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Genetics

CRISPR/Cas9 सी Elegans आरबीएम-३.२ जीन के संपादन dpy-10 सह CRISPR स्क्रीनिंग मार्कर और इकट्ठे Ribonucleoprotein परिसरों का उपयोग कर ।

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/62001
Automatic Translation
1, *1, *1, *1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य सी एलिगेंस जीनोम के निर्बाध CRISPR/Cas9 संपादन को इकट्ठे राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और स्क्रीनिंग के लिए डीपीवाई-10 सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करके सक्षम करना है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग सी एलिगेंस में विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक संशोधनों को करने के लिए किया जा सकता है जिसमें सम्मिलन, विलोपन, जीन प्रतिस्थापन और कोडन प्रतिस्थापन शामिल हैं।

Abstract

जैविक रूप से प्रासंगिक महत्वपूर्ण समस्याओं का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट(CRISPR)/स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन्स CRISPR-संबद्ध प्रोटीन (कैस) प्रणाली का उपयोग किया गया है । CRISPR/कैस जीनोम संपादन विधि की अद्वितीय शक्ति शोधकर्ताओं को ठीक से उनके चयन के किसी भी लोकस को संपादित करने की अनुमति देता है, जिससे जीन समारोह की वृद्धि की समझ की सुविधा । CRISPR/Cas9 द्वारा सी एलिगेंस जीनोम के संपादन के लिए कई तरीकों को पहले वर्णित किया गया है । यहां, हम एक विधि पर चर्चा और प्रदर्शन करते हैं जो स्क्रीनिंग के लिए विट्रो असेंबल रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और डीपीवाई-10 सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करता है। विशेष रूप से, इस लेख में, हम CRISPR/Cas9 संपादन की इस विधि का उपयोग करते हुए होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत द्वारा सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू करने की चरण-दर-चरण प्रक्रिया से गुजरते हैं। इस अपेक्षाकृत सरल संपादन विधि का उपयोग ब्याज के किसी भी जीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और दो सप्ताह से भी कम समय में CRISPR/Cas9 संपादन द्वारा होमोज़िगस-संपादित सी एलिगेंस की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है ।

Introduction

क्लस्टर्ड नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (CRISPR)/स्ट्रेप्टोकोकस पायोजीन्स CRISPR-संबद्ध प्रोटीन (कैस) तकनीक जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में कुशल लक्षित जीनोम संपादन को सक्षम बनाता है1,2,3,4। CRISPR प्रणाली को सबसे पहले प्रोकैरियोटिक एंटीवायरल इम्यून रिस्पांस 5,6,7के हिस्से के रूप मेंखोजागया था । टाइप II CRISPR सिस्टम Cas9 जैसे एंडोक्यूलाइज का उपयोग करता है, एक ट्रांसएक्टिवेट आरएनए (ट्रेसर आरएनए) और एक छोटा, लक्ष्य डीएनए-विशिष्ट 20-न्यूक्लियोटाइड लॉन्ग गाइड CRISPR आरएनए (सीआरएनए) एक "एनजीजी" प्रोटोस्पेसर आसन्न मोटिफ (पाम) को पहचानने और लक्ष्य डीएनए5,6,7,8,9,10, 11,12में डबल-फंसे ब्रेक बनानेकेलिए। इस डबल फंसे ब्रेक को सेलुलर डीएनए मरम्मत मशीनरी द्वारा घाव के रूप में पहचाना जाता है। नतीजतन, उत्पन्न डबल-फंसे ब्रेक की मरम्मत दो रास्तों में से एक द्वारा की जा सकती है- i) गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) या ii) होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)13। NHEJ अक्सर त्रुटि प्रवण है और इसलिए, जब इस मार्ग का उपयोग लक्ष्य डीएनए में डबल-फंसे ब्रेक की मरम्मत के लिए किया जाता है, तो यह अक्सर ब्याज के जीन में निष्क्रिय उत्परिवर्तन (सम्मिलन, विलोपन) का कारण बनता है। दूसरी ओर, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक के दोनों तरफ होमोलॉजी के साथ एक बहिर्जात मरम्मत टेम्पलेट की आपूर्ति करके, सेलुलर डीएनए मरम्मत मशीनरी को ब्रेक13की मरम्मत के लिए एचडीआर का उपयोग करने का निर्देश दिया जा सकता है। इस प्रकार एचडीआर विधि ब्याज के किसी भी लोकस के सटीक संपादन में सक्षम बनाती है।

सी एलिगेंस14 , 15 , 16 , 17 , 18,19,20के लिए विभिन्न प्रकार के CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रोटोकॉल का वर्णन किया गयाहै । सी एलिगेंस में सबसे अधिक नियोजित CRISPR/Cas9 संपादन विधियों में क्लोनिंग-आधारित और क्लोनिंग-मुक्त प्रोटोकॉल दोनों शामिल हैं ताकि CRISPR/Cas9 संपादन14, 15, 16,17,18,19,20के लिए मरम्मत टेम्पलेट उत्पन्न किया जा सके । इस प्रोटोकॉल में स्क्रीनिंग के लिए सह-CRISPR मार्कर के रूप में डीपीवाई-10 का उपयोग करने के आधार पर क्लोनिंग-मुक्त CRISPR/Cas9 संपादन प्रोटोकॉल पर विस्तार से चर्चा की गई है । अब तक, केवल विस्तृत सी elegans-CRISPRकेंद्रित/Cas9 संपादन वीडियो प्रोटोकॉल है कि मौजूद है21स्क्रीनिंग के लिए एक फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करता है । हालांकि, स्क्रीनिंग के लिए फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप तक पहुंच की आवश्यकता होती है, जिसे छोटे मुख्य रूप से स्नातक संस्थानों (पीयूआई) में कई प्रयोगशालाओं तक पहुंचने में मुश्किल हो सकती है। यह ध्यान रखना उत्साहजनक है कि फ्लोरोसेंट मार्कर ले जाने वाले कीड़े और21,22के संपादन के बीच पिछले अध्ययनों में सकारात्मक सहसंबद्ध परिणाम प्राप्त हुए हैं । हालांकि, विभिन्न गाइड आरएनए और मरम्मत टेम्पलेट्स के साथ विभिन्न प्रकार की लोकी के संपादन के लिए फ्लोरेसेंस-आधारित स्क्रीनिंग विधि की समग्र दक्षता निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन आवश्यक हैं। अंत में, चूंकि इन फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए प्लाज्मिड्स एक्सट्राक्रोमोमोमल सरणी बनाते हैं, इसलिए इन सरणी से चर फ्लोरेसेंस का उत्पादन अक्सर होता है जो23की पहचान करना सकारात्मक बना सकता है। इसलिए, हालांकि फ्लोरेसेंस-आधारित स्क्रीनिंग विधि अपनाने के लिए उपयोगी हो सकती है, उपरोक्त मुद्दे इसकी प्रयोज्यता को सीमित कर सकते हैं।

एक सह-CRISPR मार्कर का उपयोग करना जो एक दृश्यमान फेनोटाइप पैदा करता है, सकारात्मक रूप से संपादित कीड़ा 23,24, 25, 26,27,28कोखोजने के लिए जांच की आवश्यकता की उत्पन्नि की संख्या को बहुत कम करदेताहै। महत्वपूर्ण बात यह है कि इन मार्कर द्वारा उत्पादित फेनोटाइप को आसानी से एक साधारण विच्छेदन माइक्रोस्कोप 23 , 24 ,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34के तहत आसानी से पता लगाया जासकताहै । dpy-10 सह-CRISPR मार्कर सी एलिगेंस CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन24, 27प्रदर्शन के लिए सबसे अच्छा विशेषता और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सह CRISPR मार्कर में से एकहै । इसलिए, यह लेख सी एलिगेंस में CRISPR/Cas9 संपादन करने की विधि पर चर्चा करेगा, जिसमें एक सह-CRISPR मार्कर27,35के रूप में डीबीवाई-10 के साथ राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की सीधी डिलीवरी का उपयोग किया गया है। इस विधि में, तैयार संपादन इंजेक्शन मिश्रण में एक अच्छी तरह से विशेषता वाले डीपीवाई-10 सीआरआरएनए और डीपीवाई-10 मरम्मत टेम्पलेट होते हैं जो एक अवलोकन प्रमुख "रोलर" (रोल) फेनोटाइप की पीढ़ी में मध्यस्थता करते हैं जो डीपीवाई-10 जीन24,27, 29के भीतर एक ज्ञात विषम डीपीवाई-10 (cn64) उत्परिवर्तन द्वारा प्रदान किया जाता है। अपनी समरूप अवस्था में मौजूद होने पर, डीपीवाई-10 (cn64) उत्परिवर्तन एक डंपी (डीपीवाई) फेनोटाइप का कारण बनता है जो छोटे और स्टोयूटर कीड़े24,29का उत्पादन करता है। रोल फेनोटाइप को एचडीआर-मध्यस्थता CRISPR/Cas9 संपादन द्वारा dpy-10 जीन की एक प्रति में सह-आपूर्ति की गई डीपीवाई-10 मरम्मत टेम्पलेट के सटीक सम्मिलन द्वारा मध्यस्थता की जाती है । इसलिए, रोल सी एलिगेंस की उपस्थिति इंजेक्शन की कोशिकाओं के भीतर एक सफल एचडीआर-मध्यस्थता संपादन घटना को इंगित करती है। चूंकि सीआरआरएनए और ब्याज के लक्षित जीन का मरम्मत टेम्पलेट डीपीवाई-10 सीआरआरएनए और डीपीवाई-10 मरम्मत टेम्पलेट के साथ एक ही इंजेक्शन मिश्रण में हैं, इसलिए एक अच्छा मौका है कि पहचाने गए रोल कीड़े भी एक साथ ब्याज के लक्षित जीन पर संपादित किए गए थे। इसलिए, इन रोल कीड़े तो पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) (५० बीपी से अधिक संपादन के लिए) या पीसीआर द्वारा प्रतिबंध पाचन (५० बीपी से कम संपादन के लिए) के रूप में तकनीकों द्वारा ब्याज के संपादन के लिए जांच कर रहे हैं ।

जीनोम संपादन के लिए इस विधि का उपयोग करने के फायदे हैं: i) CRISPR संपादन अपेक्षाकृत उच्च दक्षता (2% से 70%) इस विधि का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है27; ii) इस विधि में उपयोग किए जाने वाले मरम्मत टेम्पलेट्स और गाइड आरएनए में क्लोनिंग शामिल नहीं है, जिससे उनकी पीढ़ी के लिए आवश्यक समय कम हो जाता है; iii) विट्रो मेंराइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसरों को कोडांतरण करके, इकट्ठे संपादन परिसरों की सांद्रता अपेक्षाकृत स्थिर बनाए रखी जा सकती है, जिससे प्रजनन क्षमता में सुधार होता है; iv) कुछ गाइड आरएनए जो प्लाज्मिड्स से व्यक्त किए जाने पर संपादन उत्पन्न करने में विफल रहते हैं, उन्हें 27 में विट्रो लिखित सीआरआरएएनए27के रूप में आपूर्ति किए जाने पर CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन के लिए काम करने के लिए दिखाया गया है; v) dpy-10 सह-CRISPR मार्कर सहित एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर आसान स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है और संतति की संख्या है कि सकारात्मक24, 27खोजने के लिए जांच की जानी चाहिए कम होजातीहै; और vi) डीएनए अनुक्रमण सत्यापित होमोज़िजियस-संपादित कृमि लाइनों कुछ हफ़्ते के भीतर इस विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है19,27.

कई अलग -अलग सी एलिगेंस क्रिस्पआर विधियों से संबंधित उत्कृष्ट पुस्तक अध्याय 14 ,15,16,17,18,19,20,43प्रकाशित किए गए हैं । हालांकि, एक प्रयोगशाला सेटिंग में एक वीडियो प्रारूप में DPY-10 सह CRISPR विधि के प्रदर्शन वर्तमान में कमी है । इस लेख में, हम आरबीएम-3.2 नामक प्रतिनिधि लक्ष्य जीन को संपादित करने के लिए डीपीवाई-10 सह-CRISPR विधि का उपयोग करने की प्रक्रिया का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, जो एक ख्यात आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (वर्मबेस: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10)है।  विशेष रूप से, यहां हम विस्तार से सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन के भीतर तीन समय से पहले स्टॉप कोडन शुरू करने की विधि का वर्णन करते हैं, जिसमें विट्रो इकट्ठे रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और एक एक्सोजेनोसली आपूर्ति किए गए रैखिक एकल-फंसे मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है। ये अध्ययन आरबीएम-3.2 जीन में समय से पहले स्टॉप कोडन के साथ पहले सी एलिगेंस क्रिस्पआर स्ट्रेन पैदा करने में सफल रहे हैं। चूंकि वर्तमान में सी एलिगेंस में इस जीन के कार्य के बारे में बहुत कुछ नहीं जाना जाता है, इसलिए यह तनाव आरएमबी-3.2 के कार्य को विच्छेदन करने में एक उपयोगी उपकरण के रूप में काम करेगा। सी एलिगेंस जीनोम के भीतर किसी भी लोकस पर सम्मिलन, प्रतिस्थापन और विलोपन बनाने के लिए भी इस विधि को अपनाया जा सकता है।

Protocol

CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन के लिए इस प्रोटोकॉल को एनआईएच दिशानिर्देशों का पालन करते हुए तुलसा संस्थागत जैवसेफ्टी समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था । इस प्रोटोकॉल के दौरान, बाँझ तकनीक का अभ्यास किया गया था। इस प्रोटोकॉल के सभी कदम उन एजेंटों का उपयोग करके किए गए थे जो नाभिक से मुक्त थे। RNase संदूषण को रोकने के लिए विशेष ध्यान रखा गया था जैसे दस्ताने की सफाई के साथ-साथ वर्कस्पेस और उपकरण (जैसे पिपेट, कांच के बर्तनों का बाहरी हिस्सा, आदि) एक RNase दूषित समाधान के साथ।

1. सीआरआरएनए डिजाइन

  1. पाम का पता लगाएं जो Cas9 को एडिट साइट के निकटतम में कटौती करने में सक्षम बनाता है।
    1. पीएएमएम साइट 5'-एनजीजी-3 है।
    2. याद रखें कि पाम डीएनए के या तो कतरा पर हो सकता है ।
  2. सीआरआरएनए अनुक्रम के रूप में पाम के 5 ' अंत में 20 बीपी का चयन करें ।
    नोट: वाणिज्यिक कंपनियों द्वारा संश्लेषित वास्तविक सीआरआरएनए अनुक्रम 20 बीपी से अधिक लंबा है क्योंकि इसमें एक अतिरिक्त जेनेरिक अनुक्रम है जो संश्लेषण कंपनी द्वारा लक्ष्य-विशिष्ट 20 बीपी सीआरआरएनए अनुक्रम में स्वचालित रूप से जोड़ा जाता है। ऑफ-टारगेट प्रभावों के संबंधमें, हाल के अध्ययनों में सी एलिगेंस36, 37, 38,39,40में Cas9 के ऑफ-टारगेट प्रभाव नहीं पाए गएहैं। इसके अलावा, परिणामी CRISPR-संपादित उपभेदों को पार कर रहे हैं । इसलिए, हम डिजाइन किए गए सीआरआरए के ऑफ-टारगेट प्रभावों के बारे में बहुत चिंतित नहीं हैं। हालांकि, http://genome.sfu.ca/crispr/ और http://crispor.tefor.net/ सहित ऑनलाइन वेबसाइटों का उपयोग कम से कम ऑफ-टारगेट प्रभाव38,41के साथ सीआरआरएएनए को खोजने और चुनने के लिए किया जा सकता है। जी या जीजी के साथ समाप्त होने वाले सीआरआरएन और 50% से अधिक जीसी-सामग्री वाले लोगों के अधिक कुशल होने की भविष्यवाणी की गई है19,23,42.
  3. किसी कंपनी (जैसे आईडीटी, होराइजन डिस्कवरी, आदि) से सीआरआरएनए के कम से कम 10 एनएमएएमईएम का ऑर्डर करें।
    1. एक बार lyophilized crRNA आता है, यह -30 डिग्री सेल्सियस पर माइक्रोइंजेक्शन के दिन तक स्टोर।
    2. माइक्रोइंजेक्शन करने के दिन, एक मिनट के लिए अधिकतम गति (17,000 x g) पर lyophilized crRNA स्पिन और यह 5 mM Tris-Cl (पीएच 7.4) में फिर से खर्च करने के लिए crrna के एक 8 μg/μL स्टॉक बनाने के लिए ।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए अप्रयुक्त सीआरआरएनए स्टॉक को स्टोर करें।

2. मरम्मत टेम्पलेट डिजाइन

  1. एक अनुक्रम हेरफेर सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें (जैसे सीएलसी अनुक्रम दर्शक, एपीई, स्नैपजीन, वेक्टर एनटीआई आदि)। हम सीएलसी अनुक्रम दर्शक संस्करण 8.0 (Qiagen) का उपयोग करते हैं क्योंकि यह उपयोगकर्ता के अनुकूल है और इसे मुफ्त में डाउनलोड किया जा सकता है।
  2. अनुक्रम दर्शक में ब्याज के लक्ष्य डीएनए के अनुक्रम पेस्ट करें।
  3. मरम्मत टेम्पलेट का अभिविन्यास संपादन दक्षता28को प्रभावित करता है । पाम के 5 ' अंत करने के लिए एक मरम्मत अनुक्रम डालने के लिए, एक ही डीएनए कतरा जिस पर पाम अनुक्रम स्थित है (प्रोटोस्पेसर स्ट्रैंड)28से डीएनए अनुक्रम के साथ एक एकल फंसे मरम्मत टेम्पलेट डिजाइन । जबकि पाम के 3 ' अंत करने के लिए एक मरम्मत अनुक्रम डालने के लिए, डीएनए कतरा है कि पाम अनुक्रम (spacer कतरा)28नहीं ले जाता है से डीएनए अनुक्रम के साथ एक एकल फंसे मरम्मत टेम्पलेट डिजाइन ।
  4. संपादन के दोनों पक्षों (5' और 3 ' अंत पर) पर निर्बाध होमोलॉजी के साथ अनुक्रम के 35 आधार जोड़े का चयन करें।
  5. Cas9 द्वारा मरम्मत टेम्पलेट या संपादित जीनोमिक डीएनए को काटने से रोकने के लिए पाम को म्यूट या हटा दें।
    1. यदि पाम का उत्परिवर्तन संभव नहीं है, तो मरम्मत टेम्पलेट या संपादित जीनोमिक डीएनए को काटने से रोकने के लिए पाम के 5 ' अंत के करीब कई मूक उत्परिवर्तन पेश करें।
    2. यदि यह किसी एक्सोनिक क्षेत्र में मौजूद है तो केवल पाम के मूक उत्परिवर्तन ों को पेश करना सुनिश्चित करें।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कोडन उपयोग आवृत्ति की जांच करें कि उत्परिवर्तित कोडन को एक आवृत्ति पर पेश किया गया है जो मूल गैर-उत्परिवर्तित कोडन (जैसे https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table) के बराबर है। कुछ मामलों में, एक समान आवृत्ति पर उत्परिवर्तित कोडन को अनमेटेड कोडन पेश करना संभव नहीं हो सकता है। हालांकि, कुछ अमीनो एसिड के उत्परिवर्तन करने के लिए, हम उत्परिवर्ती प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर को काफी बदल जाने की उम्मीद नहीं करते हैं।
  6. यदि संपादन छोटा है (उदाहरण के लिए कुछ आधारों का उत्परिवर्तन), मूक म्यूटेनेसिस द्वारा संपादित करने के करीब एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट पेश करें। हम http://heimanlab.com/cut2.html का उपयोग प्रतिबंध साइटों को खोजने के लिए करते हैं जिन्हें मूक म्यूटेनेसिस द्वारा पेश किया जा सकता है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कोडन उपयोग आवृत्ति की जांच करें कि उत्परिवर्तित कोडन को एक आवृत्ति पर पेश किया जाता है जो मूल गैर-उत्परिवर्तित कोडन के बराबर है। जैसा कि ऊपर कहा गया है, यह हमेशा संभव नहीं है। हालांकि, कुछ अमीनो एसिड के उत्परिवर्तनों से जुड़े प्रयोगों के लिए, हम उत्परिवर्ती प्रोटीन के अभिव्यक्ति के स्तर को काफी बदल जाने की उम्मीद नहीं करते हैं।
  7. 4 एनएमोल अल्ट्रामर ओलिगोस के रूप में एचडीआर के लिए रैखिक एकल-फंसे मरम्मत टेम्पलेट्स को संश्लेषित और खरीदें।
  8. मरम्मत टेम्पलेट का 1 μg/μL स्टॉक बनाने के लिए नाभिक मुक्त पानी में lyophilized ओलिगोन्यूक्लियोटाइड मरम्मत टेम्पलेट को फिर से खर्च करें और आगे के उपयोग तक इसे -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. स्क्रीनिंग प्राइमर डिजाइन

  1. सीएलसी अनुक्रम दर्शक या इसी तरह के अन्य अनुप्रयोगों का उपयोग करना, क्रमशः संपादन के दोनों ओर 20 से 23 बेस जोड़ी आगे और रिवर्स प्राइमर डिजाइन करें, जैसे कि वे पीसीआर प्रवर्धन पर 400 से 600 बेस जोड़े के बीच एक बैंड का उत्पादन करते हैं।
    1. आकार में कई किलोबेस वाले बड़े सम्मिलनों के लिए, मरम्मत टेम्पलेट के बाएं होमोलॉजी आर्म के ठीक बाहर स्थित होने के लिए फॉरवर्ड प्राइमर डिजाइन करें। रिवर्स प्राइमर को मरम्मत टेम्पलेट के भीतर स्थित होने के लिए डिजाइन करें। इस मामले में, एक पीसीआर उत्पाद केवल सकारात्मक-संपादित कीड़े के मामले में प्राप्त किया जाएगा।
    2. लंबे समय तक सम्मिलन के लिए होमोज़िगस-संपादित कीड़े की पहचान करने के लिए, प्रविष्टि जंक्शनों के बाहर स्थित आगे और रिवर्स प्राइमर डिजाइन करके प्रविष्टि के पूरे क्षेत्र को बढ़ाता है।
  2. प्राइमर का परीक्षण करें और जीनोटाइपिंग के लिए प्राइमर का उपयोग करने से पहले जंगली प्रकार के जीनोमिक डीएनए के साथ पीसीआर स्थितियों का अनुकूलन करें।
    1. सुनिश्चित करें कि अपेक्षित आकार का एक बैंड जीनोमिक डीएनए (जहां लागू हो) के पीसीआर प्रवर्धन पर उत्पादित किया जाता है।

4. इंजेक्शन के लिए युवा वयस्क कीड़े तैयार करना

  1. एक MYOB प्लेट पर एक ताजा जीवाणु लॉन पर L2-L3 चरण सी elegans उठाओ और 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।
    नोट: MYOB प्लेटें बनाने के लिए प्रोटोकॉल यहां पाया जा सकता है: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. माइक्रोइंजेक्शन के दिन, इंजेक्शन लगाने के लिए गर्भाशय में 10 से कम भ्रूण के साथ युवा वयस्क कीड़े चुनें।

5. इंजेक्शन मिश्रण की तैयारी

  1. इंजेक्शन मिश्रण को उसी क्रम में तैयार करें जैसा कि टेबल 1 में बाँझ नाभिक-मुक्त ट्यूबों में दिखाया गया है।
    नोट: इंजेक्शन मिश्रण के घटकों को 5 माइक्रोन इंजेक्शन मिक्स (20 माइक्रोन के बजाय) बनाने के लिए नीचे बढ़ाया जा सकता है यदि इस मिश्रण के साथ भविष्य के इंजेक्शन प्रत्याशित नहीं हैं।
  2. इंजेक्शन मिक्स को पाइपिंग करके मिलाएं।
  3. रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन परिसरों को इकट्ठा करने के लिए 15 मिनट के लिए इंजेक्शन मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. इंजेक्शन मिश्रण को 5 मिनट के लिए 17,000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।

6. सी एलिगेंस गोनाड में माइक्रोइंजेक्शन

  1. सी एलिगेंस गोनाड में CRISPR इंजेक्शन मिश्रण का माइक्रोइंजेक्शन करें, जैसा कि अय्यर एट अल में वर्णितहै।
    1. CRISPR इंजेक्शन मिश्रण के साथ लगभग 30 कीड़े इंजेक्ट करें। अप्रयुक्त इंजेक्शन मिश्रण को दक्षता49की हानि के बिना लगभग 6 महीने की अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करके फिर से उपयोग किया जा सकता है।
    2. यदि संभव हो तो दोनों गोनाड हथियार इंजेक्ट करें। इंजेक्शन कीड़े पी 0 पीढ़ी मानाजाता है।

7. इंजेक्शन कीड़ा वसूली और हस्तांतरण

  1. माइक्रोइंजेक्शन के बाद,ओपी50 ई. कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त 60 मिमी MYOB आगर प्लेट में कीड़ा-पिक का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्टेड पी 0 कीड़े को स्थानांतरित करें और उन्हें लगभग एक घंटे तक कमरे के तापमान पर ठीक होने दें।
    1. ध्यान दें कि वसूली का तापमान इंजेक्शन वाले कीड़े के जीनोटाइप पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, तापमान के प्रति संवेदनशील उपभेदों के लिए, एक अलग तापमान पर कीड़ा वसूली आवश्यक हो सकती है।
  2. प्लैटिनम वायर वर्म पिक का उपयोग करके, प्रत्येक इंजेक्शन वाले कीड़े को एक वरीयता प्राप्त 35 मिमी MYOB एगर पेट्री प्लेट पर स्थानांतरित करें और उन्हें अगले दिन तक 20 डिग्री सेल्सियस पर अंडे डालने की अनुमतिदें।
    1. ध्यान दें कि माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया से चोट के परिणामस्वरूप कुछ कीड़े मर जाएंगे। केवल उन कीड़े है कि जीवित है और प्रदर्शन आंदोलन उठाओ ।
  3. 24 घंटे के बाद, इंजेक्शन कीड़े को नई व्यक्तिगत प्लेटों (प्रति प्लेट 1 कीड़ा) में स्थानांतरित करें।

8. पिक सी. स्क्रीनिंग के लिए एलिगेंस

  1. इंजेक्शन के प्रदर्शन के बाद 20 डिग्री सेल्सियस पर 3 से 4 दिन, उन सभी प्लेटों की निगरानी करें जिनमें विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इंजेक्शन वाले कीड़े की संतान होती है।
  2. उन प्लेटों की पहचान करें जिनमें एफ1 संतान प्रदर्शन रोलर (रोल) और डम्पी (डीपीवाई) फेनोटाइप हैं। एक डीपीई फेनोटाइप वह जगह है जहां कीड़े एक ही विकासात्मक चरण (वर्मबेस: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10) पर नियंत्रण कीड़े की तुलना में छोटे और स्टोटर दिखाई देते हैं। रोल और डीपी कीड़े वाली प्लेटें प्लेटों का प्रतिनिधित्व करती हैं जहां एफ1 संतान को क्रमशः अपनी विषम या होमोज़िगस स्थिति में मौजूद होने के लिए dpy-10 (cn64) उत्परिवर्तन के साथ सफलतापूर्वक संपादित किया गया है।
  3. स्क्रीनिंग के लिए सबसे रोलर और डंपी कीड़े के साथ प्लेटें उठाओ ।
  4. इन प्लेटों से 50 से100 एफ 1 रोल कीड़े को अपनी व्यक्तिगत प्लेटों (प्लेट प्रति 1 कीड़ा) में एकल करें और उन्हें अंडे डालने की अनुमति दें।
    1. एल 4-मंचन एफ1 रोल कीड़े अंडे डालने के लिए और 1 से 2 दिनों के लिए संतान (एफ2)का उत्पादन करने की अनुमति दें ।

9. सिंगल वॉर्म लाइसिस और पीसीआर

  1. 1 से 2 दिनों के लिए एफ2 का उत्पादन करने के बाद, प्रत्येक एकल एफ1 रोल मां को लाइसिस बफर (टेबल 2) के 2.5 माइक्रोन में स्थानांतरित करें, जिसमें 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के 1:100 कमजोर पड़ने के साथ।
  2. ट्यूबों को 20 मिनट के लिए -30 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। कीड़े को आगे के विश्लेषण तक विस्तारित अवधि के लिए इस स्तर पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. निम्नलिखित शर्तों के साथ पीसीआर थर्मोसाइकिलर पर एकल वर्म लाइसिस करें: 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें।
  4. पीसीआर ट्यूब युक्त 2.5 μL के लिए सीधे निम्नलिखित रिएजेंट्स जोड़ें: 2x पीसीआर मिश्रण के 12.5 माइक्रोन DNTPs युक्त, डीएनए पॉलीमरेज, एमजीसीएल2 और लोडिंग डाई, 10 माइक्रोन फॉरवर्ड प्राइमर के 1 माइक्रोन, 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर के 1 माइक्रोन, और बाँझ पानी 22.5 माइक्रोन। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया की कुल मात्रा 25 माइक्रोन है।
    नोट: मल्टीपल एफ1 कीड़े की स्क्रीनिंग के मामले में, कई प्रतिक्रियाओं के लिए पीसीआर मास्टर-मिक्स करना और प्रत्येक लाइसिस ट्यूब में मास्टर-मिक्स का 22.5 माइक्रोन जोड़ना तेज और अधिक सुविधाजनक है।
  5. निम्नलिखित शर्तों के साथ एक थर्मोसाइकिलर पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं की स्थापना करें: 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 15 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस (प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए अनुकूलित), 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस (प्रत्येक लक्ष्य डीएनए के लिए अनुकूलित)44। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाएं पकड़ो।

10. प्रतिबंध पाचन और एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस

नोट: छोटे संपादन (50 बीपी से कम) के लिए स्क्रीनिंग करते समय एक प्रतिबंध पाचन केवल आवश्यक है।

  1. पीसीआर डीएनए के 10 माइक्रोन को स्टेप 9 से नई ट्यूब में ट्रांसफर करें।
  2. प्रतिबंध एंजाइम की 2 से 4 इकाइयों और 1x प्रतिबंध एंजाइम बफर (10x प्रतिक्रिया बफर के 1.5 माइक्रोन) प्रति 15 माइक्रोन प्रतिक्रिया के बीच जोड़ें।
  3. 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (या अन्य एंजाइम-विशिष्ट तापमान पर) पर इनक्यूबेट (कम इनक्यूबेशन समय तेजी से अभिनय एंजाइमों के साथ संभव हो सकता है)।
  4. गर्मी पीसीआर ट्यूबों को 65 डिग्री सेल्सियस (या अन्य एंजाइम-विशिष्ट तापमान) पर 10 से 15 मिनट तक गर्म करके डाइजेस्ट को निष्क्रिय करती है।
  5. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब से पूरी प्रतिक्रिया को 1%-2% एगर उठे जेल के एक कुएं में लोड करें और उचित बैंड अलगाव हासिल होने तक 110 एमए पर जेल चलाएं।
    नोट: हम एक पीसीआर मिश्रण का उपयोग करते हैं जिसमें पहले से ही एक लोडिंग डाई शामिल है, जबकि एक एगर उठे जेल पर चल रहा है। यह मिश्रण प्रतिबंध पाचन प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप नहीं करता है और इसलिए एक समय में कई कीड़े स्क्रीनिंग के लिए उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है।

11. सकारात्मक संपादित कीड़े की पहचान करें

  1. डीएनए बैंड के आकार का पता लगाने के लिए यूवी लाइट (एथिडियम ब्रोमाइड जैल के लिए) के तहत एगर उठे जैल की कल्पना करें।
    नोट: सकारात्मक रूप से संपादित कीड़े कीड़ा जीनोम के भीतर वांछित लोकस पर प्रतिबंध स्थल को ले जाने वाले मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग करके संपादन के कारण अपेक्षित आकार पर डीएनए का एक अतिरिक्त बैंड प्रदर्शित करेंगे। एफ1 रोलर कीड़े को संपादित करने के लिए विषम होने की उम्मीद है और इसलिए तीन बैंड (एक जंगली प्रकार के अनकट पीसीआर उत्पाद और संपादित कट पीसीआर उत्पाद से दो छोटे टुकड़े) प्रदर्शित करने की उम्मीद है। हालांकि दुर्लभ, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि होमोज़िगोट कभी-कभी उत्पन्न होते हैं।
  2. सभी मूल सकारात्मक-संपादित प्लेटों को तब तक सहेजें जब तक कि संपादन की उपस्थिति सेंगर अनुक्रमण द्वारा सत्यापित न हो जाए।

12. ब्याज का होमोज़िजोस संपादन

  1. क्रमशः संपादित एफ 1 रोल कीड़े प्लेटों से 8 और12 जंगली प्रकार की तलाश में गैर-रोलिंग एफ2 कीड़े चुनें और उन्हें अंडे डालने और 1 से 2 दिनों के लिए संतान का उत्पादन करने की अनुमति दें।
    नोट: चूंकि सी एलिगेंस हर्मेफ्रोडाइट्स को आत्म-निषेचित कर रहे हैं, यदि संपादित एलील व्यवहार्यता या विकास को प्रभावित नहीं करता है, तो अपेक्षित होमोज़िगस म्यूटेंट का अनुपात लगभग 25% होना चाहिए। डीपीवाई-10 लोकस के लिए गैर-रोलिंग एफ2 कीड़े जंगली प्रकार के होने चाहिए। गैर-रोलिंग कीड़े उठा संपादित कीड़े की पीढ़ी है कि dpy-10 (cn64) उत्परिवर्तन खो दिया है और केवल ब्याज के अपने जीन पर उत्परिवर्तन है सक्षम बनाता है ।
    1. ध्यान रहे कि डीपीवाई-10 जीन गुणसूत्र द्वितीय पर मौजूद हो। यदि आपकी रुचि का जीन डीपीवाई-10से जुड़ा हुआ है, तो आप आसानी से डीपीवाई-10 उत्परिवर्तन को अपने ब्याज के जीन से दूर अलग करने में सक्षम नहीं हो सकते हैं।
  2. होमोज़िगस कृमि रेखाओं की पहचान करने के लिए 11 के माध्यम से चरण 9 करें।

13. अनुक्रमण द्वारा संपादित करें

  1. एक बार होमोज़िगस कीड़े की पहचान हो जाने के बाद, स्टेप 9 में वर्णित लाइसिस और पीसीआर प्रदर्शन करें।
    1. अनुक्रमित करने के लिए प्रत्येक होमोज़िगस लाइन के लिए कम से कम 3 पीसीआर प्रतिक्रियाएं सेट करें।
  2. पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पीसीआर प्रतिक्रियाओं को शुद्ध करें।
  3. नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता को मापें।
  4. सेंगर सीक्वेंसिंग के लिए संबंधित फॉरवर्ड प्राइमर के साथ नमूना भेजें। सुनिश्चित करें कि फॉरवर्ड प्राइमर को अनुक्रमित होने के लिए संपादन से कम से कम 50 ठिकानों को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
  5. संपादन की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अनुक्रम परिणामों का विश्लेषण करें।

Representative Results

आरबीएम-3.2 एक ख्यात आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन है जिसमें मानव दरार उत्तेजना कारक सबयूनिट 2 ताऊ संस्करण (वर्मबेस: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10) के लिए होमोलॉजी है। आरबीएम-३.२ प्रोटीन की पहचान प्रोटीन फॉस्फेटे 1 (जीएसपी-1) और इसके नियामकों अवरोधक-2 (आई-2एसवाई-2)और एसडीएस-22 के एक बाध्यकारी साझेदार के रूप में की गई थी, जिसने इन प्रोटीनों को सी एलिगेंस सेंट्रील डुप्लीकेशन (डेटा नहीं दिखाया गया)४५के उपन्यास नियामकों के रूप में पहचाना था । वर्तमान में, सी एलिगेंस में आरबीएम-3.2 जीन के कार्य के बारे में बहुत कम जाना जाता है। इसलिए, सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन की जैविक भूमिका की आगे जांच करने के लिए, आरबीएम-3.2-शून्य एलेल आरबीएम-3.2 (ok688) कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से प्राप्त किया गयाथा।

दुर्भाग्य से, पूरे आरबीएम-3.2 जीन को हटाने के अलावा, आरबीएम-3.2 (ok688) एलील के परिणामस्वरूप एक ओवरलैपिंग जीन, आरबीएम-3.1 का आंशिक विलोपन भी होता है, जिससे आनुवंशिक विश्लेषण जटिल हो जाता है। इसलिए, सी एलिगेंस में आरबीएम-3.2 जीन की भूमिका की सही जांच करने के लिए, हमने सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 कोडिंग क्षेत्र की शुरुआत के बहुत करीब तीन समय से पहले स्टॉप कोडन पेश करने के लिए CRISPR/Cas9 संपादन का उपयोग किया, जिससे ओवरलैपिंग आरबीएम-3.1 जीन बरकरार रहे।

सी एलिगेंस आरबीएम-3.2 जीन में इन समय से पहले स्टॉप कोडन को पेश करने के लिए, हमने एक पाम मोटिफ के साथ एक सीआरआरएनए डिजाइन किया जो डीएनए (चित्रा 1A)के विपरीत स्ट्रैंड (टेम्पलेट स्ट्रैंड) पर स्थित था। Cas9 कट साइट आरबीएम-3.2 स्टार्ट कॉडन एटीजी से 6 ठिकानों दूर स्थित थी। आरबीएम-3.2 जीन में समय से पहले बंद codons परिचय करने के लिए, हमने निम्नलिखित पांच प्रमुख विशेषताओं के साथ एक मरम्मत टेम्पलेट तैयार किया: 1) आरबीएम-3.2 स्टार्ट कोडन (बाएं होमोलॉजी आर्म) 2 के आरबीएम-3.2 अपस्ट्रीम के लिए निर्बाध होमोलॉजी के 35 कुर्सियां) पाम आकृति युक्त ठिकानों का एक छोटा सा खिंचाव हटा दिया गया था 3) एक EcoRI प्रतिबंध साइट तुरंत स्क्रीनिंग के लिए शुरू codon के बाद शुरू किया गया था 4) दूसरे और आरबीएम-३.२ के तीसरे codons हटा दिया गया और आरबीएम-3.2 एमआरएन 5 के अनुवाद को रोकने के लिए पांचवें आरबीएम-3.2 कोडन के बाद तीन स्टॉप कोडन पेश किए गए थे) आरबीएम-3.2 के पहले इंट्रोन के लिए निर्बाध होमोलॉजी के 35 ठिकानों को एडिट (राइट होमोलॉजी आर्म) (चित्रा 1B)के डाउनस्ट्रीम को शामिल किया गया था।

इस CRISPR प्रयोग के लिए इंजेक्शन मिश्रण टेबल Iमें संकेत के रूप में तैयार किया गया था । इंजेक्शन मिक्स को रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स को असेंबल करने के लिए 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया गया था । इसके बाद मिक्स को सेंट्रलाइज्ड कर खींचा माइक्रोइंजेक्शन सुई में लोड किया गया । सी एलिगियनएस गोंड में माइक्रोइंजेक्शन को अय्यर एट अल 201943में वर्णित किया गया था।

चित्रा 2 इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर संपादित सी एलिगेंस उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक समय रेखा को दर्शाया गया है। यद्यपि हम आमतौर पर प्रत्येक CRISPR प्रयोग के लिए 30 कीड़े इंजेक्ट करते हैं, कुछ प्रयोगशालाएं प्रत्येक CRISPR प्रयोग के लिए कम कीड़े (10 से 20 के बीच) इंजेक्ट करती हैं। चूंकि अधिक कीड़े इंजेक्शन सकारात्मक संपादन खोजने की संभावना बढ़ जाती है, इसलिए हम बड़ी संख्या में कीड़े इंजेक्ट करना पसंद करते हैं। कई प्रयोगशालाओं स्क्रीनिंग के लिए "जैकपॉट" ब्रूड (50% से अधिक रोल और डीपी संतान वाली प्लेटें) चुनते हैं। कई CRISPR प्रयोगों को करने के बाद हमारे अनुभव में, हालांकि जैकपॉट ब्रूड कभी-कभी उत्पन्न होते हैं, अधिकांश समय, स्क्रीनिंग के लिए चुने गए रोल कीड़े अक्सर कई अलग-अलग पी0 प्लेटों से आते हैं, जिनमें से प्रत्येक में कुछ रोल संतान शामिल होती है। इस प्रयोग में कोई जैकपॉट ब्रूड प्राप्त नहीं किया गया था।

कुल मिलाकर, हमने 73 एफ1 रोल कीड़े के जीनोमिक डीएनए की जांच की जो संपादन की उपस्थिति के लिए 7 इंजेक्शन पी0 कीड़े से प्राप्त किए गए थे। आरबीएम-३.२ जीन के स्टार्ट कॉडन के संबंध में स्क्रीनिंग प्राइमर और उनके स्थानों के दृश्यों का प्रतिनिधित्व चित्रा 3 एमें किया गया है । हमारे विश्लेषण के माध्यम से, 73 एफ 1 में से7 कीड़े संपादित करने के लिए सकारात्मक पाए गए (9.5%) (चित्रा 3B)। असंपादित कीड़े ने इकोरी पाचन पर 445 बीपी का एक डीएनए टुकड़ा प्रदर्शित किया। जबकि, आरबीएम-३.२ जीन में समय से पहले स्टॉप कॉडन ले जाने वाले कीड़े ने इकोरी पाचन पर क्रमशः २६५ बीपी और १६६ बीपी के दो टुकड़ों का प्रदर्शन किया । हेट्रोजिगस-संपादित कीड़े ने इकोरी पाचन पर तीन टुकड़े प्रदर्शित किए: आरबीएम-३.२ जीन की संपादित प्रति लिपि से क्रमशः ४४५ बीपी के एक जंगली प्रकार के असंपादित डीएनए टुकड़े और २६५ बीपी और १६६ बीपी के दो डीएनए टुकड़े ।

होमोज़िगस संपादन ले जाने वाले कीड़े की पहचान करने के लिए, हमने पहचाने गए सकारात्मक एफ 1 हेट्रोजायगोट्स से12 एफ2 कीड़े को नई व्यक्तिगत प्लेटों पर स्थानांतरित कर दिया और उन्हें संतान (एफ3)का उत्पादन करने की अनुमति दी। एफ2 कीड़े तो होमोज़िगोसिटी के लिए जांच के रूप में पहले वर्णित किया गया । 12 में से 6 (५०%) जांच कीड़े हमारे ब्याज के संपादन के लिए समरूप पाया गया (चित्रा 4A)। डीएनए अनुक्रमण प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए एक पहचाने गए होमोज़िजियस-संपादित कृमि रेखा के जीनोमिक डीएनए का उपयोग किया गया था। डीएनए अनुक्रमण विश्लेषण ने अपनी होमोज़िगस स्थिति (चित्र 4बी)में संपादन की उपस्थिति की पुष्टि की । सामान्य तौर पर, यह सुनिश्चित करने के लिए कई होमोज़िगस कृमि रेखाओं को अनुक्रम करना फायदेमंद है कि सभी होमोज़िगस-संपादित कीड़े लाइनें एक ही फेनोटाइप प्रदर्शित करती हैं (यदि नल-उत्परिवर्तन एक विशिष्ट फेनोटाइप पैदा करता है)। इसके अलावा, यह भी एक अभिव्यक्ति आधारित परख जैसे पश्चिमी दाग या आरटी पीसीआर या फेनोटाइप विश्लेषण के माध्यम से जीन नॉकआउट मांय करने के लिए आवश्यक हो सकता है । इसका कारण यह है, यह संभव है कि जीन की शुरुआत में समय से पहले बंद codons शुरू करने के बावजूद, एक विकल्प ATG समय से पहले बंद codons के नीचे मौजूद हो सकता है । इस एटीजी का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति शुरू करने के लिए किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आंशिक रूप से कार्यात्मक कटा हुआ प्रोटीन होता है।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता वॉल्यूम जोड़ने के लिए
20% ग्लाइस्रोल के साथ नाभिक मुक्त पानी में Cas9 प्रोटीन 2 μg/μL 5 माइक्रोन
5 एमएम ट्रिस-सीएल पीएच 7.5 में ट्रेसर आरएनए 4 माइक्रोन/माइक्रोल 5 माइक्रोन
5एमएम ट्रिस-सीएल पीएच 7.5 में डीपीआई -10 सीआरआरएनए 8 μg/μL 0.4 माइक्रोन
आरबीएम-3.2 सीआरआरएनए में 5 एमएम ट्रिस-सीएल पीएच 7.5 8 μg/μL 1 माइक्रोल
बाँझ नाभिक मुक्त पानी में डीपी-10 मरम्मत टेम्पलेट 500 एनजी/μL 0.55 माइक्रोल
बाँझ नाभिक मुक्त पानी में आरबीएम-3.2 मरम्मत टेम्पलेट 1 μg/μL 2.2 माइक्रोल
बाँझ नाभिक मुक्त पानी में केसीएल 1 मीटर 0.5 माइक्रोन
बाँझ नाभिक मुक्त पानी - 5.35 माइक्रोल

तालिका 1: एक सह-CRISPR मार्कर के रूप में राइबोन्यूक्लिकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और dpy-10 का उपयोग करके CRISPR/Cas9 संपादन के लिए इंजेक्शन मिश्रण के घटक। इंजेक्शन मिक्स करते समय बाँझ तकनीकों और RNase मुक्त अभिकर् में प्रयोग करें। कृपया ध्यान दें कि बाँझ, गैर-DEPC इलाज नाभिक मुक्त पानी इंजेक्शन मिश्रण बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता वॉल्यूम जोड़ने के लिए
केसीएल 1 मीटर 5 एमएल
ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.3 1 मीटर 1 एमएल
एमजीसीएल2 1 मीटर 250 माइक्रोल
एनपी-40 (या IGEPAL CA-630) 100% 450 माइक्रोल
ट्वीन-20 100% 450 माइक्रोल
सरेस 2% 500 माइक्रोल
पानी - 92.35 एमएल

तालिका 2: कृमि लाइसिस बफर नुस्खा। कृमि लाइसिस बफर को थोक में बनाया जा सकता है, ऑटोक्लेव, फ़िल्टर किया जा सकता है और दीर्घकालिक भंडारण के लिए अलीकोश किया जा सकता है (नोट: लाइसिस बफर को कमरे के तापमान पर एक वर्ष से अधिक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है)। प्रत्येक उपयोग से ठीक पहले कीड़े लाइसिस बफर में 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज के 1:100 कमजोर पड़ने जोड़ें।

Figure 1
चित्रा 1: आरबीएम-3.2 समय से पहले स्टॉप CRISPR के लिए सीआरआरएनए और मरम्मत टेम्पलेट डिजाइन दिखा योजनाबद्ध। A.योजनाबद्ध crrna अनुक्रम और पाम आकृति अनुक्रम के साथ आरबीएम-३.२ जीन की कोडिंग और टेम्पलेट किस्में प्रदर्शित टेम्पलेट स्ट्रैंड पर स्थित है । B.योजनाबद्ध मरम्मत टेम्पलेट की विभिन्न विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करता है जिसे आरबीएम-3.2 जीन में तीन समय से पहले स्टॉप कोडन पेश करने के लिए संश्लेषित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:CRISPR/Cas9 संपादन द्वाराहोमोज़िगस-संपादित सी एलिगेंस उत्पन्न करने के लिए प्रायोगिक समयरेखा एक सह-CRISPR मार्कर के रूप में प्रीएम्बेड रिबोकेलोकोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स और dpy-10 का उपयोग करके । CRISPR/Cas9 संपादन की इस विधि का उपयोग करके होमोज़िगस-संपादित सी एलिगेंस उत्पन्न करने के लिए किए जाने वाले चरणों का दिन-प्रतिदिन टूटना। संक्षेप में, माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके 30 कीड़े को CRISPR संपादन मिश्रण के साथ इंजेक्ट किया गया था और OP50 ई. कोलाईके साथ वरीयता प्राप्त व्यक्तिगत MYOB प्लेटों पर अलग किया गया था। 24 घंटे के बाद, इंजेक्शन पी0 कीड़े ताजा नई MYOB प्लेटों पर स्थानांतरित कर दिया गया और अंडे बिछाने जारी रखने की अनुमति दी गई । माइक्रोइंजेक्शन के बाद 3 और 4 दिन में रोल एफ1 कीड़े की मौजूदगी के लिए प्लेटों की जांच की गई । रोल और डीपीवाई एफ1 कीड़े की अधिकतम संख्या वाली प्लेटों का चयन किया गया था और 73 एफ1 रोल कीड़े (हम आमतौर पर 50 से100 एफ 1 रॉल कीड़े प्रति CRISPR प्रयोग) को नए व्यक्तिगत MYOB प्लेटों (प्लेट प्रति 1 कीड़ा) पर अकेले थे और लगभग 2 दिनों के लिए अंडे देने की अनुमति दी गई थी। माइक्रोइंजेक्शन के बाद 6 दिन, प्रोजेनी (एफ2)का उत्पादन करने वाले एफ1 कीड़े से कीड़े की मात्रा तैयार की गई थी और पीसीआर द्वारा संपादित की उपस्थिति के लिए जांच की गई थी जिसके बाद इकोरी और एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ प्रतिबंध पाचन के बाद। दिन 7, 12 गैर-रोल, गैर-डीपी एफ2 कीड़े को सकारात्मक प्लेटों से नई व्यक्तिगत प्लेटों पर स्थानांतरित किया गया था और संतान (एफ3)का उत्पादन करने की अनुमति दी गई थी। 9 दिन, एफ2 कीड़े पहले वर्णित के रूप में संपादित की homozygosity के लिए जांच की गई । 10 दिन, कीड़े लाइसिस, पीसीआर और पीसीआर सफाई होमोजिगस एफ3 कीड़े के लिए किया गया था और डीएनए एकाग्रता एक नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर मापा गया था । 11 दिन, सकारात्मक नमूनों के लिए सेंगर अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं की स्थापना की गई थी और प्रतिक्रियाओं को डीएनए अनुक्रमण के लिए भेजा गया था । 12 दिन, अनुक्रमण परिणामों का विश्लेषण किया गया, और संपादन की उपस्थिति को एक अनुक्रम विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे सीएलसी अनुक्रम दर्शक) का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सी एलिगेंस के लिए स्क्रीनिंग जो आरबीएम-3.2 समय से पहले स्टॉप कोडन के लिए विषम हैं। सी एलिगेंस जीनोमिक पीसीआर डीएनए की एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस छवियां इकोरी के साथ पचाए गए। 73 व्यक्तिगत एफ1 कीड़े जीनोटाइप थे और आरबीएम-3.2 संपादन की उपस्थिति के लिए जांच की गई। लाल संख्या और तारक सकारात्मक रूप से संपादित कीड़े का संकेत देते हैं। सभी 7 सकारात्मक रूप से संपादित सी elegans संपादित के लिए विषम थे के रूप में वे ४४५ बीपी के एक जंगली प्रकार के अशिक्षित डीएनए टुकड़ा और २६५ बीपी और १६६ बीपी के दो डीएनए टुकड़े क्रमशः EcoRI पाचन पर आरबीएम-३.२ जीन की संपादित प्रतिलिपि से प्रदर्शित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आरबीएम-3.2 समय से पहले स्टॉप कोडन ले जाने वाले होमोज़िगस-संपादित सी एलिगेंस की पहचान और सत्यापन करना। A. सी एलिगेंस के लिए स्क्रीनिंग जो आरबीएम-3.2 समय से पहले स्टॉप कॉडन के लिए होमोज़िगसहैं। सी एलिगेंस जीनोमिक डीएनए की एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस छवियां इकोरी के साथ पचाए जाते हैं। सकारात्मक प्लेटों से 12 व्यक्तिगत एफ2 कीड़े जीनोटाइप किए गए थे और आरबीएम-3.2 संपादन की होमोसिज़ासिटी के लिए जांच की गई थी। लाल: होमोज़िगस-संपादित कीड़े। 12 में से 6 जांच एफ2 कीड़े (५०%) आरबीएम-३.२ समय से पहले बंद codons के लिए होमोजाइकस थे । कृमि 7 के लिए कोई पीसीआर उत्पाद मौजूद नहीं था। B. डीएनए अनुक्रमण द्वारा आरबीएम-3.2 में समय से पहले बंद codons के सम्मिलन की पुष्टि। योजनाबद्ध असंपादित और संपादित होमोज़िगोट्स के डीएनए और प्रोटीन दृश्यों की तुलना दिखा रहा है। होमोज़िजियस-संपादित कीड़े से जीनोमिक डीएनए के डीएनए अनुक्रमण परिणामों के विश्लेषण ने CRISPR/Cas9 संपादन पर आरबीएम-३.२ जीन में तीन समय से पहले स्टॉप कोडन की उपस्थिति की पुष्टि की । CRISPR/Cas9 संपादन के बाद सभी परिणामी अमीनो एसिड परिवर्तन या तो लाल अक्षरों या लाल तारक में इंगित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमने आरबीएम-3.2 के अलावा कई जीन को संपादित करने के लिए उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग किया है। विभिन्न लोकी, गाइड आरएनए और मरम्मत टेम्पलेट्स (एकल-फंसे और डबल-फंसे) के लिए हमारी संपादन क्षमता 2% और 58% (डेटा नहीं दिखाए गए) के बीच भिन्न है। मनाया संपादन क्षमता इस प्रोटोकॉल27के लिए 2% से 70% की पहले से सूचित संपादन क्षमता के बराबर हैं। हम जीन विलोपन बनाने में भी इस तकनीक का इस्तेमाल करने में सफल रहे हैं । दो crRNAs का उपयोग करके हमने एक जीन को बदल दिया जो हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) (डेटा नहीं दिखाए गए) के लिए कोडिंग अनुक्रम के साथ लंबाई में 6 केबी के करीब है। इस प्रयोग के लिए, विश्लेषण किए गए रोल एफ 1 कीड़े के बारे में14% जीएफपी (डेटा नहीं दिखाए गए) के साथ जीन विलोपन और प्रतिस्थापन के लिए सकारात्मक पाए गए। हालांकि, इस तकनीक का उपयोग करके किए जा सकने वाले जीन विलोपन और प्रतिस्थापन की अधिकतम लंबाई निर्धारित करने के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता होती है।

इस तकनीक का उपयोग उन प्रविष्टियों को बनाने के लिए किया जा सकता है जो 19 लंबाई में लगभग1.6किलो हैं। हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके लंबाई में 1.6 केबी से अधिक हैं, दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक उत्पन्न करने और लंबे समय तक होमोलॉजी हथियारों के साथ मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग करने से डीएनए के बहुत बड़े टुकड़ों (~ 10 केबी)28के सम्मिलन को सक्षम किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस प्रोटोकॉल के साथ जीन संपादन के कई दौर बड़े संपादन उत्पन्न करने के लिए किए जा सकते हैं। अन्य प्लाज्मिड आधारित सी एलिगेंस CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रोटोकॉल भी CRISPR प्रयोगों के लिए अपनाया जा सकता है जिसमें १.६ केबी४६, ४७,४८से बड़े डीएनए टुकड़ों के सम्मिलन शामिल हैं ।

जीन संपादन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले, यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि ब्याज का जीन गुणसूत्र II पर डीपीवाई-10 लोकस से जुड़ा हुआ नहीं है। एक लक्ष्य जीन को डीपीवाई-10से जोड़ा जा रहा है, यह डीपीवाई-10 उत्परिवर्तन को आपके ब्याज के संपादन से दूर अलग करने के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है । इसलिए, इस घटना में कि ब्याज का जीन डीपीवाई-10 लोकस से जुड़ा हुआ है, अन्य सह-CRISPR मार्कर जैसे यूएनसी-58 (एक्स-क्रोमोसोम),अनसी-22 या जेन-4 (गुणसूत्रIV), और बेन-1 या पीएच-1 (गुणसूत्र III) जो विभिन्न गुणसूत्रों पर स्थितहैं,का उपयोग24,25, 26,28किया जा सकता है। मेयेर लैब के डेटा से पता चलता है कि बेन-1 और ज़ेन-4 म्यूटेशन को इस विधि28के साथ स्क्रीनिंग के लिए सफल सह-CRISPR मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सह-CRISPR मार्कर के रूप में ज़ेन-4 और पीएच-1 का उपयोग करने के लिए क्रमशः26,28गैर-जंगली प्रकार के ज़ेन-4 (cle10ts) या पीएच-1 (e2123ts) पृष्ठभूमि में CRISPR प्रयोग करने की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, बेन-1 जैसे कुछ सह-CRISPR मार्कर से जुड़े CRISPR प्रयोगों के लिए विशेष प्लेटों (जैसे बेंजिमिडाजोल युक्त प्लेटें)28की तैयारी की आवश्यकता हो सकती है। हमने इस विधि (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके डीपी-10 से जुड़े जीन के लिए सकारात्मक संपादन के लिए स्क्रीन करने के लिए यूएनसी-58 सह-CRISPR मार्कर का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। यूएनसी-58 (e665) उत्परिवर्तन एक दृश्यमान फेनोटाइप (पक्षाघात) प्रदान करता है जिसका प्रभावी रूप से सकारात्मक रूप से संपादित कीड़े24के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप तक पहुंच उपलब्ध है, तो फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए जीटीबीपी-1 जीन का उपयोग इस प्रोटोकॉल19के लिए सह-CRISPR मार्कर के रूप में भी किया जा सकता है।

जीनोम संपादन की इस विधि का उपयोग करते समय एक उच्च संपादन दक्षता के लिए, संपादन साइट Cas9 काटने साइट से 10 से 30 ठिकानों के भीतर होना चाहिए। यदि संपादन स्थल Cas9 कटिंग साइट से 30 से अधिक आधार दूर है, तो संपादन दक्षता19,35, 37से काफी कम होजातीहै। हालांकि, मेयेर लैब के एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि एक-दूसरे से दूरी पर दो डबल-स्ट्रैंड ब्रेक बनाने से इस प्रोटोकॉल28का उपयोग करके Cas9 कट साइट से दूर संपादन की प्रविष्टि को सक्षम किया जा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, मरम्मत टेम्पलेट को डिजाइन किया गया था ताकि तीनों डाला गया स्टॉप कोडन एक ही रीडिंग फ्रेम में दिखाई दें। हालांकि, नल-म्यूटेंट बनाने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति एक सार्वभौमिक ४३-कुर्सियां लंबी दस्तक में स्टॉप-इन कैसेट का उपयोग करना होगा जिसे पहले५०वर्णित किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इस कैसेट सभी तीन संभव पढ़ने के फ्रेम में codons बंद कर दिया है और फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन का कारण बनता है । यह संपादित स्थल पर अनुचित या अपूर्ण मरम्मत होने पर शून्य-म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी रणनीति है।

अंत में, इसकी छोटी अवधि और इस विधि में हाल की प्रगति के कारण, यह नियमित प्रयोगशाला प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट विधि है जिसमें लघु इम्यूनोजेनिक एपिटोप टैग, फ्लोरोसेंट टैग, जीन विलोपन, जीन प्रतिस्थापन और कोडन प्रतिस्थापन शामिल हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूनिवर्सिटी ऑफ तुलसा (टीयू) स्टार्ट-अप फंड्स और टीयू फैकल्टी डेवलपमेंट समर फेलोशिप ने ज्योति अय्यर को सम्मानित किया । हम इस अध्ययन में शामिल छात्रों को वजीफे देने के लिए रसायन विज्ञान ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान कार्यक्रम (CSURP) और तुलसा स्नातक अनुसंधान चैलेंज (TURC) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम सुश्री कैरोलीन डन को उनकी तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार करना चाहेंगे । अंत में, हम डीआरएस जॉर्डन वार्ड, Aimee जारामिलो-लैम्बर्ट, अन्ना एलन, रॉबर्ट शेफ, विलियम पॉटर और सैली मोघे को इस पांडुलिपि पर उनकी आलोचनात्मक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Barcoded DNA sequencing tubes Eurofins Genomics SimpleSeq Kit Premixed N/A
Cas9 protein PNA Bio CP01 Lyophilized Cas9 protein was resuspended in 20%glycerol containing nuclease-free water, aliquoted and stored at -80 °C
crRNAs Horizon Discovery/ GE Dharmacon N/A Lyophilized crRNAs were resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C
EcoRI New England Biolabs R3101S Stored at -30 °C
Minelute PCR purification kit Qiagen 28004 Spin columns stored at 4 °C
MyTaq Redmix Meridian Bioscience BIO-25043 Stored at -30 °C
Primers IDT N/A Standard 20 nmol oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
Proteinase K Gold Bio P-480-SL4 Stored at -30 °C
Repair template oligos IDT N/A 4 nmol Ultramer oligos were synthesized, resuspended in sterile nuclease-free water and stored at -30 °C
tracrRNA Horizon Discovery/ GE Dharmacon U-002005-50 Lyophilized tracrRNA was resuspended in 5 mM Tris-Cl pH 7.5, aliquoted and stored at -80 °C

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References

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जेनेटिक्स अंक 166 CRISPR/Cas9 सी एलिगेंस,राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स जीनोम इंजीनियरिंग आरबीएम-3.2,जीन एडिटिंग माइक्रोइंजेक्शन CRISPR स्क्रीनिंग
CRISPR/Cas9 सी <em>Elegans आरबीएम-३.२</em> जीन के संपादन <em>dpy-10</em> सह CRISPR स्क्रीनिंग मार्कर और इकट्ठे Ribonucleoprotein परिसरों का उपयोग कर ।
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Smith, A., Bergwell, M., Smith, E.,… More

Smith, A., Bergwell, M., Smith, E., Mathew, D., Iyer, J. CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.. J. Vis. Exp. (166), e62001, doi:10.3791/62001 (2020).

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