Summary
В этом отчете описывается протокол одновременного выделения первичных коричневых и белых преадипоцитов у новорожденных мышей. Изолированные клетки могут быть выращены в культуре и индуцированы для дифференцировки в полностью зрелые белые и коричневые адипоциты. Метод позволяет проводить генетическую, молекулярную и функциональную характеристику первичных жировых клеток в культуре.
Abstract
Понимание механизмов, лежащих в основе дифференцировки и функции адипоцитов, значительно выиграло от использования увековеченных белых клеточных линий преадипоцитов. Однако эти культивные клеточные линии имеют ограничения. Они не полностью охватывают разнообразный функциональный спектр гетерогенных популяций адипоцитов, которые, как теперь известно, существуют в депо белого жирового полотна. Чтобы обеспечить более физиологически релевантную модель для изучения сложности белой жировой ткани, был разработан и оптимизирован протокол, позволяющий одновременно выделить первичные белые и коричневые адипоцитарные прародители от новорожденных мышей, их быстрое расширение в культуре и их дифференцировку in vitro в зрелые, полностью функциональные адипоциты. Основным преимуществом выделения первичных клеток у новорожденных, а не взрослых мышей, является то, что жировые депо активно развиваются и, следовательно, являются богатым источником пролиферирующие преадипоциты. Первичные преадипоциты, выделенные с использованием этого протокола, быстро дифференцируются по достижении слияния и становятся полностью зрелыми через 4-5 дней, временное окно, которое точно отражает появление развитых жировых подушечек у новорожденных мышей. Первичные культуры, полученные с использованием этой стратегии, могут быть расширены и изучены с высокой воспроизводимостью, что делает их пригодными для генетических и фенотипических скринингов и позволяет изучать клеточно-автономные фенотипы адипоцитов генетических моделей мышей. Этот протокол предлагает простой, быстрый и недорогой подход к изучению сложности жировой ткани in vitro.
Introduction
Ожирение является результатом хронического дисбаланса между потреблением энергии и расходом энергии. По мере развития ожирения белые адипоциты подвергаются массивному увеличению размера клеток, что приводит к гипоксии в микросреде, гибели клеток, воспалению и резистентности к инсулину1. Дисфункциональные, гипертрофированные адипоциты не могут должным образом хранить избыток липидов, которые накапливаются вместо этого в других тканях, где они ослабляют действие инсулина2,3. Агенты, которые улучшают функцию адипоцитов и восстанавливают нормальное разделение липидов между тканями, по прогнозам, будут полезны для лечения связанных с ожирением состояний, характеризующихся резистентностью к инсулину, таких как диабет 2 типа. Фенотипические экраны в адипоцитах с использованием увековеченных клеточных линий, таких как 3T3-L1, F442A и 10T 1/2, оказались полезными для выявления генетических факторов, регулирующих адипогенез, и для выделения проадипогенных молекул с антидиабетическими свойствами4,5,6,7. Эти клеточные линии, однако, не полностью отражают гетерогенность типов клеток, присутствующих в адипозов, которые включают белые, коричневые, бежевые и другие подтипы адипоцитов с уникальными характеристиками, все из которых способствуют системному гомеостазу8,9,10. Кроме того, культивируемые клеточные линии часто показывают уменьшенную реакцию на внешние раздражители.
Напротив, культуры первичных адипоцитов более точно повторяют сложность адипогенеза in vivo, а первичные адипоциты демонстрируют надежные функциональные реакции. Первичные преадипоциты обычно выделяют из стромальной сосудистой фракции адипозных депо взрослых мышей11,12,13,14. Однако, поскольку жировые депо взрослых животных состоят в основном из полностью зрелых адипоцитов, которые имеют очень медленную скорость оборота15,16,17,такой подход дает ограниченное количество преадипоцитов с низкой скоростью пролиферации. Поэтому выделение преадипоцитов у новорожденных мышей предпочтительнее для получения большого количества быстро растущих клеток, которые можно дифференцировать in vitro. Здесь был описан протокол, вдохновленный первоначальной работой с первичными коричневыми адипоцитами Kahn et al.18 для эффективного выделения как белых, так и коричневых преадипоцитов, которые могут быть расширены и дифференцированы in vitro в полностью функциональные первичные адипоциты(рисунок 1A). Преимущество выделения первичных клеток у новорожденных, в отличие от взрослых мышей, заключается в том, что жировые депо быстро растут и, таким образом, являются богатым источником активно пролиферирующие преадипоциты17. Клетки, изолированные с использованием этого протокола, обладают высокой пролиферативной способностью, что позволяет быстро масштабировать культуры. Кроме того, преадипоциты новорожденных щенков демонстрируют более высокий дифференцировальный потенциал, чем взрослые прародители, что снижает вариабельность в степени дифференцировки и, таким образом, повышает воспроизводимость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует всем руководящим принципам IACUC Научно-исследовательского института Скриппса и Университета Висконсина - Мэдисонской школы медицины и общественного здравоохранения.
1. Сбор и переваривание жировых депо (день 1)
- Подготовьте две трубки по 1,5 мл для каждого щенка: одну для коричневой жировой ткани (BAT) и одну для белой жировой ткани (WAT). Добавьте 250 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) + 200 мкл 2x изоляционного буфера (123 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,3 мМ CaCl2,5 мМ глюкозы, 100 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота (HEPES), пенициллин-стрептомицин и 4% без жирных кислот бычий сывороточный альбумин) в каждую трубку. Держите растворы стерильными и на льду.
- Поместите детенышей в небольшие камеры (например, один колодец из 6-колодезной пластины) и положите их на лед, пока они не станут гипотермическими. Убедитесь, что нет прямого контакта между детенышами и льдом. Уколите лапу кончиком, чтобы обеспечить потерю сознания, и усыпьте щенков путем обезглавливания с помощью острых ножниц.
ПРИМЕЧАНИЕ: при работе с разными генотипами подготовьте дополнительную трубку для сбора биопсии хвоста (разрез 3 мм) для генотипирования. Если генотипирование выполняется немедленно, держите усыпленных детенышей на льду до рассечения для сбора жирового депо. - Рассчитайте и взвесьте количество коллагеназы, необходимое для переваривания всех депо. Добавьте 50 мкл коллагеназы типа I 15 мг/мл в 2-кратном изоляционном буфере в каждую пробирку. Не испускайте коллагеназу в изоляционном буфере до тех пор, пока все ткани не будут собраны.
- Чтобы собрать подкожный WAT, срежьте кожу вокруг живота щенка (избегайте разрыва брюшины) и осторожно потяните кожу вниз ниже ног. Не беря кожу, тщательно соберите жировое депо, которое будет выглядеть как прозрачная (Р1 или моложе) или белая (Р2 и старше), тонкая, удлиненная ткань, прикрепленная с внутренней стороны или поверх квадрицепсов(Рисунок 1В). Промыть жировой депо в PBS и поместить его в одну из пробирок, содержащих 250 мкл PBS + 200 мкл 2x изоляционного буфера. Держитесь на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши P0 и P1 дают лучший выход. У щенков P0-1 подкожное депо WAT почти прозрачно. У мышей P2 и старше депо легче идентифицировать, потому что оно уже становится белым, что указывает на наличие полностью зрелых, нагруженных липидами, белых адипоцитов. - Чтобы собрать межлопапатный НДТ, потяните кожу с лопаток над головой. Поднимите BAT - темно-красную ткань между лопатками - и осторожно сделайте разрезы вокруг нее, чтобы отсоежевать ее от тела(рисунок 1B). Проверьте консистенцию и цвет; промыть PBS; поместите его в другую трубку, содержащую 250 мкл PBS + 200 мкл 2x изоляционного буфера; и держаться на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе BAT у мышей P2 и старше тщательно удалите белую жировую ткань, окружающую BAT. Он состоит из тонкого, мягкого, белого листа адипоцитов, расположенного между кожей и БАТ, который глубже между лопатками. - После того, как все депо собраны, аккуратно изрубите каждое депо (4-6 раз), используя небольшие ножницы непосредственно внутри трубок.
- Повторное суспендировать коллагеназу типа I в соответствующем объеме 2x изоляционного буфера для получения 10x стокового раствора при 15 мг/мл. Добавьте 50 мкл 10-кратной коллагеназы в каждую трубку, держа трубки на льду до тех пор, пока коллагеназа не будет добавлена ко всем трубкам.
- Быстро переверняйте трубки для смешивания и передавайте в смеситель с контролируемой температурой. Инкубировать образцы в течение 30 мин при 37 °C на шейкере (частота 1 400 об/мин для эффективного перемешивания образцов).
2. Покрытие преадипоцитов (1 день)
- После переваривания тканей поместите трубки обратно на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, вся работа проводится в стерильных условиях в шкафу биобезопасности. - Процедите переваренные ткани через клеточный ситечко 100 мкм в новые пробирки объемом 50 мл. Если вы работаете только с мышами WT или если известны генотипы, объедините соответствующие, диссоциированные BTS вместе; повторите это для WATs. Чтобы максимизировать выход клеток, промыть каждую трубку 1 мл изоляционной среды (модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM) + 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ HEPES, 1% пенициллин-стрептомицин) и фильтровать ее через клеточный ситечко. При работе с неизвестными генотипами перейдите к шагу 2.4
ПРИМЕЧАНИЕ: FBS является существенным фактором, определяющим как пролиферацию преадипоцитов, так и дифференцировку. Тщательно тестируйте различные партии FBS, чтобы обеспечить высокую производительность и согласованность между партиями. - Разбавляйте суспензии BAT и WAT на плите 2-3 скважины из 6 скважин для каждого образца BAT и 4-6 скважин из 6 скважин для каждого образца WAT. Например, если 6 БАТ и 6 ВАТ были объединены вместе, разбавьте суспензию ячейки НИМ до 24-36 мл и суспензию ячейки WAT до 48-72 мл. Пластина 2 мл клеточных суспензий на скважину.
- Для образцов с неизвестными генотипами держите каждый образец отдельно; поместите клеточный сетчатый фильтр 100 мкм поверх каждой скважины 6-скважинной пластины и отфильтруйте один образец на скважину. Промыть трубку 1,5 мл изоляционного носителя, и пропустить ее через сетчатый фильтр, составив конечный объем до 2 мл на скважину. Отбросьте клеточный ситечко, поместите крышку на пластину и перенесите пластину в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда в колодцах должна выглядеть мутной из-за плавающих клеток крови, клеточного мусора и липидов из лизированных клеток. - Через 1-1,5 ч после нанесения покрытия, аспирировать средой и промыть 2 мл ДМЭМ без сыворотки. Осторожно перемешиваем пластину, чтобы отсоедить клетки крови от дна колодцев. После 3 промывок добавляют 2 мл свежей изоляционной среды и переносят клетки в инкубатор (37 °C, 5% CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте клетки под микроскопом. Плавающий материал (клетки крови, клеточный мусор) должен быть минимальным. Коричневые преадипоциты будут выглядеть как маленькие непрозрачные клетки, тогда как белые преадипоциты будут демонстрировать более вытянутую форму. Как коричневые, так и белые преадипоциты должны быть плотно прикреплены к пластинке.
3. Расширение культуры преадипоцитов (день со 2 по 5 день)
- На следующий день аспирируют среду, промывают клетки 2 мл ДМЭМ без сыворотки и добавляют обратно 2 мл изоляционного носителя.
- Повторяют шаг 3.1 раз в 2 дня, пока клетки не достигнут 80-90% слияния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для первичных коричневых преадипоцитов достижение 80-90% слияния может занять 4-5 дней. Для первичных белых преадипоцитов обычно требуется 2-3 дня. Как только преадипоциты достигают 60% слияния, они могут быть эффективно инфицированы вирусными частицами для экспериментов по нокдауну или сверхэкспрессии. Инфицировать преадипоциты с соответствующей вирусной нагрузкой на срок до 8 ч. Использование катионных полимеров для повышения эффективности инфекции не рекомендуется, так как это часто приводит к токсичности и значительному снижению адипогенного потенциала инфицированных преадипоцитов. - Для расщепления клеток покрывают новые тарелки назначения стерильным раствором 0,1% мас./об. желатина (растворенного в дистиллированной воде; не используйте никакого тепла). Используйте достаточный объем, чтобы покрыть дно колодца/блюда. Инкубировать пластины при 37 °C до тех пор, пока клетки не будут готовы к посеву (не менее 10 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Покрытие пластин клеточной культуры не влияет на выход или дифференцировочный потенциал, но существенно упрощает поддержание и обработку дифференцированных адипоцитов. - Когда клетки достигнут плотности субслеживания (85-95%), аспирируют среду, промывают PBS и добавляют трипсин в течение 3 мин для отсоединения клеток. Блокируйте активность трипсина, добавляя 2,5-кратный объем трипсина изоляционного носителя. Пипетка клеточной суспензии вверх и вниз, чтобы максимизировать восстановление клеток, и перенесите в новую трубку. Промыть колодцы 1 мл изоляционного вещества и добавить его в первый сбор.
- Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 800-1200 × г,аспирируют супернатант и повторно суспендируют клетки в 3-5 мл изоляционного носителя. Подсчитайте клетки, и разбавьте их до нужной конечной плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, 50 000-80 000 ячеек/мл (2,5, 1 и 0,5 мл для плит 6-, 12 и 24 скважин соответственно) приведут к полностью спадам скважин в течение 72-96 ч. - Аспирировать раствор покрытия на этапе 3.3 и смыть избыток желатина PBS. Засевает клетки и возвращает пластины в инкубатор до полного слияния.
4. Дифференциация белых и коричневых преадипоцитов (дни 7 - 12)
- Когда преадипоциты становятся слинущимися, аспирируют среду и заменяют ее дифференцированной средой, состоящей из 10% FBS в DMEM, содержащей 170 нМ инсулина, 1 мкМ дексаметазона и 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина. При дифференцировке БАТ преадипоцитов добавляют также 1 нМ трийодтиронина (Т3). Отметьте день, в который индуцируется адипогенная дифференциация, как день 0 дифференциации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как белые, так и коричневые преадипоциты могут спонтанно дифференцироваться по достижении слияния. Однако для максимальной дифференцировки адипоцитов следует использовать традиционный проадипогенный коктейль, описанный выше (плюс Т3 для преадипоцитов БАТ). - Через 48 ч (2 день дифференцировки) освежите среду поддерживающей средой, состоящей из 10% FBS в DMEM и 170 нМ инсулина (плюс 1 нМ T3 для BAT).
ПРИМЕЧАНИЕ: На 2-й день небольшие липидные капли, накапливающиеся в клетках под микроскопом, можно наблюдать с помощью стандартного яркого поля. - Повторяйте шаг 4.2 раз в 2 дня, пока клетки не будут использованы для экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: На 4 или 5 день дифференцировки большинство клеток будут казаться загруженными липидами. Терминально дифференцированные адипоциты могут дольше храниться в культуре или использоваться на этом этапе для экспериментов.
5. Повторное покрытие для биоэнергетических экспериментов
ПРИМЕЧАНИЕ: Если намерение состоит в том, чтобы выполнить биоэнергетические исследования в зрелых адипоцитах в формате 96 скважин, необходимо предпринять следующие шаги. В идеале следует использовать клетки, которые только что полностью дифференцировались (день 4 или 5). Процедура, описанная ниже, начинается с 1 скважины 6-скважинной пластины.
- Перед перевариванием трипсина подготовьте покрытие для 96-ю плит. Добавьте 50 мкл 0,1% желатина в каждую ложе. Оставьте пластину в инкубаторе культуры тканей до тех пор, пока клетки не будут готовы к посеву.
- На 4 или 5 день дифференцировки аспирировать среду, промыть 1 мл ПБС и добавить 300 мкл 0,25% трипсин-этилендиаминовой тетрауксусной кислоты (на 1 скважину 6-скважинной пластины). Осторожно наклоните пластину, чтобы трипсин полностью закрывал дно колодца; инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре. Блокируйте действие трипсина с 700 мкл поддерживающей среды, пипеткой вверх и вниз, чтобы максимизировать восстановление клеток, и перенесите клеточную суспензию в новую трубку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируют ячейки при 1200 × г в течение 5 мин. Удалите супернатант, повторно суспендируют гранулу в 1 мл поддерживающей среды и подсчитайте ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна скважина из 6-скважинной пластины должна давать приблизительно 1,5-1,8 миллиона клеток. - Разбавьте клетки, чтобы иметь конечную концентрацию от 60 000 до 80 000 клеток / мл для коричневых адипоцитов и от 100 000 до 120 000 клеток / мл для белых адипоцитов. Пластина 100 мкл клеточной суспензии на скважину в желатиновых 96-скважинных пластинах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна скважина из 6-скважинной плиты обеспечивает достаточное количество ячеек для двух плит из 96 скважин. Для биоэнергетических экспериментов необходимо покрытие низкой плотности (слияние 30-40%), чтобы обеспечить точное измерение потребления кислорода и избежать истощения кислорода в скважинах во время анализа. - Дайте ячейкам прилипать к нижней части пластины не менее 48 ч. Если клетки хранятся в пластине более 48 ч, освежите среду через 2 дня.
- В день анализа аспирировать среду и заменить ее пробирной средой. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C в инкубаторе, не контролируемом CO2,и выполнять анализ в соответствии с инструкциями производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Раздел 1 протокола даст гетерогенную суспензию клеток, которые видны под стандартным световым микроскопом. Фильтрация переваренных тканей с помощью клеточного ситечкового фильтра (раздел 2) удалит непереваренные ткани. Тем не менее, некоторые клеточные обломки, клетки крови и зрелые адипоциты будут проходить через них(рисунок 1C). Мягкие промывки через 1 ч после покрытия удалят нерелевантные клетки, так как преадипоциты быстро прикрепляются к дну колодца(рисунок 1С). В разделе 3 предшественники адипоцитов расширяются для получения количества клеток, необходимых для экспериментального плана. Хотя как белые, так и коричневые преадипоциты, выделенные из новорожденных щенков, обладают высокой пролиферативной способностью, выход белых преадипоцитов, как правило, в два раза выше, чем у коричневых преадипоцитов на основе депо(рисунок 2A). Поэтому, если желательны синхронизированные культуры, начальная плотность белых преадипоцитов должна быть рассчитана соответствующим образом. Раздел 4 предлагает рекомендации по получению полностью зрелых адипоцитов.
В конце дифференцировки клетки будут появляться нагруженными липидными каплями и экспрессировать классические маркеры белых и коричневых адипоцитов соответственно(рисунок 2В,С). Как белые, так и коричневые адипоциты могут быть использованы для биоэнергетических исследований, как описано в разделе 5. Сравнительный анализ потребления кислорода в митохондриальном стресс-тесте первичных белых и коричневых адипоцитов в базальных условиях, а также в ответ на известные стимуляторы митохондриальной функции (например, норадреналин) показан на рисунке 2D. При выделении также можно дифференцировать первичные белые и коричневые адипоциты на пластинах, которые будут непосредственно использоваться для биоэнергетических экспериментов19. В этом случае преадипоциты выделяют и покрывают, как описано в разделах 1 и 2. Когда клетки становятся слинуными, их индуцируют дифференцировать, как описано в разделе 4, до тех пор, пока они не достигнут терминальной дифференцировки и не будут готовы к анализу биоэнергетики. Эта процедура распространена для 24-скважинного формата пластин, но в меньшей степени для плит с 96 скважинами.
Рисунок 1:Сбор и обработка жировых подушечек. (А)Схематическое изображение первичной белой (сверху) и коричневой (снизу) изоляции адипоцитов. (B) Подкожные белые (сверху) и коричневые (снизу) жировые депо. У мышей P0 подкожный WAT почти невидим, но становится различимым на ~ день после рождения. Напротив, BAT имеет отчетливый темный цвет даже при P0. У пожилых щенков BAT окружен тонким поверхностным слоем WAT, который требует удаления при рассечении ткани. (C)Репрезентативные изображения первичных белых и коричневых клеток-предшественников после фильтрации через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм, после первоначальных промывок и через 24 ч после выделения. Шкала стержней = 100 мкм. Сокращения: WAT = белая жировая ткань; BAT = коричневая жировая ткань. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Дифференциация адипоцитарных прародителей. (А) Среднее количество подкожных ВАТ и БАТ преадипоцитов, полученных на одного новорожденного (P0) щенка. (B) Репрезентативные изображения терминально дифференцированных белых и коричневых адипоцитов. Для флуоресцентной визуализации клетки инкубировали с Nile Red и Hoechst 33342 для окрашивания нейтральных липидов и ядер соответственно. Шкала полос = 100 мкм.(C)Анализ экспрессии генов классических маркеров адипоцитов, бело-бежевых маркеров и коричнево-специфических маркеров в первичных белых и коричневых адипоцитах, дифференцированных в течение 6 дней (n= 3). Для каждого гена экспрессия BAT относительна уровням WAT (установлено значение 1). (D)OCR белых и коричневых адипоцитов в митохондриальном стресс-тесте и в ответ на норадреналин (n = 3). Коричневые адипоциты показывают несвязанные дыхание и надежную реакцию на норадреналин, тогда как белые адипоциты показывают мало несвязанных дыханий и не проявляют значительного ответа на адренергическую стимуляцию. *с<0,05; **p<0.01, определяется двуххвостым t-тестомСтудента. Сокращения: WAT = белая жировая ткань; BAT = коричневая жировая ткань; OCR = норма потребления кислорода; Олиго = олигомицин; FCCP = карбонилцианид-4-(трифторметокси)фенилгидразон; РАА = ротенон, антимицин А; PPARγ = гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисомы; Acrp30 = адипоцитарный комплемент-связанный белок 30 кДа; Fabp4 = жирно-кислотосвязывающий белок 4; Glut4 = транспортер глюкозы 4; Cd36 = кластер дифференциации 36; Retn = резистин; Slc27a1 = семейство носителей 27 соленых носителей 1; Ear2 = эозинофил-ассоциированный, рибонуклеаза А семейства 2; Pgc1a = PPARγ коактиватор 1альфа; Prdm16 = положительный регуляторный домен I-связывающий фактор 1 (PRDI-BF1) и ретинобластома белково-взаимодействующий с геном цинкового пальца 1 (RIZ1) гомологичный домен, содержащий 16; Eva1 = эпителиальный V-подобный антиген 1; Cidea = вызывающий гибель клеток фактор фрагментации ДНК-альфа-подобный эффектор А; Ucp1 = разъединяющий белок 1; Dio2 = дейодиназа 2 типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Жировая ткань имеет решающее значение для системной чувствительности к инсулину и глюкозного гомеостаза20. Дисфункция адипоцитов, связанная с ожирением, тесно связана с началом диабета 2 типа. Таким образом, более глубокое понимание базовой биологии и физиологии жировой ткани может позволить разработать новые методы лечения метаболических нарушений. В дополнение к прямому функциональному и транскрипционному анализу зрелых адипоцитов, выделенных из жировых депо21,22,культивируемые первичные адипоциты, как было показано, повторяют многие аспекты патофизиологии жировой ткани, включая секрецию адипокинов, резистентность к инсулину в ответ на провоспалительные раздражители и индукцию термогенной программы23,24,25. Хотя предыдущие протоколы описывали выделение предшественников адипоцитов у взрослых мышей11,12,этот протокол обеспечивает метод эффективного выделения клеток у новорожденных детенышей. Эта стратегия дает значительно большую популяцию белых и коричневых адипоцитарных прародителей с более высоким потенциалом дифференцировки, поскольку постнатальные жировые депо все еще относительно недифференцированы по сравнению с жировыми депо взрослых мышей26. Более того, клетки, выделенные с помощью этого метода, уже зафиксированы и дают полностью функциональные дифференцированные адипоциты, которые экспрессируют маркеры зрелых клеток и проявляют свои уникальные физиологические особенности, включая хранение липидов и термогенную способность.
Первичные клетки не могут быть расширены бесконечно in vitro. Кроме того, первичные преадипоциты начинают терять свой адипогенный потенциал после нескольких проходов в культуре. Вероятно, это связано с тем, что непрерывная клеточная культура приводит к внутреннему обогащению менее совершенных, более пролиферативных клеток. Таким образом, одним из ограничений этого протокола является окно времени, в течение которого могут быть использованы преадипоциты. Адипогенный потенциал полностью сохраняется, если клетки индуцируются к дифференцировке в течение 7-8 дней с момента выделения. Адипоцитарные прародители особенно устойчивы к ферментативному пищеварению, но, тем не менее, важно правильно провести лечение коллагеназой. Переваривание тканей может привести к снижению выживаемости клеток и снижению способности клеток прилипать к пластине. На протяжении всей фазы расширения как белые, так и коричневые преадипоциты сильно адгезивны и могут переносить энергичные промывания и частый обмен средами. Тем не менее, использование покрытых пластин рекомендуется, когда преадипоциты индуцируются к дифференцировке. Зрелые, насыщенные липидами адипоциты имеют снижение поверхностной адгезии и клеточных взаимодействий, что приводит к тенденции к отсоединению во время дифференцировки, если их не обрабатывать осторожно. Наиболее деликатным этапом протокола является индукция дифференциации. ФБС, инсулин, Т3 и другие препараты должны быть протестированы, а их конечные концентрации оптимизированы, чтобы получить наибольшую степень дифференцировки. Агонист PPARγ (например, росиглитазон) также может быть добавлен для дальнейшей стимуляции адипогенеза.
Важно отметить, что условия дифференциации могут быть адаптированы к экспериментальным потребностям. Например, в экранах с генетическими или химическими библиотеками, предназначенными для идентификации белков/соединений, которые усиливают дифференцировку белых и/или коричневых адипоцитов, преадипоциты могут быть индуцированы для дифференцировки с использованием минимальной разрешительной среды, которая включает 10% FBS в DMEM и 170 нМ инсулина. Оценка каждого компонента дифференциационного коктейля рекомендуется для определения идеальных пробирных окон для дифференциации. Т3 и дексаметазон незаменимы для первичной дифференцировки белых и коричневых адипоцитов. Эти условия обеспечат низкую скорость дифференцировки в контрольных клетках, тем самым увеличивая окно анализа и максимизируя способность обнаруживать проадипогенные факторы. Культуры первичных коричневых и белых адипоцитов являются мощным инструментом для опроса автономной функции клеток адипоцитов в ответ на генетические манипуляции и метаболические стрессы, чтобы дополнить изучение коричневой и белой жировой ткани in vivo. Следовательно, протоколы выделения и культивирования первичных преадипоцитов необходимы для обеспечения воспроизводимых, высокопроизводительных исследований функции адипоцитов in vitro. Описанная здесь стратегия позволяет изучать первичные белые и коричневые преадипоциты, которые могут быть дифференцированы в полностью зрелые адипоциты и протестированы под различными экспериментальными манипуляциями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарны Кристине Годио из Национального центра биотехнологии в Мадриде, Испания, Мари Гантнер из Научно-исследовательского института Скриппса, Ла-Хойя, и Анастасии Кралли в Университете Джона Хопкинса, Балтимор, за помощь в оптимизации этого протокола на основе первоначальной работы Кана и др.18. Эта работа финансировалась грантами NIH DK114785 и DK121196 для E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H.
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
