Summary
एंडोमेट्रियोसिस के कई कृंतक मॉडल तकनीकी जटिलता, प्रजनन क्षमता, और/या इम्यूनोसमझौता जानवरों या विशेष रिपोर्टर चूहों के लिए की जरूरत से सीमित हैं । हम एक स्वतंत्र रूप से सत्यापन योग्य, उद्देश्य स्कोरिंग प्रणाली के साथ किसी भी प्रयोगात्मक माउस का उपयोग करके घाव प्रेरण की एक सरलीकृत प्रणाली पेश करते हैं और ओवारेक्टॉमी या सर्वाइवल सर्जरी के लिए कोई आवश्यकता नहीं होती है।
Abstract
एंडोमेट्रियोसिस पेल्विक दर्द और बांझपन का एक प्रमुख कारण है। यह एक्सटेराइन स्थानों में एंडोमेट्रियल ऊतक की उपस्थिति से परिभाषित किया गया है। एंडोमेट्रियोसिस के लिए उपन्यास चिकित्सा और नैदानिक उपकरणों का विकास रोग का अध्ययन करने में चुनौतियों के कारण सीमित किया गया है। वानरों के बाहर, कुछ स्तनधारियों मासिक धर्म, और कोई भी सहज एंडोमेट्रियोसिस विकसित करता है। कृंतक मॉडल लोकप्रिय हैं, लेकिन एंडोमेट्रियोसिस के कृत्रिम प्रेरण की आवश्यकता होती है, जिसमें कई इम्यूनोसमझौता चूहों या शल्य चिकित्सा प्रेरित रोग का उपयोग करते हैं। हाल ही में इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से जुड़े मॉडल्स पर ज्यादा ध्यान दिया गया है । हम एंडोमेट्रियोसिस का एक मुरीन मॉडल पेश करते हैं जो मौजूदा एंडोमेट्रियोसिस मॉडल की कई विशेषताओं को एक उपन्यास, सरलीकृत प्रणाली में एकीकृत करता है जो व्यक्तिपरक ग्रेडिंग के बदले सूक्ष्म मात्राकरण पर निर्भर करता है। इस मॉडल में, हम दाता चूहों, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, व्यवस्थित पेट सर्वेक्षण और ऊतक फसल, और हिस्टोलॉजिक क्वांटिफिकेशन की हार्मोनल उत्तेजना करते हैं जिसे नेक्रॉप्सी के बाद किसी भी समय किया और सत्यापित किया जा सकता है। इस मॉडल के लिए न्यूनतम संसाधनों और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है; मुरीन सर्वाइवल सर्जरी में या सकल एंडोमेट्रियोटिक घावों की पहचान में प्रयोगशाला तकनीशियनों द्वारा विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है; इम्यूनोसमझौता, इम्यूनोसपेसिटेंट, और/या उत्परिवर्ती चूहों में इस्तेमाल किया जा सकता है; और मज़बूती से एंडोमेट्रियोटिक घावों को बनाता है जो मानव एंडोमेट्रियोटिक रोग के अनुरूप हैं।
Introduction
एंडोमेट्रियोसिस महिला प्रजनन तंत्र की एक रहस्यपूर्ण बीमारी है , जिसमें महिलाओं पर महत्वपूर्ण वित्तीय और स्वास्थ्य का बोझ पड़ता है1,2. एंडोमेट्रियोसिस की एटियोलॉजी पूरी तरह से समझ में नहीं आती है, और कोलोमिक मेटाप्लासिया, भ्रूणीय मुलेरियन टिकी हुई है, बोन मैरो व्युत्पन्न जनक कोशिकाओं की भर्ती, और प्रतिगामी मासिक धर्म3सहित कई स्पष्टीकरण प्रस्तावित किए गए हैं। जबकि इन प्रस्तावित तंत्रों के कई पहलुओं को शामिल किया जा सकता है, और कोई भी स्पष्टीकरण रोग के सभी रूपों के लिए खाता नहीं हो सकता है, एंडोमेट्रियोसिस रोगजनन का प्रमुख मॉडल प्रतिगामी मासिक धर्म है। प्रतिगामी मासिक धर्म फैलोपियन ट्यूबों के माध्यम से और पेरिटोनियल गुहा में मासिक धर्म प्रवाह का पारित होना है; यह अनुमान लगाया गया है कि मासिक धर्म महिलाओं के 90% नियमित रूप से प्रतिगामी मासिक धर्म से गुजरना4,5. प्रतिगामी मासिक धर्म की इस आम घटना को देखते हुए, एंडोमेट्रियोसिस केवल महिलाओं के सबसेट में क्यों विकसित होता है5अस्पष्ट है। इस बीमारी के एटियोलॉजी को बेहतर ढंग से समझने के लिए, प्रत्यक्ष मानव अध्ययन व्यवहार्य नहीं हैं और पशु अध्ययन की आवश्यकता है।
एंडोमेट्रियोसिस इलाज और अध्ययन दोनों के लिए एक चुनौती है। रोग की व्यापकता का पता नहीं है लेकिन अनुमान 10%1है । जबकि कुछ उन्नत प्रकार के एंडोमेट्रियोसिस को नॉनइनवेसिव इमेजिंग के माध्यम से सटीक रूप से पहचाना जा सकता है, एक निश्चित निदान केवल शल्य चिकित्सा से प्राप्त बायोप्सी नमूनों के हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त किया जाता है; घाव जो नेत्रहीन रोगग्रस्त प्रतीत होते हैं, वास्तव में फाइब्रोसिस या अन्य कारणों से जख्म हो सकते हैं6. रोग की गंभीरता और सीमा लक्षण विज्ञान7से संबंधित नहीं है ।
एंडोमेट्रियोसिस घावों में विषम कोशिका प्रकार और आबादी होती है जो माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर जटिल तरीकों से बातचीत करती हैं, इसलिए, सेलुलर मॉडल8,9की उपयोगिता को सीमित करती हैं। वीवो मॉडल में मौजूद हैं, लेकिन इनमें अंतर्निहित चुनौतियां और सीमाएं10,11,12हैं। रहनुमा मॉडल आदर्श हैं लेकिन अक्सर13 , 14,15व्यावहारिक नहींहोतेहैं । कुछ गैर रहनुमा स्तनधारियों मासिक धर्म और एंडोमेट्रियोसिस अनायास विकसित16। एंडोमेट्रियोसिस के कृंतक मॉडल मौजूद हैं लेकिन प्रत्येक की सीमाएं17हैं । इनमें से कई मॉडलों को दाता प्राप्तकर्ता दीवार या आंत्र में सिवनी या प्रत्यारोपित एंडोमेट्रियल ऊतक के लिए जीवित रहने की सर्जरी की आवश्यकता होती है, तकनीकी जटिलता को जोड़ते हुए, संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है, और सर्जरी से प्रतिरक्षा कारकों को18,19,20से भ्रमित करते हैं। इसके अलावा, कई मॉडलों को ओवेरेक्टॉमी और एस्ट्रोजन पूरकता की आवश्यकता होती है; घाव उपज में वृद्धि करते हुए, यह समय, खर्च और अतिरिक्त जीवित रहने की सर्जरी जोड़ता है। इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन मॉडल को संज्ञाहरण या जीवित रहने की सर्जरी की आवश्यकता नहीं होती है, और ये मॉडल तार्किक रूप से प्रतिगामी मासिक धर्म को21, 22,23के मॉडलों की तुलना में बेहतरअनुकरणकरते हैं। हालांकि, अधिकांश आईपी मॉडल इंजेक्शन के बाद एंडोमेट्रियल टुकड़ों के यादृच्छिक फैलाव के कारण घाव स्थान में अधिक परिवर्तनशीलता के अधीन हैं और इसलिए घाव पहचान और माप में अधिक पूर्वाग्रह के अधीन हैं।
यहां हम एंडोमेट्रियोसिस का एक मुरीन मॉडल पेश करते हैं जो मौजूदा एंडोमेट्रियोसिस मॉडल की कई विशेषताओं को एक उपन्यास, सरलीकृत और कुशल प्रणाली में एकीकृत करता है जो व्यक्तिपरक ग्रेडिंग के बदले सूक्ष्म मात्राकरण पर निर्भर करता है।
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Protocol
नोट: इस अध्ययन में जानवरों के उपयोग को क्लीवलैंड क्लिनिक लेर्नर रिसर्च इंस्टीट्यूट में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी सार्वजनिक रूप से उपलब्ध पशु देखभाल और उपयोग मानकों को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा दिशा निर्देशों के बाद प्रदर्शन किया गया । यह प्रक्रिया एसेप्टिक तकनीकों का उपयोग कर रही है। पेट्री डिश बाँझ है। उपयोग किया जाने वाला पीबीएस/नमकीन बाँझ है । नेक्रॉप्सी और ऊतक विच्छेदन के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों को ऑटोक्लेव के माध्यम से निष्फल किया जाता है। हम संदूषण को कम करने के लिए पशु मामलों (यदि प्रति सत्र एक से अधिक) के बीच उपकरणों पर 70% EtOH का उपयोग करते हैं।
1. दाता और प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी (चित्रा 1देखें)
- सुनिश्चित करें कि प्रयोगशाला जानवरों के साथ काम करने के लिए उचित अनुमोदन मौजूद है।
- माउस के तनाव का निर्धारण करें। इन प्रयोगों में, वाइल्डटाइप और उत्परिवर्ती चूहों का उपयोग C57BL/6J पृष्ठभूमि वाले थे, लेकिन इसी तरह के मॉडलों का उपयोग करने वाले जांचकर्ताओं ने बाल्ब/सी चूहों10जैसे अन्य माउस उपभेदों के साथ सफलता की रिपोर्ट की । इसके अलावा, दाता और/या प्राप्तकर्ता चूहों ऐसे GFP या RFP चूहों के रूप में रिपोर्टर सिस्टम, का उपयोग कर सकते है (चित्रा 2 और चित्रा 3देखें) ।
- एंडोमेट्रियल ऊतक प्रत्यारोपण के समय के लिए, यह सुनिश्चित करें कि दाता चूहों गोंडोट्रोपिन इंजेक्शन के समय 22-24 दिनों के बीच पुराने हैं। यह सुनिश्चित करता है कि वे प्रजनन भोले हैं, उदाहरण के लिए, अभी तक एस्ट्रोस साइकिलिंग शुरू नहीं हुई है।
- सुनिश्चित करें कि प्राप्तकर्ता चूहों को 2 से 4 महीने की उम्र के बीच प्रजनन रूप से बरकरार (कोई पूर्व ओवेरेक्टॉमी नहीं) है। जबकि आवश्यक नहीं है, यह एक पुरुष चूहों पिंजरे से समय-समय पर एक पुरुष चूहों पिंजरे से मूत्र से लथपथ बिस्तर रखने के लिए चल रहे एस्ट्रोस साइकिल चालन की सुविधा के लिए और फिर से ७२ घंटे पर एंडोमेट्रियल ऊतक प्रत्यारोपण से पहले की सिफारिश की है ।
नोट: यह प्राप्तकर्ताओं के एस्ट्रोस चक्र का समकालिकीकरण सुनिश्चित नहीं करेगा, क्योंकि प्लेसमेंट मूत्र से लथपथ बिस्तर उपयोग किए गए पुरुष बिस्तर की मात्रा पर अत्यधिक निर्भर है और इसके चर परिणाम हैं। यदि एस्ट्रोस चक्र का समकालिकीकरण वांछित है, तो 100 एनजी/100 माइक्रोन एस्ट्रोडिओल के लगातार तीन चमड़े के नीचे इंजेक्शन सभी जानवरों को एस्ट्रोस चरण में लाएंगे। जबकि हमें एस्ट्रोस चक्र के चरण के आधार पर घाव प्रेरण में कोई अंतर नहीं मिला, अन्य समूहों ने चक्र चरण को महत्वपूर्ण पाया है10। - चमड़े के नीचे गर्भवती घोड़ी सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी, 2 आईयू 200 माइक्रोन में पतला) दाता चूहों में एक ठीक सुई (25-27 जीअनुशंसित)का उपयोग करके इंजेक्शन। प्राप्तकर्ता चूहों को पीएमएसजी न दें, क्योंकि यह ओव्यूलेशन और बाद में उच्च प्रोजेस्टेरोन वातावरण को ट्रिगर करेगा, जो एंडोमेट्रियोसिस गठन के लिए कम ग्रहणशील है।
नोट: पूर्व माउस मॉडल ने एंडोमेट्रियल हार्वेस्ट23से पहले दाता चूहों में एंडोमेट्रियल प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए पीएमएसजी या एस्ट्रोजन का उपयोग किया है । पीएमएसजी को निम्नलिखित कारणों से अनुशंसित किया जाता है: पीएमएसजी का आधा जीवन 40 घंटे है जबकि 17-बीटा-एस्ट्राडिओल का आधा जीवन केवल 2 घंटे है। एंडोमेट्रियल ऊतक की खरीद से पहले 40 घंटे दानदाताओं में पीएमएसजी के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन का उपयोग गोनाडोट्रोपिन उत्तेजना के संपर्क की एक निरंतर अवधि प्रदान करता है, जो अंतर्जात एस्ट्रोजन को प्रोत्साहित करने का कार्य करता है। एक्सोजेनस एस्ट्रोजन की कई तैयारियों को एंडोमेट्रियम को पर्याप्त रूप से प्राइम करने के लिए कई इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। - पीएमएसजी इंजेक्शन के बाद, 38-42 घंटे के बीच प्राप्तकर्ता में नेक्रॉप्सी, खरीद और प्रत्यारोपण का समय निर्धारित करें। ओव्यूलेशन से पहले ऊतक का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए गोंडोट्रोपिन इंजेक्शन के बाद एंडोमेट्रियल ऊतक फसल का समय, जो 42 घंटे पोस्ट इंजेक्शन पर होता है। ओव्यूलेशन एक उच्च प्रोजेस्टेरोन (पी 4) वातावरण पैदा करता है, जो घाव स्थापना को कम करेगा।
2. दाता माउस एंडोमेट्रियल ऊतक की खरीद
- दाता माउस की इच्छामृत्यु के बाद (सीओ2 कक्ष का उपयोग करके गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद), पेट को 70% इथेनॉल समाधान के साथ स्प्रे करें; यह त्वचा वनस्पतियों से और उखाड़ फेंका बाल से खरीदे गए ऊतकों के संदूषण को कम करने के लिए कार्य करता है। कैंची विच्छेदन के साथ, त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक के माध्यम से मिडलाइन पर एक उथले ट्रांसवर्स स्निप बनाएं। फिर त्वचा चीरा के प्रत्येक पक्ष को लोभी, पेट खोलने के लिए कुंद कर्षण का उपयोग करें।
- गर्भाशय की पहचान करें। गर्भाशय को हटाने से पहले, आसन्न कनेक्टिव ऊतक को ट्रिम करें। प्रत्येक गर्भाशय सींग को उनके संबंधित फैलोपियन ट्यूब के ठीक नीचे पार करें और फिर पूरे गर्भाशय को ब्लॉक करने के लिए गर्भाशय ग्रीवा को पार करें।
- पेट की गुहा से हटाने के बाद, गर्भाशय का सावधानी से निरीक्षण करें और किसी भी अतिरिक्त परिधीय वसा या संयोजी ऊतक को हटा दें। गर्भाशय को पेट्री डिश पर ठंडे पीबीएस की बूंद में रखें। निर्धारित करें और पूरे गर्भाशय के संयुक्त द्रव्यमान दस्तावेज़।
- गर्भाशय फंडस से प्रत्येक सींग को पार करें, जिससे ट्रांसेक्शन को यथासंभव फंडस के करीब बना दिया जा सके ताकि प्रत्येक सींग की लंबाई को अधिकतम किया जा सके। विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सहायता का उपयोग करके, पहले सींग के लुमेन के अंदर विच्छेदन कैंची का एक ब्लेड रखें, फिर ट्यूब की प्रमुख धुरी के साथ काटें। इस बात को ध्यान में रखते हुए ट्यूब को खोलें कि किस तरफ सेरोसा है और किस तरफ एपिथेलियम है।
- एक नई पेट्री डिश पर नमकीन या पीबीएस के 500 सीसी रखो; सतह के तनाव के कारण तरल एक साथ रहेगा।
- इसके बाद एक समान तरीके से गर्भाशय का विखंडन करें। कई छोटे घावों की तुलना में कम बड़े घावों का होना बेहतर है। एंडोमेट्रियल परत को पकड़कर और इसे छीलकर मायोमेट्रियम से एपिथेलियम को अलग करके शुरू करें।
- वैकल्पिक रूप से, बस मायोमेट्रियम को अलग किए बिना ऊतक को खंडित करें (जब तक एपिथेलियल पक्ष पूरी तरह से उजागर होता है), लेकिन मायोमेट्रियम को बनाए रखने से इस मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता मानव रोग में कम हो जाती है। सुनिश्चित करें कि टुकड़े जितना संभव हो उतना बड़ा है लेकिन 18 जी सुई से गुजरने के लिए काफी छोटा है; (1 मिमी x 1 मिमी की सिफारिश की जाती है)।
- पहले सींग से इन 1 मिमी x 1 मिमी टुकड़ों में से 10-12 ले लीजिए (जो मोटे तौर पर C57BL/6J चूहों में 40 मिलीग्राम ऊतक से मेल खाती है)। एकत्र किए गए टुकड़ों को तरल संग्रह में रखें।
- माउस प्रति लगभग 24 टुकड़ों के लिए अन्य गर्भाशय सींग के लिए एक ही कदम प्रदर्शन करते हैं। टुकड़ों की कुल संख्या दस्तावेज़।
3. प्राप्तकर्ता माउस में ऊतक के टुकड़ों का पेरिटोनियल इंजेक्शन
- 1 सीसी सिरिंज के कुंद अंत का उपयोग करके निलंबित 1 मिमी x 1 मिमी टुकड़ों को एस्पिरेट करें; कुल मात्रा 1 एमएल होनी चाहिए।
- पूर्ण सिरिंज के लिए एक 18 जी सुई संलग्न करें और सुई में तरल पदार्थ लोड। पेट्री डिश में एक नकली इंजेक्शन वापस विचार करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी ऊतक सुई से गुजरेंगे।
- प्राप्तकर्ता माउस ले लो। आईपी इंजेक्शन से पहले या बाद में, एस्ट्रोस चक्र प्रलेखन के लिए प्राप्तकर्ता माउस का योनि धब्बा प्राप्त करें (योनि छिद्र पर बल्ब सिरिंज का उपयोग करके नमकीन का 10 माइक्रोन और कवरस्लिप के साथ ग्लास स्लाइड पर चढ़ाया जाता है)।
- 45 डिग्री कोण पर सिरिंज के साथ टुकड़ों के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन करें, ध्यान रखें कि चमड़े के इंजेक्शन न लगाएं।
- यदि इंजेक्शन के बाद टुकड़े रहते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी टुकड़ों को सफलतापूर्वक इंट्रापेरिटोनली इंजेक्शन दिया जाता है, इंजेक्शन के लिए सिरिंज में तरल पदार्थ का एक अतिरिक्त 200 माइक्रोन खींचें।
- एक बार रक्तस्राव या जटिलताओं का आश्वासन देने के बाद, प्राप्तकर्ता चूहों को अपने पिंजरों में वापस रखें और एक सामान्य आहार खिलाएं।
4. एंडोमेट्रियोटिक घावों की फसल
- टुकड़ा इंजेक्शन के बाद प्रत्यारोपण के बाद लगभग 21 दिनों में प्राप्तकर्ता चूहों इच्छामृत्यु ।
नोट: अनुभव से और इसी तरह के मॉडल का उपयोग कर सहयोगियों के साथ चर्चा से, अधिकतम घाव आकार और संख्या लगभग 3 सप्ताह के बाद प्रत्यारोपण पर होते हैं; 3 सप्ताह के बाद, घाव आकार में पीछे हटना शुरू करते हैं। इच्छामृत्यु की IACUC अनुमोदित विधि का उपयोग किया जाता है। - इच्छामृत्यु और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, 70% इथेनॉल के साथ जानवर के पेट को स्प्रे करें और त्वचा को कैंची विच्छेदन के साथ सतही रूप से काटने के लिए तम्बू करें। पेट को स्पष्ट रूप से खोलने के लिए कैंची के साथ त्वचा और चमड़े के नीचे की जगह को चीरना।
- किसी भी आगे विच्छेदन शुरू करने से पहले, सकल घावों के लिए एक पूर्ण सर्वेक्षण किया जाता है, जिसमें कैलिपर्स द्वारा मापा जाता है और उनके शारीरिक क्षेत्र के रूप में प्रलेखित किया जाता है (नीचे देखें)।
- ब्लॉक में तीन अलग-अलग शारीरिक क्षेत्रों का पूर्ण संग्रह करें (चाहे घावों की सराहना की जा सकती है या नहीं)। यदि घावों को अन्य क्षेत्रों (जैसे, आंत) में देखा जाता है, तो इन्हें नजरअंदाज किया जाना चाहिए और तब तक एकत्र नहीं किया जाना चाहिए जब तक कि घाव नीचे दिए गए तीन क्षेत्रों में से एक को पार न करे।
- एक = पेट की दीवार/पेरिटोनम (या तो एक कैसेट में चपटा किया जा सकता है या ऊपर लुढ़का, जब तक नमूनों के बीच संगत के रूप में) ।
- बी = अग्न्याशय और मेसेनेटिक फैट।
- C = पैराटेरिन कनेक्टिव ऊतक और वसा (सफेद दीप्ति ऊतक जो गर्भाशय के चारों ओर होता है लेकिन मूत्राशय के अलावा किसी अन्य अंग को शामिल नहीं करता है; ध्यान रखें कि मूत्राशय को घाव के लिए गलती न करें)।
- प्रत्येक विच्छेदित क्षेत्र को एक कैसेट में रखें, उचित रूप से लेबल किया जाए, और इसे हिस्टोलॉजिक सेक्शनिंग के लिए लैब प्रोटोकॉल के अनुसार फॉर्मेलिन और प्रक्रिया में रखें।
- दो समान गहराई पर ऊतक क्षेत्र के प्रति दो स्लाइड (डी 1 और डी 2) में अनुभाग फॉर्मेलिन ब्लॉक।
5. एंडोमेट्रियोटिक घावों का स्कोरिंग
- स्कैन (40x आवर्धन पर) और संग्रह स्लाइड।
- डिजिटल स्लाइड रीडिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, एक एंडोमेट्रियोटिक घाव के किनारों के बीच सबसे लंबी दूरी (एक्स) को परिभाषित करें- चाहे किनारे में ग्रंथियां हों या स्ट्रोमा-और इसे चिह्नित करें। एक निरंतर घाव स्ट्रोमा से घिरे ग्रंथियों द्वारा परिभाषित किया गया है; यह रेखा केवल एंडोमेट्रियोटिक ऊतक को पार नहीं करती है (जैसा कि एंडोमेट्रियोसिस के अनियमित आकार या तरंगित फोकस पर एंडपॉइंट निर्धारित करने के मामले में) लेकिन दो अंत बिंदुओं को निरंतर स्ट्रोमा और/या ग्रंथियों (चित्र 4देखें) से जुड़ा होना चाहिए ।
- ऊपर के नियमों का पालन करते हुए निर्धारित दूसरी पंक्ति की लंबाई के साथ, पहली पंक्ति में एक दूसरी पंक्ति (वाई) 90 डिग्री बनाएं।
- यदि कई गैर-समीपस्थ घावों का सामना करना पड़ता है, तो प्रत्येक को अपना एक्स और वाई माप दें।
- प्रत्येक घाव के क्षेत्रों (X * Y) के योग के रूप में प्रत्येक स्लाइड के लिए अंतिम स्कोर की गणना करें।
- उस क्षेत्र (ए, बी, सी) के लिए अंतिम स्कोर के रूप में दो स्लाइड (D1 बनाम D2) से स्कोर का बड़ा ले लो ।
- उस जानवर के लिए अंतिम सूक्ष्म स्कोर देने के लिए प्रत्येक क्षेत्र से कुल स्कोर।
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Representative Results
अवधारणा प्रयोग के प्रारंभिक प्रमाण के लिए, आरएफपी चूहों से दाता एंडोमेट्रियम को वाइल्डटाइप प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्ट किया गया था। एचएंडई स्टेनिंग ने एंडोमेट्रियोसिस घाव(चित्रा 3 ए)के क्लासिक आर्किटेक्चर की हिस्टोपैथोलोजिक पुष्टि का खुलासा किया। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी ने पुष्टि की कि प्रश्न में मनाया गया घाव दाता(चित्रा 3B)से उत्पन्न हुआ है।
दूसरा प्रयोग 10 वाइल्डटाइप C57BL/6J दाताओं और 10 प्राप्तकर्ताओं का उपयोग करके किया गया था । एक अतिरिक्त 5 प्राप्तकर्ताओं को नकली उपचार (पीबीएस के साथ इंजेक्ट किया गया और एंडोमेट्रियल टुकड़े नहीं) प्राप्त हुए और एक यादृच्छिक पहचान संख्या सौंपी गई; समीक्षकों नेक्रॉप्सी और हिस्टोपैथालॉजिक समीक्षा से पहले अंधा कर दिया गया था ।
सभी प्राप्तकर्ताओं PSMG दाता उपचार के ४२ घंटे के भीतर दाता एंडोमेट्रियल ऊतक प्राप्त किया । इस समय अंतराल और अंतिम गर्भाशय वजन या घाव के आकार के बीच कोई संबंध नहीं था। दाता खरीद के समय, औसत कुल गर्भाशय वजन ५४ ± ९.५ मिलीग्राम था । औसत टुकड़ा संख्या 22.4 ± 5.2 थी, जिसके परिणामस्वरूप औसत टुकड़ा वजन 2.5 ± 0.5 मिलीग्राम था। एंडपॉइंट सर्जरी सभी प्राप्तकर्ताओं के लिए या तो दिन 20 या 22 दिन में हुई ।
1.5 के घावों की औसत संख्या और 3.7 मिमी के औसत सकल कुल घाव व्यास के साथ, ये अंतिम बिंदु अन्य अध्ययनों के समान हैं जो इंजेक्शन एंडोमेट्रियल टुकड़ों(चित्रा 2)10के समान वजन के साथ माउस मॉडल का उपयोग करते हैं। सभी चूहों के लिए घावों की व्यापकता 80% थी। घावों के बिना चूहों में घावों के साथ चूहों की तुलना में काफी अधिक एंडोमेट्रियल अंश था (क्रमशः 30.5 कुल टुकड़े बनाम 20.3; सभी चूहों के लिए औसत कुल टुकड़े 22.4 थे) जिसके परिणामस्वरूप इंजेक्शन के समय औसत टुकड़ा आकार से नीचे होता है (1.9 मिलीग्राम बनाम 2.6 मिलीग्राम)। जैसा कि अपेक्षित था, नकली नियंत्रण (नमकीन और एंडोमेट्रियल टुकड़ों के साथ इंजेक्शन) में कोई सकल या सूक्ष्म रोग नहीं था। चूहों की विस्तारित संख्या का उपयोग करके बाद के अध्ययन में, प्राप्तकर्ता माउस का एस्ट्रोस चरण घाव संख्या या सूक्ष्म रोग स्कोर से जुड़ा नहीं था।
सकल घाव संख्या कुल घाव बोझ के लिए एक गरीब सरोगेट मार्कर प्रतीत होता है, के रूप में वहां स्थूल और ऊतकों में मौजूद सूक्ष्म रोग के बीच कलह था । मामलों के 60% (एन = 6) में, स्थूल और सूक्ष्म स्कोरिंग (उपस्थिति या अनुपस्थिति दोनों दिखाने के रूप में परिभाषित समझौता और कुल आकार में अंतर 3 मिमी के भीतर था) के बीच समझौता हुआ था। हालांकि, मामलों के 40% (एन = 4) में, असहमति थी, समय के 10% (एन = 1) अनुपस्थित था, लेकिन सूक्ष्म रोग हिस्टोरोलॉजी द्वारा मौजूद था, 10% (एन = 1) स्थूल रोग पुष्टित्मक हिस्टोरोलॉजी(चित्रा 5)पर एंडोमेट्रियोसिस की अनुपस्थिति के बावजूद देखा गया था, और शेष 20% (एन = 2) उपस्थिति में समझौता था लेकिन घाव के आकार की भयावहता नहीं थी। इस प्रकार, केवल घावों के लिए स्थूल परीक्षा एंडोमेट्रियोसिस रोग के बोझ के मात्राकरण के लिए पर्याप्त नहीं है।
चित्रा 1:मॉडल का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:घाव मात्राकरण के लिए सर्वेक्षण क्षेत्र। जबकि आंत्र और अन्य इंट्रापेरिटोनियल स्थान घावों को आश्रय दे सकते हैं, इन को पूरी तरह से अलग करना अधिक चुनौतीपूर्ण है और पेट का एक विस्तृत सर्वेक्षण कम रिटर्न के साथ अधिक समय गहन होगा। इसलिए, पूर्ण ऊतक की कटाई का एक सुसंगत, व्यवस्थित दृष्टिकोण (चाहे सकल रोग मौजूद है) एंडोमेट्रियोसिस गठन के तीन सबसे आम क्षेत्रों में किया जाता है: पेट की दीवार/पेरिटोनियम(ए),अग्न्याशय और मेसेन्टेरिक फैट(बी),और पैराटेरिन फैट(सी)। लेबल तीन क्षेत्रों में से प्रत्येक से घावों के सूक्ष्म निष्कर्षों के प्रतिनिधि छवियां हैं । 40x आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3:लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले दाता चूहों एंडोमेट्रियम का उपयोग करके एंडोमेट्रियोसिस का प्रेरण। (ए)घाव का एचएंडई सेक्शन । (ख)डीएपीआई स्टेनिंग के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। 40x आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:घाव आयामों के आयामों को मापने और घाव के बोझ को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ्टवेयर की प्रतिनिधि छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5:सकल "घावों" के प्रतिनिधि नमूने जो हिस्टोपैथोलोजिक परीक्षा द्वारा एंडोमेट्रियोसिस नहीं हैं। 40x आवर्धन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
हमारा अध्ययन दर्शाता है कि एंडोमेट्रियोसिस को ओवेरेक्टॉमी और/या जीवित रहने की सर्जरी के उपयोग की आवश्यकता के बिना चूहों में मज़बूती से प्रेरित किया जा सकता है, और पेट और हिस्टोलॉजिक विश्लेषण के मानकीकृत सर्वेक्षण का उपयोग करके एक्टोपिक एंडोमेट्रियल घावों की पहचान और मात्रा निर्धारित की जा सकती है ।
एंडोमेट्रियोसिस के कई मुरीन अध्ययन शल्य चिकित्सा से प्रेरित एंडोमेट्रियोसिस का उपयोग करते हैं जिसमें दाता एंडोमेट्रियम को आंत्र, पेट की दीवार या अन्य इंट्रापेरिटोनियल स्थान12, 20के स्थान पर सुस्तित कियाजाताहै। यह प्रत्यारोपित ऊतक के आकार और स्थान के मानकीकरण का लाभ है। हालांकि, जीवित रहने की सर्जरी की अतिरिक्त साजो-सामान की चुनौतियों के अलावा, यह सर्जरी से ही भ्रामक चर पेश कर सकता है, यह देखते हुए कि एंडोमेट्रियोसिस एक भड़काऊ बीमारी है और एक नैदानिक सेटिंग में, एंडोमेट्रियोसिस आमतौर पर किसी भी शल्य प्रक्रिया से पहले विकसित होता है। दूसरी ओर, इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन, प्रतिगामी मासिक धर्म को अधिक सटीक रूप से मॉडल करता है जिसे एंडोमेट्रियोसिस के अधिकांश घावों का कारण माना जाता है।
ओवेरेक्टोमी अक्सर एस्ट्रसिकर चक्र द्वारा शुरू की गई परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए कृंतक मॉडल में किया जाता है; और एंडोमेट्रियोसिस एक हार्मोन पर निर्भर बीमारी है, एस्ट्रोडिओल की सुपराफिजियोलॉजिक खुराक को इन मामलों में प्रशासित किया जाता है। यह अभ्यास यकीनन मानव रोग के लिए माउस मॉडल की प्रयोज्यता को सीमित करता है। हमारा अध्ययन दर्शाता है कि ओवारेक्टोमी मज़बूती से एंडोमेट्रियोसिस घावों को बनाने के लिए आवश्यक नहीं है और एस्ट्रोस चक्र का वह चरण घावों को स्थापित करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करता है।
अन्य इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन मॉडल की कमी घाव आकार या बोझ के व्यक्तिपरक उपायों पर निर्भरता है। जबकि कैलिपर्स या अन्य उपकरणों का उपयोग वस्तुनिष्ठ उपाय प्रदान कर सकता है, ये माप घाव फसल के समय दर्ज किए जाते हैं और इसलिए बाद में सत्यापित नहीं हो पाते हैं और अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता के अधीन हो सकते हैं। हमारे मॉडल में, हिस्टोलॉजिक क्वांटिफिकेशन को नेक्रॉप्सी के बाद लंबे समय तक किया और सत्यापित किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि जो लोग नेक्रॉप्सी करते हैं, उन्हें सकल घावों की पहचान में विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है और प्राप्त हस्तक्षेप के रूप में अधिक आसानी से अंधा हो जाते हैं। इसके अलावा, जैसा कि हमारा काम दिखाता है, केवल सकल रोग पर निर्भर होने पर बीमारी का अनुपात याद किया जा सकता है; इसके अलावा, कई संदिग्ध घाव वास्तव में फिजियोलॉजिकल (जैसे, लिम्फोइड ऊतक) या फाइब्रोसिस हो सकते हैं। अंत में, प्रत्येक माउस में पूरे शारीरिक क्षेत्रों के मानकीकृत वर्गों को लेने से परिवर्तनशीलता और कम हो जाता है। माउस प्रति ऊतक की एक ही राशि की खरीद का यह दृष्टिकोण अपरिहार्य अंडरस्कोरिंग को रोकता है जो छोटे नमूनों और बड़े नमूनों के ओवर स्कोरिंग के साथ होता है, खासकर चूंकि सूक्ष्म रोग मौजूद हो सकता है।
अंततः, ये शोधन दृष्टिकोण को मानकीकृत और सरल बनाने दोनों की सेवा करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक माउस मॉडल होता है जो उच्च थ्रूपुट फैशन में एंडोमेट्रियोसिस का अध्ययन कर सकता है। यह मॉडल रास्ते और दवा लक्ष्यों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक अकथनीय तरीका है, और हमारी प्रयोगशाला वर्तमान में दवा सत्यापन अध्ययन के लिए इस मॉडल का उपयोग कर रही है। यह मॉडल विशेष रूप से सहायक है जब दाता एंडोमेट्रियम बनाम प्राप्तकर्ता पेरिटोनियल पर्यावरण में गुमराह जीन अभिव्यक्ति (या दवा उपचार) के सापेक्ष महत्व को निर्धारित करने का प्रयास करते हैं। यह भी रिपोर्टर चूहों के साथ उपयोग किया जा सकता है (जैसा कि हमने दिखाया है) और इम्यूनोसमझौता और नॉकआउट चूहों।
संक्षेप में, हम कई महत्वपूर्ण नवाचार प्रदान करते हैं जो एंडोमेट्रियोसिस का अध्ययन करने में उच्च विश्वसनीयता, प्रजनन क्षमता और वस्तुनिष्ठता के साथ एक मुरीन मॉडल प्रदान करते हैं। हमारा दृष्टिकोण न केवल घाव प्रेरण के लिए एक सीधी, सुव्यवस्थित प्रक्रिया प्रदान करके क्षेत्र को आगे बढ़ाता है बल्कि डेटा को मापने और रिपोर्ट करने का एक मानकीकृत तरीका भी है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।
Acknowledgments
हम पांडुलिपि की तैयारी के दौरान उनकी महत्वपूर्ण समीक्षा और अंतर्दृष्टि के लिए Reizes प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण में उनकी सहायता के लिए लेर्नर रिसर्च इंस्टीट्यूट में इमेजिंग और हिस्टोलॉजी कोर। इस काम को क्लीवलैंड क्लिनिक में अनुसंधान कार्यक्रम समिति के माध्यम से एक आंतरिक अनुदान वित्तपोषण के माध्यम से और प्रजनन जांच और बायर के लिए सोसायटी के माध्यम से एक बाहरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । Reizes प्रयोगशाला में अनुसंधान भी इलाज के लिए वेलोसानो बाइक के माध्यम से वित्त पोषित है, स्त्रीरोग कैंसर में अनुसंधान उत्कृष्टता के केंद्र, और लौरा जे Fogarty गर्भाशय कैंसर अनुसंधान के लिए कुर्सी संपन्न के माध्यम से । क्लीवलैंड क्लिनिक चित्रा 1 और चित्रा 2 के लिए कॉपीराइट की अनुमति कामालिक है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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