Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мышей in vitro и in vivo

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62018
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1, 1,2, 4, 4, *1,2,5, *1,2
1Immune Regulation Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Infection Immunology Group, Institute of Medical Microbiology, Infection Prevention and Control, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 3Institute for Molecular and Clinical Immunology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 4Cellular Proteome Research, Helmholtz Centre for Infection Research, 5Experimental Pneumology, University Hospital of Pneumology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg
* These authors contributed equally

Summary

Описан протокол химической конъюгации модельного антигена овальбумина к рецептор-специфическому антителу эндоцитоза для нацеливания на дендритные клетки in vivo. Протокол включает очистку антитела, химическую конъюгацию антигена, а также очистку конъюгата и проверку эффективного конъюгации.

Abstract

Таргетная доставка антигена к перекрестно-презентационным дендритным клеткам (DC) in vivo эффективно индуцирует реакции Т-эффекторных клеток и демонстрирует ценный подход в разработке вакцин. Антиген доставляется в DC через антитела, специфичные для рецепторов эндоцитоза, таких как DEC-205, которые индуцируют поглощение, обработку и презентацию MHC класса I и II.

Эффективная и надежная конъюгация желаемого антигена с подходящим антителом является критическим шагом в нацеливании на DC и среди других факторов зависит от формата антигена. Химическая конъюгация полноразмерного белка с очищенными антителами является одной из возможных стратегий. В прошлом мы успешно установили сшивку модельного антигена овальбумина (OVA) и специфического антитела IgG2a DEC-205 (αDEC-205) для исследований in vivo DC на мышах. Первым этапом протокола является очищение антитела от супернатанта NLDC (нелимфоидных дендритных клеток)-145 гибридомы методом аффинной хроматографии. Очищенное антитело активируют для химической конъюгации сульфо-SMCC (сульфосуцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат), в то время как в то же время сульфгидрильные группы белка OVA подвергают воздействию путем инкубации с TCEP-HCl (трис (2-карбоксиэтил)гидрохлорид фосфина). Избыток TCEP-HCl и сульфо-SMCC удаляют, а антиген смешивают с активированным антителом для ночного соединения. Полученный конъюгат αDEC-205/OVA концентрируется и освобождается от несвязанной OVA. Успешная конъюгация OVA с αDEC-205 подтверждается анализом вестерн-блоттинга и иммуноферментным анализом (ИФА).

Мы успешно использовали химически сшитый αDEC-205/OVA для индуцирования цитотоксических Т-клеточных реакций в печени и сравнения различных адъювантов на предмет их потенциала в индуцировании гуморального и клеточного иммунитета после нацеливания in vivo на DEC-205+ DC. Кроме того, такие конъюгаты химически связанных антител / антигенов предлагают ценные инструменты для эффективной индукции ответов вакцины на опухолевые антигены и, как было доказано, превосходят классические подходы к иммунизации в отношении профилактики и терапии различных типов опухолей.

Introduction

Дендритные клетки (DC) являются центральными игроками иммунной системы. Они представляют собой разнообразную группу клеток, специализирующихся на антиген-презентации, и их основная функция заключается в установлении врожденного и адаптивного иммунитета1,2. Важно отметить, что ДК не только играют важную роль в эффективных и специфических патогенных реакциях, но и участвуют во многих аспектах противоопухолевого иммунитета1,3.

Из-за их исключительной роли в иммунитете хозяина, DC оказался в центре внимания в качестве клеток-мишеней для вакцинации4. Один из подходов заключается в нацеливании антигенов на DC in vivo для индуцирования антиген-специфических иммунных реакций, и за последние годы большое количество исследований было посвящено определению подходящих рецепторов и стратегиям нацеливания1,4. Одним из примеров является рецептор лектина С-типа DEC-205, который может быть нацелен на специфические антитела DEC-205, чтобы вызвать эндоцитоз. Важно отметить, что было показано, что нацеливание DEC-205 в комбинации с подходящими адъювантами эффективно индуцирует долгоживущие и защитные CD4+ и CD8+ Т-клетки, а также ответы антител, также против опухолевых антигенов3,5,6,7,8,9.

Существует ряд исследований, показывающих, что конъюгированные антигены, нацеленные на DC, превосходят свободный неконъюгированный антиген3,5,10,11,12. Это делает конъюгацию антигена с соответствующим фрагментом, нацеленным на постоянный ток, центральным шагом в подходах к нацеливанию на ДК. В случае нацеливания на DC через антитела или фрагменты антител антигены могут быть либо химически, либо генетически связаны, и любая стратегия обеспечивает свои собственные (дис)преимущества1. С одной стороны, в генно-инженерных конструкциях антитело-антиген существует контроль над дозой антигена, а также местоположением, обеспечивающим превосходную сопоставимость между лотами1. В то же время, однако, химическая конъюгация требует меньшей подготовки и обеспечивает большую гибкость, особенно при попытке тестирования и сравнения различных антигенов и / или стратегий вакцинации в экспериментальных и доклинических моделях.

Здесь мы представляем протокол эффективной и надежной химической конъюгации овальбумина (OVA) в качестве модельного белкового антигена к DEC-205-специфическому антителу IgG2a (αDEC-205), подходящему для нацеливания in vivo DC на мышей. Во-первых, αDEC-205 очищают от клеток гибридомы NLDC-14513. Для химической конъюгации используется гетеробифункциональный сшивающий сульфосукцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), который содержит эфир NHS (N-гидроксисукцинимид) и малеимидные группы, позволяющий ковалентную конъюгацию амино- и сульфгидрилсодержащих молекул. В частности, первичные амины антитела первоначально реагируют с сульфо-SMCC и полученный малеимид-активированный αDEC-205 затем реагирует с сульфгидрилсодержащим белком OVA, восстановленным через TCEP-HCl (Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид). Конечный продукт представляет собой химически сопряженный αDEC-205/OVA(рисунок 1). Помимо самой химической конъюгации, наш протокол описывает удаление избытка OVA из конъюгата, а также проверку успешной конъюгации с помощью анализа вестерн-блот и специфического иммуноферментного анализа. Мы успешно использовали этот подход в прошлом для химической конъюгации OVA и других белков или иммуногенных пептидов с αDEC-205. Мы демонстрируем эффективное связывание с CD11c+ клетками in vitro, а также эффективную индукцию клеточного и гуморального иммунитета in vivo.

Конечно, у этого метода есть недостатки, такие как сопоставимость партии с партией и точное дозирование антигена в конечном конъюгате. Тем не менее, химическая конъюгация обеспечивает экспериментальную гибкость в выборе антитела и белкового антигена по сравнению с генетически модифицированными конструкциями. Поэтому мы считаем, что этот подход особенно ценен при оценке различных антигенов на предмет их эффективности в нацеливании на DC в доклинических моделях мышей, что важно также в контексте специфических противоопухолевых иммунных реакций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все описанные эксперименты на животных были одобрены местным правительственным агентством (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; номер файла 33.12-42502-04-10/0108) и были выполнены в соответствии с национальными и институциональными руководящими принципами.

1. Производство αDEC-205 из гибридной клеточной линии NLDC-145

  1. Для производства антител оттаивают криоконсервированные клетки NLDC-145, продуцирующие αDEC-205 при 37 °C на водяной бане. Расширьте ячейки при 37 °C и 5% CO2. Два 75 см2 бутылки понадобятся, чтобы приступить к производству антител. Процедуры культивирования клеток должны выполняться в шкафу безопасности для обеспечения безопасных условий труда и предотвращения загрязнения культур.
    1. Повторно суспендировать 1 мл размороженных клеток (1 х 106 - 5 х 106 клеток/мл) в 9 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином (предварительно нагретым до 37 °C) в колбу для культивирования клеток (25см2). Поместите колбу горизонтально в инкубатор клеточной культуры при 37 °C, 5% CO2.
    2. Культивируйте клетки при 37 °C и 5% CO2,до 70% слияния. Обычно это должно быть достигнуто через 24 - 48 ч.
    3. Как только ячейки сольются на 70%, перенесите полную суспензию ячейки NLDC-145 (10 мл) в коническую центрифужную трубку объемом 15 мл с помощью контроллера пипетки с пипеткой в диапазоне объемов от 1 до 10 мл. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Предварительно нагрейте среду ISF-1 до 37 °C на водяной бане и повторно суспендируйте гранулу в 12 мл среды ISF-1 с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина. Переложите повторно суспендированную клеточную суспензию в колбу для свежей культуры клеток (75см2).
    5. Культивируют и расширяют клетки в среде ISF-1, дополненной 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5% CO2,до 70% сливающегося и 99% жизнеспособного. Обычно это должно быть достигнуто через 48 - 72 ч.
    6. Разделите ячейки на две колбы по75 см2. Для этого сначала промыть нижнюю часть колбы клеточной культуры / поверхность культуры клеточной суспензией, чтобы удалить все клетки NLDC-145 с поверхности. Переложите по 6 мл клеточной суспензии NLDC-145 в один из двух свежих флаконов по75 см2 и добавьте предварительно подогретую среду ISF-1, дополненную 1% пенициллином/стрептомицином до 12 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обновляйте среду культивирования клеток, так как клетки NLDC-145 будут обусловливать среду. Переложите клетки вместе с их средой и заполните культуру до нужного объема свежей средой. Это имеет решающее значение для жизнеспособности и максимальной выработки антител клетками NLDC-145.
    7. Расширяют клеточные культуры при 37 °C и 5%CO2,до примерно 70% слива, что обычно достигается через 48 - 72 ч.
    8. Как только ячейки станут 70% сливающимися, переместите 10 мл расширенной клеточной суспензии NLDC-145 из каждой из бутылокразмером 75 см2 в одну бутылку-ролик ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль) (1050см2). Для этого промыть дно колбы клеточной культуры / поверхность культуры клеточной суспензией, чтобы удалить все клетки с поверхности с помощью контроллера пипетки и пипетки 10 мл.
    9. Добавьте 140 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином (предварительно нагретой до 37 °C) непосредственно из средней бутылки, в каждую из бутылок NLDC-145, содержащих роликовые бутылки, заполняющие их до отметки 150 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. примечание на этапе 1.1.6.
    10. Культивируйте роликовые бутылки при 37 °C, 5% CO2 и 25 раунд/мин в течение трех дней.
    11. Добавьте 150 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллина/стрептомицина (предварительно нагретого до 37 °C), к каждой из NLDC-145, содержащих роликовые бутылки, заполняющие их до отметки 300 мл.
    12. Культивируйте роликовые бутылки, которые теперь содержат культуру по 300 мл каждая при 37 °C, 5% CO2 и 25 раундов / мин в течение еще трех дней.
    13. Добавьте еще 100 мл среды ISF-1, дополненной 1% пенициллином/стрептомицином (предварительно нагретой до 37 °C), к каждой из бутылок, содержащих ролики NLDC-145, тем самым заполняя их до отметки 400 мл.
    14. Культивируйте роликовые бутылки, которые теперь содержат культуру по 400 мл каждая при 37 °C, 5% CO2 и 25 раунд/мин, в течение еще семи дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этой недели культура становится очень плотной (до 95% плотности), а жизнеспособность снижается (всего до 50%), что обеспечивает максимальное высвобождение антител.
  2. Для очистки αDEC-205 от супернатанта культуры заливают клеточную суспензию NLDC-145 (из обеих роликовых бутылок) непосредственно в 500 мл автоклавных центрифугированных бутылок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем культуры должен быть собран в 800 мл.
    1. Центрифугируйте культуру в течение 30 мин при 8 600 х г и 4 °C для удаления клеток и мусора.
    2. Соберите супернатанты, выбросив гранулы и объединив супернатанты в стерильную бутылку с реагентами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка αDEC-205 может быть начата немедленно (стадия 2.) или супернатант может храниться кратковременно при 4 °C.

2. Очистка антитела αDEC-205 от супернатанта клеток NLDC-145

ПРИМЕЧАНИЕ: Из клеточного супернатанта NLDC-145 αDEC-205 очищают с использованием белковой колонки G Sepharose (многоразовой). Размеры колонны составляют 15 мм х 74 мм, а 5 мл белка G Sepharose упаковываются на столбец.

  1. Для приготовления и промывки белковой колонки G Sepharose поставьте герметичную резиновую пробку на верхнее отверстие белковой колонки G Sepharose. Прокол резиновой заглушки двумя стерильными канюлями (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 мм).
    1. Подключите шприц объемом 10 мл к одной из двух канюль и гибкую силиконовую трубку (длиной около 100 см, диаметром 2,5 - 3 мм) с помощью разъема для трубки ко второй канюле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция шприца/резиновой заглушки является многоразовой и обеспечивает вакуум, что приводит к непрерывному потоку большого объема культивируемого супернатанта к колонке белка G Sepharose. С этой целью слегка оттяните плунжер шприца, чтобы обеспечить непрерывный поток жидкости на следующих этапах.
    2. Промыть столб 50 мл 0,1 мл ледниковой уксусной кислоты (рН 2), чтобы удалить потенциально оставшиеся антитела из любой предыдущей очистки антител. Поместите конец кремниевой трубки в бутылку с реагентом, заполненную ледниковой уксусной кислотой (рН 2). В результате индуцированного вакуума 50 мл 0,1 М ледниковой уксусной кислоты (рН 2) по каплям проходят через столб белка G Sepharose.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,1 М ледниковой уксусной кислоты (рН 2) следует хранить в бутылке с реагентами или свеженаполненной в стакане.
    3. Промыть колонну 100-200 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Поместите конец кремниевой трубки в наполненную PBS бутылку с реагентом или стакан. Пусть 100-200 мл PBS проходят по каплям через белковую колонку G Sepharose.
  2. Для очистки антител от супернатанта NLDC-145 загрузите на колонку 800 мл супернатанта NLDC-145 (полученного на стадии 1.2.2.). Поместите конец кремниевой трубки в бутылку реагента, наполненную супернатантом NLDC-145. Пусть 800 мл супернатанта NLDC-145 проходят по каплям через колонну.
    1. Вымойте колонну 500 мл PBS. Поместите конец кремниевой трубки в наполненную PBS бутылку с реагентом или стакан. Пусть 500 мл PBS проходит по каплям через столбец.
    2. Для элюирования используйте 20 пробирок 1,5 мл и пипетку 100 мкл 1,5 М Tris-HCl (рН 8,8) в каждую трубку объемом 1,5 мл. Выньте резиновую пробку из колонки и пипетку 1 мл 0,1 М глицина (рН 3) в верхнюю камеру колонки белка G Sepharose для элюирования антитела из колонки. Соберите проточную трубу непосредственно в виде элюата в одной из подготовленных пробирок объемом 1,5 мл.
    3. Повторите стадию элюирования (2.2.2.) для всех 20 пробирок (1,5 мл).
    4. Определить оптическую плотность всех фракций элюирования при 280 нм (OD280)с помощью спектрофотометра с целью идентификации фракций, содержащих антитела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте первую фракцию элюирования в качестве пустой.
    5. Объедините все фракции с OD280 больше 0,5 (приблизительно 10 фракций).
    6. Храните столбец белка G Sepharose, заполненный 20% этанолом при 4 °C.
  3. Диализуйте объединенные элюиты против 1000 мл PBS (в стакане 2000 мл) при 4 °C в течение ночи с использованием диализных трубок с отсеченной молекулярной массой (MWCO) 12 - 14 кДа.
    1. Нарежьте диализную трубку на кусочки по 20 см. Кипятите диализную трубку в 500-800 мл 10 мМ ЭДТА (рН 7,5) в течение 30 мин в стакане, используя конфорку для удаления загрязнений. Откажитесь от раствора 10 мМ ЭДТА (рН 7,5) и кипятите диализную трубку в деионизированной воде в течение 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализную трубку можно использовать непосредственно или хранить в 0,01% растворе азида натрия (NaN 3)/H2O при 4°C до следующего использования.
    2. Закройте нижнюю часть диализной трубки соответствующей диализной трубкой/ цельным, шарнирным зажимом и осторожно вставьте элюирование антител в диализную трубку. Закройте верхнюю часть диализной трубки вторым зажимом.
    3. Закрепите верхний зажим диализной трубки на плавающей подставке, поместите его вместе с магнитным перемешивателем в заполненный PBS стакан и поместите стакан на магнитную мешалку.
    4. Диализ на ночь помешивают при 4 °C.
  4. Чтобы увеличить концентрацию αDEC-205, загрузите полный диализат в центробежный концентратор с MWCO 10 кДа. Откройте один зажим трубки и аккуратно выложите весь диализат из диализной трубки в центробежный концентратор (10 кДа MWCO).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к дну концентратора наконечником пипетки.
    1. Центрифуга в течение 30 мин при 693 х г (2 000 об/мин) и 4 °C.
    2. Нагрузите центробежный концентратор 10 мл PBS и центрифугой при 693 x g (2000 об/мин) и 4 °C до тех пор, пока конечный объем оставшегося раствора антител не составит 1-1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости повторите этап центрифугирования, указанный в разделе 2.4.1. подстроиться под нужную сумму.
    3. С помощью спектрофотометра определяют оптическую плотность концентрированного раствора αDEC-205 при 280 нм (OD280). Используйте PBS в качестве пустого.
    4. Рассчитайте концентрацию αDEC-205 по следующей формуле:
      концентрация [мг/мл] = OD 280/1,4.
    5. Фильтруйте раствор αDEC-205 с помощью шприцевого фильтрующего блока 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка αDEC-205 от супернатанта клеток гибридомы NLDC-145 также может быть достигнута с помощью FPLC (быстрая белковая жидкостная хроматография). Очищенный αDEC-205 можно хранить при 4 °C или при -18 °C для длительного хранения.

3. Химическое сопряжение OVA с αDEC-205

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной химической конъюгации требуется соотношение 0,5 мг белка OVA к 2,5 мг αDEC-205 (1:5). Однако это соотношение может варьироваться для других белков и антител и должно быть оптимизировано для альтернативных конъюгатов. Восстановление дисульфидных связей белка OVA осуществляют путем инкубации с 30 мМ TCEP-HCl, которая подвергает сульфгидрильные группы химической конъюгации с αDEC-205 и 240 мкл TCEP-HCl необходимы на стадии 3.2. Обе стадии, Индуцированное TCEP восстановление OVA (этап 3.1.) и сульфо-SMCC активация αDEC-205 (этап 3.2.), предпочтительно должны выполняться параллельно.

  1. Заново приготовить раствор TCEP-HCl 125 мМ (рН 7,0). Взвесьте желаемое количество TCEP-HCl и растворите TCEP-HCl в основе 0,9 М Трис (рН 8,8). Используйте полоски индикатора pH для проверки pH раствора TCEP-HCl 125 мМ (который должен быть нейтральным) и отрегулируйте pH с основанием Tris (pH 8,8).
    1. Пипетка 200 мкл OVA белкового раствора (содержащего 0,5 мг OVA) в стерильную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 240 мкл 125 мМ TCEP-HCl и 560 мкл стерильной сверхчистой воды к белку OVA с использованием пипетки до конечной концентрации 0,5 мг/мл белка OVA и 30 мМ TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2,5 мг EndoGrade OVA (лиофилизированный) растворяют в 1 мл PBS, в результате чего получается 2,5 мг/мл раствора OVA.
    2. Инкубируют полученный OVA/TCEP-HCl при комнатной температуре в течение 1,5 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширяйте этот этап инкубации.
  2. Для активации αDEC-205 для конъюгации растворяют 2 мг сульфо-SMCC в 100 мкл сверхчистой воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сульфо-SMCC подвержен гидролизу. Поэтому следует быстро обрабатывать большие количества нерастворенных сульфо-СМАК или использовать доступные аликвоты 2 мг.
    1. Развести αDEC-205 в PBS так, чтобы 2,5 мг содержалось в 900 мкл.
    2. Смешайте 2,5 мг αDEC-205 (объем 900 мкл; полученный из стадии 3.2.1.) и 100 мкл сульфо-SMCC (полученного из стадии 3.2.) в пробирке объемом 1,5 мл, в результате чего общий объем составит 1 мл.
    3. Инкубировать раствор αDEC-205/sulfo-SMCC в течение 30 мин при 37 °C и 550 об/мин в нагревательном блоке.
  3. После этих инкубаций избыток сульфо-SMCC и TCEP-HCl немедленно удаляется из растворов с помощью обессоливающих колонн (MWCO 7 кДа; объем колонки 5 мл).
    1. Открутите нижнюю крышку колонн (MWCO 7 кДа), ослабьте крышку и поместите колонну в коническую трубку объемом 15 мл.
    2. Центрифуга в течение 2 мин при 1000 х г при комнатной температуре для удаления жидкости.
    3. Поместите колонку в свежую трубку и снимите колпачок. Медленно нагружайте антитела/сульфо-SMCC и OVA/TCEP-HCl, соответственно, в центр компактного смоляного слоя по одной колонке каждый.
    4. Центрифуга в течение 2 мин при 1 000 х г при комнатной температуре.
    5. Удалите столбцы после использования. Растворы, содержащие антитела и OVA, загрунтованные для конъюгации, находятся в пробирках.
    6. Немедленно перемешайте оба раствора путем пипетки для сопряжения αDEC-205 и OVA.
    7. Инкубировать полученную смесь αDEC-205 и OVA в течение ночи при 4°C.
  4. После конъюгации избыток несвязанной OVA удаляют из раствора и связывают αDEC-205/OVA концентрируют с использованием центробежного концентратора белка (MWCO 150 кДа).
    1. Предварительно промыть концентратор центробежного белка (MWCO 150 кДа) путем пипетирования 12 мл PBS на колонке и центрифугирования в течение 2 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости повторяйте стадию центрифугирования (3.4.1.) до тех пор, пока через колонну не пройдет объем около 5 мл.
    2. Перед загрузкой αDEC-205/OVA на концентратор центробежного белка сохраните образец неконцентрированного αDEC-205/OVA объемом 20 мкл для анализа вестерн-блоттинга. Храните эту аликвоту при 4 °C до анализа.
    3. Загрузите αDEC-205/OVA на концентратор центробежного белка путем пипетирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте любого контакта с слоем верхней камеры центробежного концентратора.
    4. Заполните концентратор до 15 мл PBS и центрифугируйте концентратор в течение 5 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
    5. Сохраните образец проточного (flow-through I) для анализа вестерн-блоттинга и отбрасывайте оставшийся поток.
    6. Заполните концентратор до 10 мл PBS и центрифугируйте концентратор не менее 8 мин при 2000 х г при комнатной температуре.
    7. Сохраните образец для второго проточного (flow-through II) для анализа вестерн-блоттинга и отбросьте оставшийся поток.
    8. Как только желаемое обогащение достигнуто (около 1,5 мл раствора αDEC-205/OVA следует оставить в верхней камере), осторожно аспирируйте концентрированный образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в верхней камере остается слишком много жидкости, центрифугирование может быть повторено, но должно быть как можно короче.
  5. Определите концентрацию белка в полученном αDEC-205/OVA с помощью микрообъемного спектрофотометра. Используйте PBS в качестве пустого.
  6. Фильтруйте αDEC-205/OVA с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующего анализа и экспериментов in vivo αDEC-205/OVA можно хранить при температуре 4 °C или -18 °C.

4. Проверка химического спряжения вестерн-блотом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки успешной химической конъюгации проводится анализ вестерн-блоттинга, обнаруживающий либо OVA (4.2), либо αDEC-205 (4.10). Обнаружение OVA (4.2.) или αDEC-205 (4.10.) должно выполняться параллельно. Орбитальный платформенный шейкер предпочтительно следует использовать для всех стадий инкубации мембран западного пятна, чтобы обеспечить равномерное распределение соответствующих растворов.

  1. Приготовьте стандартные 10% Гели SDS (додецилсульфат натрия) для SDS-PAGE (электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия).
  2. Подготовьте образцы для SDS-PAGE для обнаружения сопряженных и неконъюгированных OVA и запуска гелевого электрофореза.
    1. Разбавить различные количества связанных αDEC-205/OVA (например, 200, 100 и 50 нг), чистой OVA (например, 80, 70, 60, 50, 40 и 30 нг), аликвоты несопряженного αDEC-205 (например, 100 и 50 нг), образца неконцентрированного αDEC-205/OVA, сопряженного со стадии 3.4.2. (например, 125 нг) и аликвота проточных I и II (этапы 3.4.5 и 3.4.7, соответственно; факультативно) в 4 x невосстанавливающемся буфере образцов SDS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные концентрации конъюгата и белка загружаются, чтобы гарантировать, что как свободная OVA, так и конъюгат могут быть обнаружены на одном и том же пятне.
    2. Денатурируйте образцы при 65 °C в течение 10 мин и 550 об/мин в нагревательном блоке.
  3. Загрузите образцы и стандарт белка в гель SDS и запустите SDS-PAGE.
  4. Выполняют стандартное промокание белков из геля SDS на активированную метанолом PVDF (поливинилидендифторидную) мембрану (75 мин, 125 мА).
  5. После продувания поместите мембрану в соответствующую чашку и блокируйте мембрану, пипетируя 25 мл 4% порошка для замены пищи / TBS-T (tris-буферный физиологический раствор / 0,1% Tween 20) блокирующего буфера в чашку, содержащую мембрану.
    1. Инкубируют мембрану в блокирующем растворе в течение 60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °С.
  6. Откажитесь от блокирующего раствора и окрашивайте мембрану первичным антителом αOVA кролика в 2% порошке для замены пищи /буфере антител TBS-T (разведение 1:3000) путем пипетирования 15 мл раствора первичного антитела на мембрану в чашке.
    1. Инкубировать мембрану в течение 45 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C (используйте платформенный шейкер).
  7. Выбросьте раствор антител и промойте мембрану в посуде (используйте платформенный шейкер).
    1. Добавьте 25 мл TBS-T к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
    2. Добавьте 25 мл TBS-T/0,5 M NaCl к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
    3. Добавьте 25 мл TBS-T/0,5% Triton X-100 к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
    4. Добавьте 25 мл TBS-T к мембране и инкубируйте в течение 5 мин. Выбросьте раствор.
  8. Окрашивают мембрану вторичным антителом козьего αrabbit-IgG-HRPO (пероксидаза хрена) в 2% порошок для замены пищи / буфер антител TBS-T (разведение 1:2000) путем пипетирования 15 мл раствора вторичного антитела к мембране в чашке.
    1. Инкубировать мембрану в течение 45 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C (на платформе шейкера).
  9. Снова промыть мембрану, как описано на этапе 4.7.1.- 4.7.4. с помощью платформенного шейкера. Для этой мембраны продолжайте с шагом 4.16. (следующие шаги 4.10.- 4.15. (обнаружение αDEC-205) может быть выполнено параллельно шагам 4.2.- 4.9.).
  10. Подготовьте образцы для обнаружения αDEC-205 для SDS-PAGE и запустите гель-электрофорез.
    1. Разбавляют различные количества αDEC-205/OVA (например, 200, 100 и 50 нг), несопряженного αDEC-205 (например, 250, 125, 62,5 нг), чистой OVA (например, 80 и 70 нг), образец неконцентрированного αDEC-205/OVA из этапа 3.4.2. (например, 125 нг) и аликвота проточных I и II (этапы 3.4.5 и 3.4.7, соответственно; факультативно) в 4 x невосстанавливающемся буфере образцов SDS.
    2. Денатурируйте образцы при 65 °C в течение 10 мин и 550 об/мин в нагревательном блоке.
  11. Загрузите образцы и стандарт белка в гель SDS и запустите гель-электрофорез.
  12. Выполняют стандартное промокание белков из геля SDS на метанол активированную PVDF (поливинилидендифторидную) мембрану (75 мин, 125 мА).
  13. После блоттинга поместите мембрану в соответствующую чашку и заблокируйте мембрану, пипетировав 25 мл 10% блокирующего буфера (сухое молоко / TBS-T) в чашку, содержащую мембрану.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующие решения различаются между обнаружением αDEC-205 и OVA (шаг 4.5.).
    1. Инкубируют мембрану в блокирующем растворе в течение 60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °С (с помощью платформенного шейкера).
  14. Откажитесь от блокирующего раствора и окрашивайте мембрану козьим антителом αrat-IgG(H+L)-HRPO в буфере 5% сухого молока/TBS-T антител (разведение 1:5000) путем пипетирования 15 мл раствора антител к мембране в посуде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы антител различаются между обнаружением αDEC-205 и обнаружением OVA (шаги 4.6./ 4.8.).
    1. Инкубировать мембрану в течение 45 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °C (с помощью платформенного шейкера).
  15. Тщательно вымойте мембрану в посуде, как описано в шагах 4.7.1.- 4.7.4. (используйте шейкер платформы).
  16. Используйте соответствующий реагент обнаружения для разработки сигнала HRP и обнаружения хемилюминесценции в темной комнате с помощью рентгеновской пленки или с помощью системы визуализации.

5. Проверка химического спряжения с помощью ИФА

  1. Выполните ИФА для дальнейшей проверки успешного химического конъюгирования, в результате чего получается αDEC-205/OVA.
  2. Покрыть соответствующую 96-луночную ИФА-пластину 100 мкл/лунку 3 нг/мкл антитела αOVA кролика в буфере покрытия (0,1 М бикарбоната натрия (NaHCO3)рН 9,6, разбавленного вН2O).
    1. Инкубировать пластину в течение ночи при 4 °C.
  3. После нанесения покрытия трижды промывайте пластину PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
  4. Блокируйте пластину путем пипетирования 200 мкл блокирующего буфера (10% FCS в PBS) в каждой лунке пластины и инкубируйте пластину в течение 30 мин при комнатной температуре.
  5. Последовательно разбавляйте αDEC-205/OVA (полученное на стадии 3.6.) 1:2 в блокирующем буфере (10% FCS в PBS) для получения разрежений в диапазоне от 6 мкг/мл до 93,8 нг/мл αDEC-205/OVA и добавляйте 100 мкл/лунку этих уменьшающихся количеств αDEC-205/OVA в скважины.
    1. Инкубировать пластину в течение 1 ч при комнатной температуре.
  6. Трижды вымойте пластину с помощью PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
  7. Добавьте 100 мкл козьего антитела αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (разбавленного до 1:2000 в блокирующем буфере (10% FCS в PBS)) к каждой лунке пластины.
    1. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  8. Трижды вымойте пластину с помощью PBS, например, с помощью ИФА-шайбы.
  9. Добавьте в скважины 50 мкл HRPO-субстрата. При наблюдении четкой цветовой реакции останавливают реакцию путем добавления 150 мкл останавливающего раствора (1M H2SO4)на лунку.
  10. Через 5 мин считывать абсорбцию при 450 нм с помощью ИФА-считывателя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Химическая конъюгация белка αDEC-205 с белком OVA с использованием этого протокола обычно позволяет эффективно генерировать αDEC-205/OVA для подходов к нацеливанию in vivo DC. Существуют различные стратегии проверки самой техники и проверки функциональности полученного сопряжения. Вестерн-блот-анализ и ИФА используются для проверки успешного сопряжения и в то же время обнаружения потенциально оставленной свободной OVA(рисунок 2). Исследования связывания in vitro (Рисунок 3)и иммунизация in vivo (Рисунок 4)подтверждают связывание конъюгата с DEC-205 и нацеливание DC.

Параллельный вестерн-блот-анализ используется для обнаружения как сопряженной OVA(рисунок 2A),так и сопряженной αDEC-205(рисунок 2B). В частности, положительный сигнал для OVA на уровне молекулярной массы антитела в блоте подтверждает связь OVA и антитела(рисунок 2A). Кроме того, окрашивание для OVA в анализе вестерн-блот позволяет обнаружить избыток свободной OVA, потенциально все еще присутствующей рядом с αDEC-205/OVA, полученной на этапе 3.6., что не относится к показанному пятну(рисунок 2A). В случае обнаружения большого количества свободных OVA, шаги 3.4.1. до 3.4.8. протокола следует повторить. В дополнение к окрашиванию для OVA(рисунок 2A),окрашивание для αDEC-205 в анализе вестерн-блотов проверяет успешную конъюгацию путем увеличения молекулярной массы между «голым» αDEC-205 и сопряженным, как показано на рисунке 2B.

Наряду с западным блоттингом, также специфическая ИФА позволяет проверить успешное сопряжение αDEC-205 с OVA. Однако, в отличие от анализа вестерн-блоттинга, этот ИФА не позволяет обнаружить свободные и несопряженные αDEC-205 или OVA. Из-за установки анализа(рисунок 2C)положительный сигнал выдается только в том случае, если сопряжение было эффективным. Положительная связь между обнаруженным сигналом (поглощение при 450 нм) и анализируемым количеством белка подтверждает успешную генерацию αDEC-205/OVA посредством химической конъюгации, как показано на рисунке 2D. В то же время положительный сигнал, уже полученный от 9,38 нг конъюгата αDEC-205/OVA, демонстрирует сильную чувствительность этого метода(рисунок 2D). В случае, если не наблюдается увеличения адсорбции для увеличения количества сопряжения, спряжение, по-видимому, не было успешным. В этом случае анализ вестерн-блот также даст отрицательные результаты, т.е. не обнаружит конъюгата в пятне, окрашенном для OVA, и не увеличит молекулярную массу в пятне, окрашенном для αDEC-205.

В то время как вестерн-блот и ИФА-анализы используются для оценки конъюгации и удаления свободного антигена как такового, необходимы последующие функциональные анализы для подтверждения связывания с DEC-205 и нацеливания на DC. С этой целью мы провели исследования связывания in vitro (рисунок 3)и иммунизацию in vivo (рисунок 4). Для этих экспериментов самки 6-8-недельных мышей C57BL/6 и 8-12-недельных мышей Balb/c были получены из коммерческих источников или выведены на животноводческом объекте Центра инфекционных исследований им. Гельмгольца (HZI) и содержались в специфических условиях, свободных от патогенов. На фиг.3 показаны функциональные анализы связывания конъюгата αDEC-205 и основного белка HCV (αDEC-205/Core) с CD11c+ клетками in vitro. Проточная цитометрия ясно показала, что αDEC-205/Core эффективно связывает cd11c+ клетки костного мозга(рисунок 3A,B),а также свежеизолированные мышиные CD11c+ спленоциты (данные не показаны). Эти анализы демонстрируют, что химическое сопряжение не влияет на связывающую способность αDEC-205. Это дополнительно подтверждается иммунофлуоресцентными анализами, показывающими связывание αDEC-205/Core с MHC-II+ CD11c+ клетками, отсортированными из дендритных клеток, полученных из костного мозга in vitro (BMDC)(рисунок 3C).

В прошлом мы показали конъюгаты αDEC-205/OVA, полученные по продемонстрированному протоколу, для эффективного индуцирования OVA-специфических иммунных ответов in vivo у мышей, подтверждая успешную генерацию конъюгата, а также функциональное нацеливание dc(рисунок 4)12,14. В частности, подкожная вакцинация αDEC-205/OVA эффективно индуцировала гуморальные и клеточные OVA-специфические иммунные реакции. Важно отметить, что в модели вызова рекомбинантного аденовируса мы обнаружили противовирусные CD8+ Т-клетки, способные устранять инфицированные вирусом гепатоциты, что имеет серьезные последствия для вакцин, направленных на гепатотропные вирусы12. Кроме того, высокоэффективная индукция антиген-специфических цитотоксических Т-клеток подчеркивает потенциал этого подхода для in vivo прайминга противоопухолевого иммунитета. Кроме того, мы успешно использовали αDEC-205/OVA для тестирования и сравнения различных адъювантов в контексте in vivo DC, нацеленногона 14. При вакцинации αDEC-205/OVA вместе с адъювантной комбинацией Poly(I:C) (полиинозин-полицитидиловая кислота) и CpG (синтетические олигодезоксинуклеотиды, содержащие неметилированные мотивы CpG) мы наблюдали в целом(Рисунок 4A)и в течение некоторых временных точек значительно более высокие OVA-специфические уровни IgG по сравнению с вакцинацией только OVA(Рисунок 4B). Кроме того, αDEC-205/OVA эффективно индуцировал OVA-специфическийCD4+, а также CD8+ Т-клеточные реакции(рисунок 4C,D)и αDEC-205/OVA-индуцированный ответ CD8+ T-клеток значительно превышал ответ, индуцированный только OVA(рисунок 4D).

Figure 1
Рисунок 1:Модель химического сопряжения αDEC-205 и OVA. На первом этапе первичный амин αDEC-205 реагирует с эфиром NHS сульфо-SMCC, в результате чего малеимид активируется αDEC-205. После восстановления дисульфидных связей белка OVA путем инкубации с TCEP-HCl, активированный малеимидом αDEC-205 реагирует с TCEP-HCl-восстановленным белком OVA с образованием конъюгата антитела/антигена αDEC-205/OVA. Сокращения: N-гидроксисукцинимидный эфир (эфир NHS); сульфосуцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC); Трис(2-карбоксисетил)фосфина гидрохлорид (TCEP-HCl). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Проверка химически сопряженного αDEC-205/OVA. Для проверки эффективности химической конъюгации αDEC-205 и белка OVA проводят анализ вестерн-блоттинга(A,B)и ИФА(C,D). Образцы αDEC-205/OVA, αDEC-205 и различных концентраций белка OVA подвергали SDS-PAGE (10%) и последующему анализу вестерн-блоттинга с использованием первичного антитела αOVA кролика и вторичного антитела козы αrabbit-IgG-HRPO для обнаружения белка OVA(A)или антитела козьего αrat-IgG(H+L)-HRPO для обнаружения αDEC-205(B). (C)Схематическое изображение ИФА для проверки сопряжения αDEC-205/OVA. Антитело к покрытию αOVA кролика связывает αDEC-205/OVA через конъюгированную OVA. Козий αrat-IgG(H+L)-HRPO распознает фракцию αDEC-205 связанного сопряжения, и положительный сигнал, таким образом, подтверждает эффективное сопряжение. (D) ИФА была выполнена так, как описано в (C). Анализировали последовательно разбавленные количества (1:2) αDEC-205/OVA (от 600 нг до 9,38 нг). Данные показаны как среднее значение тройств репрезентативного анализа. Сокращения: иммуноферментный анализ (ИФА); пероксидаза хрена (HRPO); овальбумин (OVA); электрофорез додецилсульфата натрия полиакриламидного геля (SDS-PAGE). Панели A и B были изменены по сравнению с Volckmar et al.12. http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Связывание αDEC-205/Core с дендритными клетками, полученными из костного мозга (BMDC) с помощью проточной цитометрии и иммунофлуоресцентной микроскопии. Для анализа способности αDEC-205/Core связывать свою молекулу-мишень DEC-205 на BMDC in vitro   были проведены флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS)(A,B)и иммунофлуоресцентная микроскопия(C). Короче говоря, клетки костного мозга были выделены из задних лап самок мышей Balb/c (n=3) в возрасте 8-12 недель и культивированы в среде RPMI с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина, 1% глутамина, 0,25 мМ меркаптоэтанола и 5 нг/мл GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). На 6-й день неадгезивные БМДК были тщательно собраны и использованы для анализа связывания. (А,Б) БМДК, генерируемые in vitro, инкубировали с 10 мкг/мл αDEC-205/Core, αDEC-205 или средой (контроль) в течение 1 ч при 4 °C с последующим окрашиванием меченым APC αCD11c [клон HL3]. Обнаружение связанного αDEC-205/Core на поверхности BMDC выполняли путем дополнительного окрашивания клеток либо PE-меченым козьим αrat(A),либо мышиным ядром αHCV [клон C7-50] с последующим вторичным окрашиванием αmouse-IgG1-PE(B). Репрезентативные гистограммы показывают сигнал PE и % PE-положительных клеток закрытых CD11c+ клеток. (C)БМДК, полученные in vitro от наивных мышей Balb/c, сортировали по клеткам MHC-II+ и CD11c+ и инкубировали с 10 мкг/мл αDEC-205/Core в течение 1 ч при 4°C. Клеточный αDEC-205/Core окрашивали Alexa 594-связанным αrat-IgG или мышиным ядром αHCV [клон C7-50] и Alexa 488-связанным αmouse-IgG в течение 30 мин при 4 °C после стирки. Клетки визуализировали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (шкала бар = 20 мкм). Связующая способность αDEC-205/Core с BMDC была подтверждена наложением обоих окрашиваний (двойной положительный = оранжевый). Сокращения: дендритные клетки костного мозга (BMDC); флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS); гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); вирус гепатита С (ВГС). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:OVA-специфические гуморальные и клеточные иммунные реакции после иммунизации αDEC-205/OVA. Функциональность αDEC-205/OVA для нацеливания на DC in vivo была доказана в ходе экспериментов по иммунизации, как было ранее опубликовано в Volckmar et al.12. Вкратце, самки 6-8-недельных мышей C57BL/6 (n=5) были подкожно иммунизированы в дни 0, 14 и 28 с конъюгатом 30 мкг αDEC-205/OVA вместе с адъювантами 50 мкг Poly(I:C)/50 мкг CpG, 30 мкг αDEC-205 или 7 мкг OVA белка в общем объеме 50 мкл PBS на животное. Дальнейшие средства контроля рассматривались только с помощью PBS. (А,Б) Для мониторинга гуморального иммунного ответа вакцинированных мышей слегка анестезировали с помощью вдыхания изофлурана, а образцы крови были собраны из ретроорбитального синуса на 0, 13 и 27 день и путем пункции сердца на 42-й день. Сыворотки были подготовлены так, как описано, и проанализированы на наличие OVA-специфического IgG с помощью ИФА12. Титры конечных точек были выражены как обратное значение последнего разведения сыворотки, которое дало поглощение в два раза выше значений отрицательного контроля. Результаты компилируются из трех независимых экспериментов. (A) Кинетика OVA-специфических титров IgG сыворотки, показанных как среднее групповое. (B) OVA-специфический титр IgG на 27-й и 42-й день показан для отдельных мышей вместе со средним значением группы. Статистика: непарный двусторонний t-тест. (С,D) Индукция клеточных иммунных реакций была проанализирована с помощью иммуноферментных пятен (ELISPOT) с использованием мышиного набора для обнаружения IFNγ на 42-й день, как было ранее опубликовано12. Изолированные спленоциты от иммунизированных мышей были объединены для экспериментальных групп и проанализировано количество лепесткообразующих единиц IFNγ /10 6 клеток после стимуляции 5 мг / мл CD4+ (C) или CD8+ OVA пептид(D) (пептиды OVA: CD4323-339 (ISQAVHAAHAEINEAGR) и CD8257-264 (СИИНФЕКЛ)). Столбцы представляют среднее ± SEM (n=5, трил. из объединенных выборок). Статистика: односторонняя ANOVA с тестом множественных сравнений Даннетта (**p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). Сокращения: цитозин-фосфат-гуаниновые олигонуклеотидные последовательности (CpG), иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментное пятно (ELISPOT), овальбумин (OVA), фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), полиинозин-полицитидиловая кислота (Poly(I:C)). Этот рисунок был модифицирован из Volckmar et al.12 http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Химическая конъюгация рецептор-специфического антитела эндоцитоза и белкового антигена обеспечивает эффективный и, что важно, также гибкий подход к нацеливанию in vivo DC на доклинических моделях мышей. С помощью нашего протокола мы обеспечиваем эффективный подход для успешной конъюгации модельного антигена OVA с DEC-205-специфическим антителом IgG.

В нашем протоколе αDEC-205 очищается от клеточной линии гибридомы, и в прошлом мы очищали антитело с использованием белка G сефарозы, как описано. Следует отметить, что мы также использовали FPLC для очистки αDEC-205 в более поздних исследованиях, и последующая химическая конъюгация также была эффективной. Критическими шагами для эффективной химической конъюгации являются прайминг как антитела, так и белка. Мы оптимизировали эти шаги из различных доступных протоколов, чтобы, наконец, выполнить инкубацию антитела с сшивающим сульфо-SMCC и восстановление белка через TCEP-HCl. В частности, на данном этапе критическими этапами являются свежее приготовление TCEP-HCl (этап 3.1.) и продолжительность инкубации TCEP-HCl с белком, которую не следует продлевать (стадия 3.1.2.). Кроме того, белковый буфер, используемый для восстановления дисульфидных связей через TCEP-HCl, имеет решающее значение, поскольку он может негативно влиять на восстановление TCEP-HCl. Также важно немедленно смешать активированное антитело и восстановленный белок (стадия 3.3.6.) для обеспечения оптимальных условий реакции для конъюгации. В наших руках этот подход дал наиболее эффективные и надежные результаты в отношении спряжения. Еще одним критическим шагом для последующих подходов in vivo является удаление несвязанной OVA из конъюгата αDEC-205/OVA. Чтобы проверить этот шаг, мы оптимизировали анализ вестерн-блот и рекомендуем обнаруживать как конъюгированный αDEC-205, так и конъюгированный белок OVA(рисунок 2A и B). В случае, если несвязанная OVA присутствует в конечном сопряженном растворе, промокание и обнаружение известных концентраций OVA (как на рисунке 2A)поможет оценить количество несвязанной OVA по отношению к общему количеству белка, загруженного для SDS-PAGE. Если конъюгация была неэффективной, устранение неполадок должно касаться соотношения антиген/антитело, используемого для конъюгации. В случае, если конъюгация была эффективной, как обнаружено с помощью ИФА, но не может быть обнаружена с помощью анализа вестерн-блоттинга, мы испытали концентрации антител в анализах западного блота (этапы 4.6., 4.8., 4.14.) наиболее критическим фактором.

Основным ограничением нашего подхода является изменяющаяся временами эффективность конъюгации, при которой нет фиксированной корреляции между количеством молекул антител и количеством связанного белка. Тем не менее, мы считаем и испытали, что продемонстрированный протокол надежно позволяет проводить последующие исследования постоянного тока in vivo, которые дают воспроизводимые результаты. Кроме того, хотя в принципе в нашем протоколе как αDEC-205, так и белок OVA могут быть обменены на альтернативные антитела и антигены для исследований in vivo различных интересов, отдельные этапы химической конъюгации должны быть вновь оптимизированы для новых компонентов. Это относится главным образом к оптимальному соотношению антител/антиген и может зависеть, например, от доступности восстанавливаемых остатков Cys. В наших подходах оптимальные соотношения, приводящие к успешным реакциям конъюгации, составляли 1:5 для OVA к αDEC-205 и 1,35:1 для белков HCV NS3 (неструктурный белок 3) и Core к αDEC-205. Для каждого конъюгата необходимо исключить негативное воздействие сшивателя или конъюгации как таковой на антигенсвязывающую способность антитела. Следует отметить, что конъюгация иммуногенных пептидов вместо полноразмерных белков менее проблематична в этом отношении. Однако белки обеспечивают более высокое разнообразие антигенов при последующей иммунизации. Подходы к генетическому слиянию представляют собой альтернативу химическому конъюгации, а также имеют явные преимущества1. В конечном счете, выбор стратегии связывания антител и антигенов для таргетирования ДК будет зависеть от ресурсов, направленности исследований и ожидаемого применения конъюгатов. Мы считаем, что относительная гибкость в отношении антител и антигенов демонстрирует основное преимущество химической конъюгации, и мы действительно использовали протокол, описанный здесь, для эффективной химической конъюгации αDEC-205 с различными белками вируса гепатита С (HCV)(рисунок 3 и данные не показаны).

В целом, мы считаем, что химическая конъюгация специфических антител рецептора эндоцитоза к белковым антигенам, таким как в αDEC-205 / OVA, демонстрирует гибкий и надежный инструмент для генерации конъюгатов антител / антигенов, имеющих исключительную ценность при изучении подходов к таргетированию DC, в том числе тех, которые направлены на индуцирование противоопухолевого иммунитета, особенно в доклинических моделях животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы благодарят С. Преттина за экспертную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом Ассоциации немецких исследовательских центров имени Гельмгольца (HGF), который был предоставлен в рамках Альянса Гельмгольца «Иммунотерапия рака» (HCC_WP2b).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
antibody buffer 2 % 2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
antibody buffer 5 % 5 % milk powder (w/v) in TBS-T
blocking buffer (ELISA) 10 % FBS in PBS
blocking buffer 4 % 4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T
blocking buffer 10 % 10 % milk powder (w/v) in TBS-T
cell culture flask T25 Greiner Bio-One 690175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )
cell culture flask T75 Greiner Bio-One 658175 we use standard CELLSTAR  filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195) 
cell culture flask T175 Greiner Bio-One 661175 we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)
centrifugal concentrator MWCO 10 kDa Sartorius VS2001 Vivaspin 20 centrifugal concentrator
centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml Thermo Fisher Scientific 88532 Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available 
centrifuge bottles Nalgene 525-2314 PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany
coating buffer (ELISA) 0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)
desalting columns MWCO 7 kDa Thermo Fisher Scientific 89891 Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL
detection reagent ELISA (HRPO substrate) Sigma-Aldrich/Merck T8665-100ML 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system
detection reagent western blot (HRPO substrate) Roche/Merck 12 015 200 01 Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)
dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa SERVA Electrophoresis 44110 Visking dialysis tubing, 16 mm diameter
ELISA 96-well plate Thermo Fisher Scientific 442404 MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
fetal calf serum PAN-BIOtech P40-47500 FBS Good forte
ISF-1 medium Biochrom/bioswisstec F 9061-01
milk powder Carl Roth T145.2 powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket
NLDC-145 hybridoma ATCC HB-290 if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC
non-reducing SDS sample buffer 4 x  for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 µl 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 µl of 5 % Bromphenol Blue
ovalbumin Hyglos (via BioVendor) 321000 EndoGrade OVA ultrapure with <0.1 EU/mg
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used
PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles Nunc In Vitro 734-2394 standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm², 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany  
pH indicator strips Merck 109535 pH indicator strips 0-14
polyclonal goat αrat-IgG(H+L)-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  112-035-062 obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot
polyclonal goat αrat-IgG+IgM-HRPO antibody  (ELISA) Jackson ImmunoResearch  112-035-068 obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA
polyclonal goat αrabbit-IgG-HRPO (western blot) Jackson ImmunoResearch  111-035-045  obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot
polyclonal rabbit αOVA (ELISA) Abcam ab181688 used at 3 ng/µl
polyclonal rabbit αOVA antibody (western blot) OriGene R1101 used at 1:3,000 for western blot
Protein G Sepharose column Merck/Millipore P3296 5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
protein standard Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa
PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane Merck/Millipore IPVH00010 immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane
rubber plug Omnilab 5230217 DEUTSCH & NEUMANN rubber stoppers (lower Φ 17 mm; upper Φ 22 mm)
silicone tube Omnilab 5430925 DEUTSCH & NEUMANN (inside Φ 1 mm; outer Φ 3 mm)
Slim-Fast we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder
stopping solution (ELISA) 1M H2SO4
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific 22322 Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)
syringe filter unit 0.22 µm  Merck/Millipore SLGV033RS Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized 
syringe 10 ml Omnilab Disposable syringes Injekt® Solo B.Braun
Sterican® cannulas B. Braun Sterican® G 20 x 1 1/2""; 0.90 x 40 mm; yellow
TBS-T Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HCl Thermo Fisher Scientific A35349
tubing connector Omnilab Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy. Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).
  2. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).
  3. Wculek, S. K., et al. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).
  4. Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype. Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).
  5. Bonifaz, L. C., et al. In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination. Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).
  6. Boscardin, S. B., et al. Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).
  7. Hossain, M. K., Wall, K. A. Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses. Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).
  8. Johnson, T. S., et al. Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule. Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).
  9. Trumpfheller, C., et al. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).
  10. Idoyaga, J., et al. Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).
  11. Sancho, D., et al. Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin. Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).
  12. Volckmar, J., et al. Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver. Scientific Reports. 7, 43985 (2017).
  13. Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody. Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).
  14. Volckmar, J., et al. The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells. Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).

Tags

Исследования рака Выпуск 168 Нацеливание на дендритные клетки дендритные клетки DEC-205 доставка антигена конъюгация антигенов химическая конъюгация эндоцитоз опосредованный антителами вакцинация противоопухолевый иммунитет
Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мышей <em>in vitro</em> и <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T.,… More

Volckmar, J., Knop, L., Hirsch, T., Frentzel, S., Erck, C., van Ham, M., Stegemann-Koniszewski, S., Bruder, D. Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (168), e62018, doi:10.3791/62018 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter