Summary
En ny teknikk for rekonstruksjon av blodkrets i en heterotop hjertetransplantasjonsmodell av bukmus er demonstrert.
Abstract
Den kirurgiske teknikken for heterotop abdominal hjertetransplantasjon hos mus er en standardmodell for forskning på transplantasjonsimmunologi. Her presenteres den etablerte teknikken for en modifisert blodkretsrekonstruksjon i en heterotop abdominal hjertetransplantasjonsmodell. Denne metoden bruker intrathoracic dårligere vena cava (IIVC) i stedet for lungearterien i donorhjertet for anastomose til mottakerens dårligere vena cava. Det letter og forbedrer suksessratene for abdominal hjertetransplantasjon hos mus.
Introduction
Den kirurgiske teknikken for heterotop abdominal hjertetransplantasjon hos mus representerer en standardmodell for forskning på transplantasjonsimmunologi1,2,3. Det er imidlertid svært utfordrende å utføre, og dette innebærer en begrensning i den utbredte bruken av denne modellen4,5.
I tradisjonell mus hjertetransplantasjon (THTx), donor aorta og mottakeren abdominal aorta er anastomosed mens lungearterien er anastomosed til mottakeren dårligere vena cava6,7,8.
I denne modifiserte musehjertetransplantasjonsteknikken er donoraorta anastomosed til mottakeren abdominal aorta og donoren IIVC er anastomosed til mottakeren dårligere vena cava(3,4,6) ( Figur2 og Figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført etter retningslinjene fra Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål (Ethic-komiteen godkjent, #G1071/09).
MERK: Foreløpig forberedelse, anestesi, postoperativ omsorg og overvåkingsarbeid er det samme som utført i tradisjonelle kirurgiske metoder1,2,4. BALB/c mus fungerte som hjertedonorer og C57BL/6J som transplantasjonsmottakere. Mus var i alderen 8-12 uker, veide ~ 30 g ved transplantasjon og ble plassert under standardforhold.
1. Forberedende trinn
- For anestesi, gi mus inhalativ isofluran (2%) til de sovner, etterfulgt av intraperitoneale injeksjoner av ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg). For postoperativ analgesi, bruk Metamizol (200 mg/kg) p.o. og Carprofen (5 mg/kg) s.c..
MERK: Anvendelsen av antibiotika ble avstått med vilje, da disse stoffene kan påvirke immunologiske responser. - For kirurgi, bruk et sett med mikroskopiske instrumenter, inkludert en mikrosaks, mikro-tang, en nåleholder og mikro hemostatiske klemmer. En elektrokirurgisk penn er også nødvendig. Utfør suturer med 7/0er, 10/0er og 4/0er nylontyper.
- Plasser musen i en boks for isofluraninnånding (2 %) i 40-60 sekunder. Bestem dybden av anestesi ved å klemme poten med pinsett. Hvis det er en fullstendig mangel på respons for denne stimulansen, gå til neste trinn.
- Når musen har sovnet, veier du musen.
- Påfør en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg/kg) + xylazin (10 mg/kg) + acepromazin (2 mg/kg) på den bedøvede musen.
- Klipp abdominal pels og plasser musen på operasjonsbordet. Utfør desinfeksjon ved hjelp av povidonjod i 3 ganger, og draper deretter musen riktig ved hjelp av et fenestert kirurgisk håndkle.
2. Donor operasjon prosedyre
- Bruk saks til å kutte huden fra nakken til underlivet, og skrell av hele laget av huden til midtlinjen av begge axillae.
- Bruk saks til å kutte musklene i bukveggen og forsiktig flytte viscera til venstre (fra operatørens syn). Pakk bort viscera med en saltvanns imbibed gasbind for å trygt avsløre den dårligere vena cava.
- Bruk en 1 ml sprøyte til å injisere 0,4 ml heparinoppløsning (inneholder 500 U heparin) langsomt inn i nedre vena cava og vent i 1 minutt før du trekker ut nålen.
- Trekk ut nålen og bruk en mikrosaks for å kutte både den dårligere vena cava og abdominal aorta for å akselerere exsanguination.
- Bruk saks for å åpne brysthulen ved å utføre et u-formet kutt; fullstendig eksponere hjerte, lunger og alle brystblodkar.
- Utsett thoracic aorta, kutt 1/2 av lumen, og kutt deretter lungevenen for å lette vanning og drenering.
- Sett inn et vanningsrør i åpningen av thoracic aorta, injiser minst 2 ml 4 °C kald histidin-tryptofan-ketoglutarate kardiolegioppløsning (Custodiol HTK-løsning)9 til lungevenens utstrømning er helt klar og hjertet helt slutter å slå.
- Trekk ut vanningsrøret og løsne brystbenet.
- Bruk mikro saks for å fjerne thymus og å litt strippe fettet rundt aortabuen.
- Bruk rette og buede tang for å eksponere og ligate stammen av arteria pulmonalis (på høyre side av aortabuen) med en 10/0 sutur.
- Bruk mikro tang for å skille fett og bindevev festet til IIVC, eksponere og ligate den overlegne vena cava (på venstre side av aortabuen) med en 7/0 sutur og bruk mikro saks for å kutte den bak ligasjonen.
- Lag en 7/0 sutur rundt bunnen av hjertet under aortabuen, IIVC og begge auricles. Deretter ligate lungearteriegrenene og venøse lungekar.
- Bruk mikrosaks til å transektere aortabuen så distal som mulig, lungekarene under ligaturen og IIVC nær membranen. Fjern hjertet ut av brystet.
- Plasser den utplantede donorens hjerte i 4 °C kald HTK kardiooplegiløsning og konserver midlertidig.
3. Operasjonsprosedyre for mottaker
MERK: De første operasjonstrinnene ligner de som tidligere ble vist for donormusen, inkludert anestesi og desinfeksjon.
- Utfør bukhuden kuttet på en tverrgående måte, dekk bukorganene med en våt gasbind ved hjelp av saltoppløsning.
- Bruk mikro tang for å eksponere dårligere vena cava og abdominal aorta og frigjøre dem fra omkringliggende fettvev.
- Bruk mikro tang til å ligate eller elektrokauterisere sidegrensbeholdere (laterale eller under venen/aorta) under nyrefartøyene.
- Bruk klipsapplikator tang til å plassere to mikro hemostatiske klemmer på bukdelen av vene / aorta som kommer fra høyre og etterlater mer enn 1 cm avstand for både aorta / vene for å sikre plass til bygging av anastomose mellom dem.
- Bruk mikrosaks for å gjøre et snitt inn i aorta litt nærmere den nedre klemmen enn til den øvre klemmen. Alternativt kan du bruke en 30 G nål for å lage et lite hull og åpne den med mikrosaks.
- Plasser mottakermusen slik at aorta vender mot operatøren med vena cava på den andre siden. Plasser deretter hjertet inn i bukhulen og dekk det med en liten våt gasbindpute.
- Bruk en 10/0 sutur for å tilpasse og sy donor aorta til mottakeren aorta starter caudally, lage en knute og fortsette med en løpende sutur til toppen av snittet (ca 4-5 masker). Deretter vender du hjertet over til høyre (fra motivets syn), dekker det igjen og fortsetter suturen på venstre side til du når den kaudale enden og knuter den.
- Bruk et vanningsrør til å injisere minst 0,5 ml 4 °C HTK kardiooplegiløsning for å skylle donorens IIVC.
- Bruk mikrosaks for å kutte et rundt hull på mottakerens abdominal dårligere vena cava, som skal ha samme størrelse på donorene IIVC lumen. Snittet skal være plassert over den aorta anastomotiske åpningen. Gjør venesnittet større enn det aorta snittet.
- Bruk en 10/0 sutur for å sy donoren IIVC til mottakeren vena cava starter caudally. Bind en knute og utfør en løpende sutur til toppen av snittet er nådd. Bruk fem masker og fortsett suturen til venstre. Til slutt knytter du en knute i halehjørnet, og stram forsiktig (vær forsiktig så du ikke trekker for stramt).
- Plasser de små delene av den hemostatiske svampen rundt venen og aortaanastomoser.
- Bruk klipsapplikator tang for å fjerne først den nedre og deretter de øvre mikro-hemostatiske klemmer og skyll bukhulen med 38.0°C herdet 0,9% natriumklorid.
- Bruk mikro tang for å ta bort hemostatisk svamp.
- Vær oppmerksom på hjerterytmen til det transplanterte hjertet.
- Bruk tang til å sette tarmene tilbake i bukhulen og to-lags suturer (magemuskler etterfulgt av hud) for å lukke magesåret med en 4/0 sutur.
- Sett musene inn i et arbeidsstasjonskammer for oksygen- og temperaturkontroll (f.eks. INVIVO2-400) for å gi et varmt og oksygenrikt miljø for de transplanterte musene å gjenopprette, vent til musene våkner.
- For postoperativ analgesi, gi Metamizol direkte 200 mg/kg per os etter bruk. Fire og 16 timer etter operasjonen gir Metamizol 200 mg/kg per os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. I den videre oppfølgingen, gi Carprofen (5 mg/kg) s.c til de transplanterte musene hver 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenteres en modifisert teknikk for heterotop abdominal hjertetransplantasjon hos mus som tidligere er utviklet i vårt laboratorium og har vist seg nyttig de siste 16 årene. Tidligere ble det rapportert at i totalt 40 tilfeller av vena cava til vena cava (V-V gruppe) sammenlignet med 40 tilfeller av den tradisjonelle lungearterien til vena cava (P-V gruppe) anastomose prosedyre4 (Tabell 1) fartøyet anastomose tok 20,8±1,3 min i V-V-gruppen, betydelig kortere enn i P-V-gruppen (27,5±1,3 min, p<0,01). Den varme iskemitiden, total mottakeroperasjonstid og postoperativ hjertegjen gjentakende tid, som var henholdsvis 25,5±1,2 min, 42,0±1,5min og 1,1 ±0,2 min, ble også betydelig forkortet enn observert i den tradisjonelle P-V-gruppen (alle p<0,05) (Figur 1). Selv om det ikke er noen forskjeller for langvarige overlevelsesrater i denne modellen10,11, den modifiserte teknikken forenklet abdominal hjertetransplantasjon hos mus, noe som resulterer både i redusert varm iskemi og podet hjerte-rebeating tid.
Når det gjelder disse tidligere publiserte dataene og vår erfaring med denne modellen i løpet av de siste 16 årene, anbefaler vi at de viktigste operasjonstrinnene bør ta en begrenset tid for å sikre en suksessrate på >90%4. Derfor oppnås optimale resultater hvis høsting av donorhjertet ikke tar mer enn 60 min, den kalde iskemitiden bør begrenses til maksimalt 40 min, og byggingen av IIVC-anastomose bør ikke ta lengre tid enn 15 minutter, da dette er direkte forbundet med redusert varm iskemitid.
Figur 1. Sammenligning av prosedyretider mellom de to operasjonsteknikkene (n =40 hver, gjennomsnitt + SE) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Donor hjerte forberedelse ved hjelp av den tradisjonelle (a, øvre venstre) og den modifiserte (b, nedre venstre) musen hjertetransplantasjon modell. Fotografiene i panel a og b skildrer aorta (A), lungearterien (PA), høyre atrium (RA), venstre atrium (LA) og den intrathoracic dårligere vena cava (IIVC) av donorhjertet. Legg merke til forskjellen i fartøyets lengde på PA sammenlignet med IIVC. Panel c viser mottakeren situs forberedt på heterotop abdominal HTX. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Vaskulær anastomose av den modifiserte modellen: aorta (A), intrathoracic dårligere vena cava (IIVC), abdominal dårligere vena cava (aivc), abdominal aorta (aa). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Demonstrasjon av karlengde for lungearterien (PA) og den intrathoracic dårligere vena cava (IIVC). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5. Fysiologisk trompetform på slutten av den intrathoracic dårligere vena cava. Aorta (A), intrathoracic dårligere vena cava (IIVC), høyre atrium (RA), venstre atrium (LA). Den venstre røde dobbeltpilen til venstre fremhever diameteren og den røde sirkelen til høyre strukturen av trompetform. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vena cava til vena cava (ny metode) | Lunge A til vena cava (tradisjonell metode) | |
| Donorinnkjøp (min) | 12.8 + 0.3 | 11.4 + 0.4 |
| Mottakeroperasjon (min) | 42.0 + 1.5 | 48,6 + 1,4** |
| Karanastomose (min) | 20.8 + 1.3 | 27,5 + 1,3** |
| Kald iskemi (min) | 32.8 + 0.6 | 34.2 + 0.7 |
| Varm iskemi (min) | 25.5 + 1.2 | 32,6 + 1,3** |
| Rebeat postoperering (min) | 1.1 + 0.2 | 2.1 + 0.4* |
| Suksessrate | 92.50% | 90.00% |
| *P < 0,05 | ||
| **P < 0,01. |
Tabell 1. Sammenligning av tidsfordelinger og innledende resultater i to operasjoner (n - 40, gjennomsnitt + SE)
Gjengitt fra Wu, K., Zhang, J., Fu, J., Wu, S., Philipp, T., Uwe, H., Kribben, A. og Witzke, O. Ny teknikk for rekonstruksjon av blodkrets i mushjertetransplantasjonsmodell. Mikrokirurgi. 26, 594-598 (2006).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiske teknikken for heterotop abdominal hjertetransplantasjon hos mus er svært utfordrende, og dette innebærer en begrensning i den utbredte bruken av denne modellen.
En av ulempene ved den konvensjonelle teknikken er den begrensende lengden på donorens lungearterie (PA). Det er vanligvis på ca 2 mm lengde, mens lengden på donorhjertets IIVC som brukes i vår modell, vanligvis er ca. 1 cm (figur 2). Det betyr at IIVC-anastomosen i den modifiserte modellen gir et klarere syn på operasjonen situs som muliggjør forbedret kirurgi av anastomoser og forhindrer uønsket utvikling av for strenge suturer eller til og med skadelige lesjoner i karene (figur 4). Både byggingen av PA og IIVC-anastomose er utfordrende selv for erfarne operatører. PA er veldig delikat og tynnvegget og IIVC er enda tynnere og potensielt mer skjøre hos mus. Derfor må operatørene være oppmerksomme på denne begrensningen og bør være forsiktige når de suturerer IIVC. På dette tidspunktet er det imidlertid viktig å understreke at selv om IIVC-karveggen er veldig tynn, har den den store fordelen at karlengden ikke er forbundet med spenning til blodkarforbindelsen, og dermed gjør anvendelsen av en presis sutur enklere og mindre utsatt for skade. Siden forsiktig og sikker påføring av fartøyets suturer er svært kritisk for et vellykket operasjonsresultat, anbefales en forstørrelse av situs på 10 til 20 ganger.
I tillegg danner slutten av thoracic segmentet av IIVC en typisk trompetformet struktur (Figur 5). Den større åpningsdiameteren representerer en av de viktige og gunstige grunnene til at IIVC kan velges. Bruken letter anvendelsen av en tilstrekkelig anastomose. Dette reduserer både vanskeligheten med operasjonen og driftstiden.
En mulig hendelse som kan kompromittere utfallet av transplantasjonsprosedyren representerer en trombose av karanastomose, ofte fostret av en stenose. Selv om lengden på fartøyet i vår modell øker med vilje, var dette ikke forbundet med dannelsen av trombe. Trompetformet anastomose i IIVC kan også utøve en positiv effekt samtidig som forekomsten av en anastomotisk stenose reduseres sterkt. Derfor, for denne prosedyren er det ikke nødvendig med en posttransplant heparinisering.
En tidligere analyse av IVC-aivc anastomosemetoden avslørte flere fordeler og forbedringer sammenlignet med den konvensjonelle teknikken10. Med hensyn til disse resultatene og fra det retrospektive synspunktet til vår langvarige erfaring4,10,12,13, resulterer denne teknikken både i redusert varm iskemi og rebeating tid av podet hjerte. Selv om det ikke er noen forskjeller for langvarige overlevelsesrater for denne modellen10, er den modifiserte teknikken som presenteres her, tilrettelegger for den anostomotiske karrekonstruksjonen og reduserer dermed vanskeligheten med abdominal hjertetransplantasjon hos mus. Opplæring og anvendelse av denne modellen kan derfor forbedre tilgjengeligheten og utbredt anvendelse av abdominal hjertetransplantasjon hos mus for immunologiske så vel som hjerteforskningsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yun Xu for hennes hjelp som stemmeskuespiller, Dr. med. Jianhua Peng for hennes hjelp til videoredigering og Dr. Annika Kuckhahn for hennes kommentarer og støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Den tyske forskningsstiftelsen (DFG) for å fremme internasjonalt samarbeid (HO2581/4-1 til AH), og National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 til FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Köhler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Ice box | PETZ | No Catalog Number available | |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9%) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Scissors | Peha Instruments | 991083/4 | |
| small Petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| Straight forceps | WPI | 14113-G | |
| surgical tape | BSN | 4120 | |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Syringe (0.3 mL) | BD | 324826 | |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Corry, R., Winn, H., Russell, P. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. Journal of Investigative Surgery. 26, 223-228 (2013).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423 (2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
- Türk, T. R., et al. Reduction of chronic graft injury with a new HTK-based preservation solution in a murine heart transplantation model. Cryobiology. 64 (3), 273-278 (2012).
