Summary
Endometriozisin birçok kemirgen modeli teknik karmaşıklık, tekrarlanabilirlik ve / veya bağışıklığı baskılanmış hayvanlara veya özel muhabir farelere ihtiyaç duyma ile sınırlıdır. Bağımsız olarak doğrulanabilir, objektif puanlama sistemine sahip ve ovaerektomi veya sağkalım ameliyatı için gereklilik olmayan herhangi bir deneysel fare kullanarak basitleştirilmiş bir lezyon indüksiyon sistemi sunuyoruz.
Abstract
Endometriozis pelvik ağrı ve kısırlığın önde gelen bir nedenidir. Ekstrauterin yerlerde endometriyal dokunun varlığı ile tanımlanır. Endometriozis için yeni tedavilerin ve tanı araçlarının geliştirilmesi, kısmen hastalığın incelenmesindeki zorluklar nedeniyle sınırlı olmuştur. Primatların dışında, az sayıda memeli adet gösterir ve hiçbiri spontan endometriozis geliştirmez. Kemirgen modelleri popülerdir, ancak endometriozis yapay indüksiyonu gerektirir, birçoğu immün sistemi baskılanmış fareler veya cerrahi olarak indüklenen hastalık kullanır. Son zamanlarda intraperitoneal enjeksiyon içeren modellere daha fazla dikkat edilmiştir. Mevcut endometriozis modellerinin çeşitli özelliklerini öznel derecelendirme yerine mikroskobik niceleme dayanan yeni, basitleştirilmiş bir sisteme entegre eden bir endometriozis modeli sunuyoruz. Bu modelde donör farelerin hormonal stimülasyonu, intraperitoneal enjeksiyon, sistematik abdominal etüt ve doku hasadı ve nekropsi sonrası her an yapılabilen ve doğrulanabilen histolojik niceleme gerçekleştiriyoruz. Bu model minimum kaynak ve eğitim gerektirir; murine sağkalım cerrahisinde veya brüt endometriotik lezyonların tanımlanmasında laboratuvar teknisyenleri tarafından uzmanlık gerektirmez; bağışıklık sistemi baskılanmış, immün yetecekli ve/veya mutant farelerde kullanılabilir; ve güvenilir bir şekilde insan endometriotik hastalığı ile histolojik olarak tutarlı endometriotik lezyonlar oluşturur.
Introduction
Endometriozis, kadınlar üzerinde önemli finansal ve sağlık yükleri olan kadın üreme sisteminin esrarengiz bir hastalığıdır1,2. Endometriozis etiyolojisi tam olarak anlaşılamamıştır ve koelomik metaplazi, embriyonik Müllerian restleri, kemik iliği türevli progenitör hücrelerin işe alınması ve retrograd adet3dahil olmak üzere birden fazla açıklama önerilmiştir. Önerilen bu mekanizmaların birden fazla yönü söz konusu olsa da ve hastalığın tüm formlarını tek bir açıklama açıklayamasa da, endometriozis patogenezinin önde gelen modeli retrograd adettir. Retrograd adet, adet atıklarının fallop tüplerinden ve periton boşluğuna geçişidir; adet gören kadınların% 90'ının düzenli olarak retrograd adet gördüğü tahmin edilmektedir4,5. Retrograd adet görmenin bu yaygın fenomeni göz önüne alındığında, endometriozisin neden sadece kadınların bir alt kümesinde geliştiği belirsizdir5. Bu hastalığın etiyolojisini daha iyi anlamak için doğrudan insan çalışmaları mümkün değildir ve hayvan çalışmaları garanti edilir.
Endometriozis hem tedavi etmek hem de çalışmak için bir zorluktur. Hastalığın prevalansı bilinmemekle birlikte %101olarak tahmin edilmektedir. Bazı ileri endometriozis türleri noninvaziv görüntüleme ile doğru bir şekilde tanımlanabilirken, kesin tanı ancak cerrahi olarak elde edilen biyopsi örneklerinin histopatolojik analizi ile elde edilir; görsel olarak hastalıklı gibi görünen lezyonlar, aslında fibrozis veya diğer nedenlerden yara izi olabilir6. Hastalığın şiddeti ve kapsamı semptomatoloji ile ilişkili değildir7.
Endometriozis lezyonları, mikroçevrinde karmaşık şekillerde etkileşime giren heterojen hücre tiplerinden ve popülasyonlardan oluşur, bu nedenle hücresel modellerin yararlılığını sınırlar8,9. In vivo modelleri vardır, ancak bunlar doğal zorluklara ve sınırlamalara sahiptir10,11,12. Primat modelleri idealdir, ancak genellikle uygulanabilir değildir13,14,15. Birkaç primat olmayan memeli adet gören ve kendiliğinden endometriozis geliştiren16. Kemirgen endometriozis modelleri vardır, ancak her birinin sınırlamaları vardır17. Bu modellerin çoğu, donör alıcı duvarına veya bağırsayasına endometriyal doku dikmek veya implante etmek için sağkalım ameliyatı gerektirir, teknik karmaşıklık, anestezi ihtiyacı ve ameliyatın kendisinden şaşırtıcı bağışıklık faktörleri ekler18,19,20. Ek olarak, birçok model yumurtalık ve östrojen takviyesi gerektirir; lezyon verimini artırırken, bu zaman, masraf ve ek sağkalım cerrahisi ekler. Intraperitoneal (IP) enjeksiyon modelleri anestezi veya sağkalım ameliyatı gerektirmez ve bu modeller mantıksal olarak retrograd adeti dikiş modellerinden daha iyi simüle eder21,22,23. Bununla birlikte, çoğu IP modeli, enjeksiyondan sonra endometriyal parçaların rastgele dağılımı ve dolayısıyla lezyon tanımlama ve ölçümünde daha fazla önyargı nedeniyle lezyon konumunda daha fazla değişkenliğe maruz kalmaktadır.
Burada, mevcut endometriozis modellerinin çeşitli özelliklerini öznel derecelendirme yerine mikroskobik niceleme dayanan yeni, basitleştirilmiş ve verimli bir sisteme entegre eden bir endometriozis murine modeli sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu çalışmada hayvanların kullanımı Cleveland Clinic Lerner Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Kamuya açık tüm hayvan bakım ve kullanım standartları, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kurallara uygun olarak gerçek gerçekleştirildi. Bu prosedür aseptik teknikler kullanmaktadır. Petri kabı sterildir. Kullanılan PBS/salin sterildir. Nekropsi ve doku diseksiyonu için cerrahi aletler otoklav ile sterilize edilir. Kontaminasyonu azaltmak için hayvan vakaları arasındaki aletlerde (seans başına birden fazla ise) %70 EtOH kullanıyoruz.
1. Donör ve alıcı farelerin hazırlanması (bkz. Şekil 1)
- Laboratuvar hayvanlarıyla çalışmak için uygun onayın yerinde olduğundan emin olun.
- Farenin zorluğunu belirleyin. Bu deneylerde, C57BL / 6J arka planına sahip wildtype ve mutant fareler kullanılmıştır, ancak benzer modelleri kullanan araştırmacılar BALB / c fareler10gibi diğer fare suşları ile başarıyı bildirmektedir. Ek olarak, donör ve/veya alıcı fareler GFP veya RFP fareleri gibi muhabir sistemlerini kullanabilir (bkz. Şekil 2 ve Şekil 3).
- Endometriyal doku naklinin zamanlaması için, donör farelerin gonadotropin enjeksiyonu sırasında 22-24 günlük olduğundan emin olun. Bu, üreme olarak naif olmalarını sağlar, örneğin henüz östrous bisiklet sürmeye başlamamıştır.
- Alıcı farelerin 2 ila 4 ay arasında üreme bozulmadan (önceden yumurtalık ameliyatı yapılmaz) olduğundan emin olun. Gerekli olmasa da, devam eden östrous bisiklet sürmeyi kolaylaştırmak için ve endometriyal doku naklinden önce tekrar 72 saat içinde, bir erkek fare kafesinden idrarla ıslatılmış yatakların periyodik olarak alıcının kafesine yerleştirilmesi önerilir.
NOT: Bu, alıcıların östrous döngüsünün senkronizasyonunu sağlamaz, çünkü idrarla ıslatılmış yataklar kullanılan erkek yatak miktarına oldukça bağlıdır ve değişken sonuçlara sahiptir. Östrous döngüsünün senkronizasyonu istenirse, 100 ng/100 μL estradiolden oluşan ardışık üç deri altı enjeksiyonu tüm hayvanları östrous faza getirecektir. Estrous döngüsünün evresine dayanan lezyon indüksiyonunda bir fark bulamasak da, diğer gruplar döngü fazını önemli buldu10. - Hamile Mare Serum Gonadotropin'i (PMSG, 200 μL'ye seyreltilmiş 2 IU) ince bir iğne kullanarak (25-27 Gönerilir)deri altından donör farelere deri altından enjekte edin. Endometriozis oluşumuna daha az duyarlı olan yumurtlamayı ve ardından gelen yüksek progesteron ortamını tetikleyeceği için alıcı farelere PMSG vermeyin.
NOT: Önceki fare modelleri, endometriyal hasat23'tenönce donör farelerde endometriyal çoğalması teşvik etmek için PMSG veya östrojen kullanmıştır. PMSG aşağıdaki nedenlerden dolayı önerilir: PMSG'nin yarı ömrü 40 saat, 17-beta-estradiol'un yarı ömrü ise sadece 2 saattir. Endometriyal doku tedariki öncesinde donörlerde 40 saat pmsg tek bir deri altı enjeksiyonu kullanılarak, endojen östrojen uyarmak için hareket gonadotropin stimülasyonuna sürekli bir maruz kalma süresi sağlar. Eksojen östrojenin birçok preparabı, endometriumu yeterince astarlamak için birden fazla enjeksiyon gerektirir. - PMSG enjeksiyonundan sonra, nekropsi, tedarik ve nakli 38-42 saat arasında alıcıya planlayın. Yumurtlamadan önce dokunun toplanmasını sağlamak için gonadotropin enjeksiyonunu takiben endometriyal doku hasadını zamanlayın, bu da enjeksiyon sonrası 42 saattir. Yumurtlama, lezyon indüksiyonunu azaltacak yüksek progesteron (P4) ortamı üretir.
2. Donör fare endometriyal dokusunun temini
- Donör fare ötanaziden sonra (CO2 odasını ve ardından servikal çıkığı kullanarak), karnı% 70 etanol çözeltisi ile püskürtün; bu, temin edilen dokunun cilt florasından ve yerinden edilmiş tüylerden kirlenmesini azaltmaya yarar. Diseksiyon makası ile cilt ve deri altı dokusundan orta çizgide sığ bir enine yudum yapın. Daha sonra cilt kesisinin her iki tarafını kavrayarak, karnı açmak için künt çekiş kullanın.
- Rahmi tanımla. Uterusun çıkarılmasından önce, bitişik bağ dokusunu kesin. Her rahim boynuzu kendi fallop tüpünün hemen altında transekte edin ve daha sonra tüm uterus bloğunu çıkarmak için serviksi transekte edin.
- Karın boşluğundan çıkarıldıktan sonra, uterusun dikkatlice incelenmesi ve ek periferik yağ veya bağ dokusunu çıkarın. Uterusun bir Petri kabına soğuk PBS damlacıklarına yerleştirin. Tüm uterusun birleşik kütlesini belirleyin ve belgeleyin.
- Her boynuzu uterus fundusundan transeksiyon, her boynuzun uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak için fundusa mümkün olduğunca yakın hale getirir. Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla, kesme makasının bir bıçağını ilk boynuzun lümeninin içine yerleştirin, ardından tüpün ana ekseni boyunca kesin. Tüpü dikkatlice açın, hangi tarafın serosa, hangi tarafın epitel olduğunu unutmayın.
- Yeni bir Petri kabına 500 cc tuzlu su veya PBS koyun; yüzey gerilimi nedeniyle sıvı bir arada kalacaktır.
- Daha sonra, uterusun parçalanmasını düzgün bir şekilde gerçekleştirin. Birçok küçük lezyona göre daha az büyük lezyona sahip olmak daha iyidir. Endometriyal tabakayı kavrayarak ve soyup çıkararak epitelleri miyometriyumdan ayırarak başlayın.
- Alternatif olarak, miyometriumu ayırmadan (epitel tarafı tamamen maruz kaldığı sürece) dokuyu parçalayın, ancak miyometriumu korumak bu modelin insan hastalığıyla fizyolojik ilgisini azaltır. Parçaların mümkün olduğunca büyük ancak 18 G iğneden geçecek kadar küçük olduğundan emin olun; (1 mm x 1 mm önerilir).
- Bu 1 mm x 1 mm parçalardan 10-12'sini ilk boynuzdan toplayın (bu da C57BL/ 6J farelerde kabaca 40 mg dokuya karşılık gelir). Toplanan parçaları sıvı koleksiyonuna yerleştirin.
- Fare başına toplam yaklaşık 24 parça için diğer rahim boynuzu için aynı adımları uygulayın. Toplam parça sayısını belgele.
3. Alıcı fareye doku parçalarının periton enjeksiyonu
- Askıya alınan 1 mm x 1 mm'lik parçaları 1 cc şırınnanın künt ucunun künt ucunun kullanılarak aspire edin; toplam hacim 1 mL olmalıdır.
- Tam şırıngaya 18 G'lik bir iğne takın ve sıvıyı iğneye yükleyin. Tüm dokunun iğneden geçmesini sağlamak için Petri kabına sahte bir enjeksiyon düşünün.
- Alıcı fareyi alın. IP enjeksiyonundan önce veya sonra, östrous döngüsü belgeleri için alıcı farenin vajinal bir lekesini elde edin (vajinal delikte ampul şırıngını kullanarak ve kapakla cam kaydırağa kaplanmış 10 μL salin).
- Parçaların şırınd ile intraperitoneal enjeksiyonu 45 derecelik bir açıyla gerçekleştirin, deri altından enjekte etmemeye dikkat edin.
- Parçalar enjeksiyondan sonra kalırsa, tüm parçaların intraperitoneal olarak başarıyla enjekte edildiğinden emin olmak için enjeksiyon için şırındağa ilave 200 μL sıvı çizin.
- Kanama veya komplikasyon olmadığından emin olduktan sonra, alıcı fareleri kafeslerine geri yerleştirin ve normal bir diyetle besleyin.
4. Endometriotik lezyonların hasadı
- Nakil sonrası parça enjeksiyonundan yaklaşık 21 gün sonra alıcı fareleri ötenazi yapın.
NOT: Deneyimlerden ve benzer modelleri kullanan işbirlikçilerle tartışmadan, maksimum lezyon büyüklüğü ve sayısı nakil sonrası yaklaşık 3 haftada gerçekleşir; 3 hafta sonra lezyonlar boyut olarak gerilemeye başlar. IACUC onaylı ötanazi yöntemi kullanılmaktadır. - Ötenazi ve servikal çıkık sonrasında, hayvanın karnına% 70 etanol püskürtün ve cildi diseksiyon makası ile yüzeysel olarak kesmek için çadırlayın. Karnı açıkça açmak için cildi ve deri altı boşluğu makasla inzivaya çıkarın.
- Daha fazla diseksiyon yapılmadan önce, brüt lezyonlar için tam bir anket yapılır, boyutu kaliperlerle ölçülür ve anatomik bölgelerine göre belgelenir (aşağıya bakın).
- Blok olarak üç farklı anatomik bölgenin tam koleksiyonunu gerçekleştirin (lezyonların büyük ölçüde takdir edilip edilemeyeceğine bakılmaksızın). Lezyonlar diğer bölgelerde (örneğin bağırsaklar) görülüyorsa, lezyon aşağıdaki üç alandan birini geçmedikçe bunlar göz ardı edilmeli ve toplanmamalıdır.
- A = karın duvarı/periton (numuneler arasında tutarlı olduğu sürece bir kasete düzleştirilebilir veya yuvarlanabilir).
- B = pankreas ve mezenterik yağ.
- C = parauterin bağ dokusu ve yağ (uterusun etrafını saran ancak mesane dışında herhangi bir organ içermeyen beyaz ışıltılı doku; mesaneyi bir lezyonla karıştırmamaya özen gösterir).
- Diseksiyon yapılan her alanı uygun şekilde etiketlenmiş bir kasete yerleştirin ve histolojik bölümleme için laboratuvar protokolüne göre formalin ve işleme yerleştirin.
- Bölüm formalin blokları iki düzgün derinlikte doku alanı başına iki slaytta (D1 ve D2).
5. Endometriotik lezyonların puanlatması
- Tarama (40x büyütmede) ve arşiv slaytları.
- Dijital slayt okuma yazılımını kullanın, endometriotik bir lezyonun kenarları arasındaki en uzun mesafeyi (X) tanımlayın - kenarın bezlerden mi yoksa stromadan mı oluştuğunu ve işaretleyin. Sürekli bir lezyon stroma ile çevrili bezlerle tanımlanır; çizgi mutlaka sadece endometriotik dokudan geçmez (düzensiz şekilli veya dalgalı bir endometriozis odağında uç noktaların belirlenmesinde olduğu gibi) ancak iki uç noktanın sürekli stroma ve/veya bezlerle bağlanması gerekir (bkz. Şekil 4).
- yukarıdaki kurallara uyarak ikinci satırın uzunluğu belirlenecek şekilde, ilk satır boyunca 90 derecelik ikinci bir çizgi (Y) yapın.
- Bitişik olmayan birden fazla lezyonla karşılaşılırsa, her bireye kendi X ve Y ölçümlerini verin.
- Her slayt için son puanı, her lezyonun alanlarının (X * Y) toplamı olarak hesaplayın.
- O bölgenin (A, B, C) son puanı olarak iki slayttan (D1 vs D2) daha büyük puanları alın.
- Bu hayvan için son mikroskobik puanı vermek için her bölgeden puanları toplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konsept deneyinin ilk kanıtı için, RFP farelerinden donör endometriyum wildtype alıcı farelere enjekte edildi. H&E lekeleme endometriozis lezyonunun klasik mimarisinin histopatolojik teyidini ortaya koydu (Şekil 3A). Floresan mikroskopi, söz konusu gözlenen lezyonun donörden kaynaklandığını doğruladı (Şekil 3B).
İkinci deney, 10 wildtype C57BL/6J bağışçısı ve 10 alıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Ek 5 alıcı sahte tedavi aldı (endometriyal parçalarla değil PBS ile enjekte edildi) ve rastgele bir kimlik numarası atandı; hakemler nekropsi ve histopatolojik incelemeden önce kör edildi.
Tüm alıcılara PSMG donör tedavisinin 42 saat içinde donör endometriyal doku uygulandı. Bu zaman aralığı ile son rahim ağırlığı veya lezyon büyüklüğü arasında korelasyon yoktu. Donör temini sırasında ortalama toplam rahim ağırlığı 54 ± 9,5 mg idi. Ortalama parça sayısı 22.4 ± 5.2 idi ve ortalama parça ağırlığı 2.5 ± 0.5 mg idi. Uç nokta ameliyatı tüm alıcılar için 20.
Ortalama 1,5 lezyon sayısı ve ortalama brüt toplam lezyon çapı 3,7 mm olan bu uç noktalar, enjekte edilen endometriyal parçaların benzer ağırlığına sahip fare modellerini kullanan diğer çalışmalara benzer (Şekil 2)10. Tüm fareler için lezyon prevalansı% 80 idi. Lezyonları olmayan fareler, lezyonlu farelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla endometriyal fraksiyona sahipti (sırasıyla 20.3'e karşılık 30.5 toplam parça; tüm fareler için ortalama toplam parçalar 22.4 idi) enjeksiyon sırasında ortalama parça boyutunun altında (1.9 mg vs 2.6 mg). Beklendiği gibi, sham kontrollerinde (endometriyal parçalar değil, salin enjekte edilir) brüt veya mikroskobik bir hastalık yoktu. Daha sonra genişletilmiş sayıda fare kullanılarak yapılan bir çalışmada, alıcı farenin östrous fazı lezyon sayısı veya mikroskobik hastalık skoru ile ilişkili değildi.
Brüt lezyon sayısı, makroskopik ve dokularda bulunan mikroskobik hastalık arasında uyumsuzluk olduğu için toplam lezyon yükü için zayıf bir taşıyıcı belirteç olarak görünmektedir. Olguların %60'ında (n = 6) makroskopik ve mikroskobik skorlaması arasında anlaşma sağlanmıştır (hem varlığı veya yokluğu gösteren hem de toplam büyüklükteki farkı gösteren anlaşma 3 mm'dir). Ancak olguların %40'ında (n = 4) konsupsuzluk vardı, makroskopik hastalığın %10'u (n = 1) idi ancak histoloji tarafından mikroskobik hastalık mevcuttu, doğrulayıcı histolojide endometriozis olmamasına rağmen%10 (n= 1) makroskopik hastalık görüldü ( Şekil 5 ), kalan %20'si (n = 2) ise varlıkta anlaşma sağlanmıştır ancak lezyon büyüklüğünün büyüklüğü yoktur. Bu nedenle, lezyonlar için makroskopik muayene tek başına endometriozis hastalığı yükünün nicelleştirilmesi için yeterli değildir.
Şekil 1: Modele genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lezyon nicelleştirmesi için araştırılan bölgeler. Bağırsak ve diğer intraperitoneal yerler lezyonları barındırabilirken, bunları brüt olarak ayırt etmek daha zordur ve karınla ilgili kapsamlı bir anket, azalan geri dönüşlerle daha yoğun olacaktır. Bu nedenle, endometriozis oluşumunun en yaygın üç bölgesinde (brüt hastalığın olup olmadığına bakılmaksızın) tam dokuyu toplamanın tutarlı, sistematik bir yaklaşımı gerçekleştirilir: karın duvarı / periton(A), pankreas ve mezenterik yağ (B) ve parauterin yağ (C). Etiketli, üç bölgenin her birinden lezyonların mikroskobik bulgularının temsili görüntüleridir. 40 kat büyütme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kırmızı floresan proteini ifade eden donör fareler endometrium kullanılarak endometriozis indüksiyonu. (A) Lezyonun H&E bölümü. (B) DAPI lekeli floresan mikroskopi. 40 kat büyütme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Lezyon boyutlarının boyutlarını ölçmek ve lezyon yükünü ölçmek için kullanılan yazılımın temsili görüntüleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Histopatolojik inceleme ile endometriozis olmayan brüt "lezyonların" temsili örnekleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmamız, endometriozisin farelerde ovaerektomi ve/veya sağkalım cerrahisi kullanılmadan güvenilir bir şekilde indüklenebileceğini ve ektopik endometriyal lezyonların karın ve histolojik analizlerin standart bir anketi kullanılarak tespit edilip nicelleştirilebileceğini göstermektedir.
Endometriozis ile ilgili birçok murine çalışması, donör endometriyumun bağırsak, karın duvarı veya diğer intraperitoneal konuma dikildiği cerrahi olarak indüklenen endometriozis kullanır12,20. Bu, nakledilen dokunun boyutunu ve yerini standartlaştırma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, sağkalım cerrahisinin ek lojistik zorluklarına ek olarak, endometriozisin enflamatuar bir hastalık olduğu ve klinik bir ortamda endometriozisin tipik olarak herhangi bir cerrahi işlemden önce geliştiği göz önüne alındığında, bu, ameliyatın kendisinden şaşırtıcı değişkenler getirebilir. Öte yandan intraperitoneal enjeksiyon, endometriozis lezyonlarının çoğunluğuna neden olduğu düşünülen retrograd adeti daha doğru modeller.
Ovariektomi genellikle östrous döngüsü tarafından ortaya konan değişkenliği azaltmak için kemirgen modellerinde gerçekleştirilir; ve endometriozis hormona bağımlı bir hastalık olduğundan, bu durumlarda suprafizyolojik estradiol dozları uygulanır. Bu uygulama, bir fare modelinin insan hastalığına uygulanabilirliğini tartışmasız sınırlar. Çalışmamız, endometriozis lezyonlarını güvenilir bir şekilde oluşturmak için ovariektomi gerekli olmadığını ve östrous döngüsünün evresinin lezyon oluşturma yeteneğini etkilemediğini göstermektedir.
Diğer intraperitoneal enjeksiyon modellerinin eksikliği, lezyon büyüklüğü veya yükünün öznel önlemlerine güvenmektir. Kaliperlerin veya diğer aletlerin kullanımı objektif önlemler sağlayabilirken, bu ölçümler lezyon hasadı zamanında kaydedilir ve bu nedenle daha sonra doğrulanamaz ve gözlemci içi değişkenliğe maruz kalabilir. Modelimizde, histolojik niceleme nekropsiden uzun süre sonra yapılabilir ve doğrulanabilir, yani nekropsiyi yapanların brüt lezyonların tanımlanmasında uzmanlığa sahip olmaları gerekmez ve alınan müdahaleye göre daha kolay kör olurlar. Ayrıca, çalışmamızın gösterdiği gibi, sadece brüt hastalığa güvenildiğinde hastalığın bir oranı kaçırılabilir; ek olarak, birçok şüpheli lezyon aslında fizyolojik (örneğin lenfoid doku) veya fibrozis olabilir. Son olarak, her faredeki tüm anatomik bölgelerin standartlaştırılmış bölümlerini almak değişkenliği daha da azaltır. Fare başına aynı miktarda doku temin etme yaklaşımı, özellikle mikroskobik hastalık olabileceğinden, küçük örneklerle ve büyük örneklerin aşırı puanlamasıyla ortaya çıkabilecek kaçınılmaz altını çizmeyi önler.
Sonuçta, bu iyileştirmeler yaklaşımı hem standartlaştırmaya hem de basitleştirmeye hizmet eder ve endometriozis'i yüksek verimle inceleyebilen bir fare modeli ile sonuçlanır. Bu model, yolları ve ilaç hedeflerini taramak için test edilebilir bir yöntemdir ve laboratuvarımız şu anda bir ilaç doğrulama çalışması için bu modeli kullanmaktadır. Bu model, donör endometriyumda anormal gen ekspresyonunun (veya ilaç tedavisinin) alıcı periton ortamına göre önemini belirlemeye çalışırken özellikle yararlıdır. Ayrıca muhabir fareler (gösterdiğimiz gibi) ve bağışıklık sistemi baskılanmış ve nakavt fareleri ile de kullanılabilir.
Özetle, endometriozis çalışmalarında yüksek güvenilirlik, tekrarlanabilirlik ve nesnelliğe sahip bir murine modeli sağlayan birkaç önemli yenilik sunuyoruz. Yaklaşımımız, sadece lezyon indüksiyonu için basit, aerodinamik bir süreç sağlamakla kalmaz, aynı zamanda verileri ölçmenin ve raporlamanın standart bir yolunu da sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Reizes laboratuvarı üyelerine makalenin hazırlanması sırasındaki eleştirel incelemeleri ve içgörüleri için ve Lerner Araştırma Enstitüsü'ndeki Görüntüleme ve Histoloji çekirdeklerine veri toplama ve veri analizi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cleveland Clinic'teki Araştırma Programı Komitesi aracılığıyla bir iç hibe fonu ve Üreme Araştırmaları Derneği ve Bayer aracılığıyla harici bir hibe ile desteklendi. Reizes Laboratuvarı'ndaki araştırmalar ayrıca VeloSano Bike to Cure, Jinekolojik Kanser araştırma mükemmelliği merkezi ve Laura J. Fogarty Uterin Kanser Araştırmaları Için Bağışlanan Sandalye aracılığıyla finanse edilir. Cleveland Clinic, Şekil 1 ve Şekil 2için telif hakkı iznine sahiptir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for injecting PMSG into donor mouse | |||
| 1 mL Tuberculin syringe with 27G needle | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma-Aldrich | 9002-70-4 | |
| Supplies for necropsy of donor mouse and tissue processing | |||
| 6” serrated forceps, curved tip | Electron Microscopy Sciences | 72993-6C | |
| 70% ethanol solution | Pharmco | 33000HPLCCS4L | 70% solution dilute ethyl acetate 200 proof |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ME54TE | |
| Carbon dioxide | TriGas Supplier | ||
| Dissecting tray | Fisher Scientific | S14000 | |
| No. 10 disposable scalpel | Fisher Scientific | NC9999403 | |
| Scissors, curved | Electron Microscopy Sciences | 72941 | |
| Scissors, straight | Electron Microscopy Sciences | 72940 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | Leica SE 4 | For tissue dissection |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | Institutional core facility supplies | ||
| Surgical instrument sterilization tray | Electron Microscopy Sciences | 66112-02 | |
| Tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772E | |
| Weighing dishes | Fisher Scientific | 02-202-103 | |
| Supplies for injecting into recipient mouse | |||
| 1 cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 18 G needle | Fisher Scientific | 148265d | |
| 200 uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-422 | |
| Double distilled water | Institutional core facility supplies | ||
| Latex bulb | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Micro cover glass slip | VWR | 48366-067 | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Standard light microscope | Leica Microsystems | DM IL | For evaluating vaginal cytology smears |
| Supplies for harvesting tissue from recipient mouse | |||
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| Precision Digital Calipers | Electron Microscopy Sciences | 62065-40 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
- Zondervan, K. T., Becker, C. M., Missmer, S. A.
- Schwartz, K., Llarena, N. C., Rehmer, J. M., Richards, E. G., Falcone, T. The role of pharmacotherapy in the treatment of endometriosis across the lifespan. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 21 (8), 893-903 (2020).
- Giudice, L. C.
- D'Hooghe, T. M., Debrock, S. Endometriosis, retrograde menstruation and peritoneal inflammation in women and in baboons. Human Reproduction Update. 8 (1), 84-88 (2002).
- Ahn, S. H., et al. Pathophysiology and immune dysfunction in endometriosis. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Falcone, T., Flyckt, R.
- Vercellini, P., et al. Association between endometriosis stage, lesion type, patient characteristics and severity of pelvic pain symptoms: a multivariate analysis of over 1000 patients. Human Reproduction. 22 (1), 266-271 (2007).
- Bulun, S. E., et al.
- Brueggmann, D., et al. Novel three-dimensional in vitro models of ovarian endometriosis. Journal of Ovarian Research. 7, 17 (2014).
- Dodds, K. N., Beckett, E. A. H., Evans, S. F., Hutchinson, M. R. Lesion development is modulated by the natural estrous cycle and mouse strain in a minimally invasive model of endometriosis. Biology of Reproduction. 97 (6), 810-821 (2017).
- Martinez, J., Bisbal, V., Marin, N., Cano, A., Gómez, R. Noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), (2019).
- Pelch, K. E., Sharpe-Timms, K. L., Nagel, S. C. Mouse model of surgically-induced endometriosis by auto-transplantation of uterine tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3396 (2012).
- Nishimoto-Kakiuchi, A., et al. Spontaneous endometriosis in cynomolgus monkeys as a clinically relevant experimental model. Human Reproduction. 33 (7), Oxford, England. 1228-1236 (2018).
- Nair, H. B., et al. An efficient model of human endometriosis by induced unopposed estrogenicity in baboons. Oncotarget. 7 (10), 10857-10869 (2016).
- Laganà, A. S., et al. Translational animal models for endometriosis research: a long and windy road. Annals of Translational Medicine. 6 (22), 431 (2018).
- Bellofiore, N., et al. First evidence of a menstruating rodent: the spiny mouse (Acomys cahirinus). Amercian Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (1), 1-11 (2017).
- Bruner-Tran, K. L., Mokshagundam, S., Herington, J. L., Ding, T., Osteen, K. G. Rodent models of experimental endometriosis: identifying mechanisms of disease and therapeutic targets. Current Women's Health Reviews. 14 (2), 173-188 (2018).
- Bilotas, M. A., et al. Interplay between endometriosis and pregnancy in a mouse model. PloS One. 10 (4), 0124900 (2015).
- Peterse, D., et al. Of mice and women: a laparoscopic mouse model for endometriosis. Journal of Minimally Invasive Gynecology. 25 (4), 578-579 (2018).
- Richards, E. G., et al. KLF11 is an epigenetic mediator of DRD2/dopaminergic signaling in endometriosis. Reproductive Sciences. 224 (8), Thousand Oaks, Calif. 1129-1138 (2017).
- Jones, R. L., Lang, S. A., Kendziorski, J. A., Greene, A. D., Burns, K. A. Use of a Mouse Model of Experimentally Induced Endometriosis to Evaluate and Compare the Effects of Bisphenol A and Bisphenol AF Exposure. Environmental Health Perspectives. 126 (12), 127004 (2018).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Nothnick, W. B., Graham, A., Holbert, J., Weiss, M. J. miR-451 deficiency is associated with altered endometrial fibrinogen alpha chain expression and reduced endometriotic implant establishment in an experimental mouse model. PloS One. 9 (6), 100336 (2014).
