Summary
Tavuk embriyolarının retinasından koni fotoreceptörlerinin birincil kültürlerini elde etmek için bir yöntem ve yüksek içerik taraması için kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
İnsan gündüz görüşü, retinanın merkezindeki koni fotoreceptörlerinin işlevine dayanır, fovea. Kalıtsal retina dejenerasyonu en yaygın formu olan retinitis pigmentosa muzdarip hastalar, rod fotoreceptörlerinin mutasyona bağlı kaybı nedeniyle gece görüşünü kaybederler, bu fenomenin ardından körlüğe yol açan konilerin ilerleyici bir fonksiyon kaybı ve ölümü. Genetikçiler bu hastalığa neden olan mutasyonlarla birçok gen tanımladılar, ancak tanımlanan ilk mutasyonlar ikincil koni dejenerasyonunun mekanizmalarını ve sadece çubuklarda ifade edilen görsel pigment için rodopsin gen kodlamasındaki baskın bir mutasyonun koni dejenerasyonunu nasıl tetikleyebileceğini sorguladı.
Hastalığın genetik bir modelinde yapılan nakillerin bu sonucu, çubuklar ve koniler arasındaki hücre etkileşimleri ve retinitis pigmentosa'nın tüm genetik formlarındaki konilerin hücre dışı otonom dejenerasyonu kavramına yol açmıştır.
Koniler insanlardaki tüm fotoreceptörlerin% 5'ini ve farede sadece% 3'ünü oluşturur, bu nedenle çalışmaları bu türlerde zordur, ancak koniler kuş türlerinde çubuk sayısından daha fazladır. 96 kuyu plakalarını, gelişimlerinin 29. Bu birincil kültürlerde koniler in vitro farklılaşmadan sonra hücrelerin % 80'ini temsil eder. Hücreler serum yokluğunda bir haftalık bir süre içinde dejenere eder. Burada yöntemleri ve standardizasyonunu açıklıyoruz.
Bu koni ile zenginleştirilmiş kültür sistemi, sıçan retina pigmentli epitel normalleştirilmiş cDNA kütüphanesinin yüksek içerikli taraması ile epitel türevi koni canlılık faktörünü (EdCVF) tanımlamak için kullanılmıştır. Rekombinant EdCVF konilerin dejenerasyonunu önler.
Introduction
Omurgalı türlerin retinası, loş ışık görüşü için çubuk fotoreceptörler ve gün ışığı, renk ve keskinlik görüşü için koni fotoreceptörleri ile çifttir. Primat görme keskinliği retinanın merkezinde, konilerde zenginleştirilmiş fovea adı verilen bir bölgeye dayanır, ancak genel olarak koniler tüm fotoreceptörlerin sadece% 5'ini temsil eder. Sonuç olarak, primat retinadaki konilerin analizi ve özellikle koni kültürü teknik olarak zordur. Diğer tüm memeli türlerinin foveası yoktur ve retina araştırmalarında en sık kullanılan kemirgenler için konilerin yüzdesi düşüktür. Bu, konilerin bu iyi gören kuş türlerinin retinasına hakim olduğu kuş türleri için böyle değildir. Memeliler evrim sırasında ilk ortaya çıktığında ekosisteme hakim olan dinozorlar, kuşların filogenetik kökenindedir1. Dinozorlar ve erken memeliler arasındaki bu rekabetin bir sonucu olarak, memeliler çoğunlukla çubukların hakim olduğu retinalarla gecedir. Ancak daha sonra evrim sırasında, primatların ait olduğu bazı memeli türlerinin diurnal görüşü evrimsel bir avantaj haline geldi. Bununla birlikte, ata dönemi, memeli görüşünün evriminde gece darboğazının bir atavizmi olarak kalır2,3.
Adler ve Hatlee, retina hücre farklılaşması üzerinde çalışırken, fotoreceptörlerin embriyonik gün (ED) 6 veya evre 294'tetavuktan elde edilen kültürlerde retina farklılaştırılmış hücrelerin yaklaşık% 70'ini temsil ettiğini göstermiştir. Tavuk retinasındaki konilerin yaygınlığı nedeniyle, ED6 tavuk embriyolarından retina hücrelerinin kültürleri koni ile zenginleştirilmiş kültürler olarak geliştirilmiştir5.
Koni aracılı görme keskinliğinin insan için önemi bir truizmdir. Koni fonksiyonunu değiştiren genetik veya yaşlanma hastalıklarından etkilenen insanlar büyük ölçüde özürlüdür. Bu, kalıtsal retina dejenerasyonları (IRD) üzerinde bu kör edici hastalıklar için tedaviler bulmak amacı ile çok geniş bir çalışma gövdesini teşvik etti6,7. IRD Leber konjenital amaurozun (LCA) şiddetli bir formunun tedavisi için rekombinant adeno ilişkili bir vektör (AAV) kullanılarak elde edilen ilk başarı, gen tedavisi için bir kavram kanıtıdır8. Mutasyonları IRD'yi tetikleyen genlerin tanımlanması, gen tedavisi kullanılarak bu hastalıkların tedavi etme olasılığını açar. Bununla birlikte, bu hastalıklar 200'den fazla farklı gendeki mutasyonlardan kaynaklanmaktadır9. IRD'nin otozomal resesif formları söz konusu olduğunda bile, morbid genin normal kopyasının yeniden tanıtılması görsel işlevi geri getirebildiğinde, her bir gelişmenin ekonomik maliyeti, daha az yaygın olanlara ve genetik kökeninin bilinmediği kişilere zarar vermede en yaygın olanları tercih eder. Bu gerçek, araştırmacıları daha genel tedaviler hakkında düşünmeye yönlendirdi. Apoptotik hücre ölümü ortak bir yol olarak ortaya çıktı ve otozomal dominant formlar da dahil olmak üzere fotoreceptörlerin dejenerasyonu ile ilerleyen bu hastalıkların terapötik bir hedefi10,11. Ancak, böyle bir yaklaşımın başarıları eksiktir. IRD'nin en yaygın formu olan retinitis pigmentosa (RP) için, ortak yol ikincil fonksiyon kaybı ve ardından konilerin dejenerasyonu12,13. Koni fonksiyonu kaybını önlemek, foveanın merkezi görüşünü etken mutasyonlardan bağımsız olarak koruyacaktır14.
RP'nin erken aşamasında, çubukların kaybı, çubuklar ve koniler arasındaki metabolik ve redoks sinyalini kesen nükleoredoksin benzeri 1 (NXNL1) geni tarafından kodlanan çubuk türevi koni canlılık faktörünün (RdCVF) ifadesinde bir azalmayı tetikler15. NXNL1 geninin iki ürününü, trofik faktör RdCVF'yi ve tiyoredoksin enzimi RdCVFL'yi kodlayan bir rekombinant AAV'nin yönetimi, teorik olarak RP16'nıntüm genetik formlarında koni görme kaybını önleyebilir. NXNL1 gen ürünü RdCVFL'nin tavuk konisi ile zenginleştirilmiş kültürlerde ifade edildiğini gösterdik17 ve koruyucu bir rol oynadığı18. RdCVF ve NXNL1 geni, koni ile zenginleştirilmiş bir kültürden hücrelerin hayatta kalması kullanılarak retinal cDNA kütüphanesinin yüksek içerik taraması ile19olarak tanımlanmıştır. Her klon için 8 paralel test kullanarak kütüphanenin 210.000 bireysel klonunun eşdeğerini taradık. Bu, biyolojik materyale, tavuk embriyolarının retinalarına kolay erişim gerektiren çok sayıda testi temsil eder. Embriyolu tavuk yumurtalarını haftalık olarak elde etmenin nispeten kolay olduğunu gördük, çünkü yumurta yumurtlayan tavuklar ve et üreten tavuklar için tarım endüstrisi için yaygın olarak üretiliyorlar. Koni ile zenginleştirilmiş kültürlerin dikkatli bir şekilde standartlaştırılmasından sonra, sistem koni canlılığını koruma yetenekleri için binlerce molekülü test etmenin kolay, sağlam ve tekrarlanabilir bir yolunu sağlar. Bu hücreler ayrıca sinyal transdüksiyonu çalışmasına ve biyokimyasal analizlere fayda sağlayan genetik manipülasyonlar20'ye ve biyokimyasal analizlere de elverişlidir21,22,23.
Retina araştırmacıları koni hücre hattı 661W24 , 25,26olarak alternatif yöntemlergeliştirmiştir. Bununla birlikte, bu hücre hattının kimliği tartışmalı olmaya devam ediyor27,28. 661W hücreler, insan interphotoreceptor retinol bağlayıcı protein promotörünün kontrolü altındaki SV40 büyük T antijenini ifade eden transgenik bir fare hattının retina tümörlerinden klonlandı. SV40 büyük T antijeni hücresel dönüşüme ve ölümsüzleşmeye aracılık eder. Sonuç olarak, 661W hücreler kullanılarak tanımlanan sinyal yolu, yerinde konilerden birçok yönden farklı olan dönüştürülmüş ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattı bağlamına bildirilmelidir. Bu bakımdan, koni ile zenginleştirilmiş kültür sistemi, fizyolojik olarak daha alakalı koniler olan birincil nöronlardan oluşur.
Fare retinasının vibratom kesitini kullanarak saf bir fotoreceptör kültürü elde etmek mümkün olsa da, kemirgenlerin dış retinasındaki konilerin çok düşük yüzdesi, bu yaklaşımı koni ile zenginleştirilmiş kültürler üretmek için uygun hale getirir29. Domuz retinası fovea içermez, ancak konilerde çok zenginleştirilmiş area centralis adı verilen bir bölgeye sahiptir30. Arvicanthis ansorgei ve Psammomys obsesus31,32gibi retina diurnal kemirgenlerdeki konilerin yüksek oranı olası bir çözüm sunar, ancak bu tür egzotik türlerin üremesini gerektirir. Yerel mezbahalardan toplanan yetişkin domuz gözleri, fotoreceptör sağkalımını incelemek için kullanılan çubuk ve konilerin karışık bir kültürünü üretmek için kullanılabilir33. Zarif bir çözüm, konileri seçici olarak konilere bağlayan fıstık agglutinin (PNA) lektin ile tavalama kullanarak domuz retinasından önceden arındırmaktır34. Bununla birlikte, bu yöntemin karmaşıklığı nedeniyle büyük ölçekte uygulanması zordur.
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPS), retina nakli için kullanılabilecek ancak koni ile zenginleştirilmiş kültüre de uyarlanabilen bir koni fotoreceptör hücre popülasyonu elde etmek için en umut verici yaklaşımı sunar35,36. Transkripsiyon faktörü NRL çubuk fotoreceptörler için gerekli olduğundan37, Nrl-/- fare kısa dalga konilerinin (S-konileri) hakim olduğu bir retinaya sahiptir. İnaktivasyon, insanın iPS38,39'danfarklılaştırılmasıyla S-koni ile zenginleştirilmiş preparat üretmek için kullanılabilir. Başka bir olası yaklaşım tiroid hormon sinyali kullanarak koni farklılaşma teşviketmektir 40. İnsan iPS'lerinden koni ile zenginleştirilmiş kültürler üretmek için yeni yöntemler ortaya çıkarken, tavuk embriyoları mevcut kanıtlanmış bir yöntem sağlar19.
Koni ile zenginleştirilmiş kültür, RdCVF'nin19ifade klonlama ile tanımlanmasında etkili oldu. Bu sistem ayrıca, RdCVF'nin glikoz alımını ve metabolizmasını aerobik glikoliz22. Ayrıca, NXNL1 geni23'ünikinci ürünü olan RdCVFL'nin koruyucu rolünü doğrulamak için koni ile zenginleştirilmiş kültür kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, bu sistem OTX241ile transdüklenmiş retina pigmentli epitel hücreleri tarafından salgılanan koruma moleküllerinin varlığını göstermek için kullanılmıştır.
Protocol
Protokol, Pierre ve Marie Curie Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ve Fransız Araştırma Bakanlığı tarafından onaylandı (İzin Numarası: APAFIS#1028 2015070211275177). Hayvan deneyleri aşağıdaki yetkiyle gerçekleştirildi: "Certificat d'autorization d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 Kasım 2011-8 Kasım 2016)".
1. Döllenmiş yumurtaların kuluçkalanması
- Endüstriyel bir kuluçkahanede doğal olarak elde edilen haftalık döllenmiş yumurtaları (strain I 657, kırmızı etiket) toplayın.
- Döllenmiş yumurtaları tavuk tarafından "bırakıldıktan" sonra laboratuvarda 17 °C'de (biyolojik sıfırları) saklar.
- Her kültür için, yedi döllenmiş yumurtayı 20 ° C'de 24 saat ve daha sonra 37 ° C'de 136 saat boyunca, yumurtaların eğiminin aralıklı olarak geri döndürülmesiyle (bir taraftan tersine 2 saat boyunca aşamalı bir hareket, 4 saatlik bir döngü) nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın.
2. Tavuk embriyolarının geri kazanımı
- Yedi yumurtanın yüzeyini dezenfektanla yıkayın (örneğin, Pursept A express).
- Yumurta kabuğunu kırmak için, kabuğun üst kısmında büyük düz pense ile bir delik açın. Daha sonra şapkayı yumurtadan yumuşak haşlanmış bir yumurta olarak çıkarmak için kabuğu kesin.
- Her embriyoyu kavisli kümeslerle yumurta kabuğundan hafifçe çıkarın ve daha önce 37 °C'ye ısıtılmış steril fosfat tampon salin (PBS) içeren bir Petri kabına aktarın. Yavaşça, embriyoları çevreleyen zarfı (koroyon veya chorioallantoic membran) çıkarın.
- Hamburger ve Hamilton42ile görsel karşılaştırma ile her embriyonun gelişim aşamasını doğrulayın.
- Gelişimin29. Kanatlar dirseklerden bükülür. Yaka gözle görülür şekilde göze çarpıyor. Tasarı28.
- Seçilen bu embriyoların gözlerini enüklee ederek CO2-bağımsızortamda (Yaşam teknolojileri) transfer eder.
DİkKAT: Embriyonun 28 veya 30. bu yüzden sonunda sadece iki tane kullanılacak olsa bile en az 7 yumurtayı kuluçkaya yatırmak gerekir. Korozyon çok incedir, ayırt edilmesi çok zordur, ancak embriyodan çok yakındır, bu nedenle embriyoya dokunmadan çıkarılması gerekir.
3. Retinaların diseksiyonu
- Seçilen embriyoların kafasını kavisli kümes uçlarıyla deplate edin ve enükle edin.
- Dört gözü CO2-bağımsız ortama aktarın. Bu ortam 0.9 mM CaCl2 ve 0.65 mM MgCl2içerir.
- Gözü kornea yüzüstü, optik sinir deneyciye bakacak şekilde konumlandırın. İki düz emiş kullanarak optik sinirde bir delik açın.
- Retina ve pigment epitel arasına her bir eparın bir dalını yerleştirin (Şekil 2). Her bir epansı çekin ve epiteli retinadan ayırmak için gözü döndürün. Korneayı ve ardından lensi ve vitreusları çıkarın.
- Dört retinayı pH 7.2'de Ringer'ın ortasını içeren bir Petri kabına aktarın.
DİkKAT: Sadece retinanın kaldığından emin olun ve vitreus ve kalan retina pigmentli epitel izlerini giderin.
4. Retina hücre süspansiyonu hazırlama
- dört retinayı iki düz pense kullanarak çok küçük parçalar halinde kesin.
- Retina parçalarını Ringer'ın ortamıyla iki kez yıkayın.
- Ringer'ın ortamıyla ikinci yıkamadan sonra, retina parçalarının tüpün altına düşmesine izin verin ve Ringer'ın ortasını çıkarın. Retina parçalarını 37 °C'de 20 dakika boyunca tripin çözeltisi (%0,25 w/v) ile tedavi edin.
- Çözeltiyi 10 dakika sonra art arda emişle dağıtın. Pasteur pipet kullanarak deşarj edin ve retina parçalarının ayrışıp ayrışma olup olmadığını kontrol edin. %10 inaktive foetal baldır serumu ile desteklenmiş kültür medyası ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- Hücre süspansiyonunu 0,05 mg DNase I ile kuluçkaya yayalım.
- Retina hücresi süspansiyonunun kimyasal tanımlı kültür ortamı (CDCM) ile iki kez yıkanması: 100 μg/mL linoleik asit/BSA ile desteklenmiş Eşit miktarda Dulbecco Modifiye Kartal Orta ve M199 ortamı, 0,86 μM insülin, 0,07 μM transferrin, 2,0 μM progesteron, 0,28 μM prostaglandin, 0,29 μM Na2SeO3, 182 μM putrescine, 3 mM taurin, 4.7 μM sitotokin 5′-difosfokolin, 2.7 μM sitotokrin 5′-difosphoethanolamine, 0.55 μM hidrokortizon, 0.03 μM triiodothyronine, 1 mM sodyum piruvat ve 20 μM gentamycin.
5. Retina hücre tohumlama
- Şeffaf tabanlı iki siyah 96 kuyulu kültür plakayı 37 °C'de 2 saat boyunca 32,25μg/cm 2'de poli-L-lizin ile tedavi edin.
- Bu plakaları M199 kültür ortamı ile iki kez durulayın. Hücre peletini 1 mL CDCM'de yeniden sunun.
- Canlı hücreleri lekelamak için hücre süspansiyonunun 10 μL'lik bir aliquot'una maviyi deneyin. Hücrelerin süspansiyon örneğini bir hemmositometreye (Malassez hücre sayım odası) ekleyin.
- Mikroskop altında, hemositometrenin dört satırı (yani 40 kare) için lekeli hücreleri sayın ve sonra bir satır için ortalama hücre numarasını hesaplayın. Aşağıdaki yöntemi uygulayarak süspansiyonun hücrelerinin konsantrasyonunu hesaplayın: Süspansiyonun hücre/mL sayısı = bir satırdaki ortalama hücre sayısı (10 kare) x 10 hemoteratometre x seyreltmenin toplam kare sayısı trypan mavi x 1.000 (sonucu hücre/mL olarak ifade etmek için).
- Hücre süspansiyonu CDCM kullanarak iki kaplama yoğunluğuna (1 x 10 5 hücre/cm 2 ve 2 x10 5 hücre/cm2) karşılık gelen iki konsantrasyona (5,6 x10 4 hücre/mL ve 1,12 x 10 5 hücre/mL) getirin.
- İki hücre süspansiyonunun tohum 50 μL'si, önceden işlemden geçmiş iki siyah 96 kuyu kültür plakasına. Plakalardaki hücreleri plakanın sağından sola doğru çok kanallı bir pipetle dağıtın, her sütun arasında homojenleşerek hücrelerin dağılımı homojendir.
- Önceden tanımlanmış bir desen kullanılarak taranmak üzere molekül kitaplığının 50 μL'lik kısmını ekleyin(örneğin,bir cDNA kitaplığındaki koşullandırılmış ortam, aşağıya bakın).
- Plakaları 37°C'de % 5 CO2'nin altında yedi gün boyunca ortam değişikliği olmadan kuluçkaya yatırın.
6. Uygulanabilir hücreleri sayma
- Plakanın her kuyusuna 2,7 μM kalsein ve 0,3 mM ethidyum homodimer ekleyin.
NOT: Calcein, ethidyum homodimer olarak büyük moleküllere geçirimsiz hücrelere nüfuz eder. Canlı hücrelerin sitoplazmında, kalsein endojen esterazlar tarafından hidrolize edilir, 485 nm'de heyecanlandığında 520 nm'de yayılarak floresan olur. Ethidyum homodimer ölü hücrelerde DNA'ya bağlanır. Ethidyum DNA-homodimer bağlama, 520 nm'de heyecanlandıktan sonra 635 nm'de kırmızı floresanların yayılmasına neden olur. - Işık yokluğunda tabakları oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
- 485 ve 520 nm'de iki ekscitasyon filtresi, 520 ve 635 nm'de iki emisyon filtresi, bir amaç (x10), bir işlemci ve şarj bağlantılı bir cihaz kamerası (CCD) tarafından kontrol edilen motorlu bir sahne ile donatılmış ters bir mikroskopla donatılmış bir mikroskoptaki floresan okuyun. Bu sayım platformu Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilir19. 96 kuyu plakasının her kuyusunda aynı anda canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin floresan görüntülerini elde etmeyi mümkün kılar, kuyulardan başlayarak A1'den kuyu A12'ye, daha sonra B12'den B1'e doğru, C1 C1'e doğru ve benzeri (Tablo I).
- Negatif denetimlerin 18 kuyusunun(Tablo I)kullanılarak tek bir hücrenin ortalama A alanını hesaplayın.
- Plakanın her kuyusundaki hücreleri sayın ve hücre çiftlerinin (iki hücrenin gruplandırması) sayılmasını önlemek için aşağıdaki ampirik formül A x 29 / 20.7'yi uygulayın. Konilerin moleküllere göre koruyucu etkisini, molekülü test ettiğimiz 4 kuyudaki ortalama hücre sayısı ile negatif kontrolün 18 kuyusundaki ortalama hücre sayısı arasındaki oran olarak puanlandırın (bkz. Tablo 1 ve Tamamlayıcı Şekil 1).
- 1 x 105 hücre/cm2'de tohumlanan plakanın sonuçlarını, taranan her molekül tarafından potansiyel korumayı (canlılık oranı) değerlendirmek için 2 x10 5 hücre/cm2'de tohumlanmış plaka ile birleştirin.
Representative Results
Koni ile zenginleştirilmiş kültür sisteminin proteinleri koruyan yeni konileri tanımlamak için nasıl kullanılabileceğini burada açıklıyoruz. Bu protokolü, 8 haftalık Long-Evans sıçanlarının 400 gözünden koroid ve retina pigmentli epitelden yapılmış normalleştirilmiş bir cDNA kütüphanesini taramak için kullandık43.
Bu kitaplık, birimleri (CFO) oluşturan6,0 x 10 6 bağımsız koloni içerir ve ortalama klonlanmış kesici uç boyutu 2,1 kilobase (kb) dir ve rekombinant klonların% 99'undan fazladır. Bu kütüphaneden 100 klondan oluşan havuzlar geçici olarak COS-1 hücrelerine (0.1 μg plazmid DNA) transktriğe geçirildi ve COS-1'in şartlı ortamı (CM) DMEM'de serumsuz 48 saat kuluçkadan sonra hasat edildi. Membranlar veya ekzomlar ultrasantrifüjleme ile çıkarılmadı. Her CM'nin elli mikrolitresi iki 96 kuyu plakasının 4 kuyusuna eklendi: biri 2 x 105 hücre / cm2'detohumlanmış, diğeri 4 x 105 hücre / cm2. Kütüphaneyi oluşturmak için kullanılan boş vektör pcDNA3.1 ile transfecteded COS-1 hücrelerinden CM negatif kontrol olarak kullanılmıştır (Tablo 1). Dört kültür kuyusunda ve koni ile zenginleştirilmiş kültürlerin iki tohumlama koşulu için 211.200 bireysel klona karşılık gelen toplam 2.112 set 100 klon değerlendirildi. İki koşul, toplam 1.689.600 kültür kuyusu için koruyucu aktiviteyi daha hassas bir şekilde değerlendirmeyi mümkün kılan iki farklı aşılama yoğunluğuna karşılık gelir.
2'den büyük oranlı 42 klon havuzu arasında, 0080 ve 0073 havuzları, 7 günlük kültürden sonra canlılık oranı 16 ve 14 kat daha yüksektir, pcDNA3.1 (Tamamlayıcı Şekil 1). Bu analiz, ilgi alanlarını belirlemek için gereklidir. Seçilen her 100 klon havuzu, gliserol stoklarından 16 set 10 klona bölündü. Bu alt havuzlar ikinci tur taramada (yani toplam 3.200 kültür kuyusu) aynı yönteme göre hazırlanmış ve test edilmiştir. Alt havuz 0073-09 en güçlü canlılık oranını verdi (Tamamlayıcı Şekil 2A) ve koni ile zenginleştirilmiş kültürler üzerinde üçüncü turda test edilen 16 bireysel klon üretmek için alt bölümlere ayrıldı. Klon 0073-09-37 klonu, 2,5'e eşit bir canlılık oranıyla diğerlerinden açıkça sıyrılır (Tamamlayıcı Şekil 2B). Tohumlama yoğunluğu Ek şekil 2A'dan aynı olsa bile y ekseni farklı bir ölçeğe sahiptir. Bunu, tahliller aylarca haftalık olarak tekrarlandığında yaygın olarak gördük. Analizden sonra, bu sonuçlar klon 0073-09-37'nin koni sağkalımında sağlam ve tekrarlanabilir bir etkiye sahip olduğunu doğrulamaktadır. Test bağımsız olarak tekrarlandı (Şekil 3A) ve 1.8 kb'lık kesici uç sıralandı (Şekil 3B).
Biyoinformatik bir analiz, klonun 0073-09-37, epitel türevi koni canlılık faktörü (EdCVF) olarak adlandırdığımız, üç açık okuma çerçevesi (ORF) içerir, en yukarı akış (ORF1) sıçan proteininin C-terminal kısmının C-terminal kısmının 84 kalıntısı için kodlar çinko parmak proteini-180 (ZFP180, NP_653358) 727 amino asit44. Diğer iki ORF (ORF2 ve ORF3) farelerde çok daha az korunur ve diğer memelilerde yoktur. Bağımsız olarak test edildiğinde, sadece ORF1 koniler üzerinde koruyucu bir etki uygular (Ek Şekil 3). ORF1 glutatyon S-transferaz (GST) füzyon proteini olarak üretilmiştir (Şekil 4A). EdCVF proteini saflaştırılmış ve GST etiketi kaldırılmıştır (Şekil 4B). EdCVF, koni ile zenginleştirilmiş kültür sisteminde koni dejenerasyonunu önleyebilir (Şekil 4C).
Şekil 1: 28. ,29.ve 30. Oklar W: kanat, C: yaka ve B: fatura. Ölçek çubuğu 1 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tavuk embriyosunun retinasının diseksiyonu Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Epitel türevi koni canlılık faktörü (EdCVF), klon 0073-09-37. A. Koni ile zenginleştirilmiş kültürde daha fazla canlılık. B. cDNA klonunun sırası 0073-09-37. Altı çizili sıra GAATTC, kitaplığı oluşturmak için kullanılan EcoRI kısıtlama sitesidir. Kalın gtg iki codons vektör kaynaklı EdCVF için nadir çeviri başlatma siteleridir. Öğrencinin teste göre istatistiksel analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Rekombinant EdCVF aktivitesi. A. Glutatyon S-transferaz (GST) ile füzyonda EdCVF dizisi. B. Saflaştırılmış rekombinant EdCVF proteini. C. Kültürde koni üzerinde GST-EdCVF trofik aktivitesi. Tukey'in testini kullanarak istatistiksel analiz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: CDNA havuzu için ortalama hücre sayısının oranı ve negatif kontrol, taramanın ilk turunda boş vektör pcDNA3.1 ile trans enfekte cos-1 hücrelerinin koşullandırılmış ortamı. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 2: Canlı hücre sayısı. A. 0073 havuzunun alt havuzları ile ikinci tur tarama. B. İzole klonlarla üçüncü tur tarama. CN: COS-1 hücrelerinin koşullandırılmış ortamı boş vektör ile transfected, pcDNA3.1. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: İzole klonun üç açık okuma çerçevesinin trofik aktivitesi 0073-09-37. Dunnett'in testini kullanarak istatistiksel analiz. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | Nc | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | Nc |
| B | Nc | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | Nc | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| C | 6 | Nc | 6 | 6 | 6 | 7 | 7 | Nc | 7 | 7 | 8 | 8 |
| D | 8 | 8 | Nc | 9 | 9 | 9 | 9 | 10 | Nc | 10 | 10 | 10 |
| E | 11 | 11 | 11 | Nc | 11 | 12 | 12 | 12 | 12 | Nc | 13 | 13 |
| F | 13 | 13 | 14 | 14 | Nc | 14 | 14 | 15 | 15 | 15 | Nc | 15 |
| G | 16 | 16 | 16 | 16 | 17 | Nc | 17 | 17 | 17 | 18 | 18 | Nc |
| eroin | 18 | 18 | 19 | 19 | 19 | 19 | Nc | 20 | 20 | 20 | Nc | 20 |
| NC negatif kontrolleri | ||||||||||||
| Havuzların 1-20 pozisyonu dört katına test edildi | ||||||||||||
Tablo 1: Yüksek içerik taraması için 96 kuyu plakasının planı
Discussion
Tavuk embriyolarından koni ile zenginleştirilmiş bir kültürün üretimini sınırlandırabilecek birçok parametre arasında, ilk kritik adım, yumurtadan çıkan yumurtalardaki embriyoların gelişim aşamasını doğru bir şekilde tanımlamaktır. ED8'deki (34. evre) embriyoların retinalarından hücre kültürünün sadece% 35 fotoreceptör ürettiği ve geri kalan%65'inin diğer nöronlardan yapıldığı görülmüştür4. Yumurtadan çıkan yumurtaları almak için uygulanan lojistik ne olursa olsun, sıcaklığı ve kuluçka süresini hassas bir şekilde ayarlamak ve embriyoları gelişimin tüm aşamalarının referans resimlerine kıyasla dikkatlice incelemek gerekir42,45.
Başlangıçta, koni ile zenginleştirilmiş kültür sistemi White Leghorn strain4kullanılarak geliştirilmiştir. Bu türün yumurtalarının beyaz rengi Özellikle Fransa'da takdir edilmiyor, bu yüzden kahverengi yumurta üreten bir tavuk türü kullandık. Ja57 tavuğu 5 ile I 66 horozları geçerek yapılan I 657 suşunukullandık. Orijinal kültürlerin özelliklerini yeniden üretebildik. Bu, tavuğun genetik arka planının koni ile zenginleştirilmiş kültürler elde etmek için kritik olmadığını göstermektedir.
Kültür ortamında takviyelerin bireysel olarak çıkarılmasının etkisini test etmedik, ancak insülinin, otozomal resesifRP 46modeli olan rd1 faresinde konilerin hayatta kalması üzerindeki etkisine uygun olarak kritik bir rol oynadığını gözlemledik. Triiyodotironin (T3) ayrıca tavuk embriyosunun retina öncül hücrelerinin gelişim sırasında retina hücre kaderinde tiroid hormon reseptörü rolüne göre konilere farklılaşmasına katılabilir40. Sonuç olarak, koni ile zenginleştirilmiş kültür sistemi, ifade klonlama ile insülin tanımlamak için kullanılamaz46.
Koni ile zenginleştirilmiş kültür sistemi birincil nöron kültürüne dayanır ve hücre hattı 661W24 , 25,26 olarak ölümsüzleştirilmiş hücrelerin kullanımına dayanan çok daha uygun tha yöntemleridir.
Burada açıklanan yöntem plazmid DNA20ile önceden elektroporasyon yapılarak değiştirilebilir. Retina hücre süspansiyonu hazırlanmadan önce, tüm retina, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA'da 120 μL 0.5 μg / μL plazmid DNA'sı ile özel yapım bir elektroporatör odasına yerleştirilir. Her biri 50 ms için 15 V'lik beş darbe, 950 ms aralık22ile ayrılmıştır. Koni ile zenginleştirilmiş kültürlere çoğaltma yetkin kuş splice (RCAS) retrovirüslerini kullanarak müdahaleci RNA (RNAi) sunma girişimleri başarısız oldu47. Bunun nedeni kesinlikle serumun yokluğunda ve düşük yoğunluklu kültürlerde, retina öncül hücrelerin çoğalıcı olmaması, retrovirüslerin yayılması için bir gerekliliktir.
İfade klonlama kullanarak koni sağkalımını destekleyen trofik faktörleri tanımlamak için koni ile zenginleştirilmiş kültür sistemini geliştirdik19. Mümkün kılmak için, 100 klonluk havuzlardan şartlandırılmış ortam kullanarak yüksek içerik taramasının ilk adımını gerçekleştirdik. Cos-1 hücrelerinin transfeksiyonundan sonra kütüphaneden gelen cDNA'lar güçlü bir CMV promotörünün kontrolü altında ifade edilse bile, bireysel cDNA'lar tarafından kodlanan tüm proteinlerin canlılık testine göre pozitif olarak puanlanacak kadar bir konsantrasyona ulaşması garanti vermez. Bu büyük bir sınırlamadır. Bu anlamda, herhangi bir tarama gerçekten kapsamlı değildir. Ek olarak, membranöz proteinler şartlandırılmış ortamdan çıkarılmamış olsa bile, tahlil yapılandırması difüzif olmayan faktörlerin tanımlanması için elverişsizdir. Bir alternatif, aynı aday proteinin birçok kez test edilmesindeki çoğaltmaları önlemek için cDNA'ların sırasını elde ettikten sonra tek tek klonları taramak olacaktır. Bu, kullandığımız retinal cDNA kütüphanelerinin sıralanarak başlatıldı43. Rasyonel olmakla birlikte, bu yaklaşımın da sınırlamaları vardır. CDNA dizilerinin biyoinformatik analizi, artıklığın azaltılmasının yanı sıra, bilgiye dayalı belirli klonların taranma önceliklendirilmesini karşı konulmaz bir şekilde dayatacaktır. Bu, son olarak, tüm kütüphanenin yapılması için gereken süre önemli ölçüde uzatılsa bile taranması durumunda zararlı olmayacaktır. Ama her zaman, dizinin kimliği sonuçlara bakış şeklimizi etkileyecektir. Dizinin yorumlanması doğal olarak deneysel verilerle rekabet halinde olacağından bu nötr olmayacaktır.
EdCVF'nin tanımlanması, yüksek içerik taramasının teknik sınırlamalar gerektirdiğini de göstermektedir. Taramanın ilk turundan itibaren, yüksek aktiviteye sahip iki havuz belirledik (Tamamlayıcı Şekil 1). Havuz 0073, EdCVF'nin başarılı bir şekilde tanımlanmasına yol açarken, havuz 0080 bu bulguya uymuyor. Alt havuzların hazırlanması sırasında aktif klonun kaybından kaynaklanan sorunu çözemedik. Alternatif olarak, istatistiksel olarak elverişli olmasa bile, havuz 0080'in cDNA'ları arasında iki proteinin sinerjik olarak hareket ettiği ve aktivitelerinin bireysel klonlar olarak gözlemlenemediği hariç tutulmaz.
Küçük molekülleri tarayarak konileri koruyan moleküllerin tanımlanması, koni ile zenginleştirilmiş kültür sisteminin gelecekteki bir uygulamasıdır. Bu tür moleküller, gen tedavisinin yaşa bağlı makula dejenerasyonu olarak en uygun yaklaşım olmadığı retina patolojilerinin tedavisi için paha biçilmez olacaktır.
Disclosures
TL, J-AS ve VF retina dejenerasyonlarını tedavi etmek için EdCVF kullanımına ilişkin bir patente sahiptir [WO2009071659 (A1). 12 Haziran 2007].
Acknowledgments
Yazarlar Jacques Bellalou, Lorelei Fournier, Emmanuelle Clérin, Frédéric Blond ve entreprise agricole à responsabilité limitée'ye (EARL Morizeau Dangers, Fransa) paha biçilmez yardımları için teşekkür ediyor. Bu çalışma Inserm, Sorbonne Üniversitesi, Agence Nationale pour la Recherche (ANR, Labex Lifesenses), Foundation Fighting Blindness (ABD) ve IHU FOReSIGHT [ANR-18-IAHU-0001] tarafından Investissements d'Avenir programı dahilinde ANR tarafından yönetilen Fransız devlet fonları tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 black plates (Clear Button with lid Tissue culture treated) | Corning | 3603 | |
| Calcein AM | Thermo-Fisher scientific | C1430 | |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSnap FX HQ | |
| CDPC (Cytidine 5′-diphosphocholine sodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | C0256 | |
| CO2 Independant | Thermo-Fisher scientific | 18045-054 | |
| Curved forceps | Dutscher | 005093 | |
| DMEM Media | Thermo-Fisher scientific | 41966-029 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eggs incubator | FarmLine | M08 01 3100 | |
| Ethidium Homodimer | Thermo-Fisher scientific | E1169 | |
| Fœtal bovine serum | Thermo-Fisher scientific | 10270-098 | |
| Gentamycin | Thermo-Fisher scientific | 15710-049 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0880 | |
| ITS (insulin Transferine selenium) | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| large straight pliers | Dutscher | 005074 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L8384 | |
| M199 medium | Thermo-Fisher scientific | 31150-022 | |
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Microscope | NIKON | Eclipse TE2000 | |
| Motorized stage | Martzauzer | Mutlicontrol 2000 | |
| Optical filter switch | Shutter Instrument company | Lambda 10-2 | |
| PBS 1X | Thermo-Fisher scientific | 14190-086 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Pursept A express | Fisher scientific | 11814110 | |
| Putriscine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| straight forceps | Dutscher | 005092 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| Trypan blue | Thermo-Fisher scientific | 15250-061 | |
| Trypsine 0.25 % | Thermo-Fisher scientific | 25200-056 |
References
- Brownstein, C. D. The Implicit Mind. , Oxford University Press. (2019).
- Heesy, C. P., Hall, M. I. The nocturnal bottleneck and the evolution of mammalian vision. Brain, Behavior and Evolution. 75 (3), 195-203 (2010).
- Borges, R., et al. Adaptive genomic evolution of opsins reveals that early mammals flourished in nocturnal environments. BMC Genomics. 19 (1), 121 (2018).
- Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
- Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 818-825 (2003).
- Roska, B., Sahel, J. A.
- Duncan, J. L., et al. Inherited Retinal Degenerations: Current Landscape and Knowledge Gaps. Translational Vision Science & Technology. 7 (4), 6 (2018).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- RetNet. Retinal Information Network. , (2020).
- Doonan, F., Donovan, M., Cotter, T. G. Activation of multiple pathways during photoreceptor apoptosis in the rd mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (10), 3530-3538 (2005).
- Comitato, A., et al. Dominant and recessive mutations in rhodopsin activate different cell death pathways. Human Molecular Genetics. 25 (13), 2801-2812 (2016).
- Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Current Gene Therapy. 7 (2), 121-129 (2007).
- Baumgartner, W. A., Baumgartner, A. M. Accounting for disagreements on average cone loss rates in retinitis pigmentosa with a new kinetic model: Its relevance for clinical trials. Medical Hypotheses. 89, 107-114 (2016).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), (2010).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Metabolic and redox signaling in the retina. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (20), 3649-3665 (2017).
- Clerin, E., Marussig, M., Sahel, J. A., Leveillard, T. Metabolic and Redox Signaling of the Nucleoredoxin-Like-1 Gene for the Treatment of Genetic Retinal Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), (2020).
- Fridlich, R., et al. The Thioredoxin-like Protein Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVFL) Interacts with TAU and Inhibits Its Phosphorylation in the Retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants, Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nature Genetics. 36 (7), 755-759 (2004).
- Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. Journal of Visualized Experiments. (105), e52002 (2015).
- Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Ait-Ali, N., et al. Rod-derived cone viability factor promotes cone survival by stimulating aerobic glycolysis. Cell. 161 (4), 817-832 (2015).
- Mei, X., et al. The Thioredoxin Encoded by the Rod-Derived Cone Viability Factor Gene Protects Cone Photoreceptors Against Oxidative Stress. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (16), 909-923 (2016).
- Tan, E., et al. Expression of cone-photoreceptor-specific antigens in a cell line derived from retinal tumors in transgenic mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 764-768 (2004).
- Wang, X. W., Tan, B. Z., Sun, M., Ho, B., Ding, J. L. Thioredoxin-like 6 protects retinal cell line from photooxidative damage by upregulating NF-kappaB activity. Free Radical Biology and Medicine. 45 (3), 336-344 (2008).
- Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).
- Krishnamoorthy, R. R., Clark, A. F., Daudt, D., Vishwanatha, J. K., Yorio, T. A forensic path to RGC-5 cell line identification: lessons learned. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5712-5719 (2013).
- Al-Ubaidi, M. R. RGC-5: are they really 661W? The saga continues. Experimental Eye Research. 119, 115 (2014).
- Clerin, E., et al. Vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Hendrickson, A., Hicks, D. Distribution and density of medium- and short-wavelength selective cones in the domestic pig retina. Experimental Eye Research. 74 (4), 435-444 (2002).
- Bobu, C., Craft, C. M., Masson-Pevet, M., Hicks, D. Photoreceptor organization and rhythmic phagocytosis in the nile rat Arvicanthis ansorgei: a novel diurnal rodent model for the study of cone pathophysiology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 3109-3118 (2006).
- Saidi, T., Mbarek, S., Chaouacha-Chekir, R. B., Hicks, D. Diurnal rodents as animal models of human central vision: characterisation of the retina of the sand rat Psammomys obsesus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249 (7), 1029-1037 (2011).
- Traverso, V., Kinkl, N., Grimm, L., Sahel, J., Hicks, D. Basic fibroblast and epidermal growth factors stimulate survival in adult porcine photoreceptor cell cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (10), 4550-4558 (2003).
- Balse, E., et al. Purification of mammalian cone photoreceptors by lectin panning and the enhancement of their survival in glia-conditioned medium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (1), 367-374 (2005).
- Gagliardi, G., et al. Characterization and Transplantation of CD73-Positive Photoreceptors Isolated from Human iPSC-Derived Retinal Organoids. Stem Cell Reports. 11 (3), 665-680 (2018).
- Gagliardi, G., Ben M'Barek, K., Goureau, O. Photoreceptor cell replacement in macular degeneration and retinitis pigmentosa: A pluripotent stem cell-based approach. Progress in Retinal and Eye Research. 71, 1-25 (2019).
- Mears, A. J., et al. Nrl is required for rod photoreceptor development. Nature Genetics. 29 (4), 447-452 (2001).
- Swaroop, A., Kim, D., Forrest, D. Transcriptional regulation of photoreceptor development and homeostasis in the mammalian retina. Nature Reviews Neuroscience. 11 (8), 563-576 (2010).
- Kallman, A., et al. Investigating cone photoreceptor development using patient-derived NRL null retinal organoids. Nature Communications. 3 (1), 82 (2020).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Kole, C., et al. Otx2-Genetically Modified Retinal Pigment Epithelial Cells Rescue Photoreceptors after Transplantation. Molecular Therapy. 26 (1), 219-237 (2018).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Kole, C., et al. Identification of an Alternative Splicing Product of the Otx2 Gene Expressed in the Neural Retina and Retinal Pigmented Epithelial Cells. PLoS One. 11 (3), 0150758 (2016).
- Shannon, M., Hamilton, A. T., Gordon, L., Branscomb, E., Stubbs, L. Differential expansion of zinc-finger transcription factor loci in homologous human and mouse gene clusters. Genome Research. 13 (6), 1097-1110 (2003).
- Stern, C. D., Holland, P. W. Essential developmental biology: a practical approach. , (1993).
- Punzo, C., Kornacker, K., Cepko, C. L. Stimulation of the insulin/mTOR pathway delays cone death in a mouse model of retinitis pigmentosa. Nature Neuroscience. 12 (1), 44-52 (2009).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
