Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.
Abstract
שיטת השיבוט שער הזהב מאפשרת הרכבה מהירה של גנים מרובים בכל סידור המוגדר על ידי המשתמש. היא משתמשת באנזימי הגבלת IIS מסוג שחותכים מחוץ לאתרי הזיהוי שלהם ויוצרים עקיפה קצרה. מערכת שיבוט מודולרית (MoClo) זו משתמשת בזרימת עבודה הירארכית שבה חלקי דנ"א שונים, כגון מקדמים, רצפי קידוד (CDS) ומחסלים, משוכפלים תחילה לווקטור כניסה. לאחר מכן, וקטורים מרובים של הזנה מתאספים ליחידות שעתוק. מספר יחידות שעתוק מתחברות לפלסמיד מרובה גנים. אסטרטגיית השיבוט של שער הזהב היא בעלת יתרון עצום משום שהיא מאפשרת הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. זרימת העבודה ההיררכית מאפשרת בדרך כלל שיבוט קל של מגוון רחב של מבנים מרובי גנים ללא צורך ברצף מעבר לווקטורים של כניסה. השימוש בנשירה של חלבונים פלואורסצנטיים מאפשר סינון חזותי קל. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שיבוט מודולרי שמרים (MoClo). אנו מראים תוצאות אופטימליות ותת-אופטימליות של הרכבה מרובת גנים ומספקים מדריך להקרנה למושבות. אסטרטגיית שיבוט זו ישימה מאוד עבור הנדסה מטבולית שמרים ומצבים אחרים שבהם שיבוט פלסמיד רב גנים נדרש.
Introduction
ביולוגיה סינתטית שואפת להנדס מערכות ביולוגיות עם פונקציות חדשות שימושיות לתעשיות פרמצבטיות, חקלאיות וכימיות. הרכבת מספר רב של שברי דנ"א באופן בעל תפוקה גבוהה היא טכנולוגיה בסיסית בביולוגיה סינתטית. תהליך מסובך כזה יכול להתפרק לרמות מרובות עם ירידה במורכבות, מושג המושאל ממדעי ההנדסה הבסיסית1,2. בביולוגיה סינתטית, שברי DNA בדרך כלל להרכיב באופן היררכי מבוסס על פונקציונליות: (i) רמת חלק: "חלקים" מתייחס שברי DNA עם פונקציה מסוימת, כגון מקדם, רצף קידוד, שליחות קטלנית, מקור של שכפול; (ii) רמת יחידות שעתוק (TU): TU מורכב ממקדם, רצף קידוד ומחסל המסוגל לתמלל גן יחיד; (iii) רמה מרובת גנים: פלסמיד מרובה גנים מכיל מספר TUs המורכב לעתים קרובות ממסלול מטבולי שלם. הרכבה היררכית זו חלוצה על ידי קהילת BioBrick היא מושג היסוד להרכבה של קבוצות גדולות של DNAs בביולוגיה סינתטית3.
בעשור האחרון4,5,6,7, טכניקת השיבוט שער הזהב אפשרה באופן משמעותי הרכבה DNA היררכית2. שיטות שיבוט מרובות חלקים רבים אחרים, כגון שיבוט גיבסון8, שיבוט עצמאי קשירה (SLIC)9, שיבוט מבוסס כריתת uracil (USER)10, תגובת רכיבה על אופניים ליגאז (LCR)11, ו ב vivo רקומבינציה (DNA Assembler)12,13, פותחו גם עד כה. אבל שיבוט שער הזהב הוא שיטת הרכבת DNA אידיאלית משום שהוא אינו תלוי ברצפים ספציפיים לגנים, ומאפשר הרכבה נטולת צלקת, כיוונית ומודולרית בתגובת סיר אחד. שיבוט שער הזהב מנצל אנזימי הגבלה מסוג IIS המזהים רצף לא פלינדרומי ליצירת מעליות מתנדנדות מחוץ לאתר הזיהוי2. לאחר מכן, ליגאז מצטרף לרסיסי הדנ"א ה Annealed כדי להשיג הרכבה מרובת חלקים. החלת אסטרטגיית שיבוט זו על מערכת שיבוט מודולרי (MoClo) אפשרה הרכבה של עד 10 שברי DNA עם מעל 90% transformants מוקרן המכיל את המבנה שהורכב כראוי4.
מערכת MoClo מציעה יתרונות עצומים שהאיצו את מחזור התכנון-מבחן של הביולוגיה הסינתטית. ראשית, החלקים הניתנים להחלפה מאפשרים שיבוט קומבינטורי כדי לבחון מרחב גדול של פרמטרים במהירות. לדוגמה, אופטימיזציה של מסלול מטבולי בדרך כלל דורש רכיבה על אופניים דרך מקדמים רבים עבור כל גן כדי לאזן את שטף המסלול. מערכת MoClo יכולה להתמודד בקלות עם משימות שיבוט תובעניות כאלה. שנית, יש לרצף את החלק פלסמיד אך בדרך כלל לא את ה- TU או את הפלסמידים מרובי הגנים. ברוב המקרים, הקרנה על ידי PCR המושבה או הגבלת העיכול מספיק לאימות ברמת TU ו פלסמיד רב גנים. הסיבה לכך היא שיבוט פלסמיד החלק הוא הצעד היחיד הדורש PCR, אשר לעתים קרובות מציג מוטציות. שלישית, מערכת MoClo אידיאלית לבניית מסלולים מטבוליים מורכבים מרובי גנים. לבסוף, בגלל ההסתבכויות האוניברסליות, ניתן לעשות שימוש חוזר בחלקים ולשתף אותם עם הקהילה הביו-הנדסהית כולה. נכון לעכשיו, ערכות MoClo זמינות עבורצמחים 14,15,5,16,17, פטריות6,18,19,20 ,21,22,חיידקים7,23,24,25,26,27, ובעליחיים 28,29. פלטפורמת MoClo רב ממלכות הוצגה גם לאחרונה30.
עבור Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 פיתחו ערכת כלים רב-תכליתית MoClo, משאב מצוין לקהילת הביולוגיה הסינתטית שמרים. ערכה זו מגיעה במתכונת נוחה של 96 בארות ומגדירה שמונה סוגים של חלקי דנ"א הניתנים להחלפה עם אוסף מגוון של מקדמים מאופיינים היטב, חלבונים פלואורסצנטיים, מחסלים, תגי פפטיד, סמני בחירה, מקור השכפול וכלי עריכת הגנום. ערכת כלים זו מאפשרת הרכבה של עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים. תכונות אלה הן בעלות ערך עבור הנדסה מטבולית שמרים, שבו מסלולים חלקיים או שלמים מבוטאים יתר על המידה כדי לייצר כימיקלים ממוקדים. באמצעות ערכה זו, החוקרים יש אופטימיזציה הייצור של geraniol, linalool31, פניצילין32, חומצה מוקונית33, אינדיגו34, ו betalain35 בשמרים.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד כדי להנחות את השימוש בערכת הכלים MoClo כדי ליצור מסלולים מרובי גנים עבור ביטוי אפיזומלי או גנומי. באמצעות שימוש נרחב בערכה זו, מצאנו כי המדידה המדויקת של ריכוזי DNA היא המפתח להבטחת התפלגות שווה השוויון של כל חלק בתגובת שער הזהב. אנו ממליצים גם על ליגאז DNA T4 על ליגאז DNA T7 כי לשעבר עובד טוב יותר עם מספר גדול יותר של overhangs36. לבסוף, יש להסיר או לביית אתרי זיהוי פנימיים של BsmBI ו- BsaI לפני ההרכבה. לחלופין, ניתן לשקול סינתזה של חלקים כדי להסיר אתרים פנימיים מרובים ולהשיג אופטימיזציה של קודון בו זמנית. אנו מדגימים כיצד להשתמש בערכת כלים זו על ידי הבעת מסלול של חמישה גנים לייצור β קרוטן וליקופן ב- S. cerevisiae. אנו מראים עוד כיצד לדפוק את לוקוס ADE2 באמצעות כלי עריכת הגנום מערכה זו. ניסויים מבוססי צבע אלה נבחרו להדמיה קלה. אנו גם מדגימים כיצד ליצור חלבוני היתוך וליצור מוטציות חומצות אמינו באמצעות שיבוט שער הזהב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ניתן לחלק את פרוטוקול השיבוט ההירארכי המוצע בעורק כלים זה לשלושה שלבים עיקריים: 1. שיבוט פלסמידים של חלקים; 2. יחידות תעתיק שיבוט (TUs); 3. שיבוט פלסמידים מרובי גנים (איור 1). פרוטוקול זה מתחיל מעיצוב פריימר ומסתיים ביישומים של פלסמיד מרובה גנים משובטים.
1. עיצוב פריימר לשיבוט החלק פלסמיד (pYTK001):
- עיצוב פריימרים קדימה והפוך המכילים נוקלאוטידים איגוף TTT בקצה 5 ', אתר זיהוי BsmBI עם נוקלאוטידים נוספים (CGTCTCN), 4-נוקלאוטידים (nt) overhang (TCGG) משלים לזה של וקטור הכניסה, אתר זיהוי BsaI עם נוקלאוטידים נוספים (GGTCTCN) ועיקור ספציפי לחלק של 4 nt, בנוסף לרצף הספציפי לתבנית (איור 2A). GoldenBraid4.0 37 ו GoldenMutagenesis38 הם חלק התוכנות המקוונות שניתן להשתמש בהם עבור עיצוב פריימר ספציפי שער הזהב.
- אם אתרי זיהוי של BsaI או BsmBI קיימים בחלק כלשהו, השתמש בצעד ביות כדי לעבור מוטציה באתרים אלה לפני הרכבת שער הזהב39. עבור פלסמידים אינטגרטיביים (ראה שלב 4), בצע ביות של כל אתר זיהוי NotI. כדי לביית חלק עם אתר זיהוי לא רצוי אחד, חלק את החלק לשני חלקי משנה ליד האתר הלא רצוי (איור 2A):
- עצב את פריימר קדימה של תת-החלק הראשון באותו אופן כמו בשלב 1.1. אבל לעצב את פריימר הפוך עם אתר BsmBI ו 4-nt גנים ספציפיים overhang בלבד.
- עצב את פריימר החלק השני קדימה עם אתר BsmBI ואת overhang 4-nt גנים ספציפיים רק כי חופף עם פריימר הפוך של החלק הראשון. עצב את פריימר הפוך של חלק המשנה השני באותו אופן כמו בשלב 1.1.
- הציגו את המוטציות הרצויות בכיוון ההפוך (לשלב 1.2.1) או בפריימריז קדימה (שלב 1.2.2) באזור הספציפי לגנים של הפריימריז.
הערה: לחלופין, ניתן לסנתז באופן מסחרי חלק ללא BsmBI ו-BsaI וממוטב לקודון. עבור רצפי קידוד (CDS), מוטציה שם נרדף ניתן לשלב בקלות בנוקלאוטיד השלישי של קודון חומצת אמינו. עבור מקדמים ומפסקים, עם זאת, בדיקת מקדם מוטציה או פעילות שליחות קטלנית באמצעות בדיקה עיתונאי מומלץ39. אם קיים אתר הגבלה לא רצוי לקראת סוף הרצף, ניתן לשנות אותו באמצעות פריימר הפוך ארוך יותר. אם קיימים אתרים לא רצויים מרובים, ניתן לבצע mutagenesis המכוון לאתר המאפשר מוטציה של אתרים מרובים40.
- מדי פעם רצוי למזג שני חלבונים כחלק אחד עם חיבור ביניהם (איור 2A). המקשר מסייע להבטיח את השלמות המבנית של שני חלבונים בודדים41.
- פריימר קדימה עבור הגן הראשון הוא זהה בשלב 1.1. בפריימריז ההפוכים, כלול אתר BsmBI, 4-nt גנים ספציפיים overhang, ורצף מקשר. ה-4-nt overhang יכול להיות המקשר או הנוקלאוטידים הראשונים של הגן השני.
- עבור הגן השני, תכנן את פריימר קדימה כך שיש לו אתר זיהוי BsmBI ו 4-nt overhang משלים לזה של פריימר הפוך של הגן הראשון. עצב את פריימר הפוך של הגן השני כמו בשלב 1.1.
- כדי להגביר את החלקים על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR)42, להשתמש פולימראז DNA נאמנות גבוהה כדי להגביר את החלקים או DNA גנומי, cDNA, או פלסמיד. בדוק את מוצר ה- PCR על ג'ל אגרוז 1% ואחריו טיהור ג'ל. שימוש בדנ"א מטוהר מומלץ מאוד, אם טיהור הג'ל מייגע, השתמש לפחות בעמודת ספין כדי לטהר את מוצר ה- PCR.
2. שכפול חלקים בווקטור הכניסה (pYTK001) ליצירת פלסמידים חלקיים (איור 2B)
- כדי להגדיר את תערובת התגובה שער הזהב, להוסיף 20 fmol של כל מוצר PCR ואת וקטור הכניסה (pYTK001), μL אחד של 10X T4 מאגר ליגאז, 0.5 μL של Esp3I (isoschizomer יעיל מאוד של BsmBI), ו 0.5 μL של ליגאז T4. הוסף ddH2O כדי להביא את הנפח הכולל ל 10 μL.
- כדי להגדיר את תגובת השיבוט, הפעל את התוכנית הבאה בתרמוציקלר: 25-35 מחזורים של 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות (עיכול) ו 16 °C (70 °F) במשך 5 דקות (קשירה), ואחריו עיכול סופי ב 50 °C (60 °F) במשך 10 דקות והפעלת אנזים ב 80 °C (60 °F) במשך 10 דקות.
הערה: 35 מחזורים של עיכול / קשירה מומלצים בעת שיבוט חתיכות DNA מרובות לתוך וקטור הכניסה בו זמנית, למשל, במהלך שיבוט של גנים היתוך או ביות גן. - להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן DH5α או שווה ערך Escherichia coli תאים כימיים מוסמכים על ידי הלם חום. הפיכת המוצר כולו 10 μL משובט לתוך 35 μL כימית מוסמך E. coli תאים (2 X 105 cfu / mL, cfu מחושב מהפיכת 5 ng pYTK001 לתוך 100 μL של התאים המוסמכים) מומלץ. מורחים על צלחת מרק lysogeny (LB) עם 35 מיקרוגרם / מ"ל כלוראמפניקול (ס"מ). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
- לאחר 16-18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ושומרים על הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס למשך כ-5 שעות כדי לאפשר לחלבון הפלואורסצנטי הירוק (sfGFP) להתפתח לצבע ירוק אינטנסיבי יותר.
- להקרנה קלה יותר, הניחו את הצלחת על אולטרה סגול (UV) או טרנסילומינטור אור כחול. SfGFP המכיל מושבות יהיה פלואורסצנטי תחת אור UV.
- המושבות הירוקות שליליות משום שהן מכילות את pYTK001 הלא מלוטש. המושבות הלבנות הן כנראה חיוביות. השיבוט הוא בדרך כלל מוצלח אם יש ~ 30-100% מושבות לבנות. בצע סינון נוסף של כמה מושבות לבנות על ידי PCR המושבה או הגבלת עיכול (אנזים הציע: BsaI-HFv2).
- לטהר פלסמידים מכמה מהמושבות שעשויות להיות נכונות ולאשר את הרצפים על ידי רצף סנגר.
3. הרכבת פלסמידים חלק לתוך "קלטת" פלסמידים
הערה: פלסמיד קלטת מכיל יחידת תמלול (TU) המוגדרת על-ידי המשתמש, המורכבת ממקדם, CDS ומחסל. פלסמיד קלטת מאפשר ביטוי של גן יחיד. אם פלסמידים קלטת יורכבו לתוך פלסמיד רב גנים, אז הצעד הראשון הוא לקבוע את המספר ואת הסדר של TUs בפלסמיד מרובה גנים. אלה יקבעו באיזה מחברים להשתמש בפלטות הקלטת מאחר שמחברים מקשרים TUs בפלסמיד מרובה הגנים. המחבר השמאלי הראשון של TU צריך להיות ConLS, והמחבר הימני של ה- TU האחרון צריך להיות ConRE. הם יחפפו עם קונלס וקון-רה של פלסמידים מרובי גנים. שאר המחברים צריכים להיות בסדר המספרי הגדל. לדוגמה, אם הפלסמיד מרובה הגנים מכיל ארבעה TUs, שילובי המחברים יהיו ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 ו- ConL3-TU4-ConRE (איור 1).
- לפני הרכבת יחידות שעתוק, מומלץ להרכיב וקטור ביניים עם ששת החלקים הבאים: המחבר השמאלי, הנשירה של sfGFP (pYTK047), המחבר הימני, סמן בחירת שמרים, מקור שמרים של שכפול והחלק פלסמיד עם mRFP1, מקור E. coli והגן העמיד לאמפצילין (pYTK083) (איור 3).
- לטהר את ששת הפלסמידים לעיל. להקליט את הריכוזים שלהם באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis או בדיקת פלואורסצנטיות מבוסס לדלל כל פלסמיד עם ddH 2 Oכך1 μL יש 20 fmol של DNA. לחשב את ריכוז הטוחנת DNA באמצעות מחשבון מקוון.
הערה: חשוב מאוד למדוד את ריכוזי הדנ"א במדויק ולצנרת בדיוק כדי שההרכבה תעבוד, במיוחד עבור מכלולים עם פלסמידים של חמישה עד שבעה חלקים. טעויות קטנות בריכוז הדנ"א של כל פלסמיד יכולות לגרום לירידה משמעותית ביעילות השיבוט. - הוסף 1 μL של כל פלסמיד, 1 μL של 10X T4 מאגר ליגאז, 0.5 μL של BsaI-HFv2 (גרסה יעילה מאוד של BsaI), ו 0.5 μL של ליגס T4. הפוך את עוצמת הקול ל 10 μL על ידי הוספת ddH2O.
- כדי להגדיר את תגובת השיבוט, הפעל את התוכנית הבאה בתרמוציקלר: 25-35 מחזורים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (עיכול) ו- 16 °C (60 °F) במשך 5 דקות (קשירה). השמט את שלבי העיכול וההשבתה הסופיים של החום, שכן אתרי BsaI צריכים להישמר בווקטור הביניים (איור 3).
- להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן DH5α או תאים אחרים E. coli מוסמך. מורחים על צלחת LB עם 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין (Cb) או אמפיצילין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
הערה: קרבניצילין הוא אנלוגי יציב של אמפצילין. - לאחר 16-18 שעות, להוציא את הצלחת של האינקובטור. הצלחת תכיל מושבות אדומות וחיוורות וירוקות חיוורות(איורים 6C ו-6D). שמור את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 5 שעות כדי לאפשר mRFP1 ו sfGFP בוגרת. השתמש UV או transilluminator אור כחול כדי לזהות את המושבות הירוקות, אשר מכילים וקטור ביניים פוטנציאל נכון.
- פסים את המושבות הירוקות על צלחת LB + Cb ודגרת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, פס החוצה שוב על צלחת LB + ס"מ לדגר ב 37 מעלות צלזיוס לילה. המושבות הגדלות על לוחות LB + Cm מכילות פלסמידים שהורכבו שלא כהלכה מכיוון שוואקטורים חלק עמידים Cm נשמרים.
- בחר את המושבות שאינן גדלות על צלחת LB + Cm ולבצע עיכול הגבלה (אנזימים מוצעים: BsaI-HFv2, Esp3I) כדי לאשר את פלסמיד שהורכב כראוי. לחלופין, השתמש PCR המושבה להקרנה.
- לטהר את ששת הפלסמידים לעיל. להקליט את הריכוזים שלהם באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis או בדיקת פלואורסצנטיות מבוסס לדלל כל פלסמיד עם ddH 2 Oכך1 μL יש 20 fmol של DNA. לחשב את ריכוז הטוחנת DNA באמצעות מחשבון מקוון.
- לאחר שווקטור הביניים הורכב בהצלחה, השלב הבא הוא להרכיב יחידות שעתוק. זוהי הרכבה של 4 חלקים עם החלקים הבאים: וקטור הביניים, מקדם, CDS ומחסל.
- לטהר את ארבעת החלקים פלסמידים. להקליט את הריכוזים שלהם לדלל כל פלסמיד כך 1 μL יש 20 fmol של DNA.
- כדי להגדיר את תערובת התגובות, בצע את שלב 3.1.2.
- כדי להגדיר את תגובת השיבוט, בצע את שלב 2.2.
- להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך DH5α או שווה ערך E. coli תאים מוסמכים צלחת על LB + Cb. דגירה ב 37 °C (69 °F) לילה.
- לאחר 16-18 שעות, להוציא את הצלחת מהחממה. מושבות ירוקות לבנות וחיוורות יופיעו (איורים 6E ו- 6F). שמור את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס במשך כ 5 שעות כדי לאפשר sfGFP להתבגר. השתמש UV או טרנסילומינטור אור כחול כדי לזהות את המושבות הלבנות שאינן פלואורסצנטיות. אלה מכילים את יחידות התמלול שעשויות להיות נכונות.
- פס החוצה ולגדול 8-10 מושבות לבנות ולבצע PCR מושבה. לטהר פלסמידים מהמושבות כי הבדיקה חיובית ממושבה PCR. בצע עיכול הגבלה (אנזים מוצע: Esp3I) כדי לאשר עוד יותר את ההרכבה.
הערה: יחידות שעתוק רצף בדרך כלל אין צורך כי השיבוט כרוך רק הגבלת עיכול קשירה. כל רצפי העניין אושרו ברמת הפלסמיד החלקית.
4. הרכבת פלטות קלטת לפלסמידים "מרובי גנים":
הערה: פלסמידים מרובי גנים מאפשרים ביטוי של יותר מגן אחד. בהתאם ליישום במורד הזרם, פלסמידים מרובי גנים יכולים להיות משכפלים או אינטגרטיביים. פלסמידים משוכפלים יש את מקור השמרים של שכפול; לכן, זה יכול להישמר ביציבות כאשר תא שמרים מתחלק. פלסמידים אינטגרטיביים אין את מקור השמרים של שכפול. במקום זאת, יש להם זרועות הומולוגיות של 5 ו -3 'המאפשרות שילוב של גנים מרובים לתוך לוקוסים ספציפיים של הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית.
- עבור פלסמידים מרובי גנים, להרכיב וקטור ביניים הראשון.
- כדי להרכיב וקטורים מתווכים משוכפלים(איור 4A),הרכב את ששת החלקים הבאים: המחבר השמאלי (ConLS'-pYTK008), הנשירה sfGFP (pYTK047), המחבר הימני (ConRE'-pYTK072), סמן בחירת שמרים, מקור שמרים של שכפול, ואת החלק plasmid עם mRFP1, מקור E. coli של שכפול, ואת הגן עמיד kanamycin (pYTK084).
- להרכבה, בצע את השלבים מ- 3.1.1 עד 3.1.3.
- להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך DH5α או שווה ערך E. coli תאים מוסמכים, צלחת על LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל kanamycin (ק"מ). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
- להקרנה על בסיס צבע אדום/ירוק, בצע את שלב 3.1.5.
- להקרנה של הרכבות שגויות, פס ולגדל את המושבות הירוקות על צלחת LB + ק"מ. לאחר מכן בצע את שלב 3.1.6.
- לווקטורים רב-גנים אינטגרטיביים (איור 4B), קבעו תחילה את מוקד העניין הגנומי, ולאחר מכן תכננו כ-500 זוגות בסיסים של זרועות הומולוגיות בגודל 5 אינץ' ו-3 אינץ' לשילוב באותו מוקד.
- שכפלו את זרועות ההומולוגיה של 5' ו-3' מהדנ"א הגנומי של השמרים לווקטור הכניסה-pYTK001. בצע את שלבים 1 ו- 2.
- הרכב את שבעת הפלסמידים הבאים: המחבר השמאלי (ConLS'-pYTK008), הנשירה sfGFP (pYTK047), המחבר הימני (ConRE'-pYTK072), סמן בחירת שמרים, זרוע ההומולוגיה 3 ', החלק פלסמיד עם mRFP1, E. מקור קולי של שכפול, ואת הגן עמיד kanamycin (pYTK090), ואת הזרוע 5 'הומולוגיה.
- להרכבה והקרנה, בצע את שלב 4.1.1.
- כדי להרכיב וקטורים מתווכים משוכפלים(איור 4A),הרכב את ששת החלקים הבאים: המחבר השמאלי (ConLS'-pYTK008), הנשירה sfGFP (pYTK047), המחבר הימני (ConRE'-pYTK072), סמן בחירת שמרים, מקור שמרים של שכפול, ואת החלק plasmid עם mRFP1, מקור E. coli של שכפול, ואת הגן עמיד kanamycin (pYTK084).
- הרכבה של פלסמיד מרובה גנים
- לטהר פלסמידים של וקטור ביניים שהושגו בשלב 4.1 ואת פלסמידים קלטת משלב 3. רשום את הריכוזים שלהם באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis או מבחנה מבוססת פלואורסצנטיות. לדלל כל ddH 2 Oכך1 μL יש 20 fmol DNA.
- הוסף 1 μL של וקטור ביניים, 1 μL של כל יחידת שעתוק, 1 μL של 10x T4 מאגר ליגאז, 0.5 μL של Esp3I, ו 0.5 μL של ליגאז T4. להביא את עוצמת הקול ל 10 μL של שימוש ddH2O.
- כדי להגדיר את תגובת השיבוט, בצע את שלב 2.2.
- להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך DH5α או שווה ערך E. coli תאים מוסמכים, צלחת על LB + Km. דגירה ב 37 °C (69 °F) לילה.
- בצע את ההקרנה בירוק/לבן כמו בשלב 3.2.5.
- לטהר פלסמידים מכמה מושבות לבנות ולבצע עיכול מוגבל. מומלץ להשתמש באנזים NotI-HF מכיוון שקיימים שני אתרי NotI בחלק סמן הבחירה E. coli ו- Km, בהתאמה (איור 4B). אם פלסמיד התאספו הוא גדול מאוד, אז אתר הגבלה אחר ניתן לבחור לאישור נוסף. לחלופין, מסך עם PCR המושבה לפני שתמשיך להגביל את העיכול.
5. החלת פלסמידים מרובי גנים לביטוי גנים כרומוזומלי או מבוסס פלסמיד
- שילוב פלסמיד רב-גנים בגנום השמרים לביטוי גנים כרומוזומליים (איור 5)
- תכנן RNA מדריך (gRNA) עבור הלוקוס הרצוי. שימוש במשאבים מקוונים מרובים, כגון ספסל, CRISPRdirect43ו- CHOPCHOP44, מומלץ לקבוע את הספציפיות המרבית ביעד.
- לשכפל את 20-nt gRNA מסונתז לתוך pCASפלסמיד 45 על ידי שיבוט גיבסון. ליניארי pCAS plasmid על ידי PCR באמצעות זוג פריימר הפוך מחייב את 3 ' של ריבוזים HDV ו 5 ' של tracrRNA בהתאמה (איור 5). לחלופין, לשכפל את gRNA לתוך פלסמיד נשירה sgRNA (pYTK050) ולהרכיב את פלסמיד הנשירה לתוך קלטת plasmid עם מקשר. לאחר מכן להרכיב את Cas9 TU עם פלסמיד חלק Cas9 (pYTK036). לבסוף, להרכיב את Cas9 TU ואת sgRNA TU לתוך פלסמיד רב גנים משוכפל.
- ליניארי 5-15 מיקרוגרם של פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי עם 1 μL של אנזים NotI-HF בן לילה. הפוך 1 מיקרוגרם של pCAS-gRNA ואת פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי ליניארי לתוך S. cerevisiae. הכן תאים מוסמכים באמצעות ערכת טרנספורמציה שמרים זמינה מסחרית או בעקבות הפרוטוקול על ידי Geitz ו Schiestl, 200746.
הערה: אין צורך לטהר את הפלסמיד מרובה הגנים ליניארי לאחר העיכול NotI. - גלולה התאים לאחר ההתאוששות, להשליך את supernatant, לשטוף עם נפח שווה של מים. צלחת שמרים תאים על מדיום סינתטי מלא (CSM) צלחת נשירה או שמרים תמצית פפטון דקסטרוז בינוני (YPD) צלחת עם אנטיביוטיקה, בהתאם סמן סלקטיבי שמרים. דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך יומיים למושבות להיווצר. במקרה שלא נצפתה מושבה, דגירה למשך יום עד יומיים נוספים ב-30 מעלות צלזיוס.
- מושבות שמרי מסך לשילוב על ידי מושבה PCR47.
- כדי לרפא את pCAS, פס את המושבה עם האינטגרציה הנכונה על צלחת YPD לא סלקטיבית. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס לילה. פס מושבה אחת מלוחית YPD על צלחת YPD טרי. שוב, לגדול ב 30 מעלות צלזיוס לילה. פס מושבה מלוח YPD השני כדי YPD בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל nourseothricin, סמן הבחירה של pCAS. ריפוי מוצלח מתרחש כאשר תאי שמרים אינם מצליחים לגדול על הצלחת הסלקטיבית.
הערה: אם פלסמיד pCAS אינו נרפא בשני סיבובים של YPD לא סלקטיבי, פס שוב על YPD טרי עבור 1-2 סיבובים נוספים.
- הפיכת פלסמיד רב-גנים משוכפל לביטוי גנים מבוססי פלסמיד
- להפוך 100 ng-1 מיקרוגרם טהור רב גנים plasmid לתוך S. cerevisiae תאים מוסמכים.
- פלייט תאי שמרים מיד לאחר השינוי על צלחת נשירה CSM או YPD בתוספת צלחת אנטיביוטית, בהתאם לסמן בחירת שמרים בשימוש. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים למושבות להיווצר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן התוצאות של ארבעה פלסמידים מרובי גנים משוכפלים לייצור β קרוטן (צהוב) וליקופן (אדום). פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2 נבנה, שהמושבות שלו אדומות.
שכפול תקליטורים לווקטור הערך (pYTK001)
ERG20 הוגבר מגנום השמרים ושלושת הגנים הקרוטנואידים crtE, crtYB, crtI מהפלסמיד pLM49448 לתוך הכניסה וקטור pYTK001 כמתואר. מקדמי שמרים pENO2, pTIP1, pPYK1 ו pPDC1 ומחסלים tTDH2, tHSP26, tADH2, tACS2 היו משובטים כחלק פלסמידים. מוטציה נקודתית הוכנסה לתוך CrtYB (G247A) לייצור ליקופן ומבנה היתוך BTS1-ERG20 נוצר כדי לתעל טוב יותר את ביניים prenyl כדי קרוטנואידים. איורים 6A ו- 6B מראים צלחת מייצגת של שיבוט מוצלח של פלסמיד חלק ומספקים דוגמה להקרנה ירוקה/לבנה עם 90.35 ± 4.22% המושבות הכוללות הן בעלות פוטנציאל נכון (לבן).
הרכבה של יחידות תמלול (פלסמידים בקלטת)
לפני הרכבת פלסמיד הקלטת, העיצוב של פלסמיד רב גנים היה סופי. עבור ארבעת התווים הקרוטנואידים, ארבעה וקטורים בינוניים עם מחברים שונים שוכפלו ראשונים לאחר שלב 3.1. איורים 6C ו- 6D מראים לוחית מייצגת מהרכבה מוצלחת של וקטור הביניים ומספקים דוגמה להקרנה האדומה/ירוקה, כאשר 17.56 ± 3.32% מכלל המושבות חיוביות (ירוקות). למרות שיחס זה נמוך יחסית, ההקרנה מקלה מאוד על הפלואורסצנטיות הירוקה.
לאחר מכן, ה- TUs עבור BTS1-ERG20, ERG20, crtE, crtYB, crtYB(G247A) ו- crtI הורכבו לאחר שלב 3.2 (טבלה 1). איורים 6E ו- 6F מראים לוח מייצג של הרכבה מוצלחת של התווים ומספקים דוגמה לשיטת סינון ירוק/לבן, כאשר 65.02 ± 4.99% מכלל המושבות חיוביות (לבנות).
הרכבה של פלסמידים מרובי גנים
ארבעה פלסמידים משוכפלים ואחד רב-גנים אינטגרטיבי הורכבו. עבור פלסמידים מרובי גנים משוכפלים, ERG20, BTS1-ERG20, crtE, crtYB, crtYB (G247A) ו crtI הורכבו בארבעה שילובים שונים, יצירת ארבעה פלסמידים: שניים עבור β קרוטן ושניים לייצור ליקופן (טבלה 2). היחס בין המושבות הנכונות (ירוקות) לשיבוט וקטור הביניים היה 1.83 ± 0.15%(איורים 7A ו-7B). למרות שמספר זה נראה נמוך, ההקרנה נעשתה קלה על ידי גילוי הפלואורסצנטיות הירוקה (איור 7B). לאחר שכפול פלסמיד הביניים, שיעור ההצלחה של הרכבת פלסמידים רב-גנים (לבן) מהבינוני היה 93.77± 1.65%(איורים 7C ו-7D). איורים 7E ו- 7F מראים הרכבה תת-אופטימלית של פלסמידים מרובי גנים, שכן מספרי המושבות החיוביות (הלבנות) היו זניחים. לאחר שהפכו לשמרים, מושבות המייצרות β קרוטן (צהוב) וליקופן (אדום) גדלו ביום השלישי. ארבע מושבות מכל צלחת היו מפוספסות על צלחות טריות וגדלו במשך יומיים נוספים. איורים 8A ו- 8B מראים כי מיזוג BTS1-ERG20 מביים יותר geranylgeranyl-pyrophosphate לכיוון הייצור קרוטנואיד, כפי שניתן לראות על ידי צבעים כהים יותר מאשר באמצעות ERG20 לבד. עם החילוץ49 וכימות הקרוטנואידים על ידי ספקטרופוטומיית UV-Vis עם סטנדרטים אותנטיים, נראה כי היתוך של BTS1-ERG20 מוביל לייצור של 0.729 מיקרוגרם / מ"ג β קרוטן, שהוא ~ 35 לקפל גבוה יותר מ 0.021 מיקרוגרם / מ"ג β קרוטן המיוצר על ידי המתח עם ERG20 לבד. כמו כן, הייצור של ליקופן הוא ~ 16.5 לקפל גבוה יותר בזן עם BTS1-ERG20 (1.126 מיקרוגרם / מ"ג) לעומת ERG20 (0.068 מיקרוגרם / מ"ג) לבד (איור 8C).
פלסמידים מרובי גנים משוכפלים הפכו לשמרים עם (A) BTS1-ERG20 היתוך TU ו -( B) ERG20 TU. על כל צלחת, שמרים בצד שמאל יש פלסמידים המכילים CRTE TU, crtYB TU ו CRTI TU לייצור β-קרוטן ושמרים בצד ימין יש פלסמידים המכילים CRTE TU, crtYB (G247A)TU, ו CRTI TU לייצור ליקופן.
עבור פלסמיד אינטגרטיבי, של ConLS, נשירה sfGFP, ConRE', שלו3 (סמן בחירת שמרים), ADE2 5 ' ו 3 ' זרועות הומולוגיות הורכבו לאחר שלב 4.1.2. זרועות ההומולוגיה 5' ו -3 ' היו 500 bp זה מזה, מחיקת ~ 180 חומצות אמינו לאחר אינטגרציה. בנוסף, לזרוע ההומולוגיה 5' היו שישה קודיונים עצירה לקראת סופו 3 '. ADE2 מוטציה הביא מושבות אדומות50. ADE2 gRNA 5'-ATTGGGAC GTATGATTGTTGAGG-3'51 שימשו ועקבו אחר שלב 5.1 לאינטגרציה גנומית. לאחר 3-4 ימים, מושבות אדומות נצפו על צלחת YPD + 100 מיקרוגרם / מ"ל nourseothricin, המציין כי ADE2 שובש בהצלחה (איורים 8D ו-8E).
איור 1: מבט כולל על הרכבה מרובת גנים. ההרכבה מתקיימת בשלושה מפלסים. In0 רמה 1, התקליטור, או כל חלק אחר, מוגבר מהגנום או מסונתז, ולאחר מכן משובט לתוך וקטור הכניסה pYTK001 באמצעות האנזים BsmBI (או Esp3I). ColE1: E. מקור קולי של שכפול; CmR: גן עמיד לכלוראמפניקול. ברמה 2, יחידת התמלול (TU) המכילה מקדם, CDS ומחסל מורכבת באמצעות האנזים BsaI. ברמה 3, עד חמש יחידות שעתוק מורכבות לפלסמיד מרובה גנים באמצעות האנזים BsmBI (או Esp3I). הפלסמיד מרובה הגנים יכול להיות משכפל או אינטגרטיבי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עיצוב ראשוני ושיבוט של פלסמידים חלקיים. (A) עיצוב פריימר להגברת חלקים בודדים, ביות גנים או יצירת מוטציות נקודתיות והרכבת חלבוני היתוך. בין הפריימריז ניתן למנות אתרי הכרה וחיתוך של BsmBI ו-BsaI ואתרים חתוכים ואתר MoClo להרכבה נאותה. Overhangs MoClo מיוצגים כמו 1, 2, 3, 4, ו 5, 6, 7, 8. פריימרים פנימיים לביות או יצירת חלבון היתוך מכילים את BsmBI אך לא את אתרי BsaI. ההסתבכויות עבור אלה הן רצפים פנימיים מותאמים אישית (NNNN ו- N'N'N'N' בסגול). מסוף "ttt" כלולים לעיכול אנזים אופטימלי. גן מעניין. (B)שכפול חלקים מוגברים לווקטור הערך pYTK001 באמצעות BsmBI (או Esp3I). מעליות משלימות מובילות לשילוב החלק ולהסרת אתר הזיהוי של BsmBI. ColE1: E. מקור קולי של שכפול; CmR: גן עמיד לכלוראמפניקול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הרכבה של יחידת שעתוק. כדי להרכיב את פלסמידים TU, ההרכבה של וקטור ביניים מומלץ להקל על הרכבה TU קומבינטורית. כדי להרכיב את וקטור הביניים, לשכפל את קון LX (X: אחד מחמשת המחברים השמאליים), נשירה sfGFP, קון RY (Y: אחד מחמשת המחברים הימניים), ORI שמרים (מקור השכפול), וחלק סמן שמרים לתוך וקטור נשירה mRFP1 באמצעות האנזים BsaI. פלסמיד הביניים עמיד בפני אמפצילין. אתרי הזיהוי של BsaI נשמרים לשיבוט פלסמיד TU. כדי לשכפל את פלסמיד TU, מקדם, CDS, ו שליחות קטלנית מורכבים לתוך וקטור ביניים באמצעות BsaI. TU משובטים יהיו אתרי BsmBI באזורים ConLX ו ConRY לשלב הבא הרכבה מרובת גנים. TU משובט הוא גם עמיד אמפילין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | ConLX (מחבר שמאלי) | יזם | תקליטורים | המחסל | ConRY (מחבר ימני) |
| BTS/ERG20 Tu | LS (LS) | pENO2 | BTS1/ERG20 | tTDH2 | R1 |
| ERG20 Tu | LS (LS) | pENO2 | ERG20 | tTDH2 | R1 |
| crtE Tu | L1 | pTIP1 | crtE | tHSP26 | ארטו |
| crtYB Tu | L2 | pPDC1 | crtYB | tADH2 | R3 |
| CRTYBG247A Tu | L2 | pPDC1 | CRTYBG247A | tADH2 | R3 |
| crtI Tu | L3 | pPYK1 | crtI | tACS2 | מחדש |
טבלה 1: יחידות תעתיק המשמשות במחקר זה. מקדמים ומיסיקים הוגברו מ S. cerevisiae. BTS1 (גרנילגרניל דיפוספט סינתאז) ו ERG20 (פרנסיל פירופוספט סינתטאז) הוגברו מ S. cerevisiae. הגנים crtE (geranylgeranyl דיפוספט סינתאז), crtYB (ליקופן ליקופציה bifunctional / פיטואן סינתאז), ו crtI (פיטואן desaturase) היו מ Xanthophyllomyces dendrorhous.
איור 4: הרכבה מרובת גנים. (A)הרכבה פלסמיד משכפלת. הרכבה של וקטור ביניים שכפול כולל שיבוט קון LS', נשירה sfGFP, קון RE', שמרים ORI, סמן שמרים, ומקור E. coli וסמן על וקטור נשירה mRFP1 באמצעות האנזים BsaI. אתרי ConLS ו- ConRE מציגים אתרי זיהוי של BsmBI לווקטור. הרכבות שעשויות להיות נכונות יכולות להיות מוקרנות על ידי חיפוש מושבות ירוקות על צלחת סלקטיבית עם קנמיצין. לאחר מכן ניתן לשכפל את התווים שהורכבו בעבר לווקטור הביניים באמצעות האנזים BsmBI. פלסמיד זה מכיל שמרים ORI המאפשר לו לשכפל במחשב מארח שמרים. (B)הרכבה פלסמיד אינטגרטיבית. הרכבה של וקטור הביניים האינטגרטיבי כוללת שיבוט קון LS', נשירה sfGFP, קון RE', זרוע הומולוגית 5 ', זרוע הומולוגית 3 ', סמן שמרים, ואת מקור E. coli ואת הסמן לתוך וקטור נשירה RFP באמצעות האנזים BsaI. הרכבות נכונות צריכות להיראות ירוקות על צלחת סלקטיבית עם קנאמיצין. יחידות שעתוק שנעשו בעבר ניתן לשכפל לתוך וקטור ביניים שכפול באמצעות האנזים BsmBI. וקטור זה אין ORI שמרים וישולב לתוך מוקד היעד באמצעות CRISPR ו רקומבינציה הומולוגית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | TU1 | TU2 | TU3 | TU4 | המוצר |
| B/E-β קרוטן | BTS1/ERG20 | crtE | crtYB | crtI | קרוטן β |
| B/E-ליקופן | BTS1/ERG20 | crtE | CRTYBG247A | crtI | ליקופן (ליקופן) |
| E-β קרוטן | ERG20 | crtE | crtYB | crtI | קרוטן β |
| אי-ליקופן | ERG20 | crtE | CRTYBG247A | crtI | ליקופן (ליקופן) |
טבלה 2: פלסמידים מרובי גנים המשמשים במחקר זה.
איור 5: אינטגרציית CRISPR. (A)שיבוט פלסמיד של CRISPR ועוזר. הפלסמיד pCAS מכיל את האנדונוקלאאז והרכיבים של Cas9 (מקדם tRNA, שליחות קטלנית SNR52, ריבוזים HDV ו- tracrRNA) לביטוי אופטימלי של gRNA. לשכפל את pCAS + gRNA פלסמיד על ידי הרכבת gRNA סינתטי עם pCAS ליניארי באמצעות שיבוט גיבסון. (B)CRISPR סייעה לאינטגרציה גנטית. שלב 1: קוטרנספורמציה: pCAS +gRNA הפך במשותף שמרים עם פלסמיד אינטגרטיבי המכיל את הגנים של עניין (GOI), סמן סלקטיבי שמרים, ו 5 ' ו 3 ' אזור הומולוגיה מיקוד הארבה הגנומי. לשילוב מיטבי, יש ליניאריזציה של הפלסמיד האינטגרטיבי עם NotI. שלב 2: אינטגרציה בלוקוס היעד: הגדלת השמרים שהשתנו על צלחת סלקטיבית עבור סמן שמרים, אנטיביוטיקה או auxotrophic. בצע genotyping כדי לאשר את השילוב. שלב 3: לרפא את pCAS + gRNA plasmid על ידי פסים שמרים על צלחת לא סלקטיבית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: לוחות מייצגים של שיבוט ברמת וקטור הכניסה ויחידת שעתוק ב- E. coli. לוחות מייצגים של שיבוט מוצלח של גן לתוך וקטור הכניסה pYTK001 תחת (A) אור נראה ו - (B) אור UV. מושבות חיוביות הן מושבות לבנות ושליליות הן ירוקות. היחס בין המושבות החיוביות הכוללות הוא 90.35 ± 4.22 %. הרכבה מוצלחת של וקטור הביניים להרכבה ברמת יחידת שעתוק ובחירה ירוקה/אדומה תחת (C) אור נראה ואור UV (D). מושבות חיוביות הן ירוקות. היחס בין המושבות החיוביות הכוללות הוא 17.56 ± 3.32 %. הרכבה מוצלחת של יחידת שעתוק מההקרנה הווקטורית הבינונית והירוק/לבן תחת (E) אור נראה ואור UV (F). מושבות חיוביות הן מושבות לבנות ושליליות הן ירוקות. היחס בין המושבות החיוביות הכוללות הוא: 65.02 ± 3.32 %. הנתונים הם משלושה משכפלים ביולוגיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: צלחות מייצגות של שיבוט פלסמיד רב-גנים באי קולי. הרכבה של וקטור ביניים להרכבה ברמת רב-גנים ובחירהאדומה/ירוקהתחת ( A ) אור נראה ואור UV(B). מושבות חיוביות הן מושבות ירוקות ושליליות הן אדומות. היחס בין המושבות החיוביות הכוללות הוא 1.83 ± 0.15%. הרכבה מוצלחת של תפאורות TUs מרובות מהבחירה הווקטורית הבינונית והירוק/לבן (C) תחת אור נראה ואור UV(D). מושבות חיוביות הן לבנות. היחס בין המושבות החיוביות הכוללות הוא 93.77 ± 1.65%. הרכבה תת-אופטימלית של פלסמיד רב-גנים תחת(E)אור נראה ואור UV (F). מספר המושבות החיוביות הוא זניח. הנתונים הם משלושה משכפלים ביולוגיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: לוחות מייצגים של פלסמידים אינטגרטיביים ומשוכפלים בשמרים. פלסמידים מרובי גנים משוכפלים הפכו לשמרים עם (A) BTS1-ERG20 היתוך TU ו -( B) ERG20 TU. על כל צלחת, שמרים בצד שמאל יש פלסמידים המכילים CRTE TU, crtYB TU ו CRTI TU לייצור β-קרוטן ושמרים בצד ימין יש פלסמידים המכילים CRTE TU, crtYB (G247A)TU, ו CRTI TU לייצור ליקופן. (C)כימות β קרוטן וליקופן מתמצית שמרים עם ארבעה פלסמידים מרובי גנים באמצעות ספקטרומטר UV-vis. הספיגה המקסימלית נרשמה ב 450 ננומטר ו 470 ננומטר עבור β קרוטן וליקופן בהתאמה. הכימות המוחלט בוצע בסטנדרטים אותנטיים (איור S3 משלים). היתוך של BTS1-ERG20 מוביל לייצור של ~ 35-פי 35 גבוה יותר β קרוטן ו ~ 16.5 פי ליקופן גבוה יותר בהשוואה ERG20 לבד. לוחות מייצגים לשיבוש ארקוס ADE2 על ידי שילוב של פלסמיד אינטגרטיבי רב-גנים עם gRNA וללא דנ"א עוזר (D) ועם gRNA ופלסמיד אינטגרטיבי רב-גנים כ- DNA עוזר (E). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
חומרים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ערכת השיבוט המבוססת על MoClo שפותחה על ידי Lee et al. מספקת משאב מצוין להרכבה מהירה של אחת עד חמש יחידות שעתוק לפלסמיד מרובה גנים או לשכפול או להשתלבות בגנום השמרים. השימוש בערכה זו מבטל את צוואר הבקבוק של שיבוט זמן רב שקיים לעתים קרובות להבעת גנים מרובים בשמרים.
בדקנו חמישה תנאים שונים למחזורי העיכול/קשירה של שיבוט שער הזהב עם קשירת DNA T4. מצאנו כי 30 מחזורים של עיכול ב 37 °C (70 °F) במשך 5 דקות קשירה ב 16 °C (60 °F) במשך 5 דקות ואחריו שלב העיכול הסופי ב 50 °C (50 °F) במשך 10 °C (70 °F) במשך 5 דקות ואחריו צעד העיכול הסופי ב 50 °C (10 °F) עבור 4 חלקים הרכבה(איור משלים S1 וטבלה S3). קשירה ב 16 °C (60 °F) מבטיח פעילות ליגאז אופטימלית חישול overhang. עיכול סופי ב 50 °C (60 °F) מונע מוצרים מתעכלים של קשירה מחדש. מחזור זה היה אחריו עבור כל התגובות הרכבה אלא אם צוין אחרת.
מצאנו גם כמה צעדים קריטיים הזקוקים לתשומת לב מיוחדת לקבלת תוצאות מיטביות. אנו ממליצים בחום להרכיב וקטורים בינוניים עם נשירה sfGFP לפני הרכבת יחידות שעתוק. בתיאוריה, כל שבעת החלקים ניתן לשכפל לתוך וקטור E. coli עם mRFP1, ואחריו הקרנה אדום / לבן. עם זאת, בפועל, mRFP1 מפתחת צבע לאט מאוד וזה מאתגר להבחין בין מושבות E. coli אדום חיוור וצהוב תחת אור נראה. כמו sfGFP סופג בטווח UV52, באמצעות UV או transilluminator אור כחול מאפשר את ההקרנה למושבות ירוקות בהירות. כמו כן, שיבוט וקטור ביניים מאפשר הרכבה קלה יותר של שילובי האמרגן, התקליטורים והמסיתים השונים, ומאפשר יצירת ספריה משולבת קלה יותר, שכן הרכבה עם ארבעה חלקים גורמת בדרך כלל למושבות חיוביות יותר מאשר הרכבה עם יותר חלקים. איור S2 משלים מציג ירידה הדרגתית ביחס בין מושבות שעשויות להיות נכונות ממכלול של 6 חלקים להרכבה של 8 חלקים.
הריכוזים של כל החלקים חייבים להימדד בקפדנות כדי להבטיח את הריכוז המשווני של כל חלק. כימות חלקים באמצעות ספקטרומטר UV-Vis הוא בדרך כלל מספיק אבל שיטות רגישות יותר, כגון מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות, עשוי לתת תוצאות טובות יותר. כישלון לכמת במדויק את כל החלקים גורם לעתים קרובות ליעילות הרכבה נמוכה. יש לבחור את Esp3I ו- BsaI-HFv2 היעילים ביותר, בהתאמה. ראינו כי T4 עובד היטב עבור שני overhangs בערכה ו overhangs מותאם אישית יש צורך להתיך שני חלקים, אשר עולה בקנה אחד עם ספרות36, אם כי המאמר המקורי המליץ T7 ligase6. הגדלת מספר המחזורים יכולה להגדיל במידה מסוימת את מספר המושבות שעשויות להיות נכונות. לדוגמה, 25 מחזורים של עיכול וקשירת מספיקים כדי להרכיב שלושה עד ארבעה חלקים אבל 30-35 מחזורים לתת תוצאות טובות יותר עבור חלקים נוספים.
אסטרטגיית MolClo היא יתרון על פני שיטות הרכבה מרובות חלקים חלופיים8,9,10,11,12 כי זה מאפשר שיבוט מודולרי מאוד תכליתי. עם זאת, המגבלה העיקרית היא שלב הביות מאחר שלחלקים יש לעתים אתרי BsmBI, BsaI או NotI מרובים. מוטציה של כל החלקים עלולה לגזול זמן רב. במקרה זה, ניתן לשקול לסנתז את התקליטורים ללא אתרי הגבלה אלה. עם זאת, עבור מקדמים ומחסלים, מוטציה אפילו נוקלאוטידים בודדים עשויים לשנות את הפונקציונליות שלהם. לכן, אימות הפעילות של חלקים אלה באמצעות כתב assay מומלץ39. מגבלה נוספת היא שערכה זו מאפשרת רק עד חמש יחידות שעתוק בפלסמיד רב-גנים. אם רצויות יחידות תמלול נוספות, ייתכן שיבנו מחברים נוספים על-ידי בחירת ערכה של overhangs36תואם ביותר .
הערכה מספקת 27 מקדמים, שישה מחסלים, שבעה סמני בחירת שמרים, ושני שמרים ממוצא של שכפולים. ניתן לשכפל חלקים מותאמים אישית, כגון מקדמים ומיסיים, מקוריים או סינתטיים, לווקטור הכניסה בהתאם לפרוטוקול זה. ערכת MoClo שמרים שימש בעיקר עבור overexpressing מסלולים מטבוליים רב גנים לייצר כימיקלים בעלי ערך גבוה בשמרים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כאשר מתגים שונים עבור מעגלים ביולוגיים רצויים שמרים. יש גם פוטנציאל עצום ליישם ערכה זו לחקירת שאלות ביולוגיות בסיסיות על אינטראקציות חלבון-חלבון, לוקליזציה של חלבונים ופעילויות אנזימים. בסך הכל, פרוטוקול זה הוא מאוד גמיש ואמין והוא יכול לתמוך בכל שיבוט תובעני בביולוגיה שמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר של אוניברסיטת מדינת ניו יורק (פרס #: 71272) ופרס IMPACT של האוניברסיטה בבאפלו (פרס #: 000077).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
References
- Endy, D.
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
