à sua disponibilidade e despesa relativa. Embora essas restrições possam exigir modificações no procedimento para acessar compostos específicos ou impedir o acesso a outros completamente, o método descrito no protocolo pode fornecer um meio de acoplamento de anéis aromáticos para numerosos sistemas através de uma reação de passo único processualmente simples e econômica. No caso dos análogos dipyrrinone 16-25, a condensação claisen-schmidt permitiu uma das rotas mais acessíveis para fluoroforos dependentes de pH descritos até hoje.
A reação de condensação de Claisen-Schmidt tem o potencial de servir como uma reação chave para a criação de uma gama de diferentes sistemas fluoróforos ciclistas e tricíclicos. Embora essa reação tenha sido fundamental para o desenvolvimento de 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pyrimidin-3-ones(1),xanthoglows(2),pirroloindo Análogos de dizânion(3, Figura 1),e mais recentemente análogos de dipirorinono 16-25, é possível gerar uma gama de sistemas fluorescentes completamente novos através da combinação da condensação claisen-Schmidt com desenhos moleculares para restringir processos fotoisomeóricos. Mais específico para o estudo em questão, os projetos futuros de análogos dipyrrinone provavelmente serão desenvolvidos usando este procedimento delineado, a fim de gerar compostos fluorescentes com maior capacidade de ligação de hidrogênio intramolecular evalores mais baixos de pK a. Prevemos que essas sondas dependentes de pH aprimoradas possuam maiores rendimentos quânticos, permitindo a visualização de flutuações de pH para uma gama mais ampla de eventos intracelulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Z.R.W. e N.B. agradecem ao NIH (2P20 GM103440-14A1) por seu generoso financiamento, bem como Jungjae Koh e a Universidade de Nevada, Las Vegas por sua ajuda na aquisição de 1H e 13C NMR. Além disso, gostaríamos de agradecer aos alunos de mídia visual da NSC, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs e Alistair Cooper por sua ajuda nos processos de filmagem e animação dentro das partes cinematográficas deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-ethyl-4-methyl-3-pyrrolin-2-one | Combi-Blocks | [766-36-9] | Yellow solid reagent |
| isoindolin-1-one | ArkPharm | [480-91-1] | Off-white solid reagent |
| 5-bromoisoindolin-1-one | Combi-Blocks | [552330-86-6] | Pink solid reagent |
| 2-formylimidazole | Combi-Blocks | [10111-08-7 ] | Off-white solid reagent |
| Imidazole-4-carbaldehyde | ArkPharm | [3034-50-2] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-4-carbaldehyde | Oakwood Chemicals | [35344-95-7] | Solid reagent |
| 1-H-pyrazole-5-carbaldehyde | Matrix Scientific | [3920-50-1] | Solid reagent |
| Solid KOH Pellets | BeanTown Chemicals | [1310-58-3] | White solid pellets |
| Siliflash Silica Gel | Scilicycle | R12030B | Fine white powder |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (x10) | Growcells | MRGF-6235 | Colorless translucent liquid |
| Beckman Coulter DU-800 UV/Vis Spectrophotometer and Software | Beckman Coulter | N/A | Spectroscopy Instrument and Software |
| Fluoromax-4 Spectrofluorometer | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Instrument |
| FluorEssence Fluoremetry Software V3.5 | Horiba Scientific | N/A | Spectroscopy Software |
| Finnpipette II Micropipette (sizes: 100-1,000, 20-200, and 0.5-10 µL) | Fischerbrand | N/A | Equipment |
| Wilmad-LabGlass Rotary Evaporator (Model: WG-EV311-V-PLUS) | SP Scienceware | N/A | Equipment |
| DuoSeal Vacuum Pump (Model Number: 1405) | Welch | N/A | Equipment |
| GraphPad Prism 4 | GraphPad | N/A | Data Analysis Software |
| SympHony pH Meter (Model: Sb70P) | VWR | N/A | Equipment |
References
- Abbandonato, G., et al. Cis-trans photoisomerization properties of GFP chromophore analogs. European Biophysics Journal. 40 (11), 1205-1214 (2011).
- Funakoshi, H., et al. Spectroscopic studies on merocyanine photoisomers. IV. Catalytic isomerization of photoisomers of merocyanine derivatives in protic solvents. Nippon Kagaku Kaishi. (9), 1516-1522 (1989).
- Puzicha, G., Shrout, D. P., Lightner, D. A. Synthesis and properties of homomologated and contracted dipyrrinone analogs of xanthobilirubic acid. Journal of Heterocyclic Chemistry. 27 (7), 2117-2123 (1990).
- Bonnett, R., Hamzetash, D., Asuncion Valles, M. Propentdyopents [5-(2-oxo-2H-pyrrol-5-ylmethylene)pyrrol-2(5H)-ones] and related compounds. Part 2. The Z E photoisomerization of pyrromethenone systems. Journal of the Chemical Society, Perkins Transactions. 1 (6), 1383-1388 (1987).
- Tikhomirova, K., Anisimov, A., Khoroshutin, A. Biscyclohexane-Annulated Diethyl Dipyrrindicarboxylates: Observation of a Dipyrrin Form with Absent Visible Absorption. European Journal of Organic Chemistry. 2012 (11), 2201-2207 (2012).
- Brower, J. O., Lightner, D. A. Synthesis and spectroscopic properties of a new class of strongly fluorescent dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 67 (8), 2713-2716 (2002).
- Woydziak, Z. R., Boiadjiev, S. E., Norona, W. S., McDonagh, A. F., Lightner, D. A. Synthesis and Hepatic Transport of Strongly Fluorescent Cholephilic Dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 70 (21), 8417-8423 (2005).
- Jarvis, T., et al. Pyrrole β-amides: Synthesis and characterization of a dipyrrinone carboxylic acid and an N-Confused fluorescent dipyrrinone. Tetrahedron. 74 (14), 1698-1704 (2018).
- Bodio, E., Denat, F., Goze, C. BODIPYS and aza-BODIPY derivatives as promising fluorophores for in vivo molecular imaging and theranostic applications. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 23, 1159-1183 (2019).
- Acharya, A., et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing. Chemical Reviews. 117 (2), 758-795 (2017).
- Romei, M. G., Lin, C. -Y., Mathews, I. I., Boxer, S. G. Electrostatic control of photoisomerization pathways in proteins. Science. 367 (6473), 76-79 (2020).
- Benson, N., Suleiman, O., Odoh, S. O., Woydziak, Z. Ryrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Analogues: pH-Dependent Fluorophores That Red-Shift Emission Frequencies in a Basic Solution. Journal of Organic Chemistry. 84 (18), 11856-11862 (2019).
- Xie, P., Gao, G., Liu, J., Jin, Q., Yang, G. A New Turn on Fluorescent Probe for Selective Detection of Cysteine/Homocysteine. Journal of Fluorescence. 25 (5), 1315-1321 (2015).
- Alty, I. G., et al. Intramolecular Hydrogen-Bonding Effects on the Fluorescence of PRODAN Derivatives. Journal of Physical Chemistry A. 120 (20), 3518-3523 (2016).
- Yang, Y., Li, D., Li, C., Liu, Y. F., Jiang, K. Hydrogen bond strengthening induces fluorescence quenching of PRODAN derivative by turning on twisted intramolecular charge transfer. Spectrochimica Acta, Part A. 187, 68-74 (2017).
- Zhang, L., Liu, J., Gao, J., Zhang, F., Ding, L. High solid fluorescence of a pyrazoline derivative through hydrogen bonding. Molecules. 22 (8), 1 (2017).
- Williams, A. T. R., Winfield, S. A., Miller, J. N. Relative fluorescence quantum yields using a computer-controlled luminescence spectrometer. Analyst. 108 (1290), 1067-1071 (1983).
- Eaton, D. F. Reference materials for fluorescence measurement. Pure and Applied Chemistry. 60 (7), 1107-1114 (1988).
- Dawson, W. R., Windsor, M. W.
- Zhang, X. -F., Zhang, J., Lu, X. The Fluorescence Properties of Three Rhodamine Dye Analogues: Acridine Red, Pyronin Y and Pyronin B. Journal of Fluorescence. 25 (4), 1151-1158 (2015).
- Zanker, V., Rammensee, H., Haibach, T. Measurements of the relative quantum yields of the fluorescence of acridine and fluorescein dyes. Zeitschrift für Angewandte Physik. 10, 357-361 (1958).
- Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., Waggoner, A. S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry. 4 (2), 105-111 (1993).
- Battersby, A. R., Dutton, C. J., Fookes, C. J. R. Synthetic studies relevant to biosynthetic research on vitamin B12. Part 7. Synthesis of (±)-bonellin dimethyl ester. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1 (6), 1569-1576 (1988).
- Pfeiffer, W. P., Lightner, D. A.
- Huggins, M. T., Musto, C., Munro, L., Catalano, V. J. Molecular recognition studies with a simple dipyrrinone. Tetrahedron. 63 (52), 12994-12999 (2007).
- Groselj, U., et al. Synthesis of Spiro-δ2-Pyrrolin-4-One Pseudo Enantiomers via an Organocatalyzed Sulfa-Michael/Aldol Domino Sequence. Advanced Synthesis & Catalyst. 361 (22), 5118-5126 (2019).
- El-Shwiniy, W. H., Shehab, W. S., Mohamed, S. F., Ibrahium, H. G. Synthesis and cytotoxic evaluation of some substituted pyrazole zirconium(IV) complexes and their biological assay. Applied Organometallic Chemistry. 32 (10), (2018).
- Murray, L., O'Farrell, A. -M., Abrams, T. Preparation of indolinone compounds for treatment of excessive osteolysis. US Patent. , US20040209937A1 (2004).
- Lozinskaya, N. A., et al. Synthesis and biological evaluation of 3-substituted 2-oxindole derivatives as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 27 (9), 1804-1817 (2019).
- Montforts, F. P., Schwartz, U. M.
- Uddin, M. I., Thirumalairajan, S., Crawford, S. M., Cameron, T. S., Thompson, A. Improved synthetic route to C-ring ester-functionalized prodigiosenes. Synlett. (17), 2561-2564 (2010).
- Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, stereochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron. 57 (37), 7813-7827 (2001).
- Clift, M. D., Thomson, R. J. Development of a Merged Conjugate Addition/Oxidative Coupling Sequence. Application to the Enantioselective Total Synthesis of Metacycloprodigiosin and Prodigiosin R1. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14579-14583 (2009).
- Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Synthesis of a New Lipophilic Bilirubin. Conformation, Transhepatic Transport and Glucuronidation. Tetrahedron. 56 (40), 7869-7883 (2000).
