Summary
Denne rapport beskriver en protokol for samtidig isolering af primære brune og hvide præadipocytter fra nyfødte mus. Isolerede celler kan dyrkes i kultur og induceres til at differentiere sig til fuldt modne hvide og brune adipocytter. Metoden muliggør genetisk, molekylær og funktionel karakterisering af primære fedtceller i kulturen.
Abstract
Forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for adipocyt differentiering og funktion har i høj grad nydt godt af brugen af udødeliggjorte hvide preadipocyt cellelinjer. Disse kultiverede cellelinjer har dog begrænsninger. De fanger ikke fuldt ud det forskelligartede funktionelle spektrum af de heterogene adipocytpopulationer, der nu er kendt for at eksistere inden for hvide fedtdepoter. For at give en mere fysiologisk relevant model til at studere kompleksiteten af hvidt fedtvæv er der udviklet og optimeret en protokol for at muliggøre samtidig isolering af primære hvide og brune adipocyt forfædre fra nyfødte mus, deres hurtige ekspansion i kulturen og deres differentiering in vitro til modne, fuldt funktionelle adipocytter. Den primære fordel ved at isolere primærceller fra nyfødte snarere end voksne mus er, at fedtdepoterne aktivt udvikler sig og derfor er en rig kilde til prolifererende præadipocytter. Primære præadipocytter isoleret ved hjælp af denne protokol differentierer hurtigt ved at nå sammenløb og bliver fuldt modne om 4-5 dage, et tidsvindue, der nøjagtigt afspejler udseendet af udviklede fedtpuder hos nyfødte mus. Primære kulturer, der er udarbejdet ved hjælp af denne strategi, kan udvides og studeres med høj reproducerbarhed, hvilket gør dem velegnede til genetiske og fænotypiske skærme og gør det muligt at studere de celleuafhæmodige adipocyt-fænotyper af genetiske musemodeller. Denne protokol tilbyder en enkel, hurtig og billig tilgang til at studere kompleksiteten af fedtvæv in vitro.
Introduction
Fedme skyldes en kronisk ubalance mellem energiindtag og energiforbrug. Efterhånden som fedme udvikler sig, gennemgår hvide adipocytter en massiv udvidelse i cellestørrelse, der resulterer i hypoxi i mikromiljøet, celledød, betændelse og insulinresistens1. Dysfunktionelle, hypertrophied adipocytter kan ikke korrekt gemme overskydende lipider, som i stedet akkumuleres i andre væv, hvor de dæmper insulinvirkning2,3. Midler, der forbedrer adipocytfunktionen og genopretter normal lipidpartition mellem væv, forventes at være gavnlige for behandlingen af fedmerelaterede tilstande karakteriseret ved insulinresistens som type 2-diabetes. Fænotypiske skærme i adipocytter ved hjælp af udødeliggjorte cellelinjer, såsom 3T3-L1, F442A og 10T 1/2, har vist sig nyttige til at identificere genetiske faktorer, der regulerer adipogenesis og til at isolere pro-adipogene molekyler med anti-diabetiske egenskaber4,5,6,7. Disse cellelinjer afspejler imidlertid ikke fuldt ud heterogeniteten af celletyper, der findes i fedtdepoter, som omfatter hvide, brune, beige og andre adipocytundertyper med unikke egenskaber, som alle bidrager til systemisk homøostase8,9,10. Desuden viser kultiverede cellelinjer ofte en formindsket reaktion på eksterne stimuli.
I modsætning hertil opsummerer kulturer af primære adipocytter mere præcist kompleksiteten af in vivo adipogenesis, og primære adipocytter viser robuste funktionelle reaktioner. Primære præadipocytter er typisk isoleret fra den strøgmale vaskulære fraktion af fedtdepoter af voksne mus11,12,13,14. Da de adiposedepoter for voksne dyr imidlertid primært består af fuldt modne adipocytter, der har en meget langsom omsætningshastighedpå 15,16,17, giver denne tilgang en begrænset mængde præadipocytter med en lav spredningsrate. Derfor er isolering af præadipocytter fra nyfødte mus at foretrække at opnå store mængder hurtigt voksende celler, der kan differentieres in vitro. Her er en protokol blevet beskrevet, inspireret af det indledende arbejde med primære brune adipocytter af Kahn et al.18 til effektivt at isolere både hvide og brune præadipocytter, der kan udvides og differentieres in vitro til fuldt funktionelle primære adipocytter (Figur 1A). Fordelen ved at isolere primærceller fra nyfødte, i modsætning til voksne mus, er, at fedtdepoterne vokser hurtigt og dermed er en rig kilde til aktivt at sprede præadipocytter17. Celler isoleret ved hjælp af denne protokol har høj proliferativ kapacitet, hvilket muliggør hurtig opskalering af kulturer. Derudover udviser præadipocytter fra nyfødte hvalpe et højere differentieringspotentiale end voksne forfædre, hvilket reducerer variationen fra godt til godt i graden af differentiering og dermed øger reproducerbarheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger alle IACUC's retningslinjer fra The Scripps Research Institute og University of Wisconsin – Madison School of Medicine and Public Health.
1. Indsamling og fordøjelse af fedtdepoter (dag 1)
- Forbered to 1,5 mL rør til hver hvalp: en til brunt fedtvæv (BAT) og et til hvidt fedtvæv (WAT). Der tilsættes 250 μL fosfatstødpudesum (PBS) + 200 μL 2x isolationsbuffer (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glukose, 100 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES), penicillin-streptomycin og 4% fedtsyrefri kvæg serum albumin) til hvert rør. Hold opløsningerne sterile og på is.
- Placer hvalpene i små kamre (f.eks. en brønd af en 6-brønds plade), og sæt dem på is, indtil de bliver hypotermiske. Sørg for, at der ikke er direkte kontakt mellem hvalpene og isen. Prik en pote med et tip for at sikre tab af bevidsthed, og aflive hvalpene ved halshugning ved hjælp af skarpe saks.
BEMÆRK: Hvis du arbejder med forskellige genotyper, skal du forberede et ekstra rør til opsamling af en halebiopsi (3 mm snit) til genotypning. Hvis genotyping udføres med det samme, skal du holde de aflivede hvalpe på is indtil dissektionen for at indsamle fedtdepoter. - Beregn og afveje mængden af kollagen er nødvendig for at fordøje alle depoter. Der tilsættes 50 μL på 15 mg/mL kollagen type I i 2x isolationsbuffer til hvert rør. Opsuspend ikke kollagenen i isolationsbuffer, før alle væv er indsamlet.
- For at indsamle subkutan WAT, skære huden omkring hvalpens mave (undgå peritoneal brud), og forsigtigt trække huden ned under benene. Uden at tage huden skal du omhyggeligt indsamle fedtdepotet, der vises som et klart (P1 eller yngre) eller hvidt (P2 og ældre), tyndt, langstrakt væv fastgjort på indersiden eller oven på quadriceps(Figur 1B). Fedtdepotet skylles i PBS, og det anbringes i et af rørene med 250 μL PBS + 200 μL 2x isolationsbuffer. Bliv ved med at være på is.
BEMÆRK: P0- og P1-mus giver det bedste udbytte. I P0-1 hvalpe er det subkutane WAT-depot næsten gennemsigtigt. I P2 mus og ældre er depotet lettere at identificere, fordi det allerede bliver hvidt, hvilket indikerer tilstedeværelsen af fuldt modne, lipidbelastede, hvide adipocytter. - For at samle interscapular BAT, trække huden fra skulderbladene over hovedet. Løft BAT - det dybe røde væv mellem skulderbladene - og lav forsigtigt snit rundt om det for at løsne det fra kroppen (Figur 1B). Kontroller, om der er konsistens og farve. skyl med PBS det anbringes i det andet rør, der indeholder 250 μL PBS + 200 μL 2x isolationsbuffer og holde på is.
BEMÆRK: Når bat høstes fra P2-mus og ældre, skal du forsigtigt fjerne det hvide fedtvæv, der omgiver BAT. Den består af et tyndt, blødt, hvidt ark adipocytter placeret mellem huden og BAT, som er dybere mellem skulderbladene. - Når alle depoter er blevet indsamlet, skal du forsigtigt hakke hvert depot (4-6 gange) ved hjælp af en lille saks direkte inde i rørene.
- Opsuspend kollagen type I i det relevante volumen af 2x isolationsbuffer for at opnå en 10x stamopløsning ved 15 mg/mL. Der tilsættes 50 μL 10x kollagen til hvert rør, og rørene opbevares på is, indtil der er tilsat kollagen til alle rørene.
- Vend rørene hurtigt for at blande, og overfør til en temperaturstyret mixer. Prøverne inkuberes i 30 minutter ved 37 °C på en shaker (1.400 omdrejningstalfrekvens for effektiv prøveblanding).
2. Plating preadipocytes (dag 1)
- Efter at have fordøjet vævene, skal du placere rørene tilbage på is.
BEMÆRK: Fra dette trin udføres alt arbejde under sterile forhold i et biosikkerhedsskab. - Strain de fordøjede væv gennem en 100 μm celle si i nye 50 mL rør. Hvis du kun arbejder med WT-mus, eller hvis genotyper er kendt, skal du samle de relevante, adskilte BAT'er. gentage dette for WAT'erne. For at maksimere celleudbyttet skal hvert rør skylles med 1 ml isolationsmedium (Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) + 20% føtal kvægserum (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicillin-streptomycin) og filtreres gennem cellesien. Hvis du arbejder med ukendte genotyper, skal du gå til trin 2.4
BEMÆRK: FBS er en væsentlig faktor for både præadipocytspredning og differentiering. Test grundigt forskellige masser af FBS for at sikre høj ydeevne og konsistens mellem partier. - Bat- og WAT-affjedringer fortyndes til plade 2-3 brønde af en 6-brønds plade for hver BAT-prøve og 4-6 brønde af en 6-brønds plade for hver WAT-prøve. For eksempel, hvis 6 BAT'er og 6 WAT'er blev samlet, fortyndes BAT-celleophænget op til 24-36 mL og WAT-celleophænget op til 48-72 mL. Plade 2 mL af celleaffjedringerne pr. brønd.
- For prøver med ukendte genotyper skal hver prøve holdes adskilt. en 100 μm cellesien oven på hver brønd på en 6-brønds plade, og filtrer en prøve pr. brønd. Skyl røret med 1,5 mL isolationsmedium, og send det gennem sien, der udgør det endelige volumen til 2 mL pr. brønd. Kassér cellesien, læg låget på pladen, og overfør pladen til inkubatoren.
BEMÆRK: Mediet i brøndene skal se uklart ud på grund af flydende blodlegemer, cellerester og lipider fra lysede celler. - 1-1,5 timer efter plating, aspirat medier og vask med 2 mL DMEM uden serum. Omrør forsigtigt pladen for at løsne blodlegemer fra bunden af brøndene. Efter 3 vaske tilsættes 2 mL frisk isoleringsmedium, og cellerne overføres til inkubatoren (37 °C, 5% CO2).
BEMÆRK: Kontroller cellerne under mikroskopet. Flydende materiale (blodlegemer, celleaffald) bør være minimal. Brune præadipocytter vises som små ikke-gennemskinnelige celler, mens hvide præadipocytter vil vise en mere langstrakt form. Både brune og hvide præadipocytter skal være tæt fastgjort til pladen.
3. Udvidelse af præadipocytkulturen (dag 2 til dag 5)
- Den næste dag aspireres mediet, cellerne vaskes med 2 mL DMEM uden serum, og der tilsættes 2 mL af isolationsmediet tilbage.
- Gentag trin 3.1 en gang hver anden dag, indtil cellerne når 80-90% sammenløb.
BEMÆRK: For primære brune præadipocytter kan det tage 4-5 dage at nå 80-90%-sammenløbet. For primære hvide præadipocytter tager det normalt 2-3 dage. Når præadipocytterne når 60% sammenløb, kan de effektivt inficeres med virale partikler til knockdown eller overekspressionseksperimenter. Inficere præadipocytter med en passende viral belastning i op til 8 timer. Brugen af kationiske polymerer til at øge infektionseffektiviteten frarådes, da det ofte resulterer i toksicitet og i en betydelig reduktion af det adipogene potentiale hos inficerede præadipocytter. - For at opdele cellerne skal du belægge nye destinationsplader med en steril opløsning på 0,1% w/v gelatine (opløst i destilleret vand; brug ikke varme). Brug nok volumen til at dække bunden af brønden / skålen. Inkubatplader ved 37 °C, indtil cellerne er klar til at blive seedet (mindst 10 min).
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Belægning af cellekulturplader påvirker ikke udbyttet eller differentieringspotentialet, men det forenkler i væsentlig grad vedligeholdelsen og håndteringen af differentierende adipocytter. - Når cellerne når sub-confluent tæthed (85-95%), aspirere mediet, vask med PBS, og tilsæt trypsin i 3 min for at løsne cellerne. Bloker trypsinaktivitet ved at tilføje 2,5 x trypsin-diskenhed af isolationsmedie. Pipette cellen suspension op og ned for at maksimere celle opsving, og overføre til et nyt rør. Vask brøndene med 1 mL isolationsmedium, og tilsæt det til den første kollektion.
- Centrifuge cellerne i 5 min ved 800-1200 × g, aspirere supernatanten og genbruge cellerne i 3-5 mL af isolationsmediet. Tæl cellerne, og fortynd dem til den ønskede endelige tæthed.
BEMÆRK: For eksempel vil 50.000-80.000 celler/mL (henholdsvis 2,5, 1 og 0,5 mL for henholdsvis 6-, 12- og 24-brøndsplader) resultere i fuldt sammenløbsbrønde inden for 72-96 timer. - Belægningsopløsningen indsugningsopløsningen i trin 3.3, og vask overskydende gelatine af med PBS. Frø cellerne, og returnere pladerne til inkubatoren, indtil fuldt sammenløbet.
4. Differentiering af hvide og brune præadipocytter (dag 7 - 12)
- Når præadipocytter bliver sammenflydende, aspireres mediet, og det erstattes med differentieringsmedium bestående af 10% FBS i DMEM, der indeholder 170 nM insulin, 1 μM dexamethasone og 0,5 mM 3-isobuthyl-1-methylxantin. Hvis bat-præadipocytter differentieres, tilsættes også 1 nM triiodothyronin (T3). Marker den dag, hvor adipogen differentiering induceres som dag 0 i differentiering.
BEMÆRK: Både hvide og brune præadipocytter kan spontant differentiere ved at nå sammenløb. For at maksimere adipocytdifferentiering bør den traditionelle pro-adipogene cocktail, der er beskrevet ovenfor (plus T3 for BAT-præadipocytter), dog anvendes. - Efter 48 timer (dag 2 af differentiering), opdatere mediet med vedligeholdelse medium bestående af 10% FBS i DMEM og 170 nM insulin (plus 1 nM T3 for BAT).
BEMÆRK: På dag 2 kan små lipiddråber, der akkumuleres i cellerne under mikroskopet, observeres ved hjælp af et lyst standardfelt. - Gentag trin 4.2 en gang hver anden dag, indtil cellerne bruges til eksperimenter.
BEMÆRK: På dag 4 eller 5 af differentiering vises de fleste celler fyldt med lipider. Terminalt differentierende adipocytter kan opbevares i kulturen længere eller anvendes på dette stadium til eksperimenter.
5. Genudgring til bioenergetiske forsøg
BEMÆRK: Hvis det er hensigten at udføre bioenergeticsundersøgelser i modne adipocytter i 96-brøndsformatet, skal følgende trin tages. Ideelt set bør celler, der lige har fuldt differentieret (dag 4 eller 5) anvendes. Den nedenfor beskrevne procedure starter fra 1 brønd af en 6-brønds plade.
- Før trypsin fordøjelsen, forberede belægning til 96-godt plader. Der tilsættes 50 μL 0,1% gelatine til hver brønd. Lad pladen stå i en vævskulturinkubator, indtil cellerne er klar til at blive seedet.
- På dag 4 eller 5 af differentiering, aspirere mediet, vask med 1 mL PBS, og tilsæt 300 μL af 0,25% trypsin-ethylendiamine tetraeddikesyre (for 1 brønd af en 6-brønds plade). Vip forsigtigt pladen for at sikre, at trypsin helt dækker bunden af brønden; inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur. Bloker virkningen af trypsin med 700 μL vedligeholdelsesmedium, pipette op og ned for at maksimere cellegenvindingen, og overfør celleaffjedringen til et nyt 1,5 mL rør.
- Centrifuge cellerne ved 1200 × g i 5 min. Fjern supernatanten, genbrug pelleten i 1 mL vedligeholdelsesmedium, og tæl cellerne.
BEMÆRK: En brønd af en 6-brønds plade skal give ca. 1,5-1,8 millioner celler. - Cellerne fortyndes til at have en endelig koncentration på 60.000 til 80.000 celler/mL for brune adipocytter og 100.000 til 120.000 celler/mL for hvide adipocytter. Plade 100 μL af celleaffjedringen pr. brønd i gelatinebelagte 96-brøndsplader.
BEMÆRK: En brønd af en 6-brønds plade giver nok celler til op til to 96-brønds plader. Til bioenergetics eksperimenter er lav densitetsbelægning (30-40% sammenløb) nødvendig for at muliggøre nøjagtig måling af iltforbruget og undgå iltudtømning i brøndene under analysen. - Lad cellerne klæbe til bunden af pladen i mindst 48 timer. Hvis celler opbevares i pladen i mere end 48 timer, skal mediet opdateres efter 2 dage.
- På dagen for analysen, indsug mediet, og erstatte det med assay medium. Inkuberes i 1 time ved 37 °C i en ikke-CO2-styretinkubator, og analysen udføres i henhold til fabrikantens anvisninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afsnit 1 i protokollen vil give en heterogen suspension af celler, der er synlige under en standard lys mikroskop. Filtrering af fordøjet væv med en celle si (afsnit 2) vil fjerne ufordøjet væv. Men nogle cellulære vragrester, blodlegemer, og modne adipocytter vil passere igennem (Figur 1C). Skånsom vask 1 time efter plating vil fjerne ikke-relevante celler som præadipocytter tillægger hurtigt til bunden af brønden (Figur 1C). I afsnit 3 udvides adipocytprækursorer for at opnå det antal celler, der kræves til forsøgsplanen. Selv om både hvide og brune præadipocytter isoleret fra nyfødte unger har høj proliferativ kapacitet, er udbyttet af hvide præadipocytter generelt dobbelt så stort som for brune præadipocytter pr. depot (figur 2A). Hvis der ønskes synkroniserede kulturer, skal starttætheden af hvide præadipocytter derfor beregnes i overensstemmelse hermed. Afsnit 4 indeholder retningslinjer for opnåelse af fuldt modne adipocytter.
I slutningen af differentieringen vises celler fyldt med lipiddråber og udtrykker klassiske markører for henholdsvis hvide og brune adipocytter (Figur 2B,C). Både hvide og brune adipocytter kan anvendes til bioenergetiske undersøgelser som beskrevet i afsnit 5. Figur 2Dviser en sammenlignende analyse af iltforbruget i en mitokondriestresstest af primære hvide og brune adipocytter under basale forhold samt som reaktion på kendte stimulatorer af mitokondriefunktion (f.eks. noradrenalin). Ved isolering er det også muligt at differentiere primære hvide og brune adipocytter på pladerne, der vil blive direkte brugt til bioenergetiske eksperimenter19. I dette tilfælde isoleres præadipocytter og besudtes som beskrevet i afsnit 1 og 2. Når celler bliver sammenflydende, tilskyndes de til at differentiere som beskrevet i afsnit 4, indtil de når terminal differentiering og er klar til bioenergetics analyse. Denne procedure er almindelig for en 24-godt plade format, men mindre så for 96-brønd plader.
Figur 1: Indsamling og forarbejdningaf fedtpuder. (B) Subkutane hvide (øverste) og brune (nederste) fedtdepoter. I P0 mus er subkutan WAT næsten usynlig, men bliver skelnelig på ~ dag 2 efter fødslen. I modsætning hertil har BAT en tydelig mørk farve selv ved P0. Hos ældre hvalpe er BAT omgivet af et tyndt overfladisk lag WAT, som kræver fjernelse, når vævet dissekeres. (C) Repræsentative billeder af primære hvide og brune prækursorceller efter filtrering gennem 100 μm cellesien efter de første vask og 24 timer efter isolering. Skalastænger = 100 μm. Forkortelser: WAT = hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Differentiering af adipocyt forfædre. (B) Repræsentative billeder af uhelbredeligt differentierede hvide og brune adipocytter. Til fluorescensbilleddannelse blev cellerne inkuberet med henholdsvis Nil rød og Hoechst 33342 for at plette neutrale lipider og kerner. Skalalinjer = 100 μm.(C) Analyse af genekspression af klassiske adipocytmarkører, hvide beigemarkører og brunspecifikke markører i primære hvide og brune adipocytter differentieret i 6 dage (n=3). For hvert gen er BAT-ekspressionen relativ i forhold til WAT-niveauer (indstillet til 1). D) OCR af hvide og brune adipocytter i en mitokondriestresstest og som reaktion på noradrenalin (n=3). Brown adipocytes viser ufarvet åndedræt og en robust reaktion på noradrenalin, mens hvide adipocytter viser lidt ufarvet åndedræt og ingen signifikant reaktion på adrenergic stimulation. *p<0,05; ** p<0,01, bestemt af to-tailed Student's t-test. Forkortelser: WAT = hvidt fedtvæv; BAT = brunt fedtvæv; OCR = iltforbrug; Oligo = oligomycin; FCCP = carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone; RAA = rotenon, antimycin A; PPARγ = peroxysom proliferator-aktiveret receptor gamma; Acrp30 = adipocyt komplementrelateret protein på 30 kDa; Fabp4 = fedtsyrebindende protein 4; Glut4 = glukosetransportør 4; Cd36 = differentieringsklynge 36; Retn = resistin; Slc27a1 = opløst bærefamilie 27 medlem 1; Ear2 = eosinofil-associeret, ribonuklease En familie 2; Pgc1a = PPARγ coactivator 1alpha; Prdm16 = positivt regulatorisk område I-bindingsfaktor 1 (PRDI-BF1) og retinoblastoma proteininteraktivt zinkfingergen 1 (RIZ1) homologt domæne, der indeholder 16; Eva1 = epitel V-lignende antigen 1; Cidea = celledødsfremkaldende DNA-fragmenteringsfaktor-alfa-lignende effektor A; Ucp1 = afkobling af protein 1; Dio2 = type 2 deiodinase. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fedtvæv er afgørende for systemisk insulinfølsomhed og glukosehomøostase20. Fedme-forbundet adipocyt dysfunktion er tæt forbundet med starten af type 2 diabetes. Derfor kan større forståelse af den grundlæggende biologi og fysiologi af fedtvæv gøre det muligt at designe nye behandlinger for metaboliske lidelser. Som et supplement til direkte funktionel og transskriptionel analyse af modne adipocytter isoleret fra fedtdepoter21,22, har kultiverede primære adipocytter vist sig at opsummere mange aspekter af fedtvævspatofysiologi, herunder udskillelse af adipokiner, resistens over for insulin som reaktion på proinflammatoriske stimuli og induktion af det termogeniske program23,24,25. Selvom tidligere protokoller har beskrevet isoleringen af adipocytprækursorer fra voksne mus11,12, giver denne protokol en metode til effektiv isolering af celler fra nyfødte hvalpe. Denne strategi giver en betydeligt større population af hvide og brune adipocyt forfædre med højere differentieringspotentiale, da postnatal fedtdepoter stadig er relativt udifferentierede sammenlignet med de fedtdepoter hos voksne mus26. Desuden er celler isoleret ved hjælp af denne metode allerede begået og giver fuldt funktionelle differentierede adipocytter, der udtrykker markører for modne celler og udviser deres unikke fysiologiske egenskaber, herunder lipidlagring og termogenisk kapacitet.
Primære celler kan ikke udvides på ubestemt tid in vitro. Derudover begynder primære præadipocytter at miste deres adipogene potentiale efter flere passager i kulturen. Dette skyldes sandsynligvis, at kontinuerlig cellekultur resulterer i en iboende berigelse af mindre engagerede, mere proliferative celler. En begrænsning af denne protokol er således det tidsrum, hvor præadipocytter kan bruges. Adipogent potentiale bevares fuldt ud, hvis cellerne induceres til at differentiere sig inden for 7-8 dage fra isolationstidspunktet. Adipocyt forfædre er særligt resistente over for enzymatisk fordøjelse, men det er ikke desto mindre vigtigt at korrekt tid kollagen behandling. Over fordøjelsesbesvær af væv kan resultere i nedsat celle overlevelse og nedsat evne til celler til at overholde pladen. I hele ekspansionsfasen er både hvide og brune præadipocytter stærkt klæbende og kan tåle kraftige vaske og hyppig medieudveksling. Det anbefales dog at anvende belagte plader, når præadipocytter induceres for at differentiere. Modne, lipidbelastede adipocytter har nedsat overflade vedhæftning og cellecelleinteraktioner, hvilket resulterer i en tendens til at løsne sig under differentiering, medmindre de håndteres forsigtigt. Det mest delikate trin i protokollen er induktion af differentiering. FBS, insulin, T3 og andre lægemidler skal testes, og deres endelige koncentrationer optimeres for at opnå det højeste omfang af differentiering. En PPARγ agonist (f.eks rosiglitazone) kan også tilføjes for yderligere at stimulere adipogenesis.
Det er vigtigt at bemærke, at differentieringsbetingelserne kan tilpasses forsøgsbehovene. For eksempel kan præadipocytter i skærme med genetiske eller kemiske biblioteker, der er designet til at identificere proteiner / forbindelser, der forbedrer hvid og / eller brun adipocytdifferentiering, induceres til at differentiere ved hjælp af et minimalt eftergivende medium, der kun omfatter 10% FBS i DMEM og 170 nM insulin. Vurdering af hver komponent i differentieringscocktailen anbefales at bestemme ideelle assayvinduer til differentieringsanalyser. T3 og dexamethasone kan undværes for primær hvid og brun adipocyt differentiering. Disse betingelser vil sikre en lav differentiering i kontrolceller, hvilket øger vinduet i analysen og maksimerer evnen til at opdage pro-adipogene faktorer. Kulturer af primære brune og hvide adipocytter er et kraftfuldt redskab til at afhøre adipocytcelle-autonome funktion som reaktion på genmanipulation og metaboliske belastninger for at supplere undersøgelsen af brunt og hvidt fedtvæv in vivo. Der er derfor behov for protokoller for isolation og kultur af primære præadicytter for at muliggøre reproducerbare undersøgelser af adipocytfunktionen in vitro, der kan reproduceres. Den strategi, der er beskrevet her, gør det muligt at studere primære hvide og brune præadipocytter, der kan differentieres til fuldt modne adipocytter og testes under en række eksperimentelle manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for Cristina Godio på Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spanien, Mari Gantner på The Scripps Research Institute, La Jolla, og Anastasia Kralli på Johns Hopkins University, Baltimore, for at få hjælp til at optimere denne protokol baseret på det første arbejde Kahn et al.18. Dette arbejde blev finansieret af NIH grants DK114785 og DK121196 til E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H.
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
