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Genetics

CRISPR/Cas9 Édition du gène C. elegans rbm-3.2 à l’aide du marqueur de criblage co-CRISPR dpy-10 et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62001
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa
* These authors contributed equally

Summary

L’objectif de ce protocole est de permettre l’édition CRISPR/Cas9 transparente du génome de C. elegans en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines assemblés et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer une variété de modifications génétiques chez C. elegans, y compris des insertions, des délétions, des remplacements de gènes et des substitutions de codon.

Abstract

Le système bactérien CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) /Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) a été exploité par les chercheurs pour étudier d’importants problèmes biologiquement pertinents. La puissance inégalée de la méthode d’édition du génome CRISPR/Cas permet aux chercheurs d’éditer avec précision n’importe quel locus de leur choix, facilitant ainsi une meilleure compréhension de la fonction des gènes. Plusieurs méthodes d’édition du génome de C. elegans par CRISPR/Cas9 ont été décrites précédemment. Ici, nous discutons et démontrons une méthode qui utilise des complexes de ribonucléoprotéines assemblés in vitro et le marqueur co-CRISPR dpy-10 pour le dépistage. Plus précisément, dans cet article, nous passons par le processus étape par étape d’introduction de codons d’arrêt prématuré dans le gène C. elegans rbm-3.2 par réparation dirigée par homologie en utilisant cette méthode d’édition CRISPR / Cas9. Cette méthode d’édition relativement simple peut être utilisée pour étudier la fonction de n’importe quel gène d’intérêt et permet la génération de C. elegans édités homozygotes par édition CRISPR / Cas9 en moins de deux semaines.

Introduction

La technologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) / Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) permet une édition ciblée efficace du génome dans un large éventail d’organismes1,2,3,4. Le système CRISPR a d’abord été découvert dans le cadre d’une réponse immunitaire antivirale procaryote5,6,7. Le système CRISPR de type II utilise une endonucléase telle que Cas9, un ARN transactivant (tracrRNA) et un court guide cible à 20 nucléotides spécifiques à l’ADN CRISPR (ARNc) pour reconnaître un protospacer adjacent (PAM) « NGG » et faire une rupture double brin dans l’ADN cible5,6,7,8,9,10,11,12. Cette cassion double brin est reconnue comme une lésion par la machinerie de réparation de l’ADN cellulaire. Par conséquent, la rupture double brin générée peut être réparée par l’une des deux voies : i) Jointure d’extrémité non homologue (NHEJ) ou ii) Réparation dirigée par homologie (HDR)13. Le NHEJ est souvent sujet aux erreurs et, par conséquent, lorsque cette voie est utilisée pour réparer la rupture double brin dans l’ADN cible, elle provoque souvent des mutations inactivantes (insertions, délétions) dans le gène d’intérêt. D’autre part, en fournissant un gabarit de réparation exogène avec homologie de part et d’autre de la rupture double brin, la machinerie de réparation de l’ADN cellulaire peut être dirigée vers l’utilisation de HDR pour réparer la casse13. La méthode HDR permet ainsi un montage précis de tout lieu d’intérêt.

Divers protocoles d’édition de gènes CRISPR/Cas9 ont été décrits pour C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Les méthodes d’édition CRISPR/Cas9 les plus couramment utilisées dans C. elegans incluent à la fois des protocoles basés sur le clonage et sans clonage pour générer des modèles de réparation pour l’édition CRISPR/Cas914,15,16,17,18,19,20. Ce protocole traite en détail d’un protocole d’édition CRISPR/Cas9 sans clonage basé sur l’utilisation de dpy-10 comme marqueur co-CRISPR pour le dépistage. Jusqu’à présent, le seul protocole vidéo de montage CRISPR/Cas9 détaillé axé sur C. elegansqui existe utilise un marqueur fluorescent pour ledépistage 21. Cependant, l’utilisation d’un marqueur fluorescent pour le dépistage nécessite l’accès à un microscope à fluorescence, auquel de nombreux laboratoires de petits établissements principalement de premier cycle (PUI) peuvent trouver difficile d’accès. Il est encourageant de noter que des résultats corrélatifs positifs ont été obtenus dans des études antérieures entre des vers porteurs de marqueurs fluorescents et la présence de l’edit21,22. Cependant, des études supplémentaires sont nécessaires pour déterminer l’efficacité globale de la méthode de criblage basée sur la fluorescence pour l’édition d’une grande variété de loci avec différents ARN guides et modèles de réparation. Enfin, puisque les plasmides codés pour ces marqueurs fluorescents forment des réseaux extrachromosomiques, une fluorescence variable est souvent produite à partir de ces réseaux qui peuvent rendre les positifs difficiles à identifier23. Par conséquent, bien que la méthode de criblage basée sur la fluorescence puisse être utile à adopter, les questions susmentionnées peuvent limiter son applicabilité.

L’utilisation d’un marqueur co-CRISPR qui produit un phénotype visible réduit considérablement le nombre de descendance qui doivent être filtrées pour trouver un ver édité positivement23,24,25,26,27,28. Il est important de savoir que les phénotypes produits par ces marqueurs peuvent être facilement détectés sous un simple microscope à dissection23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Le marqueur co-CRISPR dpy-10 est l’un des marqueurs co-CRISPR les mieux caractérisés et largement utilisés pour effectuer l’édition du génome C. elegans CRISPR / Cas924,27. Par conséquent, cet article discutera de la méthode d’exécution de l’édition CRISPR / Cas9 chez C. elegans en utilisant l’administration directe de complexes ribonucléoprotéiques avec dpy-10 comme marqueur co-CRISPR27,35. Dans cette méthode, le mélange d’injection d’édition préparé consiste en un ARNc dpy-10 bien caractérisé et un modèle de réparation dpy-10 pour médier la génération d’un phénotype dominant observable « rouleau » (Rol) qui est conféré par une mutation hétérozygote connue dpy-10 (cn64) dans le gène dpy-10 24,27,29. Lorsqu’elle est présente dans son état homozygote, la mutation dpy-10(cn64) provoque un phénotype dumpy (Dpy) qui produit des vers plus courts et plus robustes24,29. Le phénotype Rol est médié par l’insertion précise du modèle de réparation dpy-10 co-fourni dans une seule copie du gène dpy-10 par édition CRISPR / Cas9 médiée par HDR. Par conséquent, l’apparition de Rol C. elegans indique une injection réussie ainsi qu’un événement d’édition réussi médié par HDR dans les cellules du ver injecté. Étant donné que l’ARNcr et le gabarit de réparation du gène cible d’intérêt sont dans le même mélange d’injection que l’ARNc dpy-10 et le gabarit de réparation dpy-10, il y a de fortes chances que les vers Rol identifiés aient également été modifiés simultanément au niveau du gène cible d’intérêt. Par conséquent, ces vers Rol sont ensuite examinés pour l’édition d’intérêt par des techniques telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) (pour les modifications supérieures à 50 pb) ou par PCR suivie d’une digestion de restriction (pour les modifications inférieures à 50 pb).

Les avantages de l’utilisation de cette méthode pour l’édition du génome sont les suivants: i) les modifications CRISPR peuvent être générées à une efficacité relativement élevée (2% à 70%) en utilisant cette méthode27; ii) les modèles de réparation et les ARN guides utilisés dans cette méthode n’impliquent pas de clonage, ce qui réduit le temps nécessaire à leur génération; iii) en assemblant des complexes ribonucléoprotéiques in vitro,les concentrations des complexes d’édition assemblés peuvent être maintenues relativement constantes, améliorant ainsi la reproductibilité; iv) il a été démontré que certains ARN guides qui ne génèrent pas de modifications lorsqu’ils sont exprimés à partir de plasmides fonctionnent pour l’édition du génome CRISPR/Cas9 lorsqu’ils sont fournis sous forme d’ARN crrnaques transcrits in vitro 27; v) l’inclusion du marqueur co-CRISPR dpy-10 permet un dépistage facile à l’aide d’un microscope à dissection et diminue le nombre de descendance qui doivent être dépistées pour trouver des positifs24,27; et vi) les lignées de vers homozygotes vérifiées par séquençage de l’ADN peuvent être obtenues par cette méthode en quelques semaines19,27.

D’excellents chapitres de livres relatifs à de nombreuses méthodes CRISPR de C. elegans ont été publiés14,15,16,17,18,19,20,43. Cependant, la démonstration de la méthode dpy-10 co-CRISPR dans un format vidéo en laboratoire fait actuellement défaut. Dans cet article, nous décrivons et démontrons le processus d’utilisation de la méthode dpy-10 co-CRISPR pour éditer un gène cible représentatif nommé rbm-3.2, une protéine putative de liaison à l’ARN (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Plus précisément, nous décrivons ici en détail la méthode d’introduction de trois codons d’arrêt prématuré dans le gène C. elegans rbm-3.2 en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques assemblés in vitro et un modèle de réparation monocatélique linéaire fourni de manière exogène. Ces études ont réussi à générer la première souche CRISPR de C. elegans avec des codons d’arrêt prématuré dans le gène rbm-3.2. Étant donné que l’on ne sait pas grand-chose actuellement sur la fonction de ce gène chez C. elegans, cette souche servira d’outil utile pour disséquer la fonction du RMB-3.2. Cette méthode peut également être adoptée pour effectuer des insertions, des substitutions et des délétions à n’importe quel locus du génome de C. elegans.

Protocol

Ce protocole pour l’édition du génome CRISPR/Cas9 a été approuvé par le Comité institutionnel de biosécurité de l’Université de Tulsa conformément aux directives des NIH. Tout au long de ce protocole, la technique stérile a été pratiquée. Toutes les étapes de ce protocole ont été réalisées à l’aide de réactifs exempts de nucléases. Des précautions particulières ont été prises pour prévenir la contamination par la RNase, comme les gants de nettoyage ainsi que les espaces de travail et l’équipement (p. ex. pipettes, extérieur de la verrerie, etc.) avec une solution de décontamination de la RNase.

1. Conception de l’ARNc

  1. Recherchez le PAM qui permet à Cas9 de couper le plus près du site d’édition.
    1. Le site PAM est 5'-NGG-3'.
    2. Rappelez-vous que le PAM peut être sur l’un ou l’autre brin de l’ADN.
  2. Sélectionnez 20 bp à l’extrémité 5' du PAM comme séquence d’ARNc.
    REMARQUE: La séquence d’ARNc réelle synthétisée par les sociétés commerciales est supérieure à 20 pb car elle a une séquence générique supplémentaire qui est automatiquement ajoutée à la séquence d’ARNc de 20 pb spécifique à la cible par la société de synthèse. En ce qui concerne les effets hors cible, des études récentes n’ont pas trouvé d’effets hors cible de Cas9 chez C. elegans36,37,38,39,40. De plus, les souches éditées par CRISPR qui en résultent sont croisées. Par conséquent, nous ne sommes pas très préoccupés par les effets hors cible des ARRc conçus. Cependant, les sites Web en ligne, y compris http://genome.sfu.ca/crispr/ et http://crispor.tefor.net/, peuvent être utilisés pour trouver et sélectionner les ARRc ayant le moins d’effets hors cible38,41. Les crRNA qui se terminent par un G ou un GG et ceux dont la teneur en GC est supérieure à 50% devraient être plus efficaces19,23,42.
  3. Commandez au moins 10 nmol de l’ARNcr auprès d’une entreprise (par exemple, IDT, Horizon Discovery, etc.).
    1. Une fois que l’ARNc lyophilisé arrive, conservez-le à -30°C jusqu’au jour de la microinjection.
    2. Le jour de la microinjection, faire tourner l’ARNc lyophilisé à la vitesse maximale (17 000 x g) pendant une minute et le remettre en service dans 5 mM de Tris-Cl (pH 7,4) pour obtenir un stock de 8 μg/μL de l’ARNc.
    3. Conservez le stock d’ARNc inutilisé congelé à -80 °C.

2. Réparer la conception du modèle

  1. Téléchargez un logiciel de manipulation de séquence (par exemple, visionneuse de séquence CLC, APE, Snapgene, Vector NTI, etc.). Nous utilisons la visionneuse de séquenceS CLC version 8.0 (Qiagen) car elle est conviviale et peut être téléchargée gratuitement.
  2. Collez la séquence de l’ADN cible d’intérêt dans la visionneuse de séquence.
  3. L’orientation du modèle de réparation influence l’efficacité de l’édition28. Pour insérer une séquence de réparation à l’extrémité 5' du PAM, concevez un modèle de réparation monocatéreur avec séquence d’ADN du même brin d’ADN sur lequel se trouve la séquence PAM (brin protospacer)28. Alors que pour insérer une séquence de réparation à l’extrémité 3' du PAM, concevez un modèle de réparation monocatéreur avec une séquence d’ADN du brin d’ADN qui ne porte pas la séquence PAM (brin d’espacement)28.
  4. Sélectionnez 35 paires de bases de séquence avec une homologie ininterrompue des deux côtés (à l’extrémité 5' et 3') de l’édition.
  5. Mutez ou supprimez le PAM pour empêcher la découpe du gabarit de réparation ou de l’ADN génomique modifié par Cas9.
    1. Si la mutation du PAM n’est pas possible, introduisez plusieurs mutations silencieuses près de l’extrémité 5' du PAM pour éviter de couper le gabarit de réparation ou l’ADN génomique modifié.
    2. Assurez-vous de n’introduire des mutations silencieuses du PAM que s’il est présent dans une région exonique.
    3. Vérifiez la fréquence d’utilisation du codon pour vous assurer que le codon muté est introduit à une fréquence comparable à celle du codon non muté d’origine (p. ex. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). Dans certains cas, il peut ne pas être possible d’introduire le codon muté à une fréquence similaire à celle du codon non muté. Cependant, pour faire des mutations de quelques acides aminés, nous ne nous attendons pas à ce que le niveau d’expression de la protéine mutante soit modifié de manière significative.
  6. Si l’édition est petite (par exemple, mutation de quelques bases), introduisez un site de restriction unique proche de l’édition par mutagénèse silencieuse. Nous utilisons http://heimanlab.com/cut2.html pour trouver des sites de restriction qui peuvent être introduits par mutagénèse silencieuse.
    1. Vérifiez la fréquence d’utilisation du codon pour vous assurer que le codon muté est introduit à une fréquence comparable à celle du codon non muté d’origine. Comme indiqué ci-dessus, ce n’est pas toujours possible. Cependant, pour les expériences impliquant des mutations de quelques acides aminés, nous ne nous attendons pas à ce que le niveau d’expression de la protéine mutante soit modifié de manière significative.
  7. Synthétisez et achetez des modèles de réparation linéaires monocatérons pour HDR sous forme d’oligos ultramères de 4 nmol.
  8. Remettre en suspension le gabarit de réparation des oligonucléotides lyophilisés dans de l’eau sans nucléase pour constituer un stock de 1 μg/μL du gabarit de réparation et le stocker à -30 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Conception de l’apprêt de criblage

  1. À l’aide de la visionneuse de séquence CLC ou d’autres applications similaires, concevez 20 à 23 amorces avant et arrière de chaque côté de l’édition, de sorte qu’elles produisent une bande comprise entre 400 et 600 paires de bases lors de l’amplification PCR.
    1. Pour les insertions plus grandes de plusieurs kilobases, concevez l’amorce avant pour qu’elle soit située juste à l’extérieur du bras d’homologie gauche du gabarit de réparation. Concevez l’amorce inverse pour qu’elle se trouve dans le modèle de réparation lui-même. Dans ce cas, un produit PCR ne sera obtenu que dans le cas de vers modifiés positivement.
    2. Pour identifier les vers homozygotes édités pour les insertions plus longues, amplifiez toute la région de l’insertion en concevant des amorces avant et arrière situées à l’extérieur des jonctions d’insertion.
  2. Testez les amorces et optimisez les conditions de PCR avec de l’ADN génomique de type sauvage avant d’utiliser les amorces pour le génotypage.
    1. S’assurer qu’une seule bande de taille prévue est produite lors de l’amplification par PCR de l’ADN génomique (le cas échéant).

4. Préparation des jeunes vers adultes pour injection

  1. Cueillez L2-L3 stage C. elegans sur une pelouse bactérienne fraîche sur une plaque MYOB et incubez à 20 °C pendant la nuit.
    REMARQUE: Le protocole de fabrication des plaques MYOB peut être trouvé ici: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. Le jour de la microinjection, cueillez les jeunes vers adultes avec moins de 10 embryons dans l’utérus à injecter.

5. Préparation du mélange d’injection

  1. Préparer le mélange injectable dans le même ordre que celui indiqué dans le tableau 1 dans des tubes stériles sans nucléase.
    REMARQUE: Les composants du mélange d’injection peuvent être réduits pour faire des mélanges d’injection de 5 μL (au lieu de 20 μL) si les injections futures avec ce mélange ne sont pas prévues.
  2. Mélanger le mélange d’injection par pipetage.
  3. Incuber le mélange injectable à 37 °C pendant 15 minutes pour assembler des complexes ribonucléoprotéiques.
  4. Faire tourner le mélange d’injection à 4 °C à 17 000 x g pendant 5 minutes.

6. Microinjection dans la gonaille de C. elegans

  1. Effectuer une microinjection du mélange d’injection CRISPR dans la gonde de C. elegans, comme décrit dans Iyer et al. 201943.
    1. Injectez environ 30 vers avec le mélange d’injection CRISPR. Le mélange d’injection inutilisé peut être réutilisé en le stockant à 4°C pendant une période d’environ 6 mois sans perte d’efficacité49.
    2. Injectez les deux bras gond si possible. Les vers injectés sont considérés comme la génération P0.

7. Récupération et transfert du ver injecté

  1. Après la microinjection, déplacez les vers P0 microinjectés à l’aide d’un pic à vis vers sur une plaque de gélose MYOB de 60 mm ensemencée d’OP50 E. coli et laissez-les récupérer à température ambiante pendant environ une heure.
    1. Notez que la température de récupération dépendra du génotype des vers injectés. Par exemple, pour les souches sensibles à la température, la récupération des vers à une température différente peut être nécessaire.
  2. À l’aide d’un pic de ver de fil de platine, transférer chaque ver injecté sur une seule plaque de Pétri de gélose MYOB de 35 mm et laisser pondre des œufs à 20 °C jusqu’aulendemain.
    1. Notez que certains vers mourront à la suite d’une blessure causée par la procédure de micro-injection. Ne choisissez que les vers qui sont vivants et qui présentent des mouvements.
  3. Après 24 heures, transférer les vers injectés sur de nouvelles plaques individuelles (1 ver par plaque).

8. Cueillette C. elegans pour le dépistage

  1. 3 à 4 jours à 20°C après l’injection, surveillez toutes les plaques qui contiennent la progéniture des vers injectés à l’aide d’un microscope à dissection.
  2. Identifiez les plaques qui ont une descendance F1 présentant des phénotypes à rouleaux (Rol) et à dumpy (Dpy). Un phénotype Dpy est l’endroit où les vers apparaissent plus courts et plus robustes que les vers témoins au même stade de développement (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Les plaques avec des vers Rol et Dpy représentent des plaques où la descendance F1 a été modifiée avec succès avec la mutation dpy-10 (cn64) pour être présente dans son état hétérozygote ou homozygote, respectivement.
  3. Choisissez les plaques avec le plus de vers à rouleaux et de vers dumpy pour le criblage.
  4. Distinguer 50 à 100 vers F1 Rol de ces plaques à leurs propres plaques individuelles (1 ver par assiette) et leur permettre de pondre des œufs.
    1. Laissez les vers F1 Rol de stadifiés L4 pondre des œufs et produire une progéniture (F2)pendant 1 à 2 jours.

9. Lyse à un seul ver et PCR

  1. Après avoir produit F2 pendant 1 à 2 jours, transférer chaque mère F1 Rol unique dans 2,5 μL de tampon de lyse (tableau 2) avec une dilution 1:100 de 20 mg/mL de protéinase K.
  2. Congeler les tubes à -30 °C pendant 20 minutes. Les vers peuvent être stockés à ce stade pendant une période prolongée jusqu’à une analyse plus approfondie.
  3. Effectuer une lyse à vis sans fin sur un thermocycleur PCR dans les conditions suivantes : 60 °C pendant 1 heure, 95 °C pendant 15 min et maintenir à 4 °C.
  4. Ajouter les réactifs suivants directement à 2,5 μL du ver lysé contenant le tube PCR : 12,5 μL de 2x mélange PCR contenant des dNTP, de l’ADN polymérase, duMgCl2 et du colorant de chargement, 1 μL d’apprêt avant de 10 μM, 1 μL d’apprêt inverse de 10 μM et de l’eau stérile à 22,5 μL. Le volume total de chaque réaction PCR est de 25 μL.
    REMARQUE: En cas de criblage de plusieurs vers F1, il est plus rapide et plus pratique de faire un mélange maître PCR pour plusieurs réactions et d’ajouter 22,5 μL du mélange maître à chaque tube de lyse.
  5. Mettre en place des réactions PCR sur un thermocycleur dans les conditions suivantes : 95 °C pendant 1 minute, 35 cycles de 95 °C pendant 15 s, 55 °C pendant 15 s (optimiser pour chaque jeu d’amorces), 72 °C pendant 1 minute (optimiser pour chaque ADN cible)44. Maintenir les réactions à 4 °C.

10. Digestion de restriction et électrophorèse sur gel d’agarose

REMARQUE: Une digestion de restriction n’est nécessaire que lors du dépistage de petites modifications (moins de 50 pb).

  1. Transférer 10 μL de l’ADN PCR de l’étape 9 vers un nouveau tube.
  2. Ajouter entre 2 à 4 unités d’enzyme de restriction et 1x tampon d’enzyme de restriction (1,5 μL de 10x tampon de réaction) par réaction de 15 μL.
  3. Incuber à 37 °C (ou à une autre température spécifique à l’enzyme) pendant 2 heures (des temps d’incubation plus courts peuvent être possibles avec des enzymes à action rapide).
  4. La chaleur inactive la digestion de restriction en chauffant les tubes PCR à 65 °C (ou à une autre température spécifique à une enzyme) pendant 10 à 15 minutes.
  5. Chargez toute la réaction de chaque tube PCR dans un seul puits d’un gel d’agarose à 1% -2% et faites fonctionner le gel à 110 mA jusqu’à ce que la séparation de bande appropriée soit obtenue.
    REMARQUE: Nous utilisons un mélange PCR qui a déjà un colorant de chargement inclus pour la visualisation lors de l’exécution sur un gel d’agarose. Ce mélange n’interfère pas avec la réaction de digestion de restriction et est donc pratique à utiliser pour le dépistage de nombreux vers à la fois.

11. Identifier les vers modifiés positivement

  1. Visualisez les gels d’agarose sous la lumière UV (pour les gels de bromure d’éthidium) pour détecter la taille des bandes d’ADN.
    REMARQUE: Les vers modifiés positivement afficheront une bande supplémentaire d’ADN à la taille attendue en raison de l’édition à l’aide du modèle de réparation portant le site de restriction au locus souhaité dans le génome du ver. Les vers à rouleaux F1 devraient être hétérozygotes pour l’édition et devraient donc présenter trois bandes (un produit pcR non coupé de type sauvage et deux fragments plus petits du produit PCR coupé édité). Bien que rares, il faut noter que les homozygotes apparaissent occasionnellement.
  2. Enregistrez toutes les plaques originales éditées positivement jusqu’à ce que la présence de l’édition soit vérifiée par séquençage Sanger.

12. Édition homozygose d’intérêt

  1. Choisissez entre 8 et 12 vers F2 non roulants de type sauvage dans les plaques de ver F1 Rol respectives éditées positivement et laissez-les pondre des œufs et produire une progéniture pendant 1 à 2 jours.
    REMARQUE: Étant donné que C. elegans est un hermaphrodite autofertilisant, si l’allèle modifié n’affecte pas la viabilité ou le développement, la proportion de mutants homozygotes attendus devrait être d’environ 25%. Les vers F2 non roulants doivent être de type sauvage pour le locus dpy-10. La cueillette de vers non roulants permet la génération de vers modifiés qui ont perdu la mutation dpy-10 (cn64) et n’ont la mutation qu’à votre gène d’intérêt.
    1. Notez que le gène dpy-10 est présent sur le chromosome II. Si votre gène d’intérêt est lié à dpy-10, vous ne pourrez peut-être pas facilement séparer la mutation dpy-10 de votre gène d’intérêt.
  2. Effectuez les étapes 9 à 11 pour identifier les lignes de ver homozygotes.

13. Confirmer la modification par séquençage

  1. Une fois les vers homozygotes identifiés, effectuez la lyse et la PCR comme décrit à l’étape 9.
    1. Mettre en place au moins 3 réactions PCR pour chaque ligne homozygote à séquencer.
  2. Purifiez les réactions PCR à l’aide d’un kit de purification PCR.
  3. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre nanogoutte.
  4. Envoyez l’échantillon avec l’amorce avant correspondante pour le séquençage de Sanger. Assurez-vous que l’amorce avant est conçue pour être à au moins 50 bases de l’édition à séquencer.
  5. Analysez les résultats du séquençage à l’aide d’un logiciel d’analyse de séquence pour confirmer la présence de l’édition.

Representative Results

rbm-3.2 est une protéine putative de liaison à l’ARN qui a une homologie à la sous-unité 2 tau du facteur de clivage humain (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). La protéine RBM-3.2 a été identifiée comme un partenaire de liaison de la protéine phosphatase 1 (GSP-1) et de ses régulateurs Inhibitor-2 (I-2SZY-2) et SDS-22 dans une étude précédente qui a identifié ces protéines comme de nouveaux régulateurs de la duplication du centriole de C. elegans (données non présentées)45. À l’heure actuelle, on sait très peu de choses sur la fonction du gène rbm-3.2 chez C. elegans. Par conséquent, pour étudier plus avant le rôle biologique du gène C. elegans rbm-3.2, l’allèle rbm-3.2-null rbm-3.2 (ok688) a été obtenu du Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

Malheureusement, en plus de posséder une délétion de l’ensemble du gène rbm-3.2, l’allèle rbm-3.2(ok688) entraîne également une délétion partielle d’un gène qui se chevauche, rbm-3.1, compliquant ainsi l’analyse génétique. Par conséquent, afin d’étudier avec précision le rôle du gène rbm-3.2 chez C. elegans, nous avons utilisé l’édition CRISPR/Cas9 pour introduire trois codons d’arrêt prématurés très proches du début de la région codante C. elegans rbm-3.2, laissant intact le gène rbm-3.1 qui se chevauche.

Pour introduire ces codons d’arrêt prématuré dans le gène C. elegans rbm-3.2, nous avons conçu un ARNc avec un motif PAM qui était situé sur le brin opposé (brin modèle) de l’ADN (Figure 1A). Le site de coupe Cas9 était situé à 6 bases du codon de départ RBM-3.2 ATG. Pour introduire des codons d’arrêt prématuré dans le gène rbm-3.2, nous avons conçu un modèle de réparation avec les cinq caractéristiques principales suivantes: 1) 35 bases d’homologie ininterrompue à rbm-3.2 en amont du codon de départ rbm-3.2 (bras d’homologie gauche) 2) Une courte étendue de bases contenant le motif PAM a été supprimée 3) Un site de restriction EcoRI a été introduit immédiatement après le codon de départ pour le dépistage 4) Les deuxième et troisième codons de rbm-3.2 ont été supprimés et trois codons d’arrêt ont été introduits après le cinquième codon RBM-3.2 pour arrêter la traduction de l’ARNm rbm-3.2 5) 35 bases d’homologie ininterrompue vers le premier intron de rbm-3.2 ont été incluses en aval de l’édition (bras d’homologie droite) (Figure 1B).

Le mélange d’injection pour cette expérience CRISPR a été préparé comme indiqué dans le tableau I. Le mélange injectable a été incubé à 37 °C pendant 15 minutes pour assembler des complexes de ribonucléoprotéines. Le mélange a ensuite été centrifugé et chargé dans l’aiguille de micro-injection tirée. La microinjection dans la gonaille de C. elegana été effectuée comme décrit dans Iyer et al. 201943.

La figure 2 illustre la chronologie expérimentale pour la génération de C. elegans édités à l’aide de ce protocole. Bien que nous injections généralement 30 vers pour chaque expérience CRISPR, certains laboratoires injectent moins de vers (entre 10 et 20) pour chaque expérience CRISPR. Étant donné que l’injection de plus de vers augmente la probabilité de trouver des modifications positives, nous préférons injecter un plus grand nombre de vers. De nombreux laboratoires choisissent des couvées « jackpot » (plaques avec plus de 50% de progéniture Rol et Dpy) pour le dépistage. D’après notre expérience après avoir effectué plusieurs expériences CRISPR, bien que des couvées de jackpot surviennent occasionnellement, la plupart du temps, les vers Rol qui sont sélectionnés pour le dépistage proviennent souvent de nombreuses plaques P0 différentes, chacune composée de quelques descendance Rol. Aucune couvée de jackpot n’a été obtenue dans cette expérience.

Au total, nous avons examiné l’ADN génomique de 73 vers F1 Rol obtenus à partir de 7 vers P0 injectés pour la présence de l’édition. Les séquences des amorces de criblage et leurs emplacements par rapport au codon de départ du gène rbm-3.2 sont représentés à la figure 3A. Grâce à notre analyse, 7 des 73 vers F1 se sont révélés positifs pour l’édition (9,5%) (Figure 3B). Les vers non édités présentaient un seul fragment d’ADN de 445 pb lors de la digestion EcoRI. Tandis que les vers porteurs d’un codon d’arrêt prématuré dans le gène rbm-3.2 présentaient deux fragments de 265 pb et 166 pb respectivement lors de la digestion EcoRI. Les vers hétérozygotes ont montré trois fragments lors de la digestion EcoRI: un fragment d’ADN non édité de type sauvage de 445 bp et deux fragments d’ADN de 265 bp et 166 bp respectivement de la copie éditée du gène rbm-3.2.

Pour identifier les vers porteurs d’éditions homozygotes, nous avons transféré 12 vers F2 des hétérozygotes F1 positifs identifiés sur de nouvelles plaques individuelles et leur avons permis de produire une progéniture (F3). Les vers F2 ont ensuite été examinés pour l’homozygorie comme décrit précédemment. 6 vers criblés sur 12 (50 %) se sont révélés homozygotes pour notre édition d’intérêt (Figure 4A). L’ADN génomique d’une lignée de vers homozygotes identifiée a été utilisé pour mettre en place une réaction de séquençage de l’ADN. L’analyse du séquençage de l’ADN a confirmé la présence de l’édition dans son état homozygote (Figure 4B). En général, il est avantageux de séquencer plusieurs lignées de vers homozygotes pour s’assurer que toutes les lignées de vers homozygotes modifiées présentent le même phénotype (si la mutation nulle produit un phénotype spécifique). En outre, il pourrait également être nécessaire de valider les knockouts de gènes à l’aide d’un test basé sur l’expression tel que le western blotting ou la RT-PCR ou via une analyse de phénotype. En effet, il est possible qu’en dépit de l’introduction de codons d’arrêt prématurés au début du gène, un ATG alternatif puisse être présent en aval des codons d’arrêt prématurés. Cet ATG pourrait être utilisé pour initier l’expression des protéines, résultant en une protéine tronquée partiellement fonctionnelle.

Réactif Concentration Volume à ajouter
Protéine Cas9 dans de l’eau sans nucléase avec 20% de glycérol 2 μg/μL 5 μL
tracrRNA dans 5 mM Tris-Cl pH 7,5 4 μg/μL 5 μL
dpy-10 ARNr dans 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 0,4 μL
rbm-3,2 ARNr dans 5 mM Tris-Cl pH 7,5 8 μg/μL 1 μL
dpy-10 gabarit de réparation dans de l’eau stérile sans nucléase 500 ng/μL 0,55 μL
rbm-3.2 modèle de réparation dans de l’eau stérile sans nucléase 1 μg/μL 2,2 μL
KCl dans de l’eau stérile sans nucléase 1 M 0,5 μL
eau stérile sans nucléase - 5,35 μL

Tableau 1 : Composants du mélange d’injection pour l’édition CRISPR/Cas9 utilisant des complexes ribonucléoprotéiques et dpy-10 comme marqueur co-CRISPR. Utilisez des techniques stériles et des réactifs sans RNase lors de l’injection du mélange. Veuillez noter que de l’eau stérile sans nucléase traitée au DEPC a été utilisée pour fabriquer le mélange d’injection.

Réactif Concentration Volume à ajouter
Kcl 1 M 5 mL
Tris-HCl pH 8,3 1 M 1 mL
MgCl2 1 M 250 μL
NP-40 (ou IGEPAL CA-630) 100% 450 μL
Préadolescent-20 100% 450 μL
Gélatine 2% 500 μL
Eau - 92,35 mL

Tableau 2 : Recette du tampon de lyse par ver. Le tampon de lyse par vis sans fin peut être fabriqué en vrac, autoclavé, filtré et alicité pour un stockage à long terme (REMARQUE: le tampon de lyse peut être stocké pendant plus d’un an à température ambiante). Ajouter une dilution 1:100 de 20 mg/mL de protéinase K au tampon de lyse du ver juste avant chaque utilisation.

Figure 1
Figure 1: Schéma montrant la conception de l’ARNc et du modèle de réparation pour l’arrêt prématuré RBM-3.2 CRISPR . Schémaaffichant les brins codants et modèles du gène rbm-3.2 avec la séquence d’ARNc et la séquence de motif PAM situées sur le brin modèle. B. Schéma représentant les différentes caractéristiques du gabarit de réparation qui a été synthétisé pour introduire trois codons d’arrêt prématurés dans le gène rbm-3.2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Chronologie expérimentale pour la génération de C. elegans édités homozygotes par édition CRISPR/Cas9 en utilisant des complexes de ribonucléoprotéines préassemblés et dpy-10 comme marqueur co-CRISPR. Une ventilation quotidienne des étapes à effectuer pour générer des C. elegans édités homozygotes à l’aide de cette méthode d’édition CRISPR / Cas9. En bref, 30 vers ont été injectés avec le mélange d’édition CRISPR par micro-injection et séparés sur des plaques MYOB individuelles ensemencées avec OP50 E. coli. Après 24 heures, les vers P0 injectés ont été transférés sur de nouvelles plaques MYOB fraîches et autorisés à continuer à pondre. Les jours 3 et 4 après la microinjection, les plaques ont été examinées pour la présence de vers Rol F1. Les plaques avec le nombre maximum de vers Rol et Dpy F1 ont été sélectionnées et 73 vers F1 Rol (nous choisissons généralement entre 50 et 100 vers F1 Rol par expérience CRISPR) ont été isolés sur de nouvelles plaques MYOB individuelles (1 ver par assiette) et autorisés à pondre des œufs pendant environ 2 jours. Le jour 6 après la microinjection, des lysates de vers ont été préparés à partir des vers F1 qui avaient produit une progéniture (F2)et ont été examinés pour la présence de l’édition par PCR suivie d’une digestion de restriction avec EcoRI et électrophorèse sur gel d’agarose. Le jour 7, 12 vers F2 non-Rol, non-Dpy ont été transférés des plaques positives sur de nouvelles plaques individuelles et autorisés à produire une progéniture (F3). Le jour 9, les vers F2 ont été examinés pour l’homozygorie de l’édition comme décrit précédemment. Le jour 10, la lyse des vers, la PCR et le nettoyage par PCR ont été effectués pour les vers homozygotes F3 et la concentration d’ADN a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop. Le jour 11, des réactions de séquençage de Sanger ont été mises en place pour des échantillons positifs et les réactions ont été envoyées pour le séquençage de l’ADN. Le jour 12, les résultats du séquençage ont été analysés et la présence de l’édition a été vérifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse de séquence (p. ex. visionneuse de séquence CLC). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Dépistage des C. elegans hétérozygotes pour les codons d’arrêt prématuré rbm-3.2. Images d’électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN génomique PCR de C. elegans digéré avec EcoRI. 73 vers F1 individuels ont été génotypés et examinés pour la présence de l’édition rbm-3.2. Les nombres rouges et les astérisques indiquent des vers modifiés positivement. Tous les 7 C. elegans identifiés positivement modifiés étaient hétérozygotes pour l’édition car ils présentaient un fragment d’ADN non édité de type sauvage de 445 bp et deux fragments d’ADN de 265 bp et 166 bp respectivement de la copie éditée du gène rbm-3.2 lors de la digestion EcoRI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Identification et vérification de C. elegans homozygotes portant les codons d’arrêt prématuré rbm-3.2. A. Dépistage des codons d’arrêt prématuré de C. elegans homozygotes pour les codons d’arrêt prématuré rbm-3.2. Images d’électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN génomique de C. elegans digéré avec EcoRI. 12 vers F2 individuels provenant de plaques positives ont été génotypés et examinés pour l’homozygorie de l’édition rbm-3.2. Rouge : vers homozygotes édités. 6 des 12 vers F2 cribliqués (50 %) étaient homozygotes pour les codons d’arrêt prématuré rbm-3.2. Aucun produit PCR n’était présent pour le ver 7. B. Confirmation de l’insertion des codons d’arrêt prématuré dans rbm-3.2 par séquençage de l’ADN. Schéma montrant la comparaison de séquences d’ADN et de protéines d’homozygotes non édités et modifiés. L’analyse des résultats du séquençage de l’ADN génomique de vers homozygotes a confirmé la présence des trois codons d’arrêt prématurés dans le gène rbm-3.2 lors de l’édition CRISPR/Cas9. Tous les changements d’acides aminés qui en résultent après l’édition CRISPR/Cas9 sont indiqués en lettres rouges ou en astérisques rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous avons utilisé le protocole ci-dessus pour modifier plusieurs gènes en plus de rbm-3.2. Nos efficacités d’édition pour différents loci, ARN guides et modèles de réparation (simple brin et double brin) ont varié entre 2% et 58% (données non présentées). Les gains d’efficacité d’édition observés sont comparables aux gains d’efficacité d’édition précédemment signalés de 2 % à 70 % pour ce protocole27. Nous avons également réussi à utiliser cette technique pour effectuer des délétions de gènes. À l’aide de deux ARNrc, nous avons remplacé un gène d’une longueur proche de 6 kb par la séquence codante de la protéine fluorescente verte (GFP) (données non présentées). Pour cette expérience, environ 14% des vers Rol F1 analysés se sont révélés positifs pour la délétion du gène et le remplacement par GFP (données non montrées). Cependant, des expériences supplémentaires sont nécessaires pour déterminer la durée maximale des délétions et des remplacements de gènes qui peuvent être effectués à l’aide de cette technique.

Cette technique peut être utilisée pour faire des insertions d’environ 1,6 kb de longueur19. Une étude récente a montré que pour faire des insertions de plus de 1,6 kb de longueur en utilisant ce protocole, générer deux cassures double brin et utiliser des modèles de réparation avec des bras d’homologie plus longs peut permettre l’insertion de fragments d’ADN beaucoup plus grands (~10 Kb)28. Alternativement, plusieurs cycles d’édition de gènes avec ce protocole peuvent être effectués pour générer des modifications plus importantes. D’autres protocoles d’édition de gènes CRISPR/Cas9 à base de plasmides peuvent également être adoptés pour les expériences CRISPR impliquant l’insertion de fragments d’ADN supérieurs à 1,6 kb46,47,48.

Avant d’utiliser ce protocole pour l’édition de gènes, il est nécessaire de s’assurer que le gène d’intérêt n’est pas lié au locus dpy-10 sur le chromosome II. Dans le cas où un gène cible est lié à dpy-10, il peut être problématique de séparer la mutation dpy-10 de votre édition d’intérêt. Par conséquent, dans le cas où le gène d’intérêt est lié au locus dpy-10, d’autres marqueurs co-CRISPR tels que unc-58 (chromosome X),unc-22 ou zen-4 (chromosomeIV), et ben-1 ou pha-1 (chromosome III) qui sont situés sur différents chromosomes peuvent être utilisés24,25,26,28. Les données du laboratoire Meyer démontrent que les mutations ben-1 et zen-4 peuvent être utilisées comme marqueurs co-CRISPR réussis pour le dépistage avec cette méthode28. Cependant, il est important de noter que l’utilisation de zen-4 et pha-1 comme marqueurs co-CRISPR nécessite la réalisation de l’expérience CRISPR dans des arrière-plans zen-4 (cle10ts) ou pha-1 (e2123ts) de type non sauvage respectivement26,28. En outre, les expériences CRISPR impliquant certains marqueurs co-CRISPR tels que ben-1 peuvent nécessiter la préparation de plaques spéciales (par exemple des plaques contenant du benzimidazole)28. Nous avons utilisé avec succès le marqueur co-CRISPR unc-58 pour dépister les modifications positives d’un gène lié au dpy-10 en utilisant cette méthode (données non présentées). La mutation unc-58(e665) confère un phénotype visible (paralysie) qui peut être utilisé efficacement pour dépister les vers modifiés positivement24. Alternativement, si l’accès à un microscope fluorescent est disponible, un gène gtbp-1 marqué par fluorescence peut également être utilisé comme marqueur co-CRISPR pour ce protocole19.

Pour une efficacité d’édition élevée lors de l’utilisation de cette méthode d’édition du génome, le site d’édition doit se situer entre 10 et 30 bases à partir du site de découpe Cas9. Si le site d’édition est à plus de 30 bases du site de découpe Cas9, l’efficacité d’édition diminue drastiquementde 19,35,37. Cependant, une étude récente du laboratoire Meyer a démontré que la création de deux cassures double brin à distance l’une de l’autre peut permettre l’insertion d’éditions loin du site de coupe Cas9 en utilisant ce protocole28.

Dans le protocole actuel, le modèle de réparation a été conçu de manière à ce que les trois codons d’arrêt insérés apparaissent dans le même cadre de lecture. Cependant, une stratégie alternative pour créer des mutants nuls serait d’utiliser une cassette STOP-IN universelle de 43 bases qui a été décrite précédemment50. Il est important de se faire une évidence que cette cassette a des codons d’arrêt dans les trois cadres de lecture possibles et provoque des mutations de décalage de cadre. Il s’agit d’une stratégie particulièrement utile pour générer des mutants nuls lorsque des réparations incorrectes ou incomplètes se produisent sur le site d’édition.

En conclusion, en raison de sa courte durée et des progrès récents de cette méthode, il s’agit d’une excellente méthode pour les expériences de laboratoire de routine impliquant l’ajout de courtes étiquettes d’épitope immunogènes, de balises fluorescentes, de délétions de gènes, de remplacements de gènes et de substitutions de codon.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université de Tulsa (TU) et la bourse d’été de développement du corps professoral de l’Université de Tulsa décernée à Jyoti Iyer. Nous tenons à remercier le Programme de recherche d’été en chimie de premier cycle (CSURP) et le Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) d’avoir décerné des allocations aux étudiants participant à cette étude. Nous tenons à remercier Mme Caroline Dunn pour son aide technique. Enfin, nous tenons à remercier les Drs Jordan Ward, Aimee Jaramillo-Lambert, Anna Allen, Robert Sheaff, William Potter et Saili Moghe pour leurs commentaires critiques sur ce manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
EcoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

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Génétique numéro 166 CRISPR/Cas9 C. elegans complexes ribonucléoprotéiques génie du génome rbm-3.2 édition de gènes microinjection criblage CRISPR
CRISPR/Cas9 Édition du <em>gène C. elegans rbm-3.2</em> à l’aide du marqueur <em>de criblage co-CRISPR dpy-10</em> et des complexes de ribonucléoprotéines assemblés.
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Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).

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