Summary
低酸素症は腫瘍微小環境の特徴であり、癌の進行において重要な役割を果たしている。この記事では、低酸素関連の癌関連病理を再現するための3D細胞印刷技術に基づく低酸素癌オンチップの製造プロセスについて説明する。
Abstract
がん微小環境は、疾患の進行に大きな影響を与えます。特に、低酸素症は癌の生存、浸潤、および化学抵抗の主要な原動力である。低酸素関連癌病理を研究するためにいくつかのin vitroモデルが開発されているが、生体内で観察された癌微小環境の複雑な相互作用は、正確な空間制御の欠如のためにまだ再現されていない。その代わりに、がん生態学のより良いエミュレーションと正確な抗癌治療評価のための微小生理学的システムを作成するための3Dバイオファブリケーションアプローチが提案されている。ここでは、低酸素癌オンチップを作製する3D細胞印刷アプローチを提案する。チップ中の低酸素誘導成分は、酸素分布のコンピュータシミュレーションに基づいて決定した。癌-ストロマ同心円環は、神経膠芽腫細胞および内皮細胞を含むバイオインクを用いて、固体癌の一種を再現するために印刷された。得られたチップは、代表的な病態生理学的マーカーの形成を伴う癌における中央低酸素および悪化した悪性腫瘍を実現した。全体として、固形がん模倣微小生理学的システムを作るための提案されたアプローチは、がん研究のためのin vivoモデルとin vitroモデルの間のギャップを埋めることが期待される。
Introduction
がんの微小環境は、がんの進行を促進する重要な要因です。生化学的、生物物理学的、細胞の手掛かりを含む複数の成分が、癌の病理学的特徴を決定する。これらの中でも、低酸素症は、がんの生存、増殖、および浸潤1と強く関連している。がん細胞の増殖と分裂が無限に生じるため、栄養素と酸素が継続的に枯渇し、低酸素勾配が生成されます。低酸素条件下では、細胞は低酸素転写因子(HIF)関連分子カスケードを活性化します。このプロセスは壊死性コアを誘導し、代謝変化を引き起こし、血管過形成および転移を2,3に開始する。その後、がん細胞の低酸素症が隣接する正常組織の破壊を引き起こす。さらに、低酸素症は、多因子的な様式における固形腫瘍の治療抵抗性と強く関連している。低酸素症は、放射線感受性が活性酸素種1,4のために制限される放射線療法を著しく妨げる可能性がある。また、癌微小環境のpHレベルを低下させると、薬物蓄積が減少する1.したがって、インビトロでの低酸素症に関連する病理学的特徴を再現することは、科学的および前臨床所見のための有望な戦略である。
がんの特定の微小環境をモデル化することは、がんの発症を理解し、適切な治療法を探求するために不可欠です。動物モデルは、その強い生理学的関連性のために広く使用されてきたが、種の違いや倫理的問題に関連する問題は5.さらに、従来の2Dおよび3Dモデルは、がん細胞の操作とリアルタイムイメージングを可能にして詳細な分析を行うことができますが、その構造と細胞の複雑さは完全に再現できません。例えば、スフェロイド中の癌細胞凝集がコアに自然に低酸素症を発生させることができるので、癌スフェロイドモデルは広く使用されている。さらに、多数の均一なサイズのセルラースフェロイドは、プラスチックまたはシリコーンベースのマルチウェルシステム6,7を使用して製造されている。しかし、従来のプラットフォームで癌組織の正確な不均一構造を捕捉することに関しては柔軟性が低く、がん研究を改善するための高度なバイオ模倣プラットフォームを構築するための高度なバイオファブリケーション技術の確立が必要とされている8。
3D微小生理学的システム(MPS)は、癌細胞の複雑な幾何学的および病理学的進行を再現するための有用なツールである9.癌細胞は、成長因子およびケモカインの生化学的勾配を感知し、機械的不均一性をシステム上で再現するので、がんの開発の重要な特徴をインビトロで調べることができる。例えば、癌の生存率、転移性悪性度、および様々な酸素濃度に応じて薬剤耐性がMPS10、11を用いて検討されている。最近の進歩にもかかわらず、in vitroモデルの低酸素状態を発生させることは、物理的なガスポンプとの接続を含む複雑な製造手順に依存しています。そのため、がん特有の微小環境を構築するための簡便で柔軟な方法が必要です。
3D細胞印刷技術は、生体材料の空間的配置を正確に制御して、ネイティブの生物学的アーキテクチャ12を再現するため、かなりの注目を集めています。特に、がん微小環境の空間的特徴を構築するための高い制御性と実現可能性により、3D低酸素モデルの既存の限界を克服しています。3Dプリンティングは、レイヤごとのプロセスを通じてコンピュータ支援製造を容易にし、それによって、実際の組織アーキテクチャを模倣する複雑な形状の迅速で正確で再現可能な構造を提供します。3D MPSに対する既存の製造戦略の利点に加えて、癌進行の病態生理学的特徴は、生化学的、細胞、および生物物理学的成分13、14をパターニングすることによって再現することができる。
ここで、固体癌の不均質性を再現するための低酸素癌オンチップの3D細胞印刷戦略を提示する(図1)15。製造パラメータは、システム中枢低酸素形成の計算シミュレーションを介して決定した。がん-ストロマ同心円環は、神経膠芽腫細胞および内皮細胞を含むコラーゲンバイオインクスを用いて、固体癌の一種である神経膠芽腫の病態生理をエミュレートするために印刷された。放射状酸素勾配の形成は癌悪性腫瘍を悪化させた、強化された攻撃性を示す。さらに、患者固有の前臨床モデルへのチップの適用に関する将来の展望を示す。固形がん・模倣微小生理学的システムを作るための提案されたアプローチは、生体内およびインビトロの癌モデルとの間のギャップを埋めることが期待される。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 酸素勾配形成のコンピュータシミュレーション
-
低酸素癌オンチップ印刷のための3D幾何学モデルの生成
- 3D CAD ソフトウェアを実行します。
- 低酸素癌オンチップの幾何学モデルをスケッチします。 [スケッチ] をクリックし、希望の平面を選択してジオメトリを描画します。各部品の詳細尺度については、図面(図2A)を参照してください。
- フィーチャー-突起ボス/ベースをクリックしてジオメトリの厚さを設定します。空のボックスに希望の厚さを入力し(図2Aを参照)、緑色のチェックアイコンを選択して3Dジオメトリを形成します。
注:がんオンチップの寸法は、所望のメディアおよびヒドロゲルの量に基づいて定義されます。本実験では、押出ベースのバイオプリンターの分解能に関するこれまでの実用経験に基づき、それぞれ約1,500μLとヒドロゲルの所望の体積が約1,500μLであった。 - ジオメトリ ファイルを 3D CAD ファイル形式 (.prt または .stl) として保存します。
-
低酸素コア誘導のための細胞密度の測定
- 物理拡散シミュレーションプログラムを実行します。
- ライブリンクをクリックし、使用するCADプログラムを選択します。[同期]をクリックして、シミュレーションプログラム上の低酸素がんオンチップのジオメトリをインポートします。チャンバーの内部空間は実際の実験環境で培養培地で満たされるように、酸素はチャンバーの内部空間と細胞構造全体に拡散し、細胞を含むヒドロゲルで構成されます。
注:物理的なパラメータ15の詳細については、前のスタディを参照してください。 - インポートした 3D ジオメトリを、酸素が拡散し、セルが酸素を消費する空間の制御ボリュームとして定義します (図 2B)。
- ユーザガイドおよび以前に確立された方法16,17に従って、ガス拡散解析のためのコンピュータ解析を実行する。
- コンピュータ解析結果から、ユーザーガイドの後の各時点で、推定酸素濃度データを断面A-A'上にエクスポートします。この統治方程式は、Eq. (1) (図 2C) で示されているように、Fick の最初の法則に基づいています。
ここで、cは酸素拡散係数、N細胞は細胞の密度、
酸素の最大アップテイク率、Kmはミカニス・メンテン定数です。定数は、前の文書15で説明したように適用されました。
注:各時間は、時間の経過に応じて酸素拡散の変化を観察するためのステップポイントを意味します。 - 最小酸素レベルが低酸素症の閾値に達しているかどうかを評価し、細胞密度の増分または減少でコンピュータ分析プロセスを繰り返します。
注: ハイドロゲル領域の酸素レベル 80% が 24 時間後に 0.02 mM 未満の場合は、低酸素勾配がコンストラクトに形成されることを定義します。 - ステップ1.2.5のFickの最初の法則から中央領域の低酸素症を誘導する酸素勾配を生成するために必要な細胞の数を確認し、ステップ1.2.6からのシミュレーション結果を確認します。
注: このプロトコルでは、セル番号は 2 × 106セル/各構成体でした。
酸素の最大アップテイク率、Kmはミカニス・メンテン定数です。定数は、前の文書15で説明したように適用されました。2. がん細胞と間質細胞の細胞培養
-
生理的ストレスを避ける細胞培養培地の調製
- U-87 MG細胞(不死化ヒト神経膠芽腫細胞株)の場合、10%のウシ胎児血清を含む高グルコースダルベッコの改変イーグル培地の12mLを置き、 37°CのT-75細胞培養フラスコに100μg/mLストレプトマイシンを100μg/mLレンサプマイシン、30分間5%CO2 加湿インキュベーターで30分間加湿し、培地の細胞への熱及びアルカリ性の影響を最小限に抑えた。
注:神経膠芽腫は、低酸素環境で攻撃的な特性を有するため、固形癌の一種として選ばれました。他の様々なタイプの癌をこのモデルに適用することができる。 - ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の場合、内皮細胞増殖培地12mLをT-75細胞培養フラスコに37°Cで30分間加湿した 培養器に入れる。
注:HUVECは、最も代表的な内皮細胞株の1つであるために選ばれました。このモデルには様々な種類の間質細胞を適用することもできます。
- U-87 MG細胞(不死化ヒト神経膠芽腫細胞株)の場合、10%のウシ胎児血清を含む高グルコースダルベッコの改変イーグル培地の12mLを置き、 37°CのT-75細胞培養フラスコに100μg/mLストレプトマイシンを100μg/mLレンサプマイシン、30分間5%CO2 加湿インキュベーターで30分間加湿し、培地の細胞への熱及びアルカリ性の影響を最小限に抑えた。
-
凍結保存癌細胞及び間質細胞の急速な解凍とその維持
- 液体窒素容器から5 x 105 U-87 MG細胞とHUVECを含む凍結を層流キャビネットに移動します。キャップをすぐに緩めて締め直して、内部圧力を解放します。
- 凍結保存された細胞を水浴中の37°Cに2分間静かに置き、キャップを水から締め出します。汚染を防ぐために、ラミナー流下で70%エタノールでバイアルをリンスします。
- 解凍した細胞をステップ2.1に記載された調製された細胞培養培地を含むフラスコに移し、細胞回収のために細胞含有フラスコを37°Cの5%CO2 加湿インキュベーターに入れる。
- 2日ごとに細胞培養培地をリフレッシュし、細胞増殖を維持します。
- 24時間の解凍後、細胞凍結に用いたジメチルスルホキシド(DMSO)の細胞毒性を回避するために細胞培養培地を交換する。6節未満を経たHUVECを使用してください。
3. コラーゲンプレゲル溶液の調製
-
コラーゲンスポンジの可溶化 0.1 N塩酸 (HCl)
- 0.1 N HClの溶液を準備し、0.2 μmのシリンジフィルターでフィルターします。
- 3 mLの1%(w/v)中和コラーゲンプレゲル溶液の場合、コラーゲンスポンジを5 x 5 mm2 にカットし、30 mgの重量を量る準備をします。
- 切ったコラーゲン片を無菌10mLガラスバイアルに移します。
注:コラーゲン溶液の粘着性特性によるヒドロゲルの損失を考慮して、必要なコラーゲンヒドロゲルの1.5倍の量を調製してください。 - コラーゲン含有ガラスバイアルに0.1 N HClの2.4 mLを加え、15rpmと4°Cでロッカーに3日間インキュベートします。
注:0.1 N HCl溶液の体積は、必要なコラーゲンヒドロゲルの最終体積の5分の4であった。この場合、3mLのコラーゲンを調製した。 - 消化後、40μmの細胞ストレーナーを用いて未消化のコラーゲン粒子をふるいにかける。酸性コラーゲン溶液を4°Cで保存し、7日以内に使用してください。
-
1%中和コラーゲンプレゲル溶液のpH調整
- 酸性コラーゲン溶液を1224xgで5分間4°Cで遠心分離する。
- pHインジケータとして30μLのフェノールレッド溶液を、最終濃度1%(v/v)に加え、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーをコラーゲンプレゲル溶液中の最終濃度10%(v/v)に加えます。
- pHを1 N水酸化ナトリウム(NaOH)で7に中和し、色の変化を検証する。
注:式に基づいて、モルH+ = モルリティH+ xボリュームH+ = モルOH-= モルOH - xボリュームOH- NaOHの240 μLを追加します。 - 蒸留水を加え、3mLの総体積を得る。
- pH調整後、1%(w/v)中和コラーゲンプレゲル溶液を4°Cで保存し、3日以内に使用します。
注:中和コラーゲンプレゲル溶液のゲル化を事前に確認するには、プラス変位ピペットを使用して小皿に50μLのコラーゲン液滴を作り、37°Cインキュベーターで1時間インキュベートします。コラーゲン滴の架橋を確認するには、以下の3つの方法を参照してください。 - 透明色からコラーゲンの色が不透明な白色に変わったかどうかを確認します。
- 容器を傾け、コラーゲンが容器の底に付着しているかどうかを確認します。
- 液滴に1倍のPBSを注ぎ、コラーゲンコンストラクトが溶液中で壊れていないかどうかを確認します。
4.3Dガス透過性バリアの印刷
-
犠牲ポリ(エチレン-酢酸ビニル)(PEVA)金型の3D印刷
- 3D CAD ソフトウェアを使用して、ステップ 1 で定義した犠牲 PEVA 金型の 3D ジオメトリを生成します (図 3A)。
注: 寸法、単位、線種を含む 3D ジオメトリと詳細なモデル尺度を 図 2Aに示します。 - [ファイル]|をクリックして、3D CAD ファイルを STL ファイル形式に変換 します。保存ファイルの種類を STLとして保存します。また、オプション|をクリックします 。 G コード生成用の ASCII 形式で出力されます。
- [ファイル] |をクリックします。STL ファイルを開き、保存された STL ファイルを選択して、生成された STL ファイルをインポートします。STL-CAD交換器のスライスモデルをクリックして、犠牲型PEVA金型のGコードを自動的に生成します(図3B、C)。
注: 印刷パスは、STL ファイルの基本図形とスライス平面(レイヤ)との間の交差したポイントの接続によって生成されます。基本的に、STL ファイル内のフラグメントの基本的な図は、3D 座標を含む三角形です。三角形とレイヤーの間の交差した点が得られた後、画層18上のパスが重ならずに各点を接続することにより、印刷用のGコードが生成される。ボード上のGコード生成アルゴリズムは、チップ製造のための印刷パスを生成するために使用することができます。 - 滅菌接着剤と親水性の体系スライドを準備します。
注:親水性スライドガラスは、ガラス上のポリジメチルシロキサン(PDMS)の永久結合に重要であり、コラーゲンの接着は癌細胞および間質細胞をカプセル化する構築する。 - 110 °Cで500kPaの空気圧で50G精密ノズルでスライドに犠牲PEVA金型を印刷します。
注: ライン幅は、材料の送り速度、ノズルゲージ、および温度によって影響を受けます。50 Gノズルを使用し、送り速度400を適用し、犠牲壁に対して500μmのライン幅を生成しました。ノズルゲージ、空気圧、および送気率は、実用結果19で定義される。犠牲壁は、次の製造ステップであるPDMS溶液を保持するのに十分な厚さである必要があります。
- 3D CAD ソフトウェアを使用して、ステップ 1 で定義した犠牲 PEVA 金型の 3D ジオメトリを生成します (図 3A)。
-
ポリジメチルシロキサン(PDMS)バリアの鋳造
- プラスチック製の貯留層に6 mL PDMSベースエラストマーと0.6 mL硬化剤を5分以上均質に混ぜます。これは、PDMSの粘着性特性による損失を考慮して、6つの低酸素癌オンチップを製造することができる。
- ブレンド PDMS 溶液を 10 mL の使い捨てシリンジにセットし、20 G プラスチックテーパード ディスペンスチップでシリンジヘッドをフィットさせます。
- 犠牲PEVA型を注射器に配合したPDMS溶液で充填します。ブレンドされたPDMSは、犠牲PEVA金型を凸面で満たします。PDMS バリアの高さは PEVA 金型の高さよりも高くなります。
- PEVAの溶融を避けるために36時間以上40°CでオーブンでPDMSバリアを硬化させる。PEVAの融解温度である88°C以上に温度を上げないでください。
- 犠牲PEVA金型を一対の精密ピンセットで取り外し、オートクレーブで120°Cのガス透過性バリアを滅菌します。
5. 細胞内包化コラーゲンバイオインクの調製
-
調製された癌細胞および間質細胞の剥離
メモ:セルの生存率を考慮すると、セルを取り外した後、印刷プロセス全体をできるだけ早く完了する必要があります。- 血清ピペットを使用して1x PBSの10 mLで癌および間質細胞を洗浄する;ピペットを用いて0.25%トリプシン-エチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)の2mLで治療し、37°Cで3分間インキュベートします。
- 細胞培養培地の3 mLでトリプシン化細胞を中和;細胞の懸濁液を15 mLの円錐形チューブに集め、遠心分離機を516 x g で20°Cで5分間回収します。
- 上清をゆっくりと吸引する。5 mL細胞培養培地中の細胞ペレットを再懸濁し、血球計を用いて細胞数をカウントする。
- 各細胞タイプの5 x 106 細胞を新しい15 mL円錐形チューブに移し、516 x g で20°Cで5分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、湿った氷の上に置きます。
-
1%中和コラーゲンプレゲル溶液と各細胞型の混合
注:1%中和コラーゲンプレゲル溶液の熱凝固を避けるために、このプロセスは湿った氷の上で行われるべきです。- ステップ5.1.4で採取した各タイプの細胞ペレットを、それぞれ20μLの細胞培養培地で再懸濁します。
- 1%中和コラーゲンプレゲル溶液の1mLを再懸濁した細胞懸濁液のそれぞれに加え、正の変位ピペットを使用して均質に混合します。各細胞タイプの最終濃度は5 x 106 細胞/mLになります。
- 正の使い捨てピペットを使用して、細胞カプセル化コラーゲンバイオインクスを3mLの使い捨て注射器に移し、3Dセル印刷まで4°Cでシリンジを保管します。
癌間質同心環の6.3D細胞印刷
-
がん細胞と間質細胞を封入するコラーゲンバイオインキの3D細胞印刷
- 3D CAD ソフトウェアを使用して、ステップ 1.2 で定義されたがん-ストロマ同心円環の 3D ジオメトリを生成します。
注: がん間質同心円環の寸法は、シミュレートされたパラメータを使用して定義されます。最終的な寸法パラメータの寸法を 図 3Aに示します。 - 3D CADファイルをSTLファイル形式に変換し、STL-CAD交換器を使用してがん間質同心円環のGコードを生成します。
注: G コード生成アルゴリズムについては、ステップ 4.1.2 のメモを参照してください。 - 3 mLの使い捨て注射器に含まれる細胞封入コラーゲンバイオインクスを3Dプリンタのヘッドにロードし、ヘッドとプレートの温度を15°Cに設定します。
メモ:プリンタのヘッドとプレートの温度が37°C以上になると、バイオインクは架橋され、印刷されなくなります。 - 生成された印刷パスを 3D プリンタの制御ソフトウェアにロードします。
- スタートボタンをクリックすると、15°Cで約20kPaの空気圧で18Gプラスチック針を搭載したGコードに続いて、ガス透過性バリアに癌細胞と間質細胞をカプセル化したコラーゲンバイオインクを印刷します。
- すべての印刷操作の終わりに、手動で低酸素勾配を生成するために、気孔バリアの上に滅菌された22ミリメートルx 50ミリメートルガラスカバーを配置します。
注:低酸素勾配の生成を確認するために、ガラスカバー(GR +)と不在(GR-)の存在に応じて2つのグループを比較してください。 - 3つの低酸素癌オンチップを生成した後、チップを37°Cのインキュベーターに1時間移してコラーゲンバイオインクを架橋します。
- 3D CAD ソフトウェアを使用して、ステップ 1.2 で定義されたがん-ストロマ同心円環の 3D ジオメトリを生成します。
-
低酸素癌オンチップの製造プロセスとメンテナンスの完了
- 低酸素癌オンチップのすべての3D細胞印刷プロセスが完了した後、ガス透過性バリアの上にカバーグラスを、密着結合のためのセルスクレーパーで優しくこすります(図4A、B)。
注:カバーガラスとガス透過性バリアは、化学接着剤なしで疎水性結合を介して組み立てられ、カバーガラスとPDMSバリアの間の接着部分を単に削ります。 - 各チップに1.5mLの内皮細胞増殖培地を導入する。癌構築物の剥離を避けるために、チップの片側から細胞培養培地を導入する。チップを傾けて、ピペットを使用して細胞培養培地を流れるようにします。
- 細胞培養培地を毎日1週間リフレッシュする。ピペットを使用して細胞培養培地を吸引する。圧力ポンプを使用しないでください。
- 低酸素癌オンチップのすべての3D細胞印刷プロセスが完了した後、ガス透過性バリアの上にカバーグラスを、密着結合のためのセルスクレーパーで優しくこすります(図4A、B)。
7. ポストプリンティングセルの生存率の評価
-
カルセインAMおよびEthD-1溶液によるサンプルおよび治療の調製
- 37°Cの水浴で1x PBSを温めます。
- 0.75 μLのカルセインアセトキシメチル(カルセインAM)とエチジウムホモジマー(EthD-1)3 μLを1.5 mLの予熱PBSに加えて、アッセイ液を調製します。
- 慎重にピペットを使用してチップからすべてのメディアを吸引します。
- がんコンストラクトを温め込んだPBSで洗浄します。ピペットを使用して1.5mL PBSをチップに充填し、室温で10分間放置します。癌の構造の変形を避けるために、チップの片側から1x PBSを導入し、1x PBSが流れるようにチップを傾ける。
- チップからPBSを吸引する;1.5 mLアッセイ液を処理し、光から保護するためにホイルを使用して20分間、チップを37°Cでインキュベートしてください。ピペットを使用して1x PBSを吸引する。吸引ポンプを使用しないでください。
-
蛍光顕微鏡を用いた細胞生存率のイメージング
- 蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞を見て捕捉する(図4C)。
注:カルセインAMは、緑色蛍光(波長〜488nm)で生細胞をマークします。EthD-1は、赤色蛍光(波長〜594nm)を有する死細胞のシグナルを表す。 - イメージングソフトウェア、オープンソース画像処理プログラムを使用して、生細胞と死細胞の数をカウントし、数字で生存率を計算します。
- 蛍光顕微鏡を用いて標識された細胞を見て捕捉する(図4C)。
8. 中枢低酸素症の形成と癌悪性腫瘍への影響を検証する免疫蛍光
-
癌構築物の固定、透過性、および遮断
- PBS、4%パラホルムアルデヒド(PFA)、0.1%(v/v)トリトンX-100、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を室温で調製します。
- 慎重にピペットを使用してチップからすべての培地を吸引し、1x PBSでチップを3回リンスします。癌の構造の変形を避けるために、チップの片側から1x PBSを導入し、1x PBSが流れるようにチップを傾ける。各洗浄工程の間に、チップを1x PBSで5分間放置し、残留溶液を除去します。
注:1x PBSは、圧力ポンプではなくピペットを使用して吸引しました。 - ピペットを使用してチップ上の癌構造に4%PFAの500 μLを加える;15分間放置し、1x PBSで3回洗浄して、がん構築物の細胞を固定します。
- 5分間室温でピペットを使用して0.1%トリトンX-100の500 μLのがん構築物を治療し、1x PBSで3回洗浄して細胞膜を可溶化し、透過させます。
- 反応性エピトープをブロックするために室温でピペットを使用して2%BSAの500 μLで癌構築物を治療します。
注:蒸発を防ぐために、パラフィンフィルムでチップを覆います。 - 1時間後、チップを1倍PBSで3回洗います。
-
一次抗体による治療、二次抗体、及びDAPI及び共焦点顕微鏡を用いた構造のイメージング。
- アイソタイプコントロール抗体と一次抗体のカクテルを、各所望の作業濃度に1xPBSで希釈して調製します。
注: 抗体の具体的な詳細は、 資料一覧に記載されています。一次抗体と同じアイソタイプ対照抗体の働き濃度を使用すべきである。 - チップから1x PBSすべてをピペットを使用して慎重に吸引し、一晩4°Cで200μLの一次抗体溶液でチップを処理します。蒸発を防ぐためにパラフィンフィルムでチップを覆います。
- 一次抗体溶液を吸引し、チップを1x PBSで3回洗浄する。
- 1xPBS中の二次抗体及びDAPIを所望の働き濃度に希釈する。
注:緑色蛍光結合二次抗体は、この場合1:200の比率で使用されます。DAPIは1:1000の比率で使用されました。 - チップからチップから1x PBSをすべて慎重に吸引し、4°Cで200μLの二次抗体DAPI溶液を3時間処理します。蒸発を防ぐためにパラフィンフィルムでチップを覆い、それをアルミニウム箔で包んで、光の漂白を防ぎます。
- 二次抗体DAPI溶液を吸引し、チップを1x PBSで3回洗浄する。
- 染色ステップを終了した後、鉗子で軽くつかまって癌構造を共焦点皿に移す。
- 共焦点顕微鏡を使用して標識された細胞を視覚化して捕捉する(図5)。
注:共焦点顕微鏡の波長は、蛍光マーカーの種類に応じて調整しました。抗体の具体的な詳細は、 資料一覧に記載されています。細胞位置を効率よく検出するためには、最初に構築物のDAPI染色核を観察する方が良いであろう。蛍光信号の検出励起/発光波長は358/461 nm(DAPI、ブルー)、494/517nm(緑)、590/617nm(赤)であった。倍率は4倍、10倍、20倍で、最低から最高に調整された。
- アイソタイプコントロール抗体と一次抗体のカクテルを、各所望の作業濃度に1xPBSで希釈して調製します。
9. 統計分析
-
画像処理プログラムを用いてセルカウント
- ライブセルとデッドセルの数をカウントする画像処理プログラムを実行します。
- 蛍光画像ファイルを開きます。[ ファイル] |をクリックします。 TIFF イメージを開いてインポートします。
- イメージを 16 ビットのグレースケール イメージに変換します。画像|をクリックします 。タイプ|16 ビットグレースケール。
- [画像] をクリックしてしきい値を調整 ||を調整するしきい値 を選択し、黒にするセルの色を選択します。
- [プロセス |をクリックして、結合したセルを切り離す バイナリ| 正確な細胞のカウントのための流域。
- [解析] をクリックし、[パーティクルを解析] を 3 回クリックしてセル数をカウントします。平均を計算し、データを標準誤差の平均値として提示±。
注:蛍光強度を比較することにより免疫蛍光マーカーを解析した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
低酸素癌オンチップは、コンピュータ支援3D細胞印刷技術を用いて開発され、低酸素症および癌関連病理を再現した(図1)。酸素の輸送と消費は、3D ジオメトリ モデルを使用してシミュレートされました。このチップは、がん組織における放射状酸素拡散と枯渇を模倣するために同心円環の形で設計された(図2A)。酸素が拡散し、細胞によって消費された空間の制御体積を定義した後、中央低酸素発生のための適切な細胞密度を計算有限要素解析を通じて決定した(図2B、C)。
低酸素がんオンチップの3D印刷パスコードは、以前の結果に基づいて生成されました(図3)。犠牲のPEVA金型と癌構造のCADファイルは、STLファイル形式に変換されました(図3A、B)。印刷パスは、社内ソフトウェアプログラムを使用してコード化され、マルチ印刷システムに転送されました (図 3C)。
低酸素癌オンチップは、3D細胞印刷技術を使用して製造された。固形癌の構造、生化学的、および生物物理学的不均一性を再現するために、酸素がシステムに浸透できる唯一の方法である癌構築およびガス透過性障壁に対して段階的な製造プロセスが確立された(図4A)。固体癌の解剖学的特徴を再現するために、区画化された癌-ストロマ同心円環構造が作成された(図4B)。癌組織の異種幾何学は、3D細胞印刷技術を用いてインビトロで実現した。細胞生存率を印刷後に評価し、製造プロセス中の化学的および機械的ストレスを確認した。緑色染色された生細胞の比率は、赤染色死細胞の比よりも有意に高かった。定量的には、ポスト印刷セルの生存率は2.46%±96.92%以上であった(図4C)。この結果は、癌細胞および間質細胞に適切な製造条件を確認した。
酸素勾配の存在(GR+)と非存在(GR-)に応じて2つの群を比較し、低酸素勾配が癌進行に及ぼす影響を検証した(図5A)。いずれの条件においても、成熟したCD31+内皮細胞は、周辺領域に存在し、3Dバイオプリンティング技術を用いて空間パターン化されたリビングコンストラクトが作製されたことを示した。GR-条件と比較して、GR+条件は低酸素勾配を示し、HIF1α(図5B)の徐々な発現を示し、ここでSHMT2+擬似パリセーション細胞およびSOX2+多能性細胞が観察されたところ、固体癌の積極的な病態生理学的特徴を表す(図5C)。すなわち、神経膠芽腫の病的特徴は、工学的低酸素状態15の下で再現された。
図1:低酸素癌オンチップの開発の概略図 この数値は、自然生物医学工学15( 著作権、2019)から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:チップ上の低酸素癌に対する酸素勾配の形成の計算シミュレーション(A)低酸素癌オンチップの3D幾何学(B)酸素分布解析のための領域を示す概略図。この数値は、自然生物医学工学15(著作権、2019)から変更されています。(C)酸素分布プロファイルのジェットカラーマップ画像。この数値は、自然生物医学工学15(著作権、2019)から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 低酸素がんオンチップ用3Dプリントパスコードの生成(A)犠牲PEVA型の3D幾何学(B) STL ファイル形式の犠牲 PEVA 金型のイメージ。(C)犠牲PEVA型のGコード。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:低酸素癌オンチップの3D細胞印刷( A) 低酸素癌オンチップの製造プロセスの概略図(B) 印刷された低酸素癌オンチップと癌間質同心環の区画化構造;スケールバーは200 μmを表します(C) 生存率を評価するための3D細胞印刷癌構造の蛍光画像。スケールバーは200 μmを表します。
図5: 設計固形癌の低酸素勾配の生成と病理学的特徴の評価( A) 2つの異なる酸素透過条件下での実験群(B)HIF1αを用いた酸素勾配の生成の代表的な免疫染色画像スケールバーは、SHMT2、SOX2、およびCD31を使用した低酸素癌の病理学的特徴の代表的な免疫染色画像を表す。スケールバーは200 μmを表します。この数値は、自然生物医学工学15(著作権、2019)から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本研究では、3D細胞印刷技術に基づく低酸素癌オンチップの製造プロセスについて説明する。設計されたチップにおける低酸素勾配の形成は、コンピュータシミュレーションを通じて予測された。不均質な低酸素勾配を誘発できる環境を、3Dプリントされたガス透過性バリアとガラスカバーを組み合わせた簡単な戦略を通じて再現した。偽パリセードおよび癌幹細胞の少ない集団を含む神経膠芽腫の低酸素関連の病理学的特徴を、チップの低酸素勾配条件下で再現した。
生産性と再現性を向上させるために、2つの主要な製造ステップを、以前に公開されたモデル15と比較して順次変更した。まず、PDMSバリアを間接的に作製し、硬化剤を含有するPDMSの印刷性が悪く、これはワンステップダイレクト印刷方式ではなくリアルタイムで硬化する。したがって、より高い印字性を有する生体適合性PEVAは、犠牲型を製造するように適合し、PDMSを加え、ガス透過性バリアを作成した。第二に、スライドガラスの種類を親水性コーティングスライドガラスに変更し、バイオイン沈着および形状忠実度を支持するのに有利である。最後に、チップ効率の良い媒体交換の両端に中貯蔵所を構築することが可能となった。
3Dバイオプリンティングを介した低酸素癌オンチップの各製造ステップにおける重要な要因は、慎重に制御されるべきである。鋳造中、PDMSの高さは犠牲型PEVA型よりも大きく、そうでなければカバーガラスで締め付けられたチップが緩んでしまい、低酸素コア生成に悪影響を及ぼす。熱感受性ヒドロゲルであるコラーゲンの印刷時には、ゾルゲル転移現象によるノズルの詰まりを防止するため、印刷ヘッドの温度を15°Cに保つ必要があります。ハイドロゲルが時間的に架橋した場合、ブロックされたノズルは、高い空気圧と鋭利な針を使用して容易に洗浄することができます。ただし、ブロッキングが重篤な場合は、再度ヒドロゲルを調製する必要があります。さらに、細胞の生存率を考慮して、細胞印刷プロセスを1時間以内に完了する必要があります。
この3Dバイオプリンティング技術は、がんの基礎的なメカニズムを研究し、様々な固形腫瘍15の治療抵抗性を予測するために使用できる低酸素癌オンチップのエンジニアリングを促進する。特に、押出ベースの3Dバイオプリンティング技術を使用すると、高いレベルの自由度で迅速かつ反復的な生産が可能になりました。さらに、がんモデリングの再現性と迅速な時間枠により、医薬品分野は、がん治療のための薬剤併用候補のデータセットを構築することができます。しかし、この技術の分解能が限られているため、印刷された低酸素癌オンチップは数百マイクロメートルの範囲で生産され、大量の材料が必要です。また、スペース拘束20の下で高スループットの薬物スクリーニングプラットフォームを開発することは困難である。したがって、限られたリソースと空間範囲でマルチパラメーター スタディをサポートできるモデルを開発するために、このテクノロジを改善する必要があります。
開発された低酸素癌オンチップは、細胞外マトリックス(ECM)に由来するヒドロゲルなどの組織特異的材料を採用することにより、組織特異的な癌モデル化に適用することができる。ECMの生化学的および生理学的な変動が細胞機能に影響を与えるので、臓器特異的癌微小環境を有する多数の癌タイプの優れたエミュレーションが実現できる21。さらに、癌の発達に重大な影響を及ぼす、血管形成、免疫原性、転移特性の動的病態生理学的変化を含む、設計された血管を含む他の設計された組織構造と組み合わせることによって検討することができる。さらに、個別化癌治療は、患者由来細胞15を採用することによって開発されたチップで達成することができる。臨床治療前の薬物感受性の検査は、個々の患者に適切な治療レジメンを見つける過程で治療の有効性を改善するための重要なステップとなるであろう。患者由来のソースを持つ患者特異的な癌モデルは、各患者の病態生理学および化学感受性の違いを予測するために患者プロファイリングを改善することが期待される。これまでの研究では、様々な薬剤の組み合わせに対する患者特異的治療効果を、3Dプリントされた低酸素癌オンチップを用いて合理的な期間内に予測した。
要約すると、がんオンチップの3D細胞印刷は、異種癌微小環境を再現するために有利である。模倣された微小環境は、低酸素症に起因する壊死性コアの形成を含む癌の病理学的進行を促進する。このプロトコルは、抗癌剤検査および患者特異的癌モデルに適用することができる。この点で、我々は、この高度に制御可能なアプローチが様々な癌モデルを構築するために有益である可能性があることを期待しています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、文部省(2020R1A6A1A03047902およびNRF-2018H1A1A1062091)と韓国政府(MSIT)が出資する韓国国立研究財団(NRF)によって支援されました。NRF-2019R1C1C1009606およびNRF-2019R1A3A3005437)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| Human umbilical vein endothelial cells | Promocell | C-12200 | |
| U-87 MG cells | ATCC | ATCC HTB-14 | |
| Disposable | |||
| 0.2 μm syringe filter | Sartorius | 16534-K | |
| 10 mL disposable syringe | Jung Rim | 10ml 21G32 | |
| 10 mL glass vial | Hubena | A0039 | |
| 10 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91010 | |
| 15 mL conical tube | SPL lifescience | 50015 | |
| 18G plastic needle | Musashi engineering | PN-18G-B | |
| 20G plastic tapered dispense tip | Musashi engineering | TPND-20G-U | |
| 22x50 glass cover | MARIENFIELD | 0101142 | |
| 25 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90125 | |
| 3 mL disposable syringes | HENKE-JET | 4020-X00V0 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 5 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 91005 | |
| 50 mL conical tube | SPL lifescience | 50050 | |
| 50 mL Serological pipette tip | SPL lifescience | 90150 | |
| 50N precision nozzle | Musashi engineering | HN-0.5ND | |
| Aluminum foil | SINKWANG | ||
| Capillary tips | Gilson | CP1000 | |
| Cell-scrapper | SPL lifescience | 90030 | |
| Confocal dish | SPL lifescience | 200350 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Pre-coated histology slide | MATSUNAMI | MAS-11 | |
| Reservoir | SPL lifescience | 23050 | |
| T-75 cell culture flask | SPL lifescience | 70075 | |
| Equipment | |||
| 3DX printer | T&R Biofab | ||
| Autoclave | JEIOTECH | AC-12 | |
| Centrifuger | Cyrozen | 1580MGR | |
| Confocal laser microscopy | Olympus Life Science | FV 1000 | |
| Fluorescence microscope | FISHER SCEINTIFIC | O221S366 | |
| Forcep | Korea Ace Scientific | HC.203-30 | |
| Hand tally counter | KTRIO | ||
| Hemocytometer | MARIENFIELD | 0650030 | |
| Incubator | Panasonic | MCO-170AIC | |
| Laminar flow cabinet | DAECHUNG SCIENCE | CB-BMMS C-001 | |
| Metal syringe | IWASHITA engineering | SUS BARREL 10CC | |
| Operating Scissors | Hirose | HC.13-122 | |
| Oven | JEIOTECH | OF-12, H070023 | |
| Positive displacement pipette | GILSON | NJ05652 | |
| Refrigerator | SAMSUNG | CRFD-1141 | |
| Voltex Mixer | DAIHAN scientific | VM-10 | |
| Water bath | DAIHAN SCIENTIFIC | WB-11 | |
| Water purifier | WASSER LAB | DI-GR | |
| Materials | |||
| 0.25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
| 10x PBS | Intron | IBS-BP007a | |
| 4% Paraformaldehyde | Biosesang | ||
| 70% Ethanol | Daejung | 4018-4410 | |
| Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-HIF-1 alpha antibody | Abcam | ab16066 | |
| Anti-SHMT2/SHMT antibody | Abcam | ab88664 | |
| Anti-SOX2 antibody | Abcam | ab75485 | |
| Bovine Serum Albumin | Thermo scientific | J10857-22 | |
| Collagen from porcine skin | Dalim tissen | PC-001-1g | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher | D1306 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 | Promocell | C22011 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Theromofisher | A-11001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Theromofisher | A-11012 | |
| High-glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) | Hyclone | SH30243-0 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 311413-100ML | |
| Live/dead assay kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse IgG1, kappa monoclonal [15-6E10A7] - Isotype Control | Abcam | ab170190 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Poly(ethylene-vinyl acetate) | Poly science | 06108-500 | |
| Polydimethylsiloxane | Dowhitech | sylgard 184 | |
| Rabbit IgG, polyclonal - Isotype Control | Abcam | ab37415 | |
| Sodium hydroxide solution | Samchun | S0610 | |
| Triton X-100 | Biosesang | TRI020-500-50 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Software | |||
| COMSOL Multiphysics 3.5a | COMSOL AB | ||
| IMS beamer | in-house software | ||
| SolidWorks Package | Dassault Systems SolidWorks Corporation |
References
- Jing, X., et al. Role of hypoxia in cancer therapy by regulating the tumor microenvironment. Molecular Cancer. 18 (1), 157 (2019).
- Al Tameemi, W., Dale, T. P., Al-Jumaily, R. M. K., Forsyth, N. R.
- Petrova, V., Annicchiarico-Petruzzelli, M., Melino, G., Amelio, I.
- Hockel, M., Vaupel, P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects. Journal of the National Cancer Institute. 93 (4), 266-276 (2001).
- Kim, H., Lin, Q., Glazer, P. M., Yun, Z. The hypoxic tumor microenvironment in vivo selects the cancer stem cell fate of breast cancer cells. Breast Cancer Research. 20 (1), 16 (2018).
- Jeong, G. S., Lee, J., Yoon, J., Chung, S., Lee, S. -H. Viscoelastic lithography for fabricating self-organizing soft micro-honeycomb structures with ultra-high aspect ratios. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (81), e50665 (2013).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Wan, L., Neumann, C., LeDuc, P. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab on a Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
- Nam, H., Funamoto, K., Jeon, J. S. Cancer cell migration and cancer drug screening in oxygen tension gradient chip. Biomicrofluidics. 14 (4), 044107 (2020).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: a fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Mi, S., Du, Z., Xu, Y., Sun, W. The crossing and integration between microfluidic technology and 3D printing for organ-on-chips. Journal of Materials Chemistry B. 6 (39), 6191-6206 (2018).
- Yi, H. -G., Lee, H., Cho, D. -W.
- Yi, H. -G., et al. A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chip for the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 509-519 (2019).
- Kang, T. -Y., Hong, J. M., Jung, J. W., Yoo, J. J., Cho, D. -W. Design and assessment of a microfluidic network system for oxygen transport in engineered tissue. Langmuir. 29 (2), 701-709 (2013).
- Woo Jung, J., et al. Evaluation of the effective diffusivity of a freeform fabricated scaffold using computational simulation. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (8), (2013).
- Brown, A. C., De Beer, D. Development of a stereolithography (STL) slicing and G-code generation algorithm for an entry level 3-D printer. 2013 Africon (IEEE). , 1-5 (2013).
- Shim, J. -H., Lee, J. -S., Kim, J. Y., Cho, D. -W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. Journal of Micromechanics and Microengineering. 22 (8), 085014 (2012).
- Gillispie, G., et al. Assessment methodologies for extrusion-based bioink printability. Biofabrication. 12 (2), 022003 (2020).
- Kim, B. S., Das, S., Jang, J., Cho, D. -W. Decellularized extracellular matrix-based bioinks for engineering tissue-and organ-specific microenvironments. Chemical Reviews. 120 (19), 10608-10661 (2020).
