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Cancer Research

एक शुद्ध DEC-205-विट्रो में माउस Dendritic कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ एंटीबॉडी निर्देशित और वीवो में रासायनिक Conjugation

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62018
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1, 1,2, 4, 4, *1,2,5, *1,2
1Immune Regulation Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Infection Immunology Group, Institute of Medical Microbiology, Infection Prevention and Control, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 3Institute for Molecular and Clinical Immunology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 4Cellular Proteome Research, Helmholtz Centre for Infection Research, 5Experimental Pneumology, University Hospital of Pneumology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg
* These authors contributed equally

Summary

हम वीवो डेंड्रिटिक सेल टार्गेटिंग में एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए मॉडल एंटीजन ओवलबुमिन के रासायनिक संयुग्मण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी का शुद्धिकरण, एंटीजन का रासायनिक संाधीनता, साथ ही संजूगेट का शुद्धिकरण और कुशल संाधीनता का सत्यापन शामिल है।

Abstract

वीवो में डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को क्रॉस-पेश करने के लिए लक्षित एंटीजन डिलीवरी कुशलतापूर्वक टी प्रभावकार सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करती है और वैक्सीन डिजाइन में एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदर्शित करती है। एंटीजन को एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर्स जैसे डीईसी-205 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के माध्यम से डीसी को दिया जाता है जो तेज, प्रसंस्करण और MHC वर्ग I-और II-प्रस्तुति को प्रेरित करते हैं।

एक उपयुक्त एंटीबॉडी के लिए वांछित एंटीजन का कुशल और विश्वसनीय संाधीनता डीसी लक्ष्यीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम है और अन्य कारकों के बीच एंटीजन के प्रारूप पर निर्भर करता है। एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन का रासायनिक संविलियन एक संभावित रणनीति है। अतीत में, हमने चूहों में अध्ययन को लक्षित करने वाले वीवो डीसी में मॉडल एंटीजन ओवलब्यूमिन (ओडब्ल्यूए) और एक डीईसी-205-विशिष्ट IgG2a एंटीबॉडी (αDEC-205) को सफलतापूर्वक क्रॉस-लिंकिंग की स्थापना की है। प्रोटोकॉल का पहला कदम एनएलडीसी (नॉन-लिम्फोइड डेंड्रिटिक कोशिकाओं) के सुपरनिटेंट से एंटीबॉडी का शुद्धिकरण है- 145 हाइब्रिडोमा एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा। शुद्ध एंटीबॉडी को सल्फो-एसएमसीसी (सल्फोस्यूसिनिमिडिल 4-[एन-मालेमिडोमेथिल] साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट) द्वारा रासायनिक संयुग्मण के लिए सक्रिय किया जाता है, जबकि उसी समय ओवीए प्रोटीन के सल्फ्रीडिल-समूह टीसीईपी-एचसीएल (ट्राइस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड) के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से उजागर होते हैं। अतिरिक्त टीएमईपी-एचसीएल और सल्फो-एसएमसीसी को हटा दिया जाता है और एंटीजन को रातोंरात युग्मन के लिए सक्रिय एंटीबॉडी के साथ मिलाया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप αDEC-205/OVA conjugate केंद्रित है और अनबाउंड OVA से मुक्त है । αDEC-205 के लिए OVA के सफल conjugation पश्चिमी दाग विश्लेषण और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा सत्यापित किया जाता है।

हमने सफलतापूर्वक उपयोग किया है, लिवर में साइटोटॉक्सिक टी सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए रासायनिक क्रॉसलिंक-αDEC-205/OVA का उपयोग किया है और डीईसी-205+ डीसी के वीवो लक्ष्यीकरण में निम्नलिखित ह्यूमरल और सेलुलर प्रतिरक्षा को प्रेरित करने में उनकी क्षमता के लिए विभिन्न एडजुवेंट्स की तुलना करने के लिए। इसके अलावा, इस तरह के रासायनिक युग्मित एंटीबॉडी/एंटीजन conjugates ट्यूमर एंटीजन के लिए वैक्सीन प्रतिक्रियाओं के कुशल प्रेरण के लिए मूल्यवान उपकरण प्रदान करते है और रोकथाम और ट्यूमर के विभिंन प्रकार की चिकित्सा के बारे में शास्त्रीय प्रतिरक्षण दृष्टिकोण से बेहतर साबित हो गया है ।

Introduction

डेंड्रिटिक कोशिकाएं (डीसी) प्रतिरक्षा प्रणाली के केंद्रीय खिलाड़ी हैं। वे एंटीजन-प्रस्तुति में विशिष्ट कोशिकाओं के एक विविध समूह हैं और उनका प्रमुख कार्य जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा को पाटना है1,2। महत्वपूर्ण बात यह है कि डीसी न केवल कुशल और विशिष्ट रोगजनक निर्देशित प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं बल्कि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा1,3के कई पहलुओं में भी शामिल हैं।

मेजबान प्रतिरक्षा में उनकी विशेष भूमिका के कारण, डीसी टीकाकरण4के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में ध्यान में आया । एक दृष्टिकोण एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए वीवो में डीसी को एंटीजन को लक्षित करना है और पिछले वर्षों में, बड़ी संख्या में अध्ययन उपयुक्त रिसेप्टर्स को परिभाषित करने और रणनीतियों को लक्षित करने के लिए समर्पित किए गए हैं1,4। इसका एक उदाहरण सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर डीईसी-205 है, जिसे एंडोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए डीईसी-205-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा लक्षित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयुक्त एडजुवेंट के साथ संयोजन में डीईसी-205 को लंबे समय तक रहने वाले और सुरक्षात्मक सीडी 4 + और सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ-साथ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को भी ट्यूमर एंटीजन3, 5, 6,7,8,9के खिलाफ कुशलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है।

ऐसे कई अध्ययन हैं जिनमें डीसी को लक्षित एंटीजन को मुक्त संयुक्त राष्ट्र-संयुग्मित एंटीजन3,5,10, 11,12से बेहतर होने का लक्ष्य दिया गया है । इससे संबंधित डीसी को एंटीजन का संजीदिय होना पड़ता है, जिसमें डीसी लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण में एक केंद्रीय कदम है। एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े के माध्यम से डीसी लक्ष्यीकरण के मामले में, एंटीजन या तो रासायनिक या आनुवंशिक रूप से जुड़ा हो सकता है और या तो रणनीति अपने स्वयं के (dis) लाभ प्रदान करता है1। एक तरफ, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एंटीबॉडी-एंटीजन निर्माण में एंटीजन खुराक पर नियंत्रण के साथ-साथ बहुत सारे1के बीच बेहतर तुलनीयता प्रदान करने वाला स्थान है। इसके साथ ही, रासायनिक संविलियन को कम तैयारी की आवश्यकता होती है और विशेष रूप से प्रयोगात्मक और पूर्व-नैदानिक मॉडलों में विभिन्न एंटीजन और/या टीकाकरण रणनीतियों का परीक्षण और तुलना करने का प्रयास करते समय अधिक लचीलापन प्रदान करता है ।

यहां, हम एक मॉडल प्रोटीन एंटीजन के रूप में अंडाकार (ओवीए) के कुशल और विश्वसनीय रासायनिक संयुग्मण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो चूहों में वीवो डीसी लक्ष्यीकरण में उपयुक्त है। सबसे पहले, αDEC-205 एनएलडीसी-145 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं13से शुद्ध है। रासायनिक संयुग्मण के लिए, हेट्रोबिफंक्शनल क्रॉसलिंकर सल्फोसुक्यूनिमिडिल 4-[एन-मलीमिडोमेथिल] साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट (सल्फो-एसएमसीसी), जिसमें एनएचएस (एन-हाइड्रोक्सीस्यूसिनिमाइड) एस्टर और मलीमाइड समूह शामिल हैं, का उपयोग किया जाता है, जिससे अमीन और सल्फीड्रिल-युक्त अणुओं के सहसंयोजक conjugation की अनुमति होती है । विशेष रूप से, एंटीबॉडी के प्राथमिक अमीन शुरू में सल्फो-एसएमसीसी और परिणामस्वरूप मलीमाइड-सक्रिय αDEC-205 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, फिर टीएमईपी-एचसीएल (ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड) के माध्यम से कम सल्फ्लाइड्रिल युक्त ओवा प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करता है। अंतिम उत्पाद रासायनिक रूप से αDEC-205/OVA(चित्रा 1)है । रासायनिक संयुग्मण से परे, हमारा प्रोटोकॉल संयुग्म से अतिरिक्त ओवी को हटाने के साथ-साथ पश्चिमी दाग विश्लेषण और एक विशिष्ट एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख के माध्यम से सफल संयुग्मण के सत्यापन का वर्णन करता है। हमने अतीत में इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक नियोजित किया है ताकि ओडब्ल्यूए और अन्य प्रोटीन या इम्यूनोजेनिक पेप्टाइड्स को αDEC-205 तक रासायनिक रूप से संयोजित किया जा सके । हम विट्रो में सीडी 11सी+ कोशिकाओं के साथ - साथ वीवोमें सेलुलर और ह्यूमरल इम्युनिटी के कुशल प्रेरण के लिए कुशल बाध्यकारी प्रदर्शन करते हैं ।

निश्चित रूप से, इस विधि के लिए कमियां हैं जैसे कि बहुत-से-बहुत तुलनीयता और अंतिम संजूगेट के भीतर एंटीजन की सटीक डोजिंग में। फिर भी, रासायनिक संवजन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर निर्माणों की तुलना में एंटीबॉडी और प्रोटीन एंटीजन की पसंद में प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है। इसलिए, हमारा मानना है कि यह दृष्टिकोण पूर्व-नैदानिक माउस मॉडल में डीसी लक्ष्यीकरण में उनकी दक्षता के लिए विभिन्न एंटीजन का मूल्यांकन करने में विशेष रूप से मूल्यवान है, महत्वपूर्ण रूप से विशिष्ट एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में भी।

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Protocol

वर्णित पशु प्रयोगों के सभी स्थानीय सरकारी एजेंसी (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; फ़ाइल संख्या 33.12-42502-04-10/0108) द्वारा अनुमोदित किया गया और राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।

1. हाइब्रिडोमा सेल लाइन एनएलडीसी-145 से αDEC-205 का उत्पादन

  1. एंटीबॉडी उत्पादन के लिए, गल क्रायोप्रीवित एनएलडीसी-145 कोशिकाओं को पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर αDEC-205 का उत्पादन किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर कोशिकाओं का विस्तार2. दो 75 सेमी2 बोतलों एंटीबॉडी उत्पादन के लिए आगे बढ़ने की जरूरत होगी । सुरक्षित काम करने की स्थिति सुनिश्चित करने और संस्कृतियों के प्रदूषण को रोकने के लिए सेल संस्कृति प्रक्रियाओं को सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
    1. आईएसएफ-1 माध्यम के 9 एमएल में गल कोशिकाओं के 1 एमएल (1 x 106-5 x10 6 कोशिकाओं/एमएल) को 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्व-गर्म 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ सेल कल्चर फ्लास्क (25 सेमी2)में 1% के साथ पूरक किया गया । फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में क्षैतिज रूप से रखें।
    2. 70% संगम तक 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर कोशिकाओं को संस्कृति। यह सामान्य रूप से 24 - 48 घंटे के बाद प्राप्त किया जाना चाहिए।
    3. एक बार कोशिकाओं को 70% संकुचित कर रहे हैं, पूरा एनएलडीसी-145 सेल निलंबन (10 मिलीएल) एक 15 एमएल शंकुकेंद्रित अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट नियंत्रक का उपयोग कर एक पिपेट कंट्रोलर का उपयोग कर 1-10 मिलीएल से एक मात्रा रेंज में । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें।
    4. पानी के स्नान में प्री-वार्म आईएसएफ-1 मीडियम से 37 डिग्री सेल्सियस और आईएसएफ-1 मीडियम के 12 एमएल में गोली को 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ सम्प्ट करें। पुनर्संपित सेल निलंबन को एक ताजा सेल कल्चर फ्लास्क (75 सेमी2)में स्थानांतरित करें।
    5. संस्कृति और आईएसएफ-1 माध्यम में कोशिकाओं का विस्तार 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, जब तक 70% मिश्रित और 99% व्यवहार्य। यह सामान्य रूप से 48 - 72 घंटे के बाद प्राप्त किया जाना चाहिए।
    6. कोशिकाओं को दो 75 सेमी2 फ्लास्क में विभाजित करें। ऐसा करने के लिए पहले सेल कल्चर फ्लास्क बॉटम/कल्चर सरफेस को सेल सस्पेंशन के साथ फ्लश करने के लिए सभी एनएलडीसी-१४५ कोशिकाओं को सतह से हटा दें । एनएलडीसी-145 सेल सस्पेंशन के 6 एमएल को दो ताजा 75 सेमी2 बोतलों में से एक में स्थानांतरित करें और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ प्री-वार्म्ड आईएसएफ-1 माध्यम पूरक जोड़ें ।
      नोट: सेल कल्चर मीडियम को रिन्यू न करें क्योंकि एनएलडीसी-145 सेल्स ने मीडियम को वातानुकूलित किया होगा। कोशिकाओं को उनके माध्यम के साथ एक साथ स्थानांतरित करें और संस्कृति को नए माध्यम के साथ वांछित मात्रा तक भरें। यह एनएलडीसी-145 कोशिकाओं द्वारा व्यवहार्यता और अधिकतम एंटीबॉडी उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सेल संस्कृतियों का विस्तार करें, जब तक कि लगभग 70% कॉन्फ्ल्यूंट जो आम तौर पर 48 - 72 घंटे के बाद हासिल किया जाता है।
    8. एक बार कोशिकाओं को 70% ढुलमुल हो जाने के बाद, विस्तारित एनएलडीसी-145 सेल निलंबन के 10 एमएल को 75 सेमी2 बोतलों में से प्रत्येक से एक पीईटीजी (पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट ग्लाइकोल) रोलर बोतल (1,050 सेमी2)में स्थानांतरित करें। इसके लिए, एक पिपेट नियंत्रक और 10 एमएल पिपेट का उपयोग करके सतह से सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए सेल कल्चर फ्लास्क बॉटम/कल्चर सरफेस को सेल सस्पेंशन के साथ फ्लश करें ।
    9. 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमामाइसिन (पूर्व-गर्म से 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ आईएसएफ-1 माध्यम की 140 मिलीलीटर जोड़ें( 37 डिग्री सेल्सियस से पूर्व गर्म) सीधे मध्यम बोतल से प्रत्येक में रोलर बोतलों को 150 एमएल मार्क तक भरने के लिए।
      नोट: चरण 1.1.6 में नोट देखें।
    10. संस्कृति तीन दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस, 5 प्रतिशत सीओ2 और 25 राउंड/मिनट पर रोलर की बोतलें।
    11. एनएलडीसी-145 में से प्रत्येक में 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गरम) के साथ आईएसएफ-1 माध्यम की 150 मिलीलीटर पूरक जोड़ें जिसमें रोलर की बोतलें उन्हें 300 मिलीलीटर के निशान तक भर दें।
    12. संस्कृति रोलर की बोतलें अब ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और25 राउंड/मिनट में एक और तीन दिनों के लिए ३०० एमएल संस्कृति युक्त ।
    13. एनएलडीसी-145 में रोलर की बोतलों में से प्रत्येक में 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्व-गर्म से 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूर्व-गर्म से 37 डिग्री सेल्सियस) के साथ पूरक आईएसएफ-1 माध्यम की एक और 100 मिलीलीटर जोड़ें, जिससे उन्हें 400 मिलीलीटर के निशान तक भर दिया जा सके।
    14. संस्कृति रोलर की बोतलें अब ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और25 राउंड/मिनट पर एक और सात दिनों के लिए ४०० एमएल संस्कृति युक्त ।
      नोट: इस सप्ताह के दौरान, संस्कृति बहुत घने हो जाता है (९५% घनत्व तक) और व्यवहार्यता कम हो जाती है (के रूप में छोटे रूप में ५०%), अधिकतम एंटीबॉडी रिलीज को सक्षम करने ।
  2. संस्कृति सुपरनेटेंट से αDEC-205 के शुद्धिकरण के लिए एनएलडीसी-145 सेल निलंबन (दोनों रोलर बोतलों से) सीधे 500 एमएल ऑटोक्लेवेड अपकेंद्री बोतलों में डालना।
    नोट: संस्कृति के 800 मिलीएल की कुल मात्रा एकत्र की जानी चाहिए।
    1. कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए 8,600 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए संस्कृति को सेंट्रलाइज करें।
    2. सुपरनेटेंट को इकट्ठा करें, छर्रों को त्यागें और एक बाँझ अभिजेंट बोतल में सुपरनेटेंट पूलिंग करें।
      नोट: αDEC-205 की शुद्धि तुरंत शुरू किया जा सकता है (चरण 2.) या सुपरनैंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. एनएलडीसी-145 सेल सुपरनैंट से αDEC-205 एंटीबॉडी का शुद्धिकरण

नोट: एनएलडीसी-145 सेल सुपरनैंट से, αDEC-205 को प्रोटीन जी सेफ्रॉज कॉलम (पुन: प्रयोज्य) का उपयोग करके शुद्ध किया गया है। कॉलम आयाम 15 मिमी x 74 मिमी हैं और 5 एमएल प्रोटीन जी सेफ्रॉस प्रति कॉलम पैक किए जाते हैं।

  1. प्रोटीन जी सेफरोज कॉलम की तैयारी और धुलाई के लिए प्रोटीन जी सेफरोज कॉलम के ऊपरी उद्घाटन पर एक एयरटाइट रबर प्लग डालें। दो बाँझ cannulas (20 जी x 1 1/2", 0.90 x 40 मिमी) के साथ रबर प्लग पंचर।
    1. एक 10 एमएल सिरिंज को दो कैनुलास में से एक और एक लचीली सिलिकॉन ट्यूब (लगभग 100 सेमी लंबी, 2.5 - 3 मिमी व्यास) को दूसरे कैनुला में ट्यूबिंग कनेक्टर के साथ कनेक्ट करें।
      नोट: सिरिंज/रबर प्लग निर्माण पुन: प्रयोज्य है और एक वैक्यूम प्रदान करता है जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन जी सेफरोज कॉलम के लिए संस्कृति सुपरनैंट की बड़ी मात्रा का निरंतर प्रवाह होता है । इस उद्देश्य के लिए, निम्नलिखित चरणों में निरंतर तरल प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज के प्लंजर को थोड़ा पीछे खींचें।
    2. किसी भी पिछले एंटीबॉडी शुद्धिकरण से संभावित शेष एंटीबॉडी को हटाने के लिए 0.1 एम हिमनद एसिटिक एसिड (पीएच 2) के 50 एमएल के साथ कॉलम धोएं। 0.1 एम हिमनदों एसिटिक एसिड (पीएच 2) भरा रिएजेंट बोतल में सिलिकॉन ट्यूब के अंत रखो। प्रेरित वैक्यूम के परिणामस्वरूप, 0.1 एम हिमनदों एसिटिक एसिड (पीएच 2) ड्रॉपवाइज के 50 एमएल प्रोटीन जी सेफेरोज कॉलम के माध्यम से चलते हैं।
      नोट: 0.1 एम हिमनदों एसिटिक एसिड (पीएच 2) को एक अभिकर् पना बोतल में संग्रहीत किया जाना चाहिए या एक बीकर में ताजा भरा जाना चाहिए।
    3. कॉलम को 100-200 एमएल फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) से धोएं। सिलिकॉन ट्यूब के अंत को पीबीएस से भरी रिएजेंट बोतल या बीकर में रखें। प्रोटीन जी सेफरोज कॉलम के माध्यम से 100-200 एमएल पीबीएस ड्रॉपवाइज चलाएं।
  2. एनएलडीसी-145 सुपरनेट से एंटीबॉडी शुद्धिकरण के लिए, कॉलम पर एनएलडीसी-145 सुपरनेट (चरण 1.2.2 से प्राप्त) के 800 एमएल लोड करें। सिलिकॉन ट्यूब के अंत को एनएलडीसी-145 सुपरनेट भरे रिएजेंट बोतल में रखें। कॉलम के माध्यम से 800 एमएल एनएलडीसी-145 सुपरनैंट रन ड्रॉपवाइज चलो।
    1. पीबीएस के 500 एमएल के साथ कॉलम धोएं। सिलिकॉन ट्यूब के अंत को पीबीएस से भरी रिएजेंट बोतल या बीकर में रखें। कॉलम के माध्यम से 500 एमएल पीबीएस ड्रॉपवाइज चलने दें।
    2. एल्यूशन के लिए, प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में 20 1.5 एमएल ट्यूब और पिपेट 100 माइक्रोन का उपयोग करें। कॉलम से एंटीबॉडी को एल्यूट करने के लिए प्रोटीन जी सेफ्रॉज कॉलम के ऊपरी कक्ष में 0.1 एम ग्लाइसिन (पीएच 3) के कॉलम और पिपेट 1 एमएल से रबर प्लग निकालें। तैयार 1.5 एमएल ट्यूबों में से एक में सीधे एल्यूएट के रूप में प्रवाह-माध्यम से एकत्र करें।
    3. सभी 20 ट्यूबों (1.5 एमएल) के लिए एल्यूशन चरण (2.2.2.) दोहराएं।
    4. एंटीबॉडी युक्त अंशों की पहचान करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम (ओडी280)पर सभी एल्यूशन अंशों के ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण करें।
      नोट: खाली के रूप में पहले एल्यूशन अंश का उपयोग करें।
    5. 0.5 (लगभग 10 अंश) से अधिक एक ओडी280 के साथ सभी अंशों को पूल करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% इथेनॉल से भरा प्रोटीन जी सेफरोज कॉलम स्टोर करें।
  3. 12 - 14 केडीए के आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग करके रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1000 मिलीएल पीबीएस (2000 मिलीएल बीकर में) के खिलाफ पूल किए गए एल्यूशंस को डायलाइज़ करें।
    1. डायलिसिस ट्यूबिंग को 20 सेमी के टुकड़ों में काट लें। संदूषण को दूर करने के लिए गर्म प्लेट का उपयोग करके एक बीकर में 30 मिनट के लिए 10 m EDTA (पीएच 7.5) के 500-800 मिलीलन में डायलिसिस ट्यूबिंग उबालें। 10 m EDTA (पीएच 7.5) समाधान त्यागें और 10 मिनट के लिए डिएकीकृत पानी में डायलिसिस ट्यूबिंग उबालें।
      नोट: डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग सीधे किया जा सकता है या अगले उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर0.01%सोडियम एजाइड (एनएएन 3)/एच2ओ समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. डायलिसिस ट्यूबिंग के नीचे एक उपयुक्त डायलिसिस ट्यूबिंग बंद करने/एकल टुकड़ा, टिका क्लैंप के साथ बंद करो और ध्यान से डायलिसिस ट्यूबिंग में एंटीबॉडी एल्यूशन पिपेट । दूसरे क्लैंप के साथ डायलिसिस ट्यूबिंग के शीर्ष को बंद करें।
    3. डायलिसिस ट्यूबिंग के ऊपरी क्लैंप को एक फ्लोटिंग स्टैंड पर ठीक करें, इसे पीबीएस से भरे बीकर में एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक साथ रखें और बीकर को चुंबकीय उभारकर पर रखें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सरगर्मी।
  4. αDEC-205 की एकाग्रता बढ़ाने के लिए, 10 केडीए MWCO के साथ एक अपकेंद्रित्र ध्यान देने वाले को पूरा डायलासेट लोड करें। टयूबिंग का एक क्लैंप खोलें और ध्यान से डायलिसिस ट्यूबिंग से पूरी तरह से डायलिसेट को सेंट्रलाइज्ड सांद्रता (10 केडीए एमडब्ल्यूसीओ) में पिपेट करें।
    नोट: पिपेट टिप के साथ ध्यान केंद्रित नीचे मत छुएं।
    1. 693 एक्स जी (2,000 आरपीएम) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    2. 693 x g (2,000 आरपीएम) और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और सेंट्रलाइज के 10 एमएल के साथ सेंट्रलाइज्ड सांद्रता लोड करें जब तक कि एंटीबॉडी सॉल्यूशन की अंतिम मात्रा 1-1.5 एमएल न हो जाए।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो 2.4.1 के अपकेंद्रित्र चरण को दोहराएं। वांछित राशि में समायोजित करने के लिए।
    3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, 280 एनएम (ओडी 280) पर केंद्रितαDEC-205 समाधान के ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण करें। पीबीएस को खाली के रूप में इस्तेमाल करें।
    4. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर αDEC-205 की एकाग्रता की गणना करें:
      एकाग्रता [mg/mL] = OD280/1.4।
    5. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर यूनिट का उपयोग करके αDEC-205 समाधान को फ़िल्टर करें।
      नोट: एनएलडीसी-145 हाइब्रिडोमा सेल सुपरनैटोशन से αDEC-205 का शुद्धिकरण एफपीएलसी (फास्ट प्रोटीन लिक्विड क्रोमेटोग्राफी) द्वारा भी प्राप्त किया जा सकता है। शुद्ध αDEC-205 को लंबे समय तक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -18 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. ओवी के रासायनिक संविलियन αDEC-205 के लिए

नोट: इष्टतम रासायनिक संवितीकरण के लिए 0.5 मिलीग्राम ओवी प्रोटीन से 2.5 मिलीग्राम αDEC-205 (1:5) का अनुपात आवश्यक है। हालांकि, यह अनुपात अन्य प्रोटीन और एंटीबॉडी के लिए भिन्न हो सकता है और वैकल्पिक conjugates के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है। ओवा प्रोटीन के डिसल्फाइड बांड में कमी 30 एमएम टीएम-एचसीएल के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से की जाती है, जो αDEC-205 और 240 माइक्रोन ऑफ टीएम 3.2 में रासायनिक संयुग्मण के लिए सल्फ्रीड्रिल-समूहों को उजागर करता है। दोनों कदम, टीएमईपी-प्रेरित ओवी (चरण 3.1.) की कमी और αDEC-205 (चरण 3.2.) के सल्फो-एसएमसीसी सक्रियण, अधिमानतः समानांतर रूप से किया जाना चाहिए।

  1. हौसले से एक 125 mM TCEP-HCl समाधान (पीएच 7.0) तैयार करते हैं। टीएमईपी-एचसीएल की वांछित राशि का वजन करें और 0.9 एम ट्राइस बेस (पीएच 8.8) में टीएमईपी-एचसीएल को भंग करें। 125 mM TCEP-HCl समाधान (जो तटस्थ होना चाहिए) के पीएच का परीक्षण करने के लिए पीएच संकेतक स्ट्रिप्स का उपयोग करें और ट्राई बेस (पीएच 8.8) के साथ पीएच समायोजित करें।
    1. पिपेट 200 माइक्रोन ओवा प्रोटीन समाधान (0.5 मिलीग्राम ओवी युक्त) 1.5 एमएल बाँझ ट्यूब में। 0.5 मिलीग्राम/ एमएल ओवा प्रोटीन और 30 एमएम टीएम बीएसईपी-एचसीएल (ओवीए/टीएम टीएम-एचसीएल) की अंतिम सांद्रता के लिए एक पिपेट का उपयोग करके ओवी प्रोटीन में 240 माइक्रोन 125 एमएम टीएमईईपी-एचसीएल और 560 माइक्रोनल बाँझ अल्ट्रापुरे पानी जोड़ें।
      नोट: 2.5 मिलीग्राम एंडोग्रेड ओवा (lyophilized) 1 एमएल पीबीएस में भंग होता है जिसके परिणामस्वरूप 2.5 मिलीग्राम/
    2. 1.5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर जिसके परिणामस्वरूप OVA/TCEP-HCl इनक्यूबेट ।
      नोट: इस इनक्यूबेशन कदम का विस्तार न करें।
  2. αDEC-205 को संयुग्मण के लिए सक्रिय करने के लिए, अल्ट्रापुरे पानी के 100 माइक्रोन में 2 मिलीग्राम सल्फो-एसएमसीसी को भंग करें।
    नोट: सल्फो-एसएमसीसी हाइड्रोलिसिस के लिए अतिसंवेदनशील है। इसलिए, बड़ी मात्रा में अविचलित सल्फो-एसएमसीसी को तेजी से संभाला जाना चाहिए या उपलब्ध 2 मिलीग्राम एलिकोट का उपयोग किया जाना चाहिए।
    1. पीबीएस में तनु αDEC-205 ताकि 2.5 मिलीग्राम 900 माइक्रोन में निहित हो।
    2. 1.5 मिली लीटर ट्यूब में αDEC-205 (900 माइक्रोल मात्रा; चरण 3.2.1.) और 100 माइक्रोन से सल्फो-एसएमसीसी (चरण 3.2 से प्राप्त) से प्राप्त मिश्रण करें, जिसके परिणामस्वरूप कुल मात्रा 1 मिली लीटर हो गई है।
    3. αDEC-205/sulfo-SMCC समाधान 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और एक हीटिंग ब्लॉक में 550 आरपीएम इनक्यूबेट।
  3. इन ऊष्मायनों के बाद, अतिरिक्त सल्फो-एसएमसीसी और टीसीईपी-एचसीएल को डेसाल्टिंग कॉलम (MWCO 7 kDa; 5 एमएल कॉलम वॉल्यूम) का उपयोग करके समाधानों से तुरंत हटा दिया जाता है।
    1. कॉलम (MWCO 7 kDa) नीचे बंद मोड़, टोपी ढीला और एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में कॉलम जगह है ।
    2. तरल को हटाने के लिए कमरे के तापमान पर 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    3. कॉलम को एक ताजा ट्यूब में रखें और टोपी हटा दें। धीरे-धीरे एंटीबॉडी/सल्फो-एसएमसीसी और ओवी/टीएमईपी-एचसीएल को क्रमशः एक-एक कॉलम के कॉम्पैक्ट राल बिस्तर के केंद्र में लोड करें ।
    4. कमरे के तापमान पर 1,000 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    5. उपयोग के बाद कॉलम को त्याग दें। एंटीबॉडी और ओवी युक्त समाधान संयोजित करने के लिए प्रिड ट्यूबों में हैं।
    6. तुरंत αDEC-205 और OVA के conjugation के लिए pipetting द्वारा दोनों समाधान मिश्रण।
    7. परिणामी αDEC-205 और ओवी मिश्रण को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. संयोजन के बाद, अतिरिक्त अनबाउंड ओवा को समाधान से हटा दिया जाता है और युग्मित αDEC-205/OVA एक अपकेंद्रित्र प्रोटीन सांद्रता (MWCO 150 kDa) का उपयोग करके केंद्रित है।
    1. कॉलम पर पीबीएस के 12 एमएल पाइपिंग और कमरे के तापमान पर 2,000 एक्स जी पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र प्रोटीन सांद्रता (MWCO 150 केडीए) को प्री-कुल्ला।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो अपकेंद्रित्र चरण (3.4.1.) दोहराएं जब तक कि लगभग 5 एमएल की मात्रा कॉलम से नहीं गुजरी हो।
    2. अपकेंद्रित्र प्रोटीन सांसेंटर पर αDEC-205/OVA लोड करने से पहले, पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए संयुक्त राष्ट्र केंद्रित αDEC-205/OVA के एक 20 μL नमूना बचाने के लिए । विश्लेषण तक इस एलिकोट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. αDEC-205/OVA को पाइपिंग करके अपकेंद्रित्र प्रोटीन सांसेंटर पर लोड करें।
      नोट: अपकेंद्रित्र ध्यानदाता के ऊपरी कक्ष के बिस्तर के साथ किसी भी संपर्क से बचें।
    4. पीबीएस के साथ 15 एमएल तक ध्यान दें और कमरे के तापमान पर 2,000 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए ध्यान केंद्रित करें।
    5. पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए प्रवाह के माध्यम से (प्रवाह के माध्यम से मैं) का एक नमूना बचाओ और शेष प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    6. पीबीएस के साथ 10 एमएल तक ध्यान दें और कमरे के तापमान पर 2,000 x ग्राम पर कम से कम 8 मिनट के लिए ध्यान केंद्रित करें।
    7. पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए दूसरे प्रवाह के माध्यम से (प्रवाह के माध्यम से द्वितीय) के लिए एक नमूना बचाओ और शेष प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    8. एक बार वांछित संवर्धन प्राप्त हो जाने के बाद (αDEC-205/OVA समाधान के लगभग 1.5 एमएल को ऊपरी कक्ष में छोड़ दिया जाना चाहिए) धीरे-धीरे केंद्रित नमूने को एस्पिरेट करें।
      नोट: यदि ऊपरी कक्ष में बहुत अधिक तरल पदार्थ छोड़ दिया जाता है, तो अपकेंद्रित्र दोहराया जा सकता है लेकिन जितना संभव हो उतना कम रखा जाना चाहिए।
  5. एक माइक्रोवोल्ट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके परिणामस्वरूप αDEC-205/OVA की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें। पीबीएस को खाली के रूप में इस्तेमाल करें।
  6. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर यूनिट का उपयोग करके αDEC-205/OVA को फ़िल्टर करें।
    नोट: बाद के विश्लेषण के लिए और वीवो प्रयोगों में, αDEC-205/OVA को 4 डिग्री सेल्सियस या -18 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. पश्चिमी दाग द्वारा रासायनिक संवत् का सत्यापन

नोट: सफल रासायनिक संवत् के सत्यापन के लिए, पश्चिमी दाग विश्लेषण या तो ओडब्ल्यूए (4.2) या αDEC-205 (4.10) का पता लगाया जाता है। ओवी (4.2.) या αDEC-205 (4.10.) का पता लगाने समानांतर में किया जाना चाहिए। एक कक्षीय मंच शेखर अधिमानतः पश्चिमी दाग झिल्ली के सभी इनक्यूबेशन कदमों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए संबंधित समाधान के एक समान वितरण की अनुमति है ।

  1. एसडीएस-पेज (सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रीमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) के लिए मानक 10% एसडीएस (सोडियम डोडेसिल सल्फेट) जैल तैयार करें।
  2. संयुग्म और संयुक्त राष्ट्र-संयुग्मित ओवी का पता लगाने और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाने के लिए एसडीएस-पेज के लिए नमूने तैयार करें।
    1. शुद्ध ओवी (उदाहरण के लिए, 200, 100 और 50 एनजी) युग्मित αDEC-205/OVA (जैसे, 200, 100 और 50 एनजी) की विभिन्न मात्रा को पतला करें 80, 70, 60, 50, 40 और 30 एनजी), संयुक्त राष्ट्र-संयुग्मित αDEC-205 (जैसे, 100 और 50 एनजी) का एक बहाना, संयुक्त राष्ट्र केंद्रित αDEC-205/OVA का एक नमूना 3.4.2 कदम से। (उदाहरण के लिए, 125 एनजी) और प्रवाह का एक एलिकोट-थ्िरुद्ध-1 और II (क्रमशः चरण 3.4.5. और 3.4.7.; वैकल्पिक) 4 एक्स गैर-कमिंग एसडीएस नमूना बफर में।
      नोट: संजूगेट और प्रोटीन की विभिन्न सांद्रता यह सुनिश्चित करने के लिए भरी जाती है कि दोनों मुक्त ओवी के साथ-साथ एक ही दाग पर संजूगेट का पता लगाया जा सकता है।
    2. एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट और 550 आरपीएम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने डिनेचर।
  3. नमूनों और एक प्रोटीन मानक को एसडीएस जेल में लोड करें और एसडीएस-पेज चलाएं।
  4. एसडीएस जेल से प्रोटीन के मानक ब्लॉटिंग को मेथनॉल-सक्रिय पीवीडीएफ (पॉलीविनाइलाइडन डिफ्लोराइड) झिल्ली (75 मिनट, 125 एमए) तक करें।
  5. ब्लॉटिंग के बाद, झिल्ली को एक उपयुक्त पकवान में डालें और झिल्ली युक्त पकवान में बफर को अवरुद्ध करते हुए 4% भोजन प्रतिस्थापन शेक पाउडर/टीबीएस-टी (ट्रिस-बफर नमकीन/0.1% ट्वीन 20) के 25 एमएल को पाइपिंग करके झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    1. कमरे के तापमान पर 60 मिनट या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर अवरुद्ध समाधान में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  6. अवरुद्ध समाधान को त्यागें और खरगोश αOVA प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को 2% भोजन प्रतिस्थापन शेक पाउडर/टीबीएस-टी एंटीबॉडी बफर (कमजोर पड़ने 1:3,000) में पकवान में झिल्ली के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 15 एमएल को पाइपिंग करके दाग दें।
    1. कमरे के तापमान पर 45 मिनट या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली को इनक्यूबेट करें (प्लेटफ़ॉर्म शेकर का उपयोग करें)।
  7. एंटीबॉडी समाधान को त्यागें और पकवान में झिल्ली धोएं (प्लेटफ़ॉर्म शेकर का उपयोग करें)।
    1. झिल्ली में टीबीएस-टी का 25 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। समाधान को त्याग दें।
    2. टीबीएस-टी/05 एम एनएसीएल की 25 एमएल झिल्ली में डालें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें । समाधान को त्याग दें।
    3. टीबीएस-टी/05% ट्राइटन एक्स-100 की 25 एमएल झिल्ली में डालें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। समाधान को त्याग दें।
    4. झिल्ली में टीबीएस-टी का 25 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। समाधान को त्याग दें।
  8. 2% भोजन प्रतिस्थापन शेक पाउडर/टीबीएस-टी एंटीबॉडी बफर (कमजोर 1:2,000) में बकरी αrabbit-IgG-HRPO (घोड़ा मूली पेरोक्सिडाज) माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को दाग दें।
    1. कमरे के तापमान पर 45 मिनट या रात भर के लिए झिल्ली को 4 डिग्री सेल्सियस (मंच शेखर पर) में इनक्यूबेट करें।
  9. पग 4.7.1.- 4.7.4 में वर्णित झिल्ली को फिर से धोएं। मंच शेखर का उपयोग करना। इस झिल्ली के लिए, अगले चरण 4.16 के साथ जारी है। (निम्नलिखित चरण 4.10.- 4.15. (αDEC-205 का पता लगाना) चरण 4.2.- 4.9.) के समानांतर किया जा सकता है।
  10. एसडीएस-पेज के लिए αDEC-205 का पता लगाने के लिए नमूने तैयार करें और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं।
    1. αDEC-205/OVA की विभिन्न मात्रा में पतला (उदाहरण के लिए, 200, 100 और 50 एनजी), संयुक्त राष्ट्र के संयुग्मित αDEC-205 (जैसे, 250, 125, 62.5 एनजी), शुद्ध ओवा (जैसे, 80 और 70 एनजी), कदम 3.4.2 से संयुक्त राष्ट्र केंद्रित αDEC-205/OVA का एक नमूना। (उदाहरण के लिए, 125 एनजी) और प्रवाह का एक एलिकोट-थ्िरुद्ध-1 और II (क्रमशः चरण 3.4.5. और 3.4.7.; वैकल्पिक) 4 एक्स गैर-कमिंग एसडीएस नमूना बफर में।
    2. एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट और 550 आरपीएम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूने डिनेचर।
  11. नमूनों और एक प्रोटीन मानक को एसडीएस जेल में लोड करें और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं।
  12. एसडीएस जेल से प्रोटीन के मानक ब्लॉटिंग को मेथनॉल सक्रिय पीवीडीएफ (पॉलीविनाइलाइडन डिफ्लोराइड) झिल्ली (75 मिनट, 125 एमए) तक करें।
  13. ब्लॉटिंग के बाद, झिल्ली को एक उपयुक्त पकवान में डालें और झिल्ली युक्त पकवान में 10% अवरुद्ध बफर (मिल्क पाउडर/टीबीएस-टी) के 25 एमएल को पाइपिंग करके झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    नोट: अवरुद्ध समाधान αDEC-205 और OVA का पता लगाने (चरण 4.5.) के बीच भिन्न होते हैं।
    1. कमरे के तापमान पर 60 मिनट या रात 4 डिग्री सेल्सियस (प्लेटफ़ॉर्म शेकर का उपयोग करके) में अवरुद्ध समाधान में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  14. अवरुद्ध समाधान को त्यागें और बकरी के साथ झिल्ली को दाग दें-आईजीजी (एच +एल) - एचआरपीओ एंटीबॉडी में 5% मिल्क पाउडर/टीबीएस-टी एंटीबॉडी बफर (कमजोर पड़ने 1:5,000) डिश में झिल्ली के लिए एंटीबॉडी समाधान के 15 एमएल को पाइपिंग करके।
    नोट: एंटीबॉडी बफ़र्स αDEC-205 का पता लगाने और OVA का पता लगाने के बीच अलग है (कदम 4.6./
    1. कमरे के तापमान पर 45 मिनट या रात 4 डिग्री सेल्सियस (मंच शेखर का उपयोग करके) में झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  15. पग 4.7.1.- 4.7.4 में वर्णित डिश में झिल्ली को अच्छी तरह धोएं। (प्लेटफ़ॉर्म शेकर का उपयोग करें)।
  16. एचआरपी सिग्नल विकसित करने और एक्स-रे फिल्म का उपयोग करके या इमेजिंग सिस्टम के माध्यम से अंधेरे कमरे में केमिल्यूमिनेसेंस का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त डिटेक्शन रिएजेंट का उपयोग करें।

5. एलिसा द्वारा रासायनिक संवितरण का सत्यापन

  1. सफल रासायनिक संवितीकरण के आगे सत्यापन के लिए एलिसा का प्रदर्शन करें जिसके परिणामस्वरूप αDEC-205/OVA ।
  2. कोट 100 μL के साथ एक उपयुक्त 96-अच्छी तरह से एलिसा प्लेट/
    1. थाली को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. कोटिंग के बाद, पीबीएस के साथ तीन बार प्लेट धोएं, उदाहरण के लिए, एलिसा वॉशर का उपयोग करके।
  4. प्लेट के प्रत्येक कुएं में बफर (पीबीएस में 10% एफसीएस) को अवरुद्ध करने के 200 माइक्रोन को पाइप करके प्लेट को ब्लॉक करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  5. धारावाहिक पतला αDEC-205/OVA (कदम 3.6 से प्राप्त.) 1:2 बफर अवरुद्ध करने में (PBS में 10% FCS) 6 μg से लेकर कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए /एमएल नीचे ९३.८ एनजी/mL αDEC-205/OVA और १०० μL/अच्छी तरह से αDEC-205/OVA की इन घटती मात्रा के कुओं में जोड़ें ।
    1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट।
  6. पीबीएस के साथ तीन बार प्लेट धोएं, उदाहरण के लिए, एलिसा वॉशर का उपयोग करके।
  7. बकरी के 100 माइक्रोन जोड़ें-IgG +IgM (H+L)- HRPO एंटीबॉडी (बफर अवरुद्ध करने में 1:2,000 से पतला (PBS में 10% FCS)) थाली के प्रत्येक कुएं के लिए ।
    1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  8. पीबीएस का उपयोग करके प्लेट को तीन बार धोएं, उदाहरण के लिए एलिसा वॉशर का उपयोग करना।
  9. कुओं में एचआरपीओ-सब्सट्रेट के 50 माइक्रोन जोड़ें। स्पष्ट रंग प्रतिक्रिया देखते समय, 150 माइक्रोन स्टॉपिंग समाधान (1M H2एसओ4)प्रति अच्छी तरह से जोड़ के माध्यम से प्रतिक्रिया को रोकें।
  10. 5 मिनट के बाद, एक एलिसा रीडर का उपयोग कर 450 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर ओडब्ल्यूए प्रोटीन के लिए αDEC-205 के रासायनिक conjugation आम तौर पर वीवो डीसी लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण में के लिए αDEC-205/OVA की कुशल पीढ़ी की अनुमति होगी। तकनीक को सत्यापित करने और मिले हुए संजूगेट की कार्यक्षमता का परीक्षण करने के लिए अलग-अलग रणनीतियां हैं। पश्चिमी दाग विश्लेषण और एलिसा का उपयोग सफल संवत् को सत्यापित करने के लिए किया जाता है और साथ ही संभावित रूप से बाएं मुक्त ओवी(चित्रा 2)का पता लगाया जाता है। इन विट्रो बाध्यकारी अध्ययन(चित्रा 3)और वीवो प्रतिरक्षण(चित्रा 4)में डीईसी-205 और डीसी के लक्ष्यीकरण के लिए संयुग्म के बाध्यकारी की पुष्टि करते हैं।

समानांतर पश्चिमी दाग विश्लेषण दोनों संयुग्मित OVA(चित्रा 2A)के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संयुग्मित αDEC-205(चित्रा 2B)का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । विशेष रूप से, दाग में एंटीबॉडी के आणविक वजन के स्तर पर OVA के लिए सकारात्मक संकेत OVA और एंटीबॉडी(चित्रा 2A)के सहयोग की पुष्टि करता है । इसके अलावा, पश्चिमी दाग विश्लेषण में OVA के लिए धुंधला अतिरिक्त मुक्त OVA संभवतः अभी भी αDEC-205/OVA के बगल में मौजूद का पता लगाने की अनुमति देता है कदम 3.6 में मिले.6., जो दाग के लिए मामला नहीं है(चित्रा 2A)। यदि बड़ी मात्रा में मुफ्त ओवी का पता लगाया जाता है, तो चरण 3.4.1। 3.4.8 करने के लिए। प्रोटोकॉल की पुनरावृत्ति की जानी चाहिए। ओवा के लिए धुंधला करने के पूरक(चित्रा 2 ए),पश्चिमी दाग विश्लेषण में αDEC-205 के लिए धुंधला "नग्न" αDEC-205 और संजूबा के बीच आणविक वजन में वृद्धि के माध्यम से सफल संयोजिका की पुष्टि करता है जैसा कि चित्र 2 बीमें दिखाया गया है।

पश्चिमी ब्लॉटिंग के बगल में, एक विशिष्ट एलिसा भी ओडब्ल्यूए को αDEC-205 के सफल संवत् के सत्यापन की अनुमति देता है। हालांकि, पश्चिमी दाग विश्लेषणों के विपरीत, यह एलिसा स्वतंत्र और संयुक्त राष्ट्र-संयुग्मित αDEC-205 या OVA का पता लगाने की अनुमति नहीं देता है। परख सेटअप(चित्रा 2C) केकारण, एक सकारात्मक संकेत केवल तभी उत्पादित किया जाता है जब संयुग्मण कुशल था। पता चला संकेत (४५० एनएम पर अवशोषण) और प्रोटीन की विश्लेषण राशि के बीच सकारात्मक संबंध रासायनिक conjugation के माध्यम से αDEC-205/OVA की सफल पीढ़ी की पुष्टि के रूप में चित्रा 2 डीमें दिखाया गया है । इसके साथ ही, αDEC-205/OVA conjugate के ९.३८ एनजी से पहले से ही मिले सकारात्मक संकेत इस विधि(चित्रा 2D)की मजबूत संवेदनशीलता को दर्शाता है । यदि संजूगेट की मात्रा में वृद्धि के लिए सोखने में कोई वृद्धि नहीं हुई है, तो संजीदा संभवतः सफल नहीं हुआ था। इस मामले में, पश्चिमी दाग विश्लेषणों से नकारात्मक परिणाम भी प्राप्त होंगे, यानी ओडब्ल्यूए के लिए दाग वाले दाग में संजूगेट का कोई पता नहीं लगाना और αDEC-205 के लिए दाग दाग दाग में आणविक वजन में कोई वृद्धि नहीं।

जबकि पश्चिमी दाग और एलिसा परख का उपयोग संयुग्मण और मुक्त एंटीजन को हटाने का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है, बाद में कार्यात्मक विश्लेषण दिसंबर-२०५ और डीसी के लक्ष्यीकरण के लिए बाध्यकारी की पुष्टि करने की जरूरत है । इस उद्देश्य के लिए, हमने इन विट्रो बाइंडिंग स्टडीज(चित्र 3)और वीवो प्रतिरक्षण(चित्र 4)में प्रदर्शन किया है। इन प्रयोगों के लिए, महिला 6-8 सप्ताह C57BL/6 और 8-12 सप्ताह Balb/c चूहों वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया या संक्रमण अनुसंधान के लिए Helmholtz केंद्र (HZI) की पशु सुविधा में नस्ल और विशिष्ट रोगजनक मुक्त शर्तों के तहत रखे गए थे । चित्रा 3 αDEC-205 और HCV कोर प्रोटीन (αDEC-205/कोर) के एक conjugate के बाध्यकारी के लिए कार्यात्मक परख को दर्शाता है CD11c+ कोशिकाओं में विट्रो। फ्लो-साइटोमेट्री ने स्पष्ट रूप से अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न CD11c+ कोशिकाओं(चित्रा 3A,B)के साथ-साथ हौसले से अलग माउस CD11c+ splenocytes (डेटा नहीं दिखाया गया) को कुशलतापूर्वक बांधने के लिए αDEC-205/कोर दिखाया । ये परख रासायनिक संयुग्मण को प्रदर्शित करता है कि वह αDEC-205 की बाध्यकारी क्षमता में हस्तक्षेप न करे। इसकी पुष्टि इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण द्वारा की जाती है जिसमें αDEC-205/कोर के एमएचसी-II+ सीडी11सी+ कोशिकाओं को इन विट्रो जनित बोन-मैरो व्युत्पन्न डेन्ड्रिटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी)(चित्रा 3सी)से हल किया जाता है ।

अतीत में, हमने चूहों में वीवो में ओवीए-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को कुशलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए प्रदर्शन प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित αDEC-205/OVA संयुग्म को दिखाया है, जो संयुग्म की सफल पीढ़ी के साथ-साथ डीसी(चित्रा 4)12, 14के कार्यात्मक लक्ष्यीकरण की पुष्टि करता है। विशेष रूप से, αDEC-205/OVA के साथ चमड़े के नीचे टीकाकरण कुशलता से विनोदी और सेलुलर OVA विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं प्रेरित । महत्वपूर्ण बात, एक recombinant adenovirus चैलेंज मॉडल में हमने वायरस संक्रमित हेपेटोसाइट्स को नष्ट करने में सक्षम एंटीवायरल सीडी 8+ टी कोशिकाओं का पता लगाया, जिसमें हेपेटोट्रोपिक वायरस12पर निर्देशित टीकों के लिए मजबूत निहितार्थ हैं। इसके अलावा, एंटीजन-विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं का अत्यधिक प्रभावी प्रेरण एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा के वीवो प्राइमिंग में इस दृष्टिकोण की क्षमता को रेखांकित करता है। इसके अलावा, हम सफलतापूर्वक परीक्षण और वीवो डीसी 14 लक्ष्यीकरण में के संदर्भ में विभिन्न adjuvants की तुलना करने के लिएαDEC-205/OVAका इस्तेमाल किया है । αDEC-205/OVA के साथ टीकाकरण में एक साथ adjuvant संयोजन पाली (I:C) (पॉलीनोसिनिक-पॉलीसाइटिडिलिक एसिड) और सीपीजी (सिंथेटिक ओलिगोडेऑक्सीन्यूक्लियटॉट) बिना स्टाइल वाले सीपीजी रूपांकनों वालेाइड्स) हमने आम तौर पर(चित्रा 4A)और कुछ समय के लिए देखा-अंक अकेले ओवी(चित्रा 4B)के साथ टीकाकरण की तुलना में काफी अधिक OVA-विशिष्ट आईजीजी स्तर। इसके अलावा, αDEC-205/OVA कुशलता से OVA-विशिष्ट CD4+ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रियाओं(चित्रा 4C,डी)और αDEC-205/OVA प्रेरित सीडी 8+ टी सेल प्रतिक्रिया काफी अधिक है कि अकेले OVA द्वारा प्रेरित(चित्रा 4D)प्रेरित ।

Figure 1
चित्रा 1:αDEC-205 और OVA के रासायनिक conjugation के मॉडल। पहले कदम में, αDEC-205 का प्राथमिक अमीन क्रॉसलिंकर सल्फो-एसएमसीसी के एनएचएस एस्टर के साथ प्रतिक्रिया करता है जिसके परिणामस्वरूप मालेमाइड सक्रिय αDEC-205 होता है। टीएमईपी-एचसीएल के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से ओवीए प्रोटीन के डिसल्फाइड बांड की कमी के बाद, मलीमाइड सक्रिय αDEC-205 ΑCEP-HCl-कम OVA प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए αDEC-205/OVA एंटीबॉडी/एंटीजन conjugate फार्म । संक्षिप्त नाम: एन-हाइड्रोक्सीसुसिनिमाइड एस्टर (एनएचएस एस्टर); सल्फोसुसिनिमिडिल 4-[एन-मालेमिडोमेथिल]साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट (सल्फो-एसएमसीसी); ट्रिस (2-कार्बोक्सीसेथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड (टीएमईपी-एचसीएल)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:रासायनिक रूप से संयुग्मित αDEC-205/OVA का सत्यापन । αDEC-205 और ओडब्ल्यूए प्रोटीन के प्रभावी रासायनिक संवत् को सत्यापित करने के लिए, पश्चिमी दाग विश्लेषण(ए, बी)और एलिसा(सी, डी)किया जाता है। αDEC-205/OVA के नमूने, αDEC-205 और ओएवी प्रोटीन की विभिन्न सांद्रता एसडीएस-पेज (10%) और बाद में पश्चिमी दाग विश्लेषण के अधीन थे जो एक खरगोश αOVA प्राथमिक एंटीबॉडी और एक बकरी αrabbit-IgG-HRPO माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करनेके लिए OVA प्रोटीन(ए)या एक बकरी αrat-IgG (एच + L)) का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी (ग)αDEC-205/OVA conjugate के सत्यापन के लिए एलिसा का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । खरगोश αOVA कोटिंग एंटीबॉडी संयुग्मित OVA के माध्यम से αDEC-205/OVA बांधता है । बकरी αrat-IgG (H +L)- HRPO बाध्य conjugate के αDEC-205 अंश को पहचानता है और एक सकारात्मक संकेत इस प्रकार प्रभावी संजूगेशन की पुष्टि करता है। (घ)एलिसा में वर्णित(सी)के रूप में किया गया था । αDEC-205/OVA (600 एनजी से 9.38 एनजी) के क्रमिक रूप से पतला मात्रा (1:2) का विश्लेषण किया गया। डेटा को प्रतिनिधि परख के ट्रिपलिट्स के मतलब के रूप में दिखाया गया है। संक्षिप्त नाम: एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्ब्रेंट परख (एलिसा); घोड़ा मूली पेरोक्सिडेस (एचआरपीओ); ओवलबुमिन (ओवा); सोडियम डॉडेकाइल सल्फेट पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज)। पैनल ए और बी को वोल्कमार एट अल12से संशोधित किया गया है । http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह-साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) के लिए αDEC-205/कोर का बाध्यकारी । αDEC-205/कोर की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए अपने लक्ष्य अणु DEC-205 को विट्रो मेंबीएमडीसी पर बांधने के लिए,   फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) विश्लेषण(ए, बी)और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी(सी)का प्रदर्शन किया गया। संक्षेप में, बोन मैरो कोशिकाओं को मादा बाल्ब/सी चूहों (एन = 3) 8-12 सप्ताह की आयु और आरपीएमआई माध्यम में सुसंस्कृत के पिछले पैरों से अलग किया गया था, जिसमें 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमामाइसिन, 1% ग्लूटामाइन, ०.२५ एमएम मर्केप्टोथेन और 5 एनजी/एमएलए जीएम-सीएसएफ (ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफागे उत्तेजक कॉलोनी फैक्टरिंग फैक्टरिंग) के साथ पूरक किया गया था । 6 दिन, गैर-अनुयायी बीएमडीसी को सावधानीपूर्वक काटा गया था और बाध्यकारी विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। (A,B) इन विट्रो जनित बीएमडीसी को 10 μg/mL αDEC-205/कोर, αDEC-205 या मध्यम (नियंत्रण) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेटेड किया गया था और इसके बाद एपीसी-लेबल αCD1c [क्लोन HL3] के साथ धुंधला किया गया । बीएमडीसी की सतह पर बाध्य αDEC-205/कोर का पता लगाने के अतिरिक्त या तो पीई लेबल बकरी αrat(A)या माउस αHCV कोर [क्लोन C7-50] के साथ कोशिकाओं के धुंधला द्वारा किया गया था माध्यमिक αmouse-IgG1-पीई धुंधला(बी)के बाद । प्रतिनिधि हिस्टोग्राम गेटेड सीडी 11सी+ कोशिकाओं के पीई सिग्नल और% पीई-पॉजिटिव कोशिकाओं को दिखाते हैं। (ग)भोले बाल्ब/सी चूहों से विट्रो में उत्पन्न बीएमडीसी को एमएचसी-II+ और सीडी 11सी+ कोशिकाओं के लिए छांटा गया था और उन्हें 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 माइक्रोन/एमएल αDEC-205/कोर के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । सेल-बाउंड αDEC-205/कोर एलेक्सा ५९४-युग्मित αrat-IgG के साथ या माउस αHCV कोर [क्लोन C7-50] और एलेक्सा ४८८-युग्मित αmouse-IgG के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए धोने के बाद दाग था । कोशिकाओं को इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (स्केल बार = 20 माइक्रोन) द्वारा कल्पना की गई थी। αDEC-205/कोर की बाध्यकारी क्षमता बीएमडीसी के लिए दोनों धुंधला (डबल सकारात्मक = नारंगी) के एक ओवरले द्वारा पुष्टि की गई थी । संक्षिप्त रूप: अस्थि-मज्जा व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाएं (बीएमडीसी); फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS); ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ); हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:OVA-विशिष्ट विनोदी और सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं αDEC-205/OVA के साथ प्रतिरक्षण के बाद । वीवो में डीसी को लक्षित करने के लिए αDEC-205/OVA की कार्यक्षमता प्रतिरक्षण प्रयोगों के माध्यम से साबित हुई थी जैसा कि पहले वोल्कमार एट अल12में प्रकाशित हुआ था । संक्षेप में, महिला 6-8 सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों (n = 5) 0 दिन पर चमड़े के नीचे प्रतिरक्षित किया गया, 14 और 28 के साथ 30 μg αDEC-205/OVA adjuvants ५० μg पाली (I: C)/५० μg CpG, 30 μg αDEC-२०५ अकेले या 7 μg OVA प्रोटीन अकेले ५० μL PBS प्रति पशु की कुल मात्रा में के साथ मिलकर संयोजित । इसके अलावा नियंत्रण अकेले पीबीएस के साथ इलाज किया गया । (A,B) विनोदी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए, टीका लगाए गए चूहों को आइसोफ्लाणे साँस लेने के माध्यम से हल्के से एनेस्थेटाइज्ड किया गया था और 0, 13 और 27 दिन और कार्डियक पंचर द्वारा दिन 42 पर रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस से रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। सेरा को एलिसा12द्वारा ओवी-विशिष्ट आईजीजी की उपस्थिति के लिए वर्णित और परख के रूप में तैयार किया गया था । एंडपॉइंट टाइटर्स को पिछले सीरम कमजोर पड़ने के पारस्परिक मूल्य के रूप में व्यक्त किया गया था जो नकारात्मक नियंत्रणों के मूल्यों से दो गुना ऊपर एक अवशोषण प्राप्त करता था। परिणाम तीन स्वतंत्र प्रयोगों से संकलित किए जाते हैं। (A)ओवी-विशिष्ट कुल सीरम आईजीजी टाइटर्स का काइनेटिक समूह के रूप में दिखाया गया है । (ख)OVA-विशिष्ट IgG टाइटर दिन 27 और दिन ४२ पर व्यक्तिगत चूहों के लिए एक साथ समूह मतलब के साथ दिखाया गया है । आंकड़े: दो तरफा टी-टेस्ट की अप्रूव्ड । (C,D) सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रेरण एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट स्पॉट (ELISPOT) परख द्वारा विश्लेषण किया गया था ४२ दिन पर मुरीन IFNγ का पता लगाने किट का उपयोग कर के रूप में पहलेप्रकाशित 12। प्रतिरक्षित चूहों से अलग splenocytes प्रयोगात्मक समूहों के लिए जमा किया गया और IFNγ स्थान बनाने इकाइयों कीसंख्या/10 6 कोशिकाओं के साथ उत्तेजना के बाद 5 मिलीग्राम/mL CD4+ (C)या या CD8+ OVA पेप्टाइड(डी)का विश्लेषण किया गया था (ओए पेप्टाइड्स: सीडी4 323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) और सीडी8 257-264 (SIINFEKL)) । बार्स ± एसईएम (एन = 5, पूल किए गए नमूनों से ट्रिपलिकेट्स) के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकी: डंनेट के कई तुलना परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001)। संक्षिप्त नाम: साइटोसाइन-फॉस्फेट-ग्वानाइन ओलिगोन्यूक्लियोटाइड सीक्वेंस (सीपीजी), एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा), एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट स्पॉट (एलिस्पॉट), ओवलबू मिनिन (ओवा), फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), पॉलीनोसिनिक-पॉलीसाइटिडिलिक एसिड (पॉली (आई: सी)) । इस आंकड़े को वोल्कमार एट अल12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर-विशिष्ट एंटीबॉडी और प्रोटीन एंटीजन का रासायनिक संयुग्मण एक कुशल और महत्वपूर्ण बात यह है कि प्री-क्लीनिकल माउस मॉडल में वीवो डीसी लक्ष्यीकरण के लिए लचीला दृष्टिकोण भी प्रदान करता है। हमारे प्रोटोकॉल के साथ हम एक DEC-205-विशिष्ट आईजीजी एंटीबॉडी के लिए मॉडल एंटीजन ओए के सफल संवर्जन के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।

हमारे प्रोटोकॉल में, αDEC-205 एक हाइब्रिडोमा सेललाइन से शुद्ध है और अतीत में, हमने वर्णित प्रोटीन जी सेफ्रॉज का उपयोग करके एंटीबॉडी को शुद्ध किया है। ध्यान दें, हमने बाद के अध्ययनों में αDEC-205 को शुद्ध करने के लिए एफपीएलसी का भी उपयोग किया है और बाद में रासायनिक संजीदगी इसी तरह कुशल थी। कुशल रासायनिक संयोजण के लिए महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी और प्रोटीन दोनों का भड़काना है। हमने इन चरणों को विभिन्न उपलब्ध प्रोटोकॉलों से अनुकूलित किया है ताकि अंततः क्रॉसलिंकर सल्फो-एसएमसीसी के साथ एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन प्रदर्शन किया जा सके और टीएमईपी-एचसीएल के माध्यम से प्रोटीन की कमी की जा सके । विशेष रूप से, इस बिंदु पर महत्वपूर्ण कदम टीसीईपी-एचसीएल (चरण 3.1.) की ताजा तैयारी और प्रोटीन के साथ टीसीईपी-एचसीएल के इनक्यूबेशन की अवधि है, जिसे बढ़ाया नहीं जाना चाहिए (चरण 3.1.2.)। इसके अलावा, टीएमईपी-एचसीएल के माध्यम से डिसल्फाइड बांड को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन बफर महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह टीएमईपी-एचसीएल द्वारा कमी को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, संजुर्गन के लिए इष्टतम प्रतिक्रिया की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए सक्रिय एंटीबॉडी और कम प्रोटीन (चरण 3.3.6.) को तुरंत मिलाना महत्वपूर्ण है। हमारे हाथ में, इस दृष्टिकोण conjugation के बारे में सबसे कुशल और विश्वसनीय परिणाम मिले । वीवो दृष्टिकोण में बाद के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम αDEC-205/OVA conjugate से अनबाउंड OVA को हटाने है । इस कदम को सत्यापित करने के लिए, हमने पश्चिमी दाग विश्लेषणों को अनुकूलित किया है और दोनों संयुग्मित αDEC-205 के साथ-साथ संयुग्मित ओवी प्रोटीन(चित्र 2 ए और बी)का पता लगाने की सिफारिश की है। यदि अनबाउंड ओवी अंतिम संजूगेट समाधान में मौजूद है, तो ओडब्ल्यूए की ज्ञात सांद्रता को ब्लोटिंग और डिटेक्ट करने में मदद मिलेगी (जैसा कि चित्रा 2 एमें है) एसडीएस-पेज के लिए लोड किए गए प्रोटीन की कुल मात्रा के संबंध में अनबाउंड ओवी की मात्रा का अनुमान लगाने में मदद करेगा। यदि संजीदशन अक्षम था, तो समस्या निवारण को संयोजिका के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीजन/एंटीबॉडी अनुपात को संबोधित करना चाहिए । यदि एलिसा द्वारा पता लगाया गया था, लेकिन पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है, तो हमने पश्चिमी दाग विश्लेषणों (कदम 4.6.6., 4.8., 4.14.) सबसे महत्वपूर्ण कारक में एंटीबॉडी सांद्रता का अनुभव किया है।

हमारे दृष्टिकोण की मुख्य सीमा एक समय में अलग-अलग संयोजन दक्षता है जिसमें एंटीबॉडी अणुओं की संख्या और युग्मित प्रोटीन की मात्रा के बीच कोई निश्चित संबंध नहीं है। फिर भी, हम मानते हैं और अनुभव किया है कि प्रदर्शन प्रोटोकॉल मज़बूती से डीसी के वीवो अध्ययन में बाद में अनुमति देता है कि उपज प्रजनन योग्य परिणाम लक्षित। इसके अलावा, जबकि सैद्धांतिक रूप से हमारे प्रोटोकॉल में दोनों αDEC-205 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से OVA प्रोटीन वैकल्पिक एंटीबॉडी और एंटीजन के लिए विभिन्न हितों के वीवो अध्ययन में विमर्श किया जा सकता है, रासायनिक conjugation के व्यक्तिगत कदम नए घटकों के लिए नए अनुकूलित होने की आवश्यकता होगी। यह मुख्य रूप से इष्टतम एंटीबॉडी/एंटीजन अनुपात पर लागू होता है और इसलिए कम सीवाई अवशेषों की पहुंच पर निर्भर कर सकता है। हमारे दृष्टिकोणों में, सफल संवजन प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप इष्टतम अनुपात ओवी के लिए αDEC-205 और 1.35:1 के लिए एचसीवी प्रोटीन NS3 (गैर-संरचना प्रोटीन 3) और कोर से αDEC-205 तक थे। प्रत्येक संजूगेट के लिए, क्रॉसलिंकर या एंटीबॉडी की एंटीजन बाध्यकारी क्षमता पर इस तरह के संविलियन के नकारात्मक प्रभावों को बाहर रखने की आवश्यकता है। ध्यान दें, इस संबंध में पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन के बजाय इम्यूनोजेनिक पेप्टाइड्स का संजीदशन कम समस्याग्रस्त है। हालांकि, प्रोटीन बाद में प्रतिरक्षण में उच्च एंटीजन विविधता प्रदान करते हैं। आनुवांशिक संलयन दृष्टिकोण रासायनिक संवजन का विकल्प प्रदर्शित करते हैं और इसके स्पष्ट लाभ भी होते हैं1. अंततः, डीसी लक्ष्यीकरण के लिए एंटीबॉडी और एंटीजन को जोड़ने की रणनीति का विकल्प संसाधनों, अनुसंधान फोकस और conjugates के प्रत्याशित अनुप्रयोगों पर निर्भर करेगा । हमारा मानना है कि एंटीबॉडी और एंटीजन के बारे में सापेक्ष लचीलापन रासायनिक संयायंपन का एक बड़ा लाभ प्रदर्शित करता है और हम वास्तव में हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी)(चित्रा 3 और डेटा नहीं दिखाया गया) के विभिन्न प्रोटीन के लिए αDEC-205 के कुशल रासायनिक conjugation के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है।

कुल मिलाकर, हमारा मानना है कि एंडोसाइटोसिस-रिसेप्टर विशिष्ट एंटीबॉडी के रासायनिक संयुग्मण प्रोटीन एंटीजन जैसे कि αDEC-205/OVA में, डीसी लक्ष्यीकरण दृष्टिकोणों का अध्ययन करने में असाधारण मूल्य के एंटीबॉडी/एंटीजन conjugates उत्पन्न करने के लिए एक लचीला और विश्वसनीय उपकरण प्रदर्शित करता है, जिसमें विशेष रूप से प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में एंटीट्यूयर एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा के रूप में लक्ष्य रखने वाले लोग भी शामिल हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए एस प्रीटिन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को हेल्महोल्ट्ज एसोसिएशन ऑफ जर्मन रिसर्च सेंटर्स (एचजीएफ) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था जिसे हेल्महोल्ट्ज़ एलायंस 'इम्यूनोथेरेपी ऑफ कैंसर' (HCC_WP2b) के हिस्से के रूप में प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody buffer 2 % 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 % 5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA) 10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 % 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 % 10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25 Greiner Bio-One 690175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75 Greiner Bio-One 658175 we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175 Greiner Bio-One 661175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa Sartorius VS2001 Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml Thermo Fisher Scientific 88532 Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottles Nalgene 525-2314 PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA) 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa Thermo Fisher Scientific 89891 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate) Sigma-Aldrich/Merck T8665-100ML 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate) Roche/Merck 12 015 200 01 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa SERVA Electrophoresis 44110 Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate Thermo Fisher Scientific 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum PAN-BIOtech P40-47500 FBS Good forte
ISF-1 medium Biochrom/bioswisstec F 9061-01
milk powder Carl Roth T145.2 powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma ATCC HB-290 if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x  for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin Hyglos (via BioVendor) 321000 EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles Nunc In Vitro 734-2394 standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator strips Merck 109535 pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  112-035-062 obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA) Jackson ImmunoResearch  112-035-068 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  111-035-045  obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA) Abcam ab181688 used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) OriGene R1101 used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column Merck/Millipore P3296 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane Merck/Millipore IPVH00010 immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug Omnilab 5230217 DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube Omnilab 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA) 1M H2SO4
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific 22322 Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm  Merck/Millipore SLGV033RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 ml Omnilab Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas B. Braun Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl Thermo Fisher Scientific A35349
tubing connector Omnilab Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 168 डेंड्रिटिक सेल टारगेटिंग डेंड्रिटिक कोशिकाएं डीईसी-205 एंटीजन डिलीवरी एंटीजन कंजुगेशन केमिकल कंजूगेशन एंटीबॉडी-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस टीकाकरण एंटीट्यूमर इम्युनिटी
एक शुद्ध DEC-205-विट्रो <em>में</em> माउस Dendritic कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ एंटीबॉडी निर्देशित और <em>वीवो में</em> रासायनिक Conjugation
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Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T.,… More

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T., Frentzel, S., Erck, C., van Ham, M., Stegemann-Koniszewski, S., Bruder, D. Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62018, doi:10.3791/62018 (2021).

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