Summary
此协议描述了皮肤成纤维细胞转化为肌细胞及其分化成肌管。细胞系来自神经肌肉疾病患者，可用于研究病理机制和测试治疗策略。
Abstract
对肌肉营养不良症的病理生理学和治疗靶点的调查都因人类肌细胞的增殖能力有限而受阻。已经创建了几个小鼠模型，但它们要么不能真正代表人类对这种疾病的生理病理学，要么不能代表人类中发现的广泛突变。人类原发性肌瘤的永生是这一局限性的一种替代：然而，它仍然依赖于肌肉活检，这是侵入性的，不容易获得。相比之下，皮肤活检更容易获得，对患者的侵入性更小。从皮肤活检中提取的纤维细胞可以永生并转导成肌细胞，提供具有极高肌原潜力的细胞来源。在这里，我们描述了一个快速和直接的重新编程方法的成纤维细胞成致远的血统。纤维细胞被两种扁豆病毒所传递 ：hTERT 使原始文化永生，以及一种可诱导的 MYOD，在添加多氧环素后，诱导成纤维细胞转化为肌细胞，然后成熟肌管，表达后期分化标记。这种快速的异位治疗方案是研究病理机制和研究神经肌肉疾病的创新基因或药理生物疗法的有力工具。
Introduction
直接从人体组织获得的细胞模型有助于模拟许多人类遗传性疾病，其优点是具有原始的基因组背景，并在许多情况下复制患者观察到的相同分子和细胞特征。在神经肌肉疾病领域，肌肉活检一直是人类肌细胞的一大来源，有助于阐明病理机制。此外，它们是药物和基因疗法体内测试的重要工具。一方面，从肌肉碎片中提取肌细胞相对容易。另一方面，原发性肌细胞的培养和维持是具有挑战性的，因为它们的增殖率有限，体外1的复制衰老。这些局限性的一个替代方案是，通过插入人类端粒酶（hTERT）和/或环素依赖激酶4（CDK4）基因2，3，保持骨骼肌肉特征4，使肌细胞永生。然而，原发性肌细胞的衰减仍然依赖于肌肉活检，这是一种对患者不利的外科手术，在许多情况下，患者的肌肉处于晚期退化。因此，这些患者的肌肉由相当一部分纤维化和/或脂肪组织组成，产生更少的肌肉细胞，需要净化以前不朽的细胞。
与肌肉活检相比，皮肤活检更容易获得，对患者的危害也较小。原发性成纤维细胞可以从 体外的皮肤碎片中提取。虽然成纤维细胞主要不受导致神经肌肉紊乱的突变的影响，但它们可以转入肌细胞。这可以通过插入Myod基因来实现 ，Myod 基因是一种致幻调节转录因子5。在这份手稿中，我们描述了获得异化肌细胞的协议，从成纤维细胞文化的建立到分化肌管的消减（ 图1中描述了该方法的代表性摘要）。
治疗策略的临床前测试取决于携带类似于人类患者突变的细胞和动物模型。虽然随着CRISPR/Cas96等基因编辑技术的进步，动物模型的发展变得更加可行，但它仍然具有挑战性和代价高昂。因此，患者衍生的细胞系是建立模型的可访问选项，涵盖大量疾病突变，如杜氏肌营养不良症 （DMD）。细胞模型的沉降和创建对于开发针对此类病理的个性化疗法至关重要。
在已调查的个性化疗法中，exon跳过策略是针对不同肌肉萎缩症的有希望的策略之一。此策略包括生产更短但功能性强的蛋白质。这是通过将外来定义隐藏到拼接体中来执行的，因此从最终信使中排除变异的外在定义。这是一个非常有前途的技术，已被FDA批准为DMD。因此，我们还在此协议中描述了用两种不同的外在跳过相关技术来转染肌细胞的方法：抗感寡核苷酸 （AON） 和 U7snRNA-腺相关病毒 （AAV）。AON变性是一个很好的工具，为初步筛选几个序列，旨在促进exon跳过9。但是，AON 的活动是短暂的。为了获得反感序列的持续表达，我们还探索了小型核RNA（snRNA）与AAV相结合，允许核定位和纳入拼接机械10。U7 是参与组蛋白 mRNA 处理的 snRNA，可设计为结合蛋白质，将其重定向到拼接体并提供抗感序列11。使用改性 U7 snRNA 与 AAV 向量相结合，克服了 AON 的局限性，从而继续表达 AON，并更好地传递感兴趣的组织12。我们使用来自DMD患者的细胞来说明免责策略。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验和活检都是按照国家儿童医院机构审查委员会批准的有关机构的道德规则进行的。
1. 皮肤成纤维细胞文化的开始
- 建立成纤维细胞文化
- 阿里引用 10 mL 的成纤维细胞介质 （表 1） 在 15 ml 圆锥管。皮肤活检应放置并运送到这种介质中。活检可以存储在4°C，直到它被处理，优先在同一天。
注：在24-36小时内使用皮肤活检，以避免潜在的污染增长。 - 从管子中吸气介质，用 10 mL 1X PBS （室温） 冲洗活检三次。第三次洗涤后，将 PBS 留在管子中。
- 倒出PBS和皮肤到10厘米2 菜。
- 使用无菌手术刀，将活检切成尽可能小的碎片。
- 使用移液器，转移单个皮肤碎片，并将其放入干净的 10 厘米2 盘中。每道菜放置 10 到 12 个片段。
- 从每个片段周围吸出多余的 PBS。小心不要吸气碎片。
- 用盖子部分盖住盘子，让皮肤碎片干燥5-20分钟。不要让碎片过度干燥。
- 一旦碎片干燥，将盘子倾斜45度，然后慢慢将12mL的成纤维细胞介质添加到角落。放下盘子，小心地分发媒体，这样碎片就不会被媒体抬起来。
- 将菜肴放入孵化器（37 °C， 5% CO2）。在 5 - 7 天内更换媒体， 一周后更换一次。
- 观察从碎片（图2）中浮现出的成纤维细胞，一旦融合，将细胞进入75厘米2 的烧瓶中。取出介质，用PBS冲洗细胞，并添加1 mL 0.25%的试金石。在37°C下孵育5分钟，或直到所有细胞被解除。加入10 mL成纤维细胞生长介质，抑制试金石，并将细胞转移到新的烧瓶中。
注：对于通道编号命名，P1 是在皮肤活检中出现的第一个成纤维细胞转移到新的增殖烧瓶中时建立的。
- 阿里引用 10 mL 的成纤维细胞介质 （表 1） 在 15 ml 圆锥管。皮肤活检应放置并运送到这种介质中。活检可以存储在4°C，直到它被处理，优先在同一天。
- 原发性成纤维细胞线的冷冻保存
- 一旦 75 厘米2 烧瓶汇合， 冲洗它与 10 ml 1X PBS 和吸气 PBS.
- 在细胞表面添加 3 mL 的 0.25% 试金石。将烧瓶放在孵化器中5分钟。检查显微镜下的烧瓶，看看细胞是否被抬起来。否则，将烧瓶放回孵化器中5分钟。
- 一旦细胞分离，在烧瓶中加入7 mL的成纤维细胞介质，上下移液器以重新悬浮细胞。将细胞收集到 50 mL 圆锥管中。
- 准备 100 μL 的尝试盘蓝色，并从低温保存的样品中去除 100 μL，与试盘蓝色混合。将混合物加载到血小计上以计数。在显微镜下的血细胞计的四个不同领域计数细胞。要计算细胞总数，请使用公式：（计数细胞/100） * 培养量。
- 在室温或 4 °C 下以 300 x g 旋转圆锥管 10 分钟。
- 吸出介质，在足够体积的冷冻介质中重新悬生细胞：每100万个细胞/小瓶1 mL。上上下下的移液器进行均质化，并将 1 mL 分发到每个标记为低温的低温。
- 将小瓶放入冷冻盒中，让小瓶在 -80 °C 冰柜过夜时以 1 °C/min 的速度冻结。
- 第二天将小瓶转移到液氮罐或-150°C冰柜。
2. 建立纤维肌细胞（FM）细胞系
- 种子原成纤维细胞在大约30%的汇合在两个井的12井板（2×104 细胞/井），以便有约50%的汇合第二天。
- 对于扁豆病毒转导，在400μL的成纤维细胞介质中加入2至5 x10 9 vg（病毒基因组颗粒）的hTERT-普洛霉素扁豆病毒。到第二口井，只需添加400μL的成纤维细胞介质。第二天添加1 mL的媒体。
注：用于生产扁豆病毒的质粒是从出版2009年论文《潮汕 等人》的小组获得的。他们还单独描述在奥雷 等人， 200713 为 hTERT 质粒和巴德 等人， 200614 为 Tet-on 系统用于设计 MyoD 质粒.他们获得感谢与法国吉纳顿的材料转移协议（请联系文森特·穆利博士获得这些质粒 - vincent.mouly@upmc.fr）。简言之，hTERT 由由 CMV 推广器驱动的 hTERT 变体 1 组成，而紫杉素则由 PGK 推广器驱动。MyoD 质粒包含由压抑器 rtTA2 控制下的 CMV 推广器驱动的 MyoD 变种 1。此质粒还包含由于 SV40 推广商而表示的催眠素选择。
伦蒂病毒是使用常规的扁豆病毒生产（见王和麦克马纳斯JoVe协议15）。简言之，MDL助手、修订助手、SVS-G助手也通过氯化钙沉淀物或肌病质粒进行传播。48小时后，超纳坦被收集，然后额外的三天。然后，所有超纳坦都集中在超中心。然后，颗粒被重新插入特里斯-HCL+纳克勒埃塔缓冲区。通过标准扁豆病毒 qPCR 检测评估了滴答声估计。 - 一两天后，将细胞转移到一个6井板中，并将其生长到达到60-70%的汇合度。
- 用 1μg/mL 的紫霉素补充成纤维细胞介质，并在每个井中添加 2 mL。
- 保持细胞的选择，直到所有细胞在控制井死亡（长达12天），每2-3天更换媒体。将细胞从6井板中传递到两个10厘米2 的盘子中，以进一步增殖。
- 选择后冷冻成纤维细胞瓶。标记为 F （hter）。
- 种子 hTERT 表达成纤维细胞 （F（hTer）在成纤维细胞介质中约 30% 的汇合，在 12 井板的两口井中，第二天有大约 50% 的汇合。
- 对于扁豆病毒的转导，在400μl的成纤维细胞介质中混合2至5×10 9 vg的MyoD-hygromycinB扁豆病毒，并添加到相应的水井中：到第三口井添加400μl成纤维细胞介质。第二天添加1 mL的介质。
- 一两天后，将细胞转移到一个6井板，并增长到60-70%的汇合。
- 用催眠素 B （400μg/mL） 补充成纤维细胞生长介质，并在每个井中添加 2 mL。
- 保持细胞的选择，直到所有细胞在控制井死亡（长达12天），每2-3天更换媒体。
- 选择后冷冻成纤维细胞瓶。标记为调频，然后是手机识别号/名称。
3. 跨差异协议
- 种子将调频转移到10厘米2 菜与30-40%的汇合。在 12 井板中，种子 6 x 104 细胞（这取决于单个细胞线）。
注：对于免疫污染，种子细胞到玻璃盖片或室滑梯涂有马特里格尔。在 DMEM 介质中 1：10 稀释马特里格尔，添加足够覆盖表面的体积，让幻灯片在室温下坐一个小时。在播种细胞之前先吸气。 - 对于肌细胞诱导，当成纤维细胞达到70%的汇合（图3A），用PBS冲洗细胞表面，并添加新鲜的肌细胞介质，辅以新鲜的8微克/mL多氧环素。
注：分化的成功率超过80%。 - 两三天后，细胞是90-95%的汇合体，其形态将发生变化（图3B）。用PBS冲洗细胞表面，并添加新鲜的分化介质，辅以新鲜的8微克/mL多氧环素。
- 继续改变媒体每2-3天不通过，直到肌管建立（通过形态确认）（图3C）。
- 在开始肌管分化后七到十天，细胞应完全分化，并可能开始分离或死亡。在此之前，收获肌管作进一步分析。
注：肌管形成的时间过程取决于细胞线。肌肉相关蛋白质的突变可能会干扰肌原电位。当肌管开始显示明亮，并看起来白色的边界，这是一个信号，他们开始分离（图4）。 - 要收获肌管，收集介质并将其转移到 50 mL 圆锥管中。介质可能包含已分离的肌管。
- 用 5 ml PBS 冲洗肌管，并将 PBS 传输到 50 mL 管。
- 在细胞表面添加 3 mL 的 0.25% 试金石。将菜放入孵化器5分钟。检查显微镜下的盘子，看看细胞是否被抬起来。否则，将其放回孵化器中5分钟。
- 一旦细胞分离，将7mL的成纤维细胞介质添加到盘中，上下移液器以重新悬念细胞。将细胞收集到 50 mL 圆锥管中。
- 离心机在1，200 x g 7分钟在4°C。
- 小心地从液体中吸气，而不会干扰颗粒。将颗粒存放在-80°C，直至进一步加工。
4. 分化肌管的免疫
注：如上所述，用于免疫污染，将细胞生长在玻璃盖片或室滑梯中。
- 一旦肌管完全分化，吸气关闭媒体，并仔细冲洗幻灯片与PBS。吸气 Pbs 关闭。
- 加入新鲜的 4% PFA（12 井板每口井 500μL），并在室温下孵育 10 分钟。吸气 Pfa 关闭。
- 用1 mL PBS冲洗。
- 在室温下用0.2M甘氨酸孵育，10分钟。吸气甘氨酸关闭。
- 渗透与PBS 0.5% TritonX-100 （300μL/井的12井板），10分钟与温和的搅拌。
- 用 300 μL/井的阻塞溶液块，轻轻搅拌 10 分钟。
- 在300μL的阻塞溶液中用原发抗体稀释1：50，在室温下孵化2小时，轻轻摇晃。
- 用 1 mL/井的 PBS 冲洗三次 5 分钟，轻轻摇晃。
- 在300μL的阻塞溶液中用二次抗体孵化1：500，在室温下浸生1小时，轻轻摇晃。用铝箔盖住盘子。
- 用 1 mL/井的 PBS 冲洗三次 5 分钟，轻轻摇晃。
- 在PBS中稀释DAPI10分钟。用 1 mL/井的 PBS 冲洗三次。
- 在玻璃滑梯中添加一滴安装介质。用钳子取下盖夹，面朝下放在安装介质的下降处。
- 倒滑到纸巾上，轻轻按压以去除气泡和过多的安装介质。
- 用指甲油密封幻灯片，并将存储在 4 °C，直到成像。
5. 反感寡核苷酸转染
注：以下协议用于 6 井板的变换。相应地调整体积，以适应较小或更大的板材。当细胞准备好分化步骤时，在100%的粘合肌细胞中完成转染。
- 吸气肌细胞生长介质，用1 mL PBS冲洗细胞。
- 加入 500μL/井的 OptiMEM 介质，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
- 稀释OptiMEM 100 μL中的抗义寡核苷酸（AON）至所需的最终浓度（即50nM、100nM、200nM、500nM）。在室温下孵育5分钟。
注：此协议针对 2'甲基磷酸酯 AON 进行了优化。 - 将脂胺与 OptiMEM（最终体积为 100 μL）混合，最终比例为 1：1（μg DNA：μL 脂胺）。在室温下孵育5分钟。
- 将稀释的脂胺与稀释的 AON 混合。通过管道轻轻混合，在室温下孵育20分钟，使形成复杂。避免气泡。
- 在各自的油井中加入200μL的脂胺和AON混合物。在37°C、5%CO2下过夜孵育细胞。
- 第二天去除转染混合物，加入2 mL的温分化介质，辅以多氧环素。
- 收集细胞至少三天后进行RNA提取或7至21天，以防蛋白质分析。
注：检测RNA和/或蛋白质表达所需的分化天数可能因兴趣基因或细胞系而异。就 DMD而言，有可能在三天内检测到其mRNA。营养不良蛋白检测至少需要7天时间。这将因单元格线而异。高浓度的AON和转染试剂会影响变性。
6. AAV1-U7转导
注：此协议已针对 6 井板进行了优化。根据文化表面积按比例调整体积。当细胞准备好分化步骤时，转导在 100% 汇合肌细胞中完成。AAV1 是具有培养肌细胞最佳转导能力的 AAV 血清型。
- 吸气关闭肌细胞生长介质，用1 mL PBS冲洗细胞。
- 稀释 0.5-1 x10 11 AAV1-U7 病毒颗粒在 700μL 的温暖分化介质中，辅以多氧环素。
注：我们使用qPCR来确定病毒浓度。所使用的病毒数量可能因定量方法而异，应事先使用记者检测确定。 - 将病毒混合物均匀地丢弃到井中。
- 第二天，加入1.3 mL的温分化介质，辅以多氧环素。
- 收集细胞至少三天后进行RNA提取或7至21天蛋白质分析的情况下。
7.RNA提取
注意：在此步骤中使用的所有材料都应无 RNase。
- 每粒添加500μL的三氧化二醇，并上下吹几次，以确保细胞均匀地解冻。
- 将细胞在1.5mL管中解压，并在室温下孵育5分钟。
- 加入 100μL 的氯仿，手动摇动 15 s。在室温下孵化5分钟。
- 离心机在 12，000 x g 15 分钟在 4 °C。 收集液相（上一），并将其转移到一个新的1.5 mL管。
- 对于水相的1卷，100%添加1卷乙醇，并通过管道混合。
注：我们建议柱子净化和浓度。 - 将样品传输到收集管中的 Zymo-Spin IC 柱，30 s 时以 12，000 x g 的速度将离心机传输到 Zymo-Spin IC 柱。丢弃流经。
- 对于内列 DNase I 消化，用 400 μL RNA 洗涤缓冲区预洗柱。离心机在12，000 x g 30s。丢弃流经。
- 每个样品准备 40μL 的 DNase 反应混合物。将 5 μL DNase I 与 35μL DNA 消化缓冲区混合。
- 将混音直接添加到列矩阵中。在室温下孵化15分钟。
- 将 400 μL RNA 准备缓冲区添加到柱子中，在 30 s 时以 12，000 x g 的速度离心机。丢弃流经。
- 将 700 μL RNA 洗涤缓冲区添加到柱子中，在 30 s 时以 12，000 x g 的速度离心。丢弃流经。
- 将 400 μL RNA 洗涤缓冲区添加到柱子中，以 12，000 x g 的速度离心机 2 分钟，以确保完全去除垫圈。将柱子小心地转移到无 Rnase 的 1.5mL 管中。
- 直接将 15 μL 无核素水添加到柱矩阵中。孵化5分钟，离心机在12，000 x g下孵化1分钟。
注：收集已清除的RNA，并再次将其应用到柱子上以增加产量。离心机在 12，000 x g 1 分钟。 - 将样品放在冰上，并在纳米滴中量化样品。
- 将样品存放在-80°C。
8. RT-PCR 分析
注：在这一步骤中，我们提出了一个试剂的建议，以检测肌营养不良素mRNA的表达，但它可以很容易地适应其他试剂的选择。
- 反转录
- 解冻所有的试剂，并保持他们在冰上。
- 准备与 4 μL 的 5 倍反应缓冲区、2 μL 的 dNTP 混合 （10 mM）、1 μL 的 RiboLock RNase 抑制剂和 1 μL 的恢复援助 RT 混合。
- 轻轻地混合管子和离心机短暂。
- 在 0.2 mL PCR 管中，添加足够的RNA体积，以便每个反应有 1 μg。添加无核素水 q.s.p 12 μL. 包括一个没有反向转录酶的管子作为负控制，一个管子与无核水而不是RNA。
- 每管分配 8 μL 的反应混合。总音量为 20 μL。
- 将管子放在热循环器中，在 25 °C 下孵育 5 分钟，在 42 °C 下孵育 60 分钟。 在70°C下加热5分钟，停止反应。
- 将管子放在冰上或 -20 °C 处，以延长存储时间。
- PCR
注意：最好在外显子路口设计引物。- 涡流试剂，使用前旋转。
- 使用 0.5 μL 前引物（25μM）、0.5 μL 反向入门（25μM）、12.5 μL 2x PCR 主混合和 8.5 μL 的无核素水（每个样品）准备主混合。
- 阿里引用 22 μL 的主混合到每个样品的管子中。
- 在其各自的 PCR 管中添加 3 μL 的 cDNA （150 ng）。将 3 μL 无核糖水添加到 PCR 负控制管中。
- 漩涡和旋转PCR管。
- 在95°C下孵化管子3分钟，95°C30秒，（Tm-5）°C30秒，72°C（1分钟/kb）34次，72°C5分钟。
注：最佳退火温度可以实证确定。对于建议的主混合，从引体熔化温度中减去 5 °C。 - 将 PCR 反应的 12 μL 加载到阿加罗斯凝胶上，并将样品冻结在 -20 °C。
9. 西方污点检测营养不良表达
注：此协议针对一种大膜蛋白肌营养不良素进行了优化。不同蛋白质可能需要特定的条件。
- 蛋白质提取
- 经过7-21天的分化，收集含有5 mL PBS的细胞，100μL 0.5 M EDTA和50μL蛋白酶抑制剂。在37°C下孵化，直到细胞分离。离心机在1，200 x g 5分钟在4°C。 将管子浸入液氮中，将颗粒快速冻结。将颗粒存放在 -80 °C 或继续裂解步骤。
- 通过添加 1% 的数字素、1% 蛋白酶抑制剂、10% 的磷酸酶抑制剂和总体积的基础缓冲器（每个细胞颗粒 60μL）来准备裂解缓冲区。
- 在冰上将60μL的裂解缓冲器添加到细胞颗粒中。声波为5s。让我们在冰上坐8s。重复声波和休息步骤两次。
- 在冰上孵化样品30分钟。
- 离心机在 14，000 x g 20 分钟在 4 °C。
- 将超纳坦转移到清洁管中。
- 按照制造商的说明，通过双霉素酸 （BCA） 检测量化样品。
- 将蛋白质溶液与适量的莱姆利缓冲液混合。制作 100μg 的别名。如有必要，用基础裂解缓冲器将体积调整为 25μl。将样品存放在-80°C。
- 西方印迹
- 在冰上解冻样品。
- 在100°C下将样品分解5分钟，然后在冰中冷却，旋转下来。
- 在 200 mLdH2 O 中稀释 20 倍三酸醋酸盐 SDS 运行缓冲区，并添加 500 μL 抗氧化剂。
- 通过取出梳子和用 dH2O 冲洗来制备 3-8% 的三酯-醋酸聚丙烯酰胺凝胶。将凝胶组装在电泳装置中。用运行缓冲器填充内部腔室。
- 在凝胶中装载 5 μL 的蛋白质阶梯和 25μL 的样品。用运行缓冲器填充外室。
- 在 4 °C 下以 80 V 运行 1 小时。 然后，在120 V为2小时在4°C。
- 准备 3 L 的 1X 转移缓冲区，150 mL 的 20X 甲醇，150 mL 的 20X 转移缓冲区，以及 2，700 mL 的 dH2O. 将其冷却到 4 °C。
- 切 4 片滤纸和一块硝基纤维素膜。用转移缓冲器将滤纸和膜浸泡在托盘中。
- 轻轻地从箱子中取出凝胶，并用滤纸、膜和海绵将其组装在转移装置中。凝胶放在负侧，膜放在正侧。
- 在300 mA运行传输，在4°C下搅拌，过夜。
- 在室温下，用温和的搅拌将膜块在10mL的阻塞缓冲区中1小时。
- 用 10 mL 阻塞缓冲液和 50μL 营养不良素抗体 （1：200） 准备原发抗体溶液。
- 丢弃阻塞缓冲区并添加主抗体解决方案。在室温下或在4°C过夜时，在温和的搅拌下孵化至少2小时。
- 用 0.1% Tween PBS 冲洗膜三次，轻轻搅拌 5 分钟。
- 使用 10 mL 阻塞溶液、2 μL 抗兔抗体 （1：5000） 和 20 μL 0.2% Tween 准备二次抗体溶液。
- 将次要抗体溶液添加到膜中。孵化1小时，轻轻搅拌，覆盖铝箔，以防止光线。
- 丢弃抗体溶液，用0.1%Tween PBS冲洗膜3次，5分钟，轻轻搅拌，免受光线照射。
- 在成像设备上曝光和成像膜。
- 按照制造商的说明，用还原 700 总蛋白质污渍对总蛋白质的膜进行污渍。
注：西斑的肌营养素检测取决于患者的年龄/突变，以及细胞融合和保持依附足够时间积累足够的营养不良素的能力。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
此协议展示了如何建立人类皮肤衍生的成纤维细胞培养物，并将它们转化为肌细胞，然后转化为差异化肌管。这种类型的细胞系对于神经肌肉疾病的研究和潜在疗法的 体外 测试非常有用。
图 1中显示了成纤维细胞转换的示意图。 图 2A 显示了皮肤碎片和从皮肤上冒出的成纤维细胞。当达到交汇点（图2B）时，成纤维细胞应传递给新菜。 图3A 显示了成纤维细胞的理想汇合，然后再改为以多氧环素补充的肌细胞生长介质。细胞应该是大约70%的汇合，因为它们在转换过程中仍然增殖。如果细胞的汇合率超过80%，则分化可能会受到影响。转换成肌细胞需要两到四天的时间，并且通过对形态的观察来证实。细胞变得拉长和平行定向，如 图3B所示。在添加分化介质后，肌细胞停止分裂并开始融合，形成多核肌管（图3C）。当肌管边界看起来白色和明亮时，它们将分离（图4）。此时，收集或修复细胞。
分化成功率因不同的细胞系/突变而异。成熟肌管表达的肌肉蛋白的免疫素证实了转化成纤维细胞的致癌潜力（图5）。RNA-Seq分析比较FM肌管和骨骼肌肉显示高水平表达从胚胎（MYH3）和新生儿（MYH8）肌素链基因和良好的整体转录体与肌肉的全相关性（图6）。FM肌管也表达了巨大的肉瘤蛋白钛素（TTN）、内布林（NEB）和默默无闻（OBSCN）的记录，表明这些与肌纤维素发生有关的大记录的调控。因此，FM细胞具有肌肉特异性表达轮廓，表明它们是肌肉衍生细胞系的有用且可靠的代孕。
为了说明exon跳过，我们使用此协议在 DMD 基因中最频繁的exon复制之一。exon 2的重复导致DMD阅读框架的中断，因此，在exon跳过后恢复阅读帧应导致全长营养不良素的表达。 但是，跳过 exon 2 也有可能非常有效，从而产生帧外成绩单。然而，在这种情况下，跳过exon 2的两个副本诱导使用另一种内部核糖体入口站点（IRES）存在于exon 5，从而产生功能N-截断性营养不良素，在70年代12岁的患者仍然膨胀。 图7A 显示了具有exon 2复制的调频细胞RT-PCR的代表性结果。FM细胞使用AON或AAV1-U7进行治疗，其抗感序列可以跳过exon 2。在 图7B中，免疫细胞显示在用AAV1-U7治疗的调频细胞中检测到N-截断的营养不良素。FM细胞的 体外 治疗是外逃策略的概念证明。
图1：成纤维细胞转化为致癌细胞的示意图表示。 皮肤活检是从人类受试者那里获得的。皮肤碎片被放置在文化菜肴上。一周之内，成纤维细胞开始出现。纤维细胞首先与 hTERT 基因一起发生，然后与 Myod 基因一起，使用扁豆病毒载体。在选择受感染细胞的抗生素后，由于在肌细胞生长介质中加入多氧环素而诱导转化为肌细胞。在两到四天内，细胞变得拉长和平行定向。切换到分化介质后，肌细胞相互融合，形成多核肌管。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：文化中的皮肤活检片段。 （A） 从皮肤碎片中浮现出的第一个成纤维细胞。（B） 从皮肤碎片中浮现出融合成纤维细胞。缩放栏：50μm。请单击此处查看此数字的较大版本。
图3：纤维细胞的异化。 （A） 70%的汇合成纤维细胞的代表性图像。（B） 转换的肌细胞拉长了形态，并平行组织。（C） 肌管被区分为7天。缩放栏：50μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
图4：分离肌管的代表性图像。 箭头表示肌管的白色和明亮的边缘开始分离。缩放栏：50μm。 请单击此处查看此数字的较大版本。
图5：分化肌管的免疫荧光。肌管中肌素重链的免疫控制来自健康（A）个体和神经肌肉疾病患者（B和C）。在 B 中显示来自肌营养不良类型 1 （DM1） 的细胞携带 230 CTG 重复，在 C 中显示 900 CTG 重复的 DM1 细胞。比例尺：100μm。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图6：与骨骼肌相比，FM肌管的转录模式。 与骨骼肌相比，FM肌管的转录模式。从调频肌管和人类骨骼肌肉活检中编写的 Illumina RNA-Seq 库中显示的 12，134 份成绩单的读数为百万次映射读数。两个图书馆之间的成绩单水平与皮尔逊相关性为 0.71，斯皮尔曼级相关性为 0.73。发育肌素重链和大型肉瘤蛋白的脚本以红色突出显示。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图 7：代表性的 Rt - pcr 和西方污点显示 Dmd 在 Fm 细胞中跳过。 （A）由 Rt - pcr 表达 Dmd 。携带DMD外泄物2复制的患者的纤维细胞被转换成调频细胞。从肌肉活检中提取的RNA被用作对照，表明调频未经治疗的细胞表达相同的重复成绩单。使用 AON 治疗的 FM 细胞部分跳过了 exon 2 复制，而 AAV1-U7 处理的细胞显示成绩单占主导性，外显子 2 重复跳过。（B） 用 AAV1-U7 治疗的 FM 细胞的代表性免疫细胞。治疗后14天（箭头指示）检测到较小的N型脱粒性营养不良素。以前在 Wein 等人中发布的数据。从DMD exon 5 IRES的翻译导致功能性营养不良的同位素，衰减人类和小鼠的营养不良病变。自然医学。2014. 2020 斯普林格自然有限公司 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 纤维细胞生长介质 | DMEM 与 20% FBS， 1% 抗生素抗菌剂 |
| 冻结介质 | 10% DMSO， 90% 成纤维细胞介质 |
| 多氧环素库存溶液 1000X | 8毫克多西环素在1 mL超纯水。过滤0.22 μm注射器过滤器。PCR管中的阿里引用。存放在-20°C，免受光线照射。 |
| 肌细胞介质 | 骨骼肌肉细胞生长介质（见上文列表）与补充剂，8μg/mL多氧环素。例如：100 mL 中的 100 μL 1000X 股票解决方案。 |
| 差异化介质 | 骨骼肌肉细胞分化介质与补充剂（见上文列表），8μg/mL多氧环素。例如：100 mL 中的 100 μL 1000X 股票解决方案。 |
| 用于染色的阻塞解决方案 | 10%山羊血清（或饲养二次抗体的动物血清）在1X PBS |
| 蛋白质提取的基础缓冲区 | 纳克 150 米， 特里斯 50 米， 0.05% Np - 40 。将pH调整为7.4。存储在4°C。 |
表1：中等食谱
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
要获得高质量的调频细胞线，某些步骤至关重要。皮肤活检处理得越早，获得健康成纤维细胞的机会就越大。成纤维细胞文化的通过数量也很重要。原细胞的增殖能力有限，经过许多通道后，它们进入复制性衰老。因此，最好在低通道数下储存成纤维细胞，并尽早转化细胞。
另一个重要步骤是病毒生产具有最大的纯度和准确的量化。例如，使用 qPCR 的病毒基因组定量提供了合理的测量结果，但 ddPCR（数字液滴 PCR） 的定量更准确。
此外，用于肌细胞转换的成纤维细胞的充分汇合至关重要。如果细胞低于70%或超过80%的汇合，致癌分化可能会受损。如果细胞过于融合，就会叠加肌管层，干扰染色和成像。多氧环素的浓度对于 Myod 基因的正确激活和持续表达至关重要。在进行介质更改之前，始终将多氧环素添加到介质中是非常关键的，因为它在介质中稀释并储存在 4 °C 后会迅速降解。 库存应储存在 -20 °C，浓度为 1000 倍，并防止光线照射。不要重新冻结解冻的方位引用。遵循这些细节非常重要，以确保可重复的实验，并区分因基因突变和技术问题而受损的分化。然而，根据突变或疾病类型，可能不可能有良好的分化。为了确保可信的结果，以类似的通道数复制实验是非常重要的。
根据我们的经验，分化能力至少持续到25-27通道，特别是在野生类型控制中。对于某些患病的细胞系，同样的方法可能也有效，但这取决于细胞系。一些DMD细胞系仍然保留P20以上的致癌潜力。与之对立，肌营养不良1型（DM1）细胞系在P8之后降低了肌原性。然而，在DM1的情况下，这并不奇怪，因为它已经证明，在DM1的突变间接发挥作用的肌肉分化16。肌原分化能力的保留问题应单独解决，但一般来说，大多数细胞系将其保留到P20-25。
总之，将成纤维细胞转化为肌细胞是研究和测试神经肌肉疾病治疗策略的有力工具。它通过避免复杂的肌肉活检的衰减和减少肌肉活检给患者带来的不便，从而方便了获得人体细胞模型的机会。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
全国儿童医院已经授权奥登特斯治疗所描述的exon 2跳过计划。K.M.F.和 N.W. 已收到此许可证的版税付款。
Acknowledgments
我们要感谢文森特·穆利博士分享他过去对模型的了解。这项工作得到了美国国家卫生研究院国家神经疾病和中风研究所（R01 NS043264（K.M.F.， 和R.B.W.），美国国家卫生研究院国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤疾病研究所（NIAMS）（P50 AR070604-01（K.M.F.，K.M，R.N.和N.W.）。N.W.得到了俄亥俄州立大学/全国儿童医院肌肉小组和菲利普基金会的奖学金支持。这项工作也得到了内部自由裁量基金的支持，第2号外逃工作的一部分也得到了CurreDuchenne（K.M.F.）和弗朗西丝·孔特雷·莱斯·米奥帕蒂斯协会的支持。IRB 编号：IRB #： IRB10-00358/CR00005138 和 IBCSC#：IBS00000123。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA, phenol red | Thermo Fisher | 2500056 | |
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 20X Transfer buffer | Thermo Fisher | NP00061 | |
| 20X Tris-acetate SDS running buffer | Thermo Fisher | LA0041 | |
| 3-8% Tris-Acetate gel | Thermo Fisher | EA0378BOX | |
| 75 cm2 flask | Corning | 430641U | |
| Antibiotic-Antimicotic 100X | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Anti-myosin heavy chain, sarcomere antibody | Developmental Studies Hybridome Bank | MF20 supernatant | Dilution 1:50 |
| Antioxidant | Thermo Fisher | NP0005 | |
| BCA Protein Assay | Thermo Fisher | 23227 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D3571 | Dilution 1:1000 |
| Digitonin | Millipore Sigma | 300410250MG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| DMEM, High glucose, GlutaMAX supplement, Pyruvate | Thermo Fisher | 10569044 | |
| DNAse I set (250U) | Zymo Research Corporation | E1010 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP2653-5 | |
| Dup2 human primers | Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3' |
Rv_5' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3' |
|
| Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | Dilution 1:200 |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | 16000 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Goat anti-mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:1000 |
| Halt Protease inhibitor cocktail 100X | Thermo Fisher | 78430 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hygromycin B | Thermo Fisher | 10687010 | |
| IRDye 680RD goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Li-Cor | 926-68071 | Dilution 1:5000 |
| Lab-Tek II CC2 chamber slide system | Thermo Fisher | 15852 | |
| Laemmli | Bioworld | 105700201 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher | L3000008 | |
| Matrigel GFR membrane matrix | Corning | 354230 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412P-4 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher | 51000001 | |
| Nitrocellulose membrane 0.45 µm | GE Healthcare Life Sciences | 10600002 | |
| Normal Goat serum control | Thermo Fisher | 10000C | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | Li-Cor | 927-40003 | Blocking buffer for Western blot |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 11058021 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PCR master mix | Thermo Fisher | K0172 | |
| Phosphatase inhibitor | Thermo Fisher | A32957 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio Rad | 1610374 | |
| Puromycin | Thermo Fisher | A1113803 | |
| Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization | Li-Cor | 926-11021 | |
| RevertAid kit | Thermo Fisher | K1691 | |
| RNA Clean & Concentrator-25 | Zymo Research Corporation | R1018 | |
| Scalpels | Aspen Surgical | 372611 | |
| Skeletal Muscle Cell Differentiation medium | Promocell | C23061 | |
| Skeletal Muscle Cell Growth medium | Promocell | C23060 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 215682500 | |
| TRIzol reagent | Thermo Fisher | 15596026 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | |
| Ultra low temperature freezer | Thermo Scientific | 7402 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Labs | H1000 |
References
- Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
- Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
- Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43 (2016).
- Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
- Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5 (2019).
- Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
- De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
- Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
- Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
- Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
- Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
- Wang, X., McManus, M.
- Amack, J. D., Mahadevan, M. S.
